在中空纖維生物反應器中擴增干細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用中空纖維生物反應器技術(shù)產(chǎn)生大量細胞。所述細胞是非胚胎干細胞、非生殖細胞，其具有以下一個或多個特征：無需轉(zhuǎn)化而在培養(yǎng)中長期復制、長期復制的標志物例如端粒末端轉(zhuǎn)移酶、多能性標志物和廣泛的分化潛能。
【專利說明】在中空纖維生物反應器中擴增干細胞
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及使用中空纖維連續(xù)灌注生物反應器技術(shù)產(chǎn)生大量細胞。所述細胞是非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以通過以下一項或多項進行表征:無需轉(zhuǎn)化而在培養(yǎng)中長期復制、長期復制的標志物例如端粒末端轉(zhuǎn)移酶、多能性標志物和廣泛的分化潛能。
【背景技術(shù)】
[0002]中空纖維生物反應器技術(shù)已用于實現(xiàn)細胞的高密度擴增。通常，細胞在許多中空纖維內(nèi)和/或外擴增。由于這類設計提供的大表面面積，使用所述纖維作為培養(yǎng)基質(zhì)能夠產(chǎn)生大量的細胞，尤其是用于臨床應用的細胞。這種技術(shù)，首先由Knazek在20世紀70年代開發(fā)，已經(jīng)經(jīng)歷很多的發(fā)展和改進?；靖拍钍翘峁┛赏高^營養(yǎng)物、氣體和其他基礎培養(yǎng)基成分以及細胞廢物、但不能透過細胞并且所述細胞可在其上擴增的纖維基體。
[0003]在半滲透性的管狀膜上的細胞培養(yǎng)最初由Knazek在20世紀70年代早期發(fā)明。見，例如，U.S.3，821，087 ;3，883，393 ;4，220，725 ;4，184，922 ;和 4，200，689。根據(jù)所述發(fā)明，使懸浮于營養(yǎng)培養(yǎng)基中的細胞停留在毛細管的外表面，所述毛細管被流經(jīng)所述毛細管的充氧營養(yǎng)培養(yǎng)基連續(xù)灌注。營養(yǎng)物質(zhì)從所述灌注培養(yǎng)基擴散穿過所述毛細管壁并進入細胞中，而細胞廢物從所述細胞擴散穿過所述毛細管壁進入所述灌注液，可從所述灌注液中回收那些產(chǎn)物。
[0004]作為對失敗的嘗試將細胞培養(yǎng)成密度和/或結(jié)構(gòu)接近活組織的那些細胞的反應，開發(fā)了所述技術(shù)。主要地，在培養(yǎng)活細胞至非常高的密度例如至組織中的密度方面存在問題。第一，當細胞層的厚度增加時，培養(yǎng)基組分必須擴散穿過所述細胞層以到達所有細胞。第二，在細胞培養(yǎng)期間必須維持適當?shù)奈h(huán)境。因此，緊密靠近生長的細胞的流體隨著細胞代謝的進行而不斷地改變，并只有當更換或攪動所述培養(yǎng)基時以逐步的方式恢復至其最初的狀態(tài)。第三，需要在其上培養(yǎng)所述密集細胞的晶格或合適的材料。Knazek的發(fā)明通過在細胞群中提供供應 大的和小的必需分子的營養(yǎng)物源；在細胞群中的除去代謝產(chǎn)物的槽；合適的微環(huán)境；允許以三維生長的晶格；以及大的單層和/或多層細胞培養(yǎng)的表面面積(相對于標準細胞培養(yǎng)技術(shù)所需要的體積)，而解決了這些問題。
[0005]自所述最初的發(fā)明以來，已經(jīng)成功地使用這項技術(shù)來擴增多種細胞類型，并且有很多涉及對該基本技術(shù)的各種改進的科學和專利文獻。這些改進已經(jīng)進行了多種技術(shù)修改，以最優(yōu)該技術(shù)的使用以達到Knazek的最初目標。在工業(yè)中，這項技術(shù)已經(jīng)被命名為“中空纖維”細胞培養(yǎng)并且，在生物反應器裝置中，提供了中空纖維生物反應器細胞培養(yǎng)。見，例如，美國專利 3，997，396 ;4，184，922 ;4，200，689 ;4，220，725 ；4，804，628 ;4，999，298 ;5，126，238;5，162，225 ;5，627，070 ;5，656，421 ;5，712，154 ；6，001，585 ;6，680，166 ;6，911，201 ;6，933，144 ;7，534，609 ;美國公開文本 2001/0044413 ；2003/0224510 ； 2005/0032218 ； 2005/0003530 ； 2006/020507 I ； 2007/0298497 ；2008/0206733 ； 2008/02 13894 ； 2008/0220522 ； 2008/0220523 ； 2008/0227190 ；2008/248572 ；2008/254533 ；2009/0191631 ；2009/0196901 ；2010/0042260 ；2010/0144037 ；2010/0209403 ；2010/0233130 ；2010/0267134 ；W091/18972 ；W095/13088 ；W095/21911 ；W001/23520 ；W007/012144；W010/034468 ；W010/149597 ；和 Gloeckner 等，BiotechProgl7:828-31(2001)。
[0006]U.S.2010/0267134公開了使用中空纖維毛細管培養(yǎng)的成年人生殖系干細胞的分離、表征和分化。該參考文獻描述了在已經(jīng)被接種于所述中空纖維毛細管表面的塞托利(Sertoli)細胞的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)精原干細胞。
[0007]U.S.2007/0298497和2008/0220523公開了適用于間充質(zhì)干細胞的中空纖維生物反應器技術(shù)。描述了細胞擴增系統(tǒng)和使用所述系統(tǒng)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的方法。
[0008]U.S.2009/0196901涉及用于促進脂肪衍生的干細胞的生長和分化的方法和系統(tǒng)?？墒褂蒙锵嗳莸闹Ъ芙Y(jié)構(gòu)培養(yǎng)所述細胞，所述支架結(jié)構(gòu)可包括用于細胞生長和分化的中空纖維，所述支架在生物反應器中培養(yǎng)用于所述細胞的生長和分化。所述參考文獻表明，其他干細胞類型可用于該方法。然而，在用于在所述生物反應器中培養(yǎng)的編織纖維支架上生長和分化之前，所述細胞已經(jīng)在細胞培養(yǎng)中被大量地擴增。這產(chǎn)生足夠數(shù)量的干細胞，使得所述細胞可被濃縮并懸浮于基質(zhì)(例如凝膠生物材料)，并且應用于所述三維支架上。
[0009]U.S.2010/0209403公開了在可包含中空纖維的生物反應器中培養(yǎng)附著的胎盤間充質(zhì)干細胞和脂肪間充質(zhì)干細胞的方法。
[0010]W095/13088公開了以間充質(zhì)細胞支持物來培養(yǎng)造血干細胞的中空纖維技術(shù)。
[0011]W091/18972公開了用于培養(yǎng)來源于骨髓的造血干細胞的中空纖維生物反應器。
[0012]W007/012144公開了通過將`銜接物連接到表面以繁殖胚胎干細胞和其他細胞而改良的中空纖維生物反應器。
[0013]W010/149597公開了用于培養(yǎng)精原生殖細胞和其他生殖系細胞的中空纖維生物反應器。
[0014]W010/034468公開了在沒有包被層的情況下培養(yǎng)附著的細胞(例如間充質(zhì)干細胞)的中空纖維技術(shù)。
[0015]Antwiler 等("Bioreactor Design and Implementation, "Stem Ce 11Bioengineering, Parekkadan and Yarmush, eds., pp.49-62 (2009))公開了一種使用自動化的中空纖維生物反應器系統(tǒng)離體擴增來源于骨髓單核細胞和全骨髓的間充質(zhì)干細胞的方法。所述系統(tǒng)包括合成中空纖維生物反應器，其被連接至無菌閉環(huán)的計算機控制的培養(yǎng)基和氣體交換器。在實驗設置中，這使得在相對短的時間內(nèi)從少量的單次骨髓吸出物培養(yǎng)出治療劑量的間充質(zhì)干細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明涉及在中空纖維生物反應器中擴增本文所述的細胞。用于連續(xù)進料營養(yǎng)物和除去代謝廢物的連續(xù)灌注是本發(fā)明的一個方面。收集需要的分泌分子也是一個方面。
[0017]所述細胞可從作為未純化的或部分純化的制品的組織樣品(例如從骨髓、臍帶血或胎盤)直接擴增?；蛘撸黾毎梢允侵耙呀?jīng)被分離和擴增或者另外純化的基本上同質(zhì)的細胞的純化制品。因此，起始的細胞制品的純度可為實際上未純化的(例如以全骨髓單核細胞起始)或1%_100%純的。在一些實施方案中，用于給予受試者的細胞的純度為約100%(基本上同質(zhì))。在其他實施方案中，其為95%-100%。在一些實施方案中，其為85%-95%。然而，所述百分比可為約 1%_5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%_25%、25%_30%、30%_35%、35%_40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90% 或 90%_95%?；蛘撸蛛x / 純度可以以細胞倍增的方式表達，其中所述細胞已經(jīng)經(jīng)歷例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次細胞倍
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[0018]所述細胞可源自單一供體用于擴增，并返回至該同一供體(自體的)?；蛘?，所述細胞可源自單一供體用于擴增，并給予不同的受試者(異體的)?；蛘撸黾毎稍醋圆煌墓w。
[0019]所述細胞可通過任何所需次數(shù)的細胞倍增來擴增(增殖)。范圍包括從2倍至1000倍或更多。極限將取決于提供足夠營養(yǎng)物和除去有害廢物的能力。在一些實施方案中，細胞倍增在約2-約10倍、約10-約50倍和約50-100倍的范圍內(nèi)。使用本申請中描述的技術(shù)，從單個供體可產(chǎn)生多于IO8個細胞。
[0020]可將細胞擴增、收獲，然后重新接種到生物反應器中，用于進一步擴增。對于本申請的該目的，“運行”是指一輪擴增(從導入所述細胞至收獲)。因此，可在一次運行或多于一次運行后收集細胞。“傳代”是指運行。可在每次運行中通過不同的細胞倍增來擴增細胞。例如，在單次運行中，細胞可擴增2-10倍。然而，隨著重復的運行，總擴增可更高(如上文所論述)。
[0021]本發(fā)明涉及的細胞可表達多能性標志物，例如oct4。它們還可以表達與長期復制能力相關的標志物，例如端粒末端轉(zhuǎn)移酶。多能性的其他特征可以包括分化為多于一個胚層(例如外胚層胚胎胚層、內(nèi)胚層胚胎胚層和中胚層胚胎胚層中的兩個或三個)的細胞類型的能力。在培養(yǎng)中，這種細胞可以是或可以不是永生化的或轉(zhuǎn)化的。所述細胞可以不轉(zhuǎn)化而高度擴增，并且維持正常的 核型。例如，在一個實施方案中，所述非胚胎干細胞、非生殖細胞可以在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍增，例如50次、60次或更多次，其中所述細胞沒有轉(zhuǎn)化并具有正常核型。所述細胞可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中兩個的每一個的至少一種細胞類型，并且可以包括分化為所有的三個胚胎譜系。進一步地，所述細胞可以是不致瘤的，例如不會產(chǎn)生畸胎瘤。如果細胞是轉(zhuǎn)化的或致瘤的，并且需要使用它們來侵入，通過阻止細胞增殖形成腫瘤的處理，這種細胞可以是失能的，因此它們不會在體內(nèi)形成腫瘤。這種處理在本領域內(nèi)是眾所周知的。
[0022]細胞包括但不限于以下編號的實施方案:
[0023]1.分離的擴增非胚胎干細胞、非生殖細胞，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍增，其中所述細胞表達oct4、是未轉(zhuǎn)化的并具有正常的核型。
[0024]2.如以上I的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其還表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一種或多種。
[0025]3.如以上I的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中至少兩個的至少一種細胞類型。
[0026]4.如以上3的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其還表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一種或多種。
[0027]5.如以上3的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中每個的至少一種細胞類型。
[0028]6.如以上5的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其還表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一種或多種。
[0029]7.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，是通過培養(yǎng)非胚胎、非生殖組織獲得的，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少40次細胞倍增，其中所述細胞沒有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。
[0030]8.如以上7的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1 > rox-1或sox_2中的一種或多種。
[0031]9.如以上7的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中至少兩個的至少一種細胞類型。
[0032]10.如以上9的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1 > rox-1或sox_2中的一種或多種。 [0033]11.如以上9的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中每個的至少一種細胞類型。
[0034]12.如以上11的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1、rox-Ι或sox_2中的一種或多種。
[0035]13.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍增，其中所述細胞表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、沒有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。
[0036]14.如以上13的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其還表達oct4、reX-l、roX-l或sox-2中的一種或多種。
[0037]15.如以上13的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中至少兩個的至少一種細胞類型。
[0038]16.如以上15的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞,其還表達oct4、rex-l、rox_l或sox-2中的一種或多種。
[0039]17.如以上15的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中每個的至少一種細胞類型。
[0040]18.如以上17的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞,其還表達oct4、rex-l、rox_l或sox-2中的一種或多種。
[0041]19.分離的擴增的非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中至少兩個的至少一種細胞類型，所述細胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細胞倍增。
[0042]20.如以上19的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-1、rox-Ι或sox_2中的一種或多種。
[0043]21.如以上19的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中每個的至少一種細胞類型。
[0044]22.如以上21的所述非胚胎干細胞、非生殖細胞，其表達oct4、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、rex-Ι > rox-Ι或sox_2中的一種或多種。
[0045]上文所述的細胞可從任何需要的組織源制備，包括但不限于骨髓、臍帶血、臍帶基質(zhì)、外周血、胎盤、胎盤血、肌肉、腦、腎和其他實體器官。它們還可源自分泌的流體，例如尿和月經(jīng)血。
[0046]在一個實施方案中，所述細胞源自人組織。[0047]在配置所述中空纖維生物反應器中，有可根據(jù)細胞擴增相關的目標而變化的一些設計考慮和一些參數(shù)。首先，所述生物反應器中的纖維的數(shù)目可變化。通常使用多根或一束纖維來提供所需的表面積和高密度的細胞。纖維數(shù)目的實際范圍也會根據(jù)所述纖維的長度而變化。因而，所述長度也是可變的。通常，所述纖維的長度只受有效移動營養(yǎng)培養(yǎng)基而與所述細胞接觸、除去廢物或所需細胞產(chǎn)物以及有效地從所述纖維基質(zhì)上釋放所述細胞的能力的限制。因此，所述纖維的長度范圍可變化。另一個設計考慮是所述纖維壁的厚度。所述壁厚度是可變的并只受有效地為所述細胞提供營養(yǎng)物和有效地從所述細胞除去廢物或有用產(chǎn)物的參數(shù)的限制。另一個設計考慮是所述纖維壁中的孔的尺寸。通常這被設計為使營養(yǎng)物通過并到達所述細胞、帶走廢物、為所述細胞提供所需的產(chǎn)物(例如生長因子)、從所述細胞除去所需的產(chǎn)物等。例如，孔尺寸可設計為排除可存在于例如血清中的特定因子使其不能到達所述細胞。另一設計考慮是所述中空纖維的內(nèi)部尺寸(例如圓形纖維的直徑)。該選擇的考慮因素包括培養(yǎng)基充足地到達所述細胞以提供充足的營養(yǎng)物、除去廢物并達到所需的細胞密度。另一設計考慮是所述纖維壁的組成。這包括許多種提供細胞可粘附其上的基質(zhì)的生物相容性材料。在一些實施方案中，可通過使用促進粘附的基質(zhì)(例如細胞外基質(zhì)蛋白)包被所述壁材料來改善粘附。[0048]此外，關于上述多個參數(shù)，在生物反應器中可以有多于一種類型的纖維。這是有用的，例如需要共培養(yǎng)不同的細胞類型時。對于不同的細胞，最佳的纖維設計可不同。
[0049]通常可將多根中空纖維包裝進外殼中，所述外殼按需要與入口和出口通道連接，以將培養(yǎng)基灌注進入所述纖維和/或在所述纖維中環(huán)繞。在一個實施方案中，這些纖維作為其中灌注(循環(huán))有細胞培養(yǎng)基的生長腔的部分，使得培養(yǎng)基流入所述纖維和/或在所述纖維中環(huán)繞。在一個實施方案中，所述纖維位于筒中，所述筒與泵連接用于灌輸細胞培養(yǎng)基和補充物。
[0050]可制造所述纖維的材料包括許多種生物相容性的半滲透材料。這些材料使得細胞以三維生長，同時使得營養(yǎng)培養(yǎng)基擴散通過所述纖維壁以飼養(yǎng)細胞。
[0051]本發(fā)明涉及的細胞可與與其共鋪板的(co-plated)或單獨地附著或要不然在擴增腔中培養(yǎng)的其他細胞類型共培養(yǎng)。在一個實施方案中，可將所述其他細胞附著到所述纖維的內(nèi)表面(或外表面)，然后導入本發(fā)明的細胞。因此，本發(fā)明的細胞可沉積到需要的細胞類型的單層上。
[0052]可以以一種或多種細胞外基質(zhì)蛋白(例如，基質(zhì)膠、纖連蛋白或膠原)預包被所述中空纖維，以增強細胞附著。細胞外基質(zhì)蛋白可附著到所述纖維的內(nèi)表面和/或外表面。通常，可通過如美國專利N0.5，872，094和美國專利N0.6，471，689所描述的任何方法，將細胞外基質(zhì)蛋白附著于所述表面，所述兩件美國專利通過引用的方式納入本文，用于教導這些方法。
[0053]流速也可根據(jù)所要擴增的細胞和所述方法的平臺而變化。例如，完成細胞附著后，接種細胞后，可增加流速到穩(wěn)態(tài)水平。在細胞附著后會增加所述速率并再次增加速率以幫助從所述腔中收獲細胞。
[0054]使用通過許多不同的廠商容易獲得的基于合同的用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的材料，可以制造定制設計的中空纖維毛細管培養(yǎng)系統(tǒng)。用于細胞培養(yǎng)的一些類型的中空纖維系統(tǒng)可從公司(例如，F(xiàn)iberCell Systems, Inc.(Frederick, Md.))商購。由 FiberCell Systems制造的中空纖維系統(tǒng)由直徑約200 μ m的纖維組成。所述纖維被密封在筒中，所述筒的設計使得通過所述筒的末端泵入的細胞培養(yǎng)基流經(jīng)所述纖維的內(nèi)部。所述細胞附著在多孔的支持物上，并且所述培養(yǎng)可維持數(shù)月的連續(xù)產(chǎn)生。
[0055]對細胞擴增/擴增的細胞的分析可包括標志物例如在本申請中所描述的標志物的表達。此外，可分析造血標志物(例如⑶34和⑶45)的表達缺失?？芍芷谛缘乇O(jiān)測樣品上清液和單層細胞的(a)細胞形態(tài)、(b)倍性和(C)細胞標志物的原位雜交。
[0056]如上文所指明，可首先分離所述生物反應器中擴增的細胞并使用其他培養(yǎng)條件培養(yǎng)。例如，如下文所述，可首先分離示例性的細胞(命名為“MAPC”)并培養(yǎng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1提供了中空纖維細胞擴增系統(tǒng)的示意圖。
[0058]圖2是可用于本發(fā)明的生物反應器的示意圖。
[0059]圖3A描述了細胞生長腔的中空纖維細胞生長腔實施方案的側(cè)視圖。圖3B描述了圖3A的實施方案的中空纖維細胞生長腔的剖切側(cè)視圖。
[0060]圖4-細胞擴增系統(tǒng)(CES)流體回路，示出了框圖系統(tǒng)和所有袋連接。
[0061]圖5-用于從骨髓或從細胞庫擴增MultiStem的來自Caridian BCT (現(xiàn)為Terumo所有)的 Quantum Cell Expansion System 的流程圖。
[0062]圖6-將全骨髓抽吸物接種到Quantum中，事前不進行骨髓單核細胞(BMMNC)的選擇，以及將來自所述相同供體的BMMNC接種在常規(guī)的細胞培養(yǎng)塑料上。對3個獨立供體完成所述過程。將T75中的細胞傳代至少3次，然后計數(shù)細胞數(shù)目以計算群體倍增數(shù)(PD)。收獲Quantum中的細胞、計數(shù)并裝載到新生物反應器中，6天以后再次收獲。在Quantum中從骨髓抽吸物起始的MultiStem的`擴增速率與在細胞培養(yǎng)塑料上的擴增沒有顯著差異。
[0063]圖7-從骨髓抽吸物起始，有可能在17天內(nèi)建立MultiStem原始細胞庫。
[0064]圖8-圖5的裝置的更詳細方案。
[0065]圖9-具有封閉系統(tǒng)、連續(xù)灌注、中空纖維生物反應器的擴增實施方案的概述。
[0066]圖10-所述產(chǎn)生方法的概述，從分離源自合格供體的細胞到建立原始細胞庫，然后將所述細胞給予患者。
[0067]圖11-建立細胞庫的方法的示意圖。
【具體實施方式】
[0068]應該理解，本發(fā)明不受本文所述的具體操作、方法、試劑等限制，因此這些可以變化。本文使用的術(shù)語只為描述具體的實施方案，不是意欲限制所公開的發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求書限定。
[0069]本文使用的段落標題僅出于組織的目的，而不應被解釋為任何形式的對所述主題的限制。
[0070]除非另外指明，本申請中的方法和技術(shù)通常按本領域公知的常規(guī)方法和本說明書中引用和論述的多種綜合及專業(yè)參考文獻進行。參見，例如，Sambrook et al., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(2001) ；Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates(1992)；和 Harlow and Lane, Antibodies:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1990) o
[0071]
[0072]〃一 〃或〃一個〃在本文中是指一個或多于一個；至少一個。當本文中使用復數(shù)形式時，通常包括單數(shù)形式。
[0073]術(shù)語“生物反應器”是指在封閉無菌的系統(tǒng)中為細胞提供營養(yǎng)物和除去代謝產(chǎn)物，以及提供有益于細胞生長的生理化學環(huán)境的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0074]當用于本文時，術(shù)語“生物反應器”是指在其中在受監(jiān)控和受控制的環(huán)境和操作條件下(例如pH、溫度、壓力、供應營養(yǎng)物和除去廢物)，進行生物和/或生物化學過程的任何裝置。根據(jù)本發(fā)明，適合用于本發(fā)明的生物反應器的基本類別包括中空纖維生物反應器。
[0075]“細胞庫”是為將來使用而培養(yǎng)和儲存的細胞的工業(yè)術(shù)語。細胞可以儲存為小份。它們可以直接從儲存中取用或可以在儲存后擴增。這很方便以至有可用的“現(xiàn)成的”細胞用來給予。所述細胞可以是已儲存在藥用賦形劑中，因此可以直接給予，或者在所述細胞從儲存中釋放時可以和適當?shù)馁x形劑混合。細胞可以是冷凍的或儲存為保留活力的形式。在本發(fā)明的一個實施方案中，建立了細胞庫，其中所述細胞已就增強的對巨噬細胞活化的調(diào)節(jié)進行了選擇。在從儲存釋放后，給予所述受試者之前，優(yōu)選再次測定細胞的效能，即對巨噬細胞活化的調(diào)節(jié)水平。這可以使用本申請描述的或本領域已知的任何直接的或間接的測定來完成。然后，可將具有需要的效能的細胞給予所述受試者用于治療?？梢允褂脕碓从谝委煹膫€體(來自他們出生前組織例如胎盤、臍帶血或臍帶基質(zhì)或在出生后任何時間從所述個體擴增)(自體的)的細胞來建立細胞庫?；蛘?，細胞庫可以含有用于同種異體用途的細胞。原始細胞庫是細胞的貯存器，用于提供可被進一步擴增以提供用于給予受試者的劑量的小份細胞。
[0076]“臨床有意義的”細胞數(shù)是指足以產(chǎn)生臨床反應的細胞數(shù)；產(chǎn)生臨床反應即對受試者中不需要的病理狀態(tài)的預防、減少、改良等。具體的實施方案涉及足以建立原始細胞庫的細胞數(shù)。
[0077]“共給予”是指彼此結(jié)合、一起、配合地給予，包括同時或依次給予兩種或多種試劑。
[0078]在沒有其他限制的情況下，“包含”是指必須包括所述指示物，但不對其他可包括的指示物進行限制或排除。例如，“包含X和y的組合物”涵蓋含有X和y的任何組合物，而不管所述組合物中是否存在其他組分。同樣，“包含步驟X的方法”涵蓋其中進行X (不管X是所述方法中的唯一步驟還是只是步驟之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步驟，也不管X與這些步驟相比多么簡單或復雜?！鞍ā焙褪褂迷~根“含”的類似短語在本文中用作“包含”的同義詞，具有相同的含義。
[0079]“包括”是“包含”的同義詞(見上文)。
[0080]“條件細胞培養(yǎng)基”是本領域公知的術(shù)語，指細胞已在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本文中這是指將細胞培養(yǎng)足夠的時間以分泌可有效地達到本申請中描述的任何效果的因子。
[0081]條件細胞培養(yǎng)基是指細胞已在其中培養(yǎng)從而將因子分泌到所述培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基。出于本發(fā)明的目的，可培養(yǎng)細胞歷經(jīng)足夠數(shù)量的細胞分裂以產(chǎn)生有效量的所述因子，使得所述培養(yǎng)基具有效果?？赏ㄟ^本領域任何已知的方法將細胞從所述培養(yǎng)基中除去，所述方法包括但不限于離心、過濾、免疫耗竭(例如經(jīng)加標簽的抗體和磁性柱)和FACS分選。
[0082]“EC細胞”是從對被稱為畸胎瘤的癌癥類型的分析中發(fā)現(xiàn)的。1964年，研究人員注意到畸胎瘤中的單個細胞可被分離并在培養(yǎng)中保持不分化。這種類型的干細胞被稱為胚胎癌細胞(EC細胞)。
[0083]“有效量”通常指可提供需要的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以實現(xiàn)有益或需要的臨床效果的量。所述有效量可以在單次給藥中一次全部提供，或者以在多次給藥中提供所述有效量的分份形式提供。對什么量會被認為是有效量的準確確定可基于每個受試者的個體因素，包括其身材、年齡、損傷和/或待治療的疾病或損傷以及距損傷發(fā)生或疾病開始的時間。本領域技術(shù)人員能夠基于這些本領域中慣常的考慮確定給予受試者的有效量。當用于本文時，“有效劑量”與“有效量”意義相同。
[0084]“有效途徑”通常是指提供用于將試劑送遞至所需區(qū)室、系統(tǒng)或位置的途徑。例如，有效途徑是給予試劑以在所需的作用位點提供其量足以實現(xiàn)有益或所需的臨床效果的所述試劑的途徑。
[0085]“胚胎干細胞(ESC)”為本領域所熟知并已從多種不同哺乳動物種中制得。胚胎干細胞是源自被稱為胚泡的早期胚胎的內(nèi)細胞團的干細胞。它們能夠分化為三種原胚層:外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的所有衍生物。這些包括成體內(nèi)超過220種細胞類型的每一種。ES細胞可成為體內(nèi)除胎盤外的任何組織。只有桑椹胚細胞是全能性的，能夠成為所有組織和胎盤。類似于ESC的某些細胞可以通過將體細胞核轉(zhuǎn)移到去細胞核的受精卵來產(chǎn)生。
[0086]“擴增”是指輸出細胞的細胞分裂達到臨床有意義的次數(shù)。“臨床有意義”是指在所述纖維內(nèi)和/或所述纖維上實現(xiàn)這些細胞的足夠的細胞倍增，以提供臨床有意義數(shù)目的輸出細胞。中空纖維生物反應器技術(shù)已經(jīng)用于產(chǎn)生臨床有意義數(shù)目的輸出細胞的實際細胞擴增之外的目的。例如，這類生物反應器已經(jīng)用于分化輸入細胞群、濃縮輸入細胞群、通過輸入細胞群處理血液和其他液體 ，等等。在這些實施方案中，與所述纖維相連接的細胞實際上不是輸出細胞。它們粘附在所述纖維上，不是使它們擴增，而是為了不同的目的。然而，在用于達到所述其他目的的時間范圍內(nèi)，一些輸入細胞事實上可以擴增。該情形與本申請的技術(shù)的不同點是，所述細胞擴增沒有達到臨床有意義數(shù)目。細胞倍增是有限的。
[0087]術(shù)語“中空纖維”意欲包括含有尺寸、形狀和密度確定的孔的(任何形狀的)中空結(jié)構(gòu)，其用于將(溶液中的)營養(yǎng)物遞送至生物反應器中的細胞，以及用于從生物反應器中包含的細胞除去(溶液中的)廢料。為了本發(fā)明的目的，中空纖維可由可吸收的材料或不可吸收的材料構(gòu)成。纖維包括但不限于管狀結(jié)構(gòu)。
[0088]使用術(shù)語“包括”并非意圖進行限制。
[0089]“增加”意指在完全沒有預先存在的情況下引入，或者程度增加。
[0090]“誘導的多能干細胞(IPSC或IPS細胞)”是被再編程的體細胞，例如通過引入賦予所述體細胞分化程度較低的表型的外源基因的再編程。然后，這些細胞可被誘導分化為分化程度較低的后代。使用首先在2006年公開的方法的改進方法可獲得IPS細胞(Yamanaka, S.et al., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007))。例如，在一個實例中，為形成 IPS細胞，科學家以皮膚細胞開始，隨后通過用反轉(zhuǎn)錄病毒將基因插入到細胞DNA中的標準實驗室技術(shù)對所述皮膚細胞進行了改良。在一個實例中，所插入的基因為0ct4、SoX2、Lif4和c-myc,這些基因已知作為天然調(diào)控因子一起作用以使細胞保持在與胚胎干細胞相似的狀態(tài)。文獻已對這些細胞進行了描述。參見，例如，Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861(2008);Jaenisch et al., Cell, 132:567-582(2008);Hanna et al.，Cell, 133:250-264(2008);和 Brambrink et al., Cell Stem Cell, 2:151-159 (2008)。這些參考文獻以引用的方式納入以教導IPSC和產(chǎn)生它們的方法。也可通過特定培養(yǎng)條件(暴露于特定試劑)獲得這些細胞。
[0091]“輸入的細胞群”是指被導入生物反應器中的細胞類型，用于擴增該細胞類型并且最終形成輸出細胞群?？梢砸苑浅Ｐ〉牧繉⑤斎爰毎簩氲剿錾锓磻髦小＠?，在骨髓中，需要的輸入細胞群的細胞數(shù)目最初可以低至百萬分之一?；蛘撸鲚斎肴嚎梢允腔旧贤|(zhì)的，例如源自細胞庫并在生物反應器中進一步擴增。
[0092]術(shù)語“分離的”指不與一個或多個細胞結(jié)合的或者不與在體內(nèi)與所述一個細胞或多個細胞結(jié)合的一種或多種細胞組分結(jié)合的一個或多個細胞。“富集群”指需要的細胞相對于體內(nèi)或原代培養(yǎng)物中一種或多種其他細胞類型的數(shù)量上相對增加。
[0093]然而，本文所用的術(shù)語“分離的”不表示僅干細胞的存在情況。而是，術(shù)語“分離的”表示細胞從其天然組織環(huán)境中取出并以相對所述正常組織環(huán)境更高的濃度存在。因此，“分離的”細胞群可進一步包括干細胞以外的細胞類型并可包括其他組織組分。這還可用例如細胞的倍增來表示。細胞可在體外或離體進行10、20、30、40次或更多次的倍增，從而相對其在體內(nèi)或在原始組織環(huán)境(例如骨髓、外周血、脂肪組織等)中的原始數(shù)量被富集。
[0094]“MAPC”是“多能成體祖細胞”的首字母縮略詞。它是指非胚胎干細胞或非生殖細胞、但具有這兩種細胞的某些特征的細胞。MAPC可以以許多替代的描述來表征，每一個描述在被發(fā)現(xiàn)時均賦予所述 細胞以新特征。因此，它們可以用這些描述中的一個或多個來表征。第一，它們無需轉(zhuǎn)化(發(fā)生腫瘤)而具有在培養(yǎng)中長期復制的能力并具有正常核型。第二，它們在分化時可以生成多于一個胚層，例如兩個或全部三個胚層(即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)，的細胞后代。第三，雖然它們不是胚胎干細胞或生殖細胞，但它們可以表達這些原始細胞類型的標志物，因此MAPC可以表達0ct3/4(即0ct3A)、rex_l和rox_l中的一種或多種。它們還可以表達sox-2和SSEA-4中的一種或多種。第四，像干細胞一樣，它們可以自我更新，也就是無需轉(zhuǎn)化而具有長期復制能力。這意味著這些細胞可表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶(即具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性)。因此，以“MAPC”命名的細胞類型可以由通過若干新性質(zhì)描述該細胞的替代的基本特征來表征。
[0095]MAPC中的術(shù)語“成體”是非限制性的。它是指非胚胎體細胞。MAPC核型正常并且在體內(nèi)不形成畸胎瘤。該首字母縮略詞在美國專利N0.7，015，037中首次用于描述從骨髓分離的多能細胞。但是，隨后發(fā)現(xiàn)了具有多能性標志物和/或分化潛能的細胞，為了本發(fā)明的目的，這些細胞可以等價于這些首次被命名為“MAPC”的細胞。MAPC類型細胞的基本描述在上文本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
中提供。
[0096]MAPC 代表比 MSC 更原始的祖細胞群(Verfaillie, CM.，TrendsCell Bioll2: 502-8 (2002) , Jahagirdar，B.N., et a 1., ExpHematol,29:543-56(2001);Reyes,M.and CM.Verfaillie,Ann N Y AcadSci, 938:231-233(2001);Jiang, Y.et al.，Exp Hematol, 30896-904(2002);和 Jiang, Y.etal., Nature, 418:41-9.(2002))。[0097]術(shù)語“Mu丨tiStem?”是基于美國專利N0.7，015，037的MAPC的細胞制品的商品名稱，即如上所述的非胚胎干細胞、非生殖細胞。MultiStem?可按照本專利申請中公開的細胞培養(yǎng)方法制備，特別是低氧和聞血清。MultiStein?是聞度可擴增的、核型正常的，
并且在體內(nèi)不形成畸胎瘤。它可分化成多于一個胚層的細胞譜系并可表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、oct3/4、rex-1 > rox-1 > sox-2 和 SSEA4 的一種或多種。
[0098]術(shù)語“營養(yǎng)液”意欲包括進入生物反應器并且含有培養(yǎng)哺乳動物細胞或脊椎動物細胞所必需的那些營養(yǎng)物質(zhì)的溶液。營養(yǎng)液還可含有添加劑，所述添加劑影響培養(yǎng)的細胞的表型的特定改變，或者促成在形成的新生骨的基質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的改變，例如礦化作用。
[0099]營養(yǎng)物被遞送至生物反應器中的細胞，并可影響所述生物反應器中含有的細胞的生長和分化。選擇所述營養(yǎng)液以在生物反應器中為所述細胞提供足夠的營養(yǎng)物以維持生存力、生長和/或分化。本領域技術(shù)人員能夠為本發(fā)明選擇適當?shù)臓I養(yǎng)液。例如，可使用培養(yǎng)基例如達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)并可進一步補充以其他適合的營養(yǎng)物。其他適合的營養(yǎng)物包括胎牛血清、L-抗壞血酸、-2-磷酸鹽、抗生素、細胞調(diào)節(jié)劑例如地塞米松、β -甘油磷酸、葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸補充物、細胞凋亡的抑制劑(或活化劑)(例如谷胱甘肽乙基酯)、抗氧化劑、半胱天冬酶抑制劑以及陽離子和陰離子例如鎂離子、錳離子、鈣離子、磷酸根離子、氯離子、鈉離子、鉀離子、鋅離子和硫酸根離子以及硝酸鹽和亞硝酸鹽。在所述營養(yǎng)液中的其他組分濃度應該足以促進生物反應器中的生長并維持細胞的生存力。[0100]“輸出細胞群”是指在生物反應器中擴增以后希望從所述生物反應器中收獲的細胞。收獲的細胞被定義為從所述生物反應器中除去的細胞，然后其會被用于臨床目的或其他目的，例如研究、臨床試驗等。
[0101]可培養(yǎng)并刺激“原始胚胎生殖細胞”(PG或EG細胞)以產(chǎn)生很多分化程度較低的細胞類型。
[0102]“祖細胞”是在干細胞分化過程中產(chǎn)生的細胞，其具有它們的最終分化子代的一些、但非全部特性。確定的祖細胞例如“心臟祖細胞”可形成細胞譜系，而不形成具體的或終末分化的細胞類型。首字母縮略詞“MAPC”中使用的術(shù)語“祖”并不將這些細胞限制于具體的細胞譜系。祖細胞可以形成比所述祖細胞分化程度更高的子代細胞。
[0103]可以從組織中的細胞進行選擇。例如，在這種情況下，將細胞從所需的組織中分離、在培養(yǎng)中擴增、就所需的特征進行選擇，并進一步擴增選擇的細胞。
[0104]“自我更新”是指產(chǎn)生復制子代干細胞的能力，所述子代干細胞具有與產(chǎn)生其的親代細胞相同的分化潛能。本文中使用的類似術(shù)語是“增殖”。
[0105]“無血清培養(yǎng)基”是指這樣的培養(yǎng)基，其中沒有血清，或者，如果有的話，血清組分的水平對細胞的生長或變化沒有影響(即實際上是不必要的，例如殘留量或痕量)。
[0106]“干細胞”是指可以進行自我更新(即子代具有相同的分化潛能)并且也可以產(chǎn)生分化潛能更受限的子代細胞的細胞。在本發(fā)明的上下文中，干細胞還可以涵蓋分化程度更高的細胞，其已經(jīng)通過例如以下方式去分化:通過核轉(zhuǎn)移、通過與更原始的干細胞融合、通過導入特定的轉(zhuǎn)錄因子或者通過在特定條件下培養(yǎng)。參見，例如，Wilmut et al.,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al., Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.，Cell, 126:663-676(2006);Okita etal., Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.，Cell, 131:861-872(2007)。
[0107]去分化還可以通過給予一些化合物或在體內(nèi)或體外暴露于可以引起去分化的物理環(huán)境而引起。干細胞還可以來自異常組織，例如畸胎癌和一些其他來源，例如胚狀體(盡管這些可被認為是胚胎干細胞，因為它們來自胚胎組織，盡管不是直接來自于內(nèi)細胞團)。干細胞還可以通過將與干細胞功能相關的基因?qū)敕歉杉毎缯T導的多能干細胞中而產(chǎn)生。
[0108]“受試者”是指脊椎動物，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于人、狗、貓、馬、牛和豬。
[0109]術(shù)語“廢液”意欲包括流出生物反應器并含有細胞代謝的廢棄副產(chǎn)物的溶液。所述廢液中的廢棄副產(chǎn)物(例如氨、乳酸等)的濃度和營養(yǎng)物(例如葡萄糖)的殘留水平可用于評估培養(yǎng)在生物反應器中的細胞的代謝活性水平。
[0110]生物反應器
[0111]生物反應器，特別是用于組織再生過程的生物反應器，是眾所周知的。見，例如U.S.6，306，169 ;6，197，575 ;6，080，581 ;5，677，355 ;5，433，909 ;5，898，040，所有上述以引用的方式納入本文。
[0112]生物反應器是廣義的術(shù)語，其基本上涵蓋了能夠孵育細胞同時為所述細胞的環(huán)境提供一定程度保護的任何種類的容器。生物反應器可為靜態(tài)容器例如燒瓶或培養(yǎng)袋，其中的變量(例如生長培養(yǎng)基的組成、氧氣濃度、PH水平和滲透壓)非完全受到控制和監(jiān)控。另一方面，有完全自動化的機電工藝水平的生物反應器，其中的所有變量被監(jiān)控且可控制。這些實例之間的許多相互結(jié)合是細胞生物【技術(shù)領域】的普通技術(shù)人員所熟知的。
[0113]在文獻中已經(jīng)描述了用于培養(yǎng)分離的造血干細胞或祖細胞的三種不同的傳統(tǒng)方法:靜態(tài)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)和固定培養(yǎng)。靜態(tài)培養(yǎng)在非常簡單的培養(yǎng)系統(tǒng)例如孔板、組織培養(yǎng)瓶或透氣的培養(yǎng)袋中進行。因為所述孔板和組織培養(yǎng)瓶不能以臨床規(guī)模進行細胞培養(yǎng)，透氣的培養(yǎng)袋實際上是最常使用的用于干細胞擴增的技術(shù)(Purdy et al.，J Hematother,4:515-525(1995);McNiece et al., Hematol Cell Ther, 4:82-86(1999);和 McNiece etal., Exp Hematol, 28:1181-1186 (2000a))。所有這些系統(tǒng)的優(yōu)勢為容易操作且為一次性裝置，這使得細胞收獲不復雜。然而，使用所有這些系統(tǒng)時，通過控制培養(yǎng)箱環(huán)境來進行過程控制調(diào)節(jié)，也不供應連續(xù)進料。因此，在所有三種靜態(tài)培養(yǎng)的方法中，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件的改變(例如氧張力、pH、底物、代謝產(chǎn)物和細胞因子濃度)是關鍵因素。
[0114]攪拌生物反應器通常用于動物細胞培養(yǎng)，其提供同質(zhì)的環(huán)境、有代表性的取樣、更容易進行過程控制和增加的氧氣傳遞。幾種攪拌技術(shù)(旋轉(zhuǎn)燒瓶和攪拌容器生物反應器)已經(jīng)成功應用于造血細胞的培養(yǎng)(Zandstra et al.，Biotechnol, 12:909-914 (1994))。
[0115]干細胞和祖細胞的固定是在不使用間充質(zhì)飼養(yǎng)層的情況下，嘗試達到局部高細胞密度并模仿組織(例如骨髓)的三維結(jié)構(gòu)。在固定化生物催化劑反應器中，所述細胞可被固定在載體內(nèi)或載體上，通過互相之間的連接以形成更大顆粒來固定，或限制在膜屏障內(nèi)。大多數(shù)所述反應器可以以分批、分批補料或連續(xù)方式運行。固定化生物反應器在本領域是熟知的，例如常規(guī)的反應器，例如連續(xù)攪拌釜反應器(CSTR)和填充床反應器(PBR),如標準教科書例如 Ullmann’s Encyclopedia Of Industrial Chemistry:Fifthedition, T.Campbell, R.Pfefferkom and J.F.Rounsaville Eds, VCH Publishersl985, VolA4,pp141-170;Ullmanni s Encyclopedia Of Industrial Chemistry:Fifth ed.,B.Elvers,S.Hawkins and G.Schulz Eds,VCH Publishers,1992, Vol B4，pp381_433;J.B.Butt^Reaction Kinetics And Reactor Design〃Prentice_Hall，Inc.，1980，ppl85_241所描述。
[0116]因此，可根據(jù)一般的分類將生物反應器進行分組，包括:靜態(tài)生物反應器、攪拌燒瓶(flask)生物反應器、旋轉(zhuǎn)壁容器生物反應器、中空纖維生物反應器和直接灌注式生物反應器。在所述生物反應器內(nèi)，細胞可為游離的或被固定、接種在多孔三維支架(水凝膠)上。
[0117]中空纖維生物反應器可用于增強培養(yǎng)過程中的物質(zhì)傳遞。因而，對于本發(fā)明，所述生物反應器是中空纖維生物反應器。中空纖維生物反應器可具有裝入所述纖維的腔中的干細胞和/或祖細胞，同時培養(yǎng)基灌注于腔外空間，或者可穿過所述中空纖維提供氣體和培養(yǎng)基灌注，同時細胞在腔外空間中生長。如本文所述已經(jīng)公開了適合本發(fā)明的這種中空纖維生物反應器，并且一些可商購，例如Caridian(Terumo)BCT Quantum Cell ExpansionSystem。
[0118]生物反應器定義為任何可提供細胞的生理需求(例如pH、溫度、壓力、營養(yǎng)物、供給和廢物除去)用于細胞和其產(chǎn)物的標準生產(chǎn)的裝置。生物反應器可增強用于細胞增殖的工程生物反應器中的物質(zhì)傳遞。存在連續(xù)的細胞營養(yǎng)物，并去除廢物。對于細胞的自體給予，生物反應器應為相對緊湊的、一次性的和經(jīng)濟的。通常，需要大的腔/體積的比率。最后，為了使細胞保持特定的分化狀態(tài)，可需要生長因子或血清組分，并且因此需要攜帶介質(zhì)的生物反應器。Antwiler等描述的基于中空纖維生物反應器的細胞擴增系統(tǒng)滿足了這些需求。
[0119]在Antwiler等描述的裝置中，所述系統(tǒng)提供約120ml的腔生長體積，但可以提供更大的腔體積。提供了 1.7m2的表面積用于生長。因而，附著的細胞和懸浮細胞都可在這個裝置中生長，包括共培養(yǎng)。其他物理特征是長度295mm ;內(nèi)徑215 μ m ;IC容積104ml ;EC容積330ml ;纖維數(shù)目9000。對于附著的細胞可以使用纖連蛋白作為包被層。所述裝置可維持培養(yǎng)目的細胞的所有所需實驗條件，例如氣體濃度、pH、培養(yǎng)基、溫度、對營養(yǎng)物、廢物和所需添加劑的管理。為了防止污染，所述系統(tǒng)被設計成具有封閉的無菌的流體區(qū)室。數(shù)袋培養(yǎng)基試劑和溶液與所述系統(tǒng)相連，使得可根據(jù)需要替換、控制和優(yōu)化進料計劃、廢物除去和總的細胞培養(yǎng)環(huán)境。所述裝置可用在工作臺上(bench top)。細胞可生長在所述纖維的內(nèi)部(毛細管內(nèi))、外部(毛細管外)或同時在所述纖維的內(nèi)部和外部。這個中空纖維生物反應器的設計使得能夠使用管道來直接連接，以獲得封閉的系統(tǒng)，所述管道通過適當?shù)娜鋭颖?、夾管閥等確定路線。使用中空纖維氧合器來管理氣體控制。所述系統(tǒng)還提供添加和收獲細胞、置換培養(yǎng)基和添加試劑等的能力。因而，袋子用于所有流體，并且所述袋子連接全部使用無菌連接技術(shù)。示意圖見圖4。
[0120]在本申請中的示例性實施方案(實施例1)中，所述連續(xù)流動生物反應器具有184ml的內(nèi)部流體容積和303ml的外部流體容積，含有1.1 X IO4根中空纖維，所述中空纖維具有約2.1m2 (3255in2)的總表面積(毛細管內(nèi))，50 μ m的壁厚度，215 μ m的內(nèi)徑和295mm的長度?？讖骄哂?6kDa的截留用于通過組分。
[0121]所述中空纖維應適用于所述生物反應器中營養(yǎng)物的遞送和廢物的除去。所述中空纖維可為任何形狀，例如，它們可為圓形和管狀或者為同心環(huán)的形式。所述中空纖維可由可吸收的或不可吸收的膜制造。例如，適合的中空纖維的組分包括聚二噁烷酮、多乳酸化合物、羥基乳酸聚合物、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/三亞甲基碳酸酯、纖維素、甲基纖維素、纖維素聚合物、纖維素酯、再生纖維素、普流尼克(pluixmic)、膠原、彈性蛋白及其混合物。許多種適合的材料在本領域中是眾所周知的，并且由眾多文獻描述。這些材料的實例已經(jīng)在美國專利 4，220，725 ;4，184，922 ;4，200，689 ;3，821，087 ;3，883，393 ;4，184，922 ；4，200，689 ;3，997，396 ;4，220，725 ;4，999，298 ;4，804，628 ;5，126，238 ;5，656，421 ；5，162，225 ;5，622，857 ;5，627，070 ;6，001，585 ;6，911，201 ;6，933，144 ;7，534，609;和美國公開文本 2007/0298497 ；2008/0220523 ；2001/0044413 ；2009/0196901 ；2010/0233130 ；2009/0191631 ； 2005/0032218 ；2005/0003530 ；2003/0224510 ；2006/020507 I ；2010/0267134 ；2008/0206733 ；2010/0209403 ；2008/02 13894 ；2008/0220522 ；2008/0227190 ；2008/0248572 ；2008/0254533 ；2010/0144037 ;和 2010/0042260 中描述，所有上述文獻以引用的方式納入本文用于教導這些材料。用于壁材料的標準包括但不限于以下:對細胞無毒；是多孔的，用于除去廢物和接納營養(yǎng)物，以及在需要收集由細胞分泌的組分時可針對該參數(shù)調(diào)整孔隙度；對溫度變化相對不敏感，即是熱穩(wěn)定的；能夠保持形狀完整性。
[0122]還已知，這類材料對細胞是不可透過的，但對多種所需的物質(zhì)是可透過的。因而，所述中空纖維包括孔以使得營養(yǎng)物和廢物通過其進出。所述中空纖維的孔的直徑足以允許分子從所述中空纖維的一側(cè)擴散到所述中空纖維的另一側(cè)。優(yōu)選地，可以通過所述中空纖維孔的分子為約0.002-約50kDa，更優(yōu)選約5-約25kDa，或最優(yōu)選約2-約16kDa。因此，所述纖維壁的孔尺寸可根據(jù)需要通過所述壁的組分而改變。例如，孔尺寸可允許僅小分子通過，或者可能更大以允許大的蛋白質(zhì)分子(包括生長因子(包括但不限于，表皮生長因子和血小板衍生生長因子))通過。本領域普通技術(shù)人員會理解如何根據(jù)需要通過所述纖維壁到達所述細胞或從所述細胞帶走物質(zhì)的組分來改變所述孔尺寸。例如，可能需要收集由細胞產(chǎn)生的組分以備后用。例如，所述細胞可表達和分泌細胞因子、生長因子、免疫調(diào)節(jié)因子和其他有其他用途的組分?？蓮乃黾毎麕ё叩奈镔|(zhì)`還包括需要從所述細胞除去的廢物。因此，該技術(shù)可用于產(chǎn)生含有有用組分的被所述細胞條件化的培養(yǎng)基。
[0123]存在許多生物反應器構(gòu)造用于培養(yǎng)附著依賴性細胞，例如本發(fā)明的那些細胞。但是，本發(fā)明不依賴任何具體構(gòu)造。美國公開文本N0.2007/0298497提供了一個實例，其公開了一種已經(jīng)用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的構(gòu)造。
[0124]U.S.2007/0298497中的一個實例(不意欲進行限制)是在圖2示出的中空纖維生物反應器?？捎糜诒景l(fā)明的細胞擴增模塊或生物反應器10由包在殼體14中的一束中空纖維膜12構(gòu)成。所述中空纖維束總體稱作膜。所述殼體或模塊14形狀可為筒狀，并且可由任何類型的生物相容的聚合材料制造。
[0125]使用端蓋或頂蓋16、18封閉模塊14的每個末端。端蓋16、18可由任何適合的材料(例如聚碳酸酯)制造，只要所述材料與生物反應器中培養(yǎng)的細胞是生物相容的。
[0126]可有至少4個通道進出所述模塊。兩個通道與毛細管外空間(EC空間)流體相連，一個通道34用于使新鮮的毛細管外培養(yǎng)基進入所述中空纖維周圍的空間，一個通道44用于使用過的毛細管外培養(yǎng)基流出所述模塊。兩個通道還與毛細管內(nèi)空間(IC空間)流體相連，一個通道26用于使新鮮的毛細管內(nèi)培養(yǎng)基進入所述中空纖維的腔內(nèi)和用于導入待擴增的細胞，一個通道42用于使用過的毛細管內(nèi)培養(yǎng)基流出以及從生物反應器移出擴增的細胞。
[0127]生物反應器中待擴增的細胞可流入所述IC空間或EC空間。所述生物反應器可使用注射器裝載細胞或者可以直接從細胞分離器將細胞分布于所述IC空間或EC空間中。還可以從可無菌接入生物反應器的細胞輸入袋或燒瓶(顯示為元件5)將細胞導入所述培養(yǎng)模塊或生物反應器中。
[0128]在一個實施方案中，可使用的中空纖維壁材料包括但不限于兩種類型:以商品名Desmopan.RTM (可購自 Bayer MaterialScience AG, DE)銷售的 0.5% 熱塑性聚氨酯，以及商品名為Polyflux.RTM.的具有Polyamix.RTM膜(聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物)的透析膜(可購自 Gambro Dialysatoren, GmBH, Hechingen, Del.) (Hoenich, etal.(2000)ASAIO J.，46:70-75，其以引用的方式納入本文)。 [0129]U.S.2008/0220523提供了一種細胞擴增系統(tǒng)和使用所述系統(tǒng)的方法，在一個具體的實施方案中，所述系統(tǒng)適用于培養(yǎng)如本文所述的細胞。所述細胞擴增系統(tǒng)通常包括中空纖維細胞生長腔以及分別與中空纖維的內(nèi)部和中空纖維的外部相連接的第一和第二循環(huán)回路(毛細管內(nèi)回路和毛細管外回路)。還提供了可拆卸的流動回路和擴增細胞的方法。所述細胞生長腔如下所述并也示出于圖3。
[0130]細朐牛長脖(U.S.2008/0220523)
[0131]所述細胞擴增系統(tǒng)的細胞生長腔通常包括包含多根半透性的中空纖維的中空纖維膜，所述中空纖維膜分隔出第一和第二流體循環(huán)通路。
[0132]示例性細胞生長腔在圖3中描繪，圖3描繪了中空纖維細胞生長腔200的剖切側(cè)視圖。細胞生長腔200由細胞生長腔殼體202圍成。細胞生長腔殼體202還包括4個開口或通道:入口通道204、出口通道206、入口通道208和出口通道210。
[0133]在所述第一循環(huán)通路中的流體通過入口通道204進入細胞生長腔200，進入并通過多根中空纖維的毛細管內(nèi)側(cè)(在多個實施方案中稱作中空纖維膜的毛細管內(nèi)(“1C”)側(cè)或“1C空間”)，通過出口通道206流出細胞生長腔200。術(shù)語“中空纖維”、“中空纖維毛細管”和“毛細管”可互換使用。多根中空纖維總體稱作“膜”。所述第二循環(huán)通路中的流體經(jīng)過入口通道208流入所述細胞生長腔，與所述中空纖維的外部(稱作所述膜的“EC側(cè)”或“EC空間”)接觸，然后經(jīng)過出口通道210流出細胞生長腔200。細胞可包含在所述第一循環(huán)通路或第二循環(huán)通路中，并且可在所述膜的IC側(cè)或EC側(cè)。
[0134]雖然將細胞生長腔殼體202描繪成形狀為筒狀，但其可具有本領域已知的任何其他形狀。細胞生長腔殼體202可由任何類型的生物相容性的聚合材料制造。多種其他的細胞生長腔殼體可在形狀和尺寸上有差異。
[0135]本領域技術(shù)人員會認識到，術(shù)語“細胞生長腔”不意指細胞擴增系統(tǒng)中培養(yǎng)或擴增的所有細胞都在所述細胞生長腔中培養(yǎng)。附著的細胞可粘附到排列在所述生長腔中的膜上，或可在相連接的管道中生長。也可培養(yǎng)非附著細胞(也稱為“懸浮細胞”)?？蓪⒓毎囵B(yǎng)在所述第一或第二流體循環(huán)通路中的其他區(qū)域。
[0136]例如，可通過連接材料(在本文中也稱為“鑄封劑”或“鑄封材料”)將中空纖維212的末端鑄封到所述細胞生長腔的側(cè)面。所述鑄封劑可為用于粘合中空纖維212的任何合適的材料，條件是培養(yǎng)基和細胞流入所述中空纖維時不阻塞的并且經(jīng)過所述IC入口通道流入所述細胞生長腔的液體僅流入所述中空纖維。示例性鑄封材料包括但不限于聚氨酯或其他合適的粘合或膠粘組分。在多個實施方案中，可在每個末端通過垂直于所述中空纖維的中心軸線將所述中空纖維和鑄封劑切通，以允許流體流入和流出所述IC側(cè)。端蓋214和216排列在所述細胞生長腔的末端。
[0137]經(jīng)入口通道208進入細胞生長腔200的流體與中空纖維的外側(cè)接觸。所述中空纖維細胞生長腔的這個部分稱為“毛細管外(EC)空間”。小分子(例如水、氧氣、乳酸鹽等)可穿過所述中空纖維從所述中空纖維的內(nèi)部擴散到所述EC空間，或從所述EC空間擴散到所述IC空間。通常大分子量的分子太大而不能穿過所述中空纖維，并保留在所述中空纖維的IC空間中。所述培養(yǎng)基可根據(jù)需要替換。也可根據(jù)需要將培養(yǎng)基循環(huán)通過氧合器以交換氣體。
[0138]在多個實施方案中，可通過多種方法的任何一種(包括通過注射器)將細胞裝載入所述中空纖維中。還可將細胞從可與所述細胞生長腔流體連接的流體容器(例如袋)中導入所述細胞生長腔中。
[0139]配置中空纖維以允許細胞在所述纖維的毛細管內(nèi)空間內(nèi)(即在所述中空纖維腔內(nèi))生長。中空纖維足夠大以允許細胞粘附在所述腔內(nèi)，而基本不阻礙培養(yǎng)基流過所述中空纖維腔。在多個實施方案中，所述中空纖維的內(nèi)徑可大于或等于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250,200,150或100微米。同樣，所述中空纖維的外徑可少于或等于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100微米。所述中空纖維壁的厚度足以允許小分子的擴散。
[0140]任何數(shù)目的中空纖維可用于細胞生長腔中，條件是所述中空纖維可以與所述細胞生長腔的入口和出口通道流體連接。在多個實施方案中，所述細胞生長腔可包括許多大于或等于 1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000 或 12000 的中空纖維。在其他實施方案中，所述細胞生長腔可包括許多少于或等于12000、11000、10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000或2000的中空纖維。在其他多個實施方案中，所述中空纖維的長度可大于或等于100、200、300、400、500、600、700、800或900毫米。在某些實施方案中，所述細胞生長腔含有約9000根具有295mm的平均長度、215微米的平均內(nèi)徑和315微米的平均外徑的中空纖維。
[0141]中空纖維可以用能夠形成以下尺寸的任何材料構(gòu)造，所述尺寸足以形成能夠?qū)⒁后w從所述細胞生長腔入口通道運送到所述細胞生長腔出口通道的纖維。在多個實施方案中，所述中空纖維可由能夠結(jié)合某些類型的細胞(例如附著干細胞)的塑料粘附材料構(gòu)造。在多個其他實施方案中，可用化合物(例如纖連蛋白)處理中空纖維以形成粘附表面。
[0142]在某些實施方案中，所述中空纖維可由半透的生物相容的聚合材料制造?？墒褂玫囊环N這類聚合材料是聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物(“PA/PAES/PVP”)。所述半透膜允許營養(yǎng)物、廢物和溶解的氣體轉(zhuǎn)移穿過所述EC空間和IC空間之間的膜。在多個實施方案中，選擇所述中`空纖維膜的分子轉(zhuǎn)移特性，以使細胞生長所必需的昂貴試劑(例如生長因子、細胞因子等)從所述中空纖維的損失最小化，同時使代謝廢物穿過所述膜擴散進所述中空纖維腔側(cè)以被除去。[0143]在某些變化中，每個PA/PAES/PVP中空纖維的一個外層的特征為具有確定的表面粗糙度的同質(zhì)開孔結(jié)構(gòu)。所述孔的開口在0.5-3 μ m的尺寸范圍內(nèi)，并且所述纖維的外表面上的孔的數(shù)目在10000-150000個孔/mm2的范圍內(nèi)。該外層具有約1_10 μ m的厚度。每個中空纖維的下一層為具有海綿狀結(jié)構(gòu)的形式的第二層，在另一實施方案中其具有約1-15 μ m的厚度。該第二層作為所述外層的支持物。緊鄰所述第二層的第三層具有手指狀結(jié)構(gòu)的形式。該第三層提供機械穩(wěn)定性和高空隙體積，所述高空隙體積使所述膜具有非常低的阻力以運送分子通過所述膜。在使用過程中，所述手指狀空隙充滿流體，并且所述流體與使用具有更低空隙體積的海綿填充結(jié)構(gòu)的基質(zhì)相比，賦予了更低的阻力用于擴散和對流。該第三層具有20-60 μ m的厚度。
[0144]在另外的實施方案中，所述中空纖維膜可包括65-95重量％的至少一種疏水性聚合物和5-35重量％的至少一種親水性聚合物。所述疏水性聚合物可選自:聚酰胺(PA)、聚芳基酰胺(PAA)、聚芳基醚砜(PAES)、聚醚砜(PES)、聚砜(PSU)、聚芳砜(PASU)、聚碳酸酯(PC)、聚醚、聚氨酯(I3UR)、聚醚酰亞胺和任何上述聚合物的共聚物混合物，例如聚醚砜或聚芳基醚砜和聚酰胺的混合物。在其他實施方案中，所述親水性聚合物可選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇單酯、水溶性纖維素衍生物、聚山梨酯和聚環(huán)氧乙烷聚環(huán)氧丙烷共聚物(polyethylene-polypropylene oxide copolymer)。
[0145]根據(jù)待在所述細胞生長腔中擴增的細胞的類型，可以以物質(zhì)(例如纖連蛋白)處理所述聚合纖維，以增強細胞生長和/或細胞與所述膜的粘附。[0146]U.S.2008/0220523和U.S.2008/0248572中還有其他詳細的反應器實施方案的示例，包括詳細的流程圖方法。例如，這些不同的實施方案可見于U.S.2008/0220523的圖1B、1C和1D。所述流程圖方法示于圖1D。任何這些均適合于實施本發(fā)明。還可查閱U.S.2008/0220522中公開的實施方案。該文獻的全文因為公開了這些實施方案而以引用的方式納入本文，用于與本發(fā)明的細胞一起使用。
[0147]W0/2010/034468提供了另一示例性裝置，所述裝置包括由安裝在外殼內(nèi)的半透膜分開的兩個區(qū)室，第一內(nèi)部區(qū)室安裝有兩個通路(access)，第二外部區(qū)室包括一個或兩個通路，兩個區(qū)室還被基于適當?shù)哪z粘劑化合物的鑄封化合物分開，意欲形成適用的(i )分開所述裝置的兩個區(qū)室的圓柱狀隔板，其含有如上定義的中空纖維束類型的半透膜或(ii)所述裝置中的密封層，其包括如上文定義的薄層膜類型的半透膜。
[0148]另一示例性裝置包含多根中空纖維膜，其包含在外殼中，其被配置使得所述中空纖維外空間(即毛細管外區(qū)室)內(nèi)的流體與通過所述中空纖維及其相應孔口的流體分開。此外，所述裝置包括在所述裝置的相對末端的外殼內(nèi)的兩個多支管末端腔(manifold endchamber).中空纖維的兩個孔口的每個與不同的末端腔相連。所述末端腔和所述毛細管外區(qū)室由所述中空纖維的半透膜分開。在一定程度上，可通過中空纖維膜的截留分子量或孔尺寸控制所述毛細管外區(qū)室內(nèi)的組成。
[0149]在操作所述裝置的一種模式中，將細胞培養(yǎng)在所述毛細管外區(qū)室中，而使營養(yǎng)培養(yǎng)基通過所述中空纖維。在操作所述裝置的另一種模式中，將細胞培養(yǎng)在所述中空纖維的毛細管內(nèi)空間(即內(nèi)腔)中，而使營養(yǎng)培養(yǎng)基通過所述毛細管外區(qū)室和/或所述毛細管內(nèi)區(qū)室。所述中空纖維的半透特性允許營養(yǎng)物和細胞廢物通過所述中空纖維的壁，而阻攔細胞通過。[0150]殼管式生物反應器提供了幾種優(yōu)勢。對于附著的細胞，若干中空纖維的使用在相對小的容積內(nèi)提供了其上可生長細胞的巨大表面積。這種巨大表面積還有助于營養(yǎng)培養(yǎng)基集中分布于所述生長的細胞，并使得容易地收集細胞廢物。與其他細胞培養(yǎng)裝置可能達到的相比，殼管式生物反應器使細胞在更高密度下生長。它們可支持大于IO8個細胞/毫升的細胞密度，而其他細胞培養(yǎng)裝置通常限于約IO6個細胞/毫升的密度。
[0151]干細朐
[0152]本發(fā)明可以優(yōu)選地使用脊椎動物物種的干細胞進行，所述脊椎動物物種例如人、非人靈長類、馴養(yǎng)動物、家畜和其他非人哺乳動物。這些包括但不限于下文所述的那些細胞。
[0153]胚胎干細胞
[0154]研究最透徹的干細胞是胚胎干細胞(ESC)，因為它具有無限的自我更新和多能分化潛能。這些細胞可以源自胚泡的內(nèi)細胞團，或者可以源自植入后胚胎的原始生殖細胞(胚胎生殖細胞或EG細胞)。ES和EG細胞最初是從小鼠中得到，之后從很多不同的動物中得到，最近還從非人靈長類和人中得到。當ESC被導入小鼠胚泡或者其他動物的胚泡中時，ESC可以成為所述動物的所有組織。ES和EG細胞可通過用抗SSEAl (小鼠)和SSEA4 (人)的抗體陽性染色來鑒別。參見，例如，美國專利 N0.5，453，357,5, 656，479,5, 670，372,5, 843，780、5，874，301、5，914，268、6，110，739、6，190，910、6，200，806、6，432，711,6, 436，701、6，500，668,6, 703，279,6, 875，607,7, 029，913,7, 112，437,7, 145，057,7, 153，684 和7，294，508，其各自以引用的方式納入本文，用于教導胚胎干細胞以及制備和擴增胚胎干細胞的方法。因此，ESC及其分離和制備方法是本領域中公知的。
[0155]已經(jīng)鑒定了許多影響胚胎干細胞在體內(nèi)的效能狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子和外源性細胞因子。被描述涉及干細胞多能性的首個轉(zhuǎn)錄因子是0ct4。0ct4屬于POU (Pit-Oct-Unc)轉(zhuǎn)錄因子家族，是能夠活化基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白，在啟動子或增強子區(qū)域內(nèi)包含被稱為“八聚體基序”的八聚序列。0ct4在受精卵的分裂期時表達，直到卵圓柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化誘導基因(即FoxaD3、hCG)、活化促進多能性的基因(FGF4、UtfU RexD0
Sox2-高遷移率族(high mobility group, HMG)盒轉(zhuǎn)錄因子的成員-與0ct4協(xié)作活
化內(nèi)細胞團中表達的基因的轉(zhuǎn)錄。0ct3/4在胚胎干細胞中的表達維持在某些水平之間是必要的。0ct4表達水平>50%的過表達或者下調(diào)將改變胚胎干細胞命運，分別為形成原始內(nèi)胚層/中胚層或滋養(yǎng)外胚層。在體內(nèi)，0ct4缺陷的胚胎可發(fā)育至胚泡期，但是內(nèi)細胞團細胞不是多能的。相反，它們沿著胚胎外滋養(yǎng)層譜系分化。Sall4——一種哺乳動物Spalt轉(zhuǎn)錄因子一是0ct4的上調(diào)調(diào)節(jié)子，因此對于在胚胎早期維持合適的0ct4水平是重要的。當Sall4水平下降至低于某一閾值時，滋養(yǎng)外胚層細胞將異位擴增至內(nèi)細胞團中。多能性所需要的另一個轉(zhuǎn)錄因子是Nanog,是以Celtic部族“Tir Nan 0g”:永遠年輕的土地,命名的。在體內(nèi)，Nanog從致密桑葚胚期表達，之后被限制在內(nèi)細胞團中，并且在植入期下調(diào)。Nanog的下調(diào)對于在原腸胚形成過程中避免多能細胞的不受控擴增和允許多向分化可能是重要的。第5.5天分離的Nanog無效胚胎由無序胚泡構(gòu)成，主要包含胚胎外內(nèi)胚層和無法辨認的上胚層。
[0156]非胚胎干細胞
[0157]已在大部分組織中鑒別到干細胞?？赡茏钋宄碚鞯氖窃煅杉毎?HSC)。HSC是來自中胚層的細胞，其可以使用細胞表面標志物和功能特性來純化。它們已經(jīng)被從骨髓、外周血、臍帶血、胎肝和卵黃囊中分離到。它們起始造血作用并且產(chǎn)生多種造血譜系。當它們被移植進入致死量放射線照射的動物中時，它們能夠再造紅系嗜中性粒細胞-巨噬細胞(erythroid neutrophiΙ-macrophage)>巨核細胞和淋巴造血細胞庫。它們還能被誘導進行一些自我更新的細胞分裂。參見，例如，美國專利N0.5，635，387,5, 460，964,5, 677，136、5，750，397,5, 681，599和5，716，827。美國專利N0.5，192，553報道了用于分離人新生兒或胎兒造血細胞或祖細胞的方法。美國專利N0.5，716，827報道了作為Thy-祖細胞的人造血細胞，以及在體外再生它們的合適生長培養(yǎng)基。美國專利N0.5，635，387報道了一種用于培養(yǎng)人造血細胞和它們的前體的方法和裝置。美國專利N0.6，015，554描述了一種重建人淋巴和樹突細胞的方法。因此，HSC及其分離和擴增方法是本領域中公知的。 [0158]本領域熟知的另一種干細胞是神經(jīng)干細胞(NSC)。這些細胞可在體內(nèi)增殖并且連續(xù)地再生至少一些神經(jīng)元細胞。當離體培養(yǎng)時，神經(jīng)干細胞可被誘導增殖以及分化為不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。當神經(jīng)干細胞被移植至腦時，其能夠植入并且產(chǎn)生神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。參見，例如Gage F.H.，Science, 287:1433-1438(2000)
,Svendsen S.N.et al,Brain Pathology,9:499-513 (1999),和 Okabe S.et al., MechDevelopment, 59:89-102 (1996)。U.S.5，851，832報道了從腦組織中得到的多能神經(jīng)干細胞。U.S.5，766，948報道了由新生兒大腦半球產(chǎn)生神經(jīng)母細胞。U.S.5，564，183和5，849，553報道了哺乳動物神經(jīng)嵴干細胞的用途。U.S.6，040, 180報道了在體外由哺乳動物多能CNS干細胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生分化的神經(jīng)元。W098/50526和W099/01159報道了神經(jīng)上皮干細胞、少突星型膠質(zhì)細胞前體和譜系受限的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離。U.S.5，968，829報道了從胚胎前腦得到的神經(jīng)干細胞。因此，神經(jīng)干細胞及其制備和擴增方法是本領域熟知的。
[0159]本領域已經(jīng)大量研究的另一種干細胞是間充質(zhì)干細胞(MSC)。MSC來自于胚胎中胚層，可從多種來源分離，包括成體骨髓、外周血、脂肪、胎盤、臍帶血等。MSC能夠分化成為很多中胚層組織，包括肌肉、骨、軟骨、脂肪和腱。關于這些細胞有大量的文獻。參見，例如，U.S.5，486，389,5, 827，735,5, 811，094,5, 736，396,5, 837，539,5, 837，670 和 5，827，740。還參見 Pittenger, M.et al, Science, 284:143-147 (1999)。
[0160]成體干細胞的另一個實例是脂肪來源的成體干細胞(ADSC)，其通常已被通過以下方式從脂肪分離:吸脂術(shù)，之后使用膠原酶釋放ADSC。ADSC在很多方面類似于源自骨髓的MSC，不同的是能夠從脂肪中分離更多細胞。已經(jīng)報道這些細胞可以分化成為骨、脂肪、肌肉、軟骨和神經(jīng)元。U.S.2005/0153442描述了一種分離方法。
[0161]本領域已知的其他干細胞包括胃腸干細胞、表皮干細胞和肝臟干細胞，其也被稱作“卵形細胞”(Potten, C.，et al., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998), Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997);Alison et al., Hepatology, 29:678-683(1998))。
[0162]據(jù)報道能夠分化成為超過一種胚胎胚層的細胞類型的其他非胚胎細胞包括但不限于來自臍帶血的細胞(參見美國公布文本N0.2002/0164794)、來自胎盤的細胞(參見美國公布文本N0.2003/0181269)、來自臍帶基質(zhì)的細胞(Mitchell, K.E.et al., StemCells, 21:50-60(2003))、來自小胚胎樣干細胞的細胞(Kucia，M.et al., J PhysiolPharmacol, 57Suppl5:5-18 (2006))、來自羊水干細胞的細胞(Atala, A., J TissueRegen Med, 1:83-96 (2007))、來自皮膚來源的前體的細胞(Toma et al., Nat CellBiol, 3:778-784(2001))和來自骨髓的細胞(參見美國公布文本N0.2003/0059414和2006/0147246)，其各自因?qū)@些細胞的教導以引用的方式納入本文。
[0163]重編程體細胞的方法
[0164]已經(jīng)使用了一些不同的策略，例如核移植、細胞融合和培養(yǎng)誘導的重編程，來誘導分化的細胞轉(zhuǎn)化為胚胎狀態(tài)。核移植包括將體細胞核注射進入去核卵母細胞，其當起被移植進入代理母親時，可以形成克隆(“生殖性克隆”)，或者當在培養(yǎng)中擴增時，可以形成遺傳匹配的胚胎干(ES)細胞(“體細胞核移植”，SCNT)。體細胞與ES細胞的細胞融合致使產(chǎn)生顯示多能ES細胞的全部特性的雜合體。培養(yǎng)中的體細胞外植可選擇用于可以是多能(pluripotent or multipotent)的無限繁殖細胞系。目前,精原細胞干細胞是可衍生自出生后動物的多能細胞的唯一來源。用規(guī)定的因子轉(zhuǎn)導體細胞可以起始重編程至多能狀態(tài)。對這些實驗方法有大量綜述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067 (2006)and Yamanaka, S., Cell Stem Cell, 1:39-49(2007))。
[0165]核移棺
[0166]核移植(NT)，也被稱作體細胞核移植(SCNT)，是指將來自供體體細胞的核導入去核卵母細胞以產(chǎn)生克隆動物，例如多莉羊(ffilmut et al.，Nature, 385:810-813 (1997))。通過NT產(chǎn)生活的動物證明了體細胞的表觀遺傳狀態(tài)，包括終末分化的細胞的表觀遺傳狀態(tài)，盡管穩(wěn)定，不是不可逆地固定的，而是可以重編程至胚胎狀態(tài)，其能夠指導新生物體的發(fā)育。除了對闡釋胚胎發(fā)育和疾病中涉及的基本表觀遺傳機制提供令人興奮的實驗方法外，核克隆技術(shù)具有用于患者特異移植醫(yī)學的潛在益處。
_7] 體細胞和胚胎干細胞的融合
[0168] 將體細胞核表觀遺傳重編程至未分化狀態(tài)已經(jīng)在通過胚胎細胞和體細胞融合產(chǎn)生的小鼠雜合體中被證明。多種體細胞和胚胎癌細胞之間的雜合體(Solter，D.，Nat RevGenet, 7:319-327 (2006))、胚胎生殖細胞(EG)或 ES 細胞(Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233(2005))有很多與親本胚胎細胞相同的特性，表明多能表型在這樣的融合產(chǎn)物中是主要的。對于小鼠(Tada et al., Curr Biol, 11:1553-1558 (2001))，人 ES 細胞具有在融合之后重編程體細胞核的潛能(Cowan et al., Science, 309:1369-1373 (2005));Yu et al.，Science, 318:1917-1920(2006))。沉默多能標志物例如0ct4的活化，或者失活體細胞X染色體的再活化為體細胞基因組在雜合細胞中重編程的分子證據(jù)。已經(jīng)提出DNA復制對于在融合后2天首次觀察到的多能標志物的活化是必要的(Do and Scholer, StemCells, 22:941-949 (2004))，并且當與神經(jīng)干細胞融合時，Nanog在ES細胞中的強制過表達可促進多能性(Silva et al.，Nature, 441:997-1001 (2006))。
_9] 培養(yǎng)誘導的重編程
[0170] 已經(jīng)從胚 胎源得到了多能細胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的內(nèi)細胞團(ICM) (ES細胞)、上胚層(EpiSC細胞)、原始生殖細胞(EG細胞)和出生后精原細胞干細胞(“maGSCsm”，“ ES-樣”細胞)。以下的多能細胞，與它們的供體細胞/組織一起，描述如下:單性生殖ES細胞(parthogenetic ES cell)來自小鼠卵母細胞(Narasimha et al., Curr Biol, 7:881-884(1997));胚胎干細胞來自卵裂球(Wakayama et al., Stem Cells, 25:986-993 (2007));內(nèi)細胞團細胞(來源不適用)(Eggan et al.，Nature, 428:44_49 (2004));胚胎生殖細胞和胚胎癌細胞來自原始生殖細胞(Matsui et al.，Cell, 70:841-847 (1992)) ;GMCS、maSSC 和 MASC 來自精原細胞干細胞(Guan et al., Nature, 440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara etal., Cell, 119:1001-1012 (2004);和 Seandel et al., Nature, 449:346-350 (2007))；EpiSC 細胞來自上胚層(Brons et al., Nature, 448:191-195(2007);Tesar etal., Nature, 448:196-199 (2007));單性生殖 ES 細胞來自人卵母細胞(Cibelli et al.,Science, 295L819(2002);Revazova et al., Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007))；人 ES 細胞來自人胚泡(Thomson et al.，Science, 282:1145-1147(1998)) ;MAPC 來自骨髓(Jiang et al., Nature, 418:41-49(2002);Phinney and Prockop,StemCells, 25:2896-2902(2007));臍帶血細胞(來自臍帶血)(an de Ven et al., ExpHematoI, 35:1753-1765 (2007));神經(jīng)球(neurosphere)衍生的細胞來自神經(jīng)細胞(Clarkeet al.，Science, 288:1660-1663 (2000))。來自生殖細胞系的供體細胞，例如PGC或精原細胞干細胞已知在體內(nèi)是單能性的，但是已證明多能ES樣細胞(Kanatsu-Shinohara etal.,Cell, 119:1001-1012(2004))或 maGSC(Guan et al., Nature, 440:1199-1203 (2006))在體外長時間培養(yǎng)后可被分離。盡管大部分這些多能細胞類型能夠在體外分化和形成畸胎瘤，但依據(jù)更嚴格的標準，僅ES、EG、EC和精原細胞干細胞衍生的maGCS或ES樣細胞是多能的，因為它們能夠形成出生后嵌合體并且成為生殖細胞系。最近，多能成體精原細胞干細胞(MASC)可從成體小鼠的睪丸精原細胞干細胞中得到，并且這些細胞具有與ES細胞不同(Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007))、但與 EpiSC細胞類似的表達譜，所述EpiSC細胞來自小鼠胚胎移植后的上胚層(Brons et al., Nature, 448:191-195 (2007) ;Tesar etal.，Nature, 448:196-199(2007))。
[0171]通過規(guī)定的轉(zhuǎn)錄因子進行重編程
[0172]Takahashi和Yamanaka已經(jīng)報道了將體細胞重編程回ES樣狀態(tài)(Takahashi andYamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。在將 4 種轉(zhuǎn)錄因子 0ct4、Sox2、c-myc 和 Klf4 進行病毒介導的轉(zhuǎn)導，之后針對0ct4靶基因Fbxl5的活化進行選擇之后，他們成功地將小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和成體成纖維細胞重編程為多能ES樣細胞(圖2A)。具有活化的Fbxl5的細胞是制造的iPS (誘導性多能干)細胞并且通過它們形成畸胎瘤的能力顯示是多能的，但是它們不能產(chǎn)生活的嵌合體。這種多能狀態(tài)依賴于轉(zhuǎn)導的0ct4和Sox2基因的連續(xù)病毒表達，而內(nèi)源0ct4和Nanog基因或者不表達，或者以比ES細胞中低的水平表達，并且發(fā)現(xiàn)它們各自的啟動子大量甲基化。這與以下結(jié)論一致，即Fbxl5-1PS細胞與ES細胞并不一致，但是可能代表了重編程的不完全狀態(tài)。盡管遺傳實驗已經(jīng)確定了 0ct4和Sox2 對于多能性是必要的(Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004) ; Ivanona et al., Nature, 442:5330538(2006);Masui et al., Nat Cell Biol,9:625-635 (2007))，但是兩種癌基因c-myc和Klf4在重編程中的作用仍不清楚。一些這些癌基因?qū)嶋H上對于重編程是可省去的，因為已經(jīng)在不存在c-myc轉(zhuǎn)導的情況下得到了小鼠和人iPS細胞，盡管效能較低(Nakagawa et al., Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008) ; Werning etal.，Nature, 448:318-324(2008);Yu et al.，Science, 318:1917-1920(2007))。
[0173]MAPC[0174]人MAPC描述于美國專利7，015, 037。已經(jīng)在其他哺乳動物中鑒定了 MAPC。例如，鼠MAPC描述于美國專利7，015, 037。大鼠MAPC還描述于美國專利N0.7，838，289。
[0175]這些參考文獻因描述MAPC由Catherine Verfaillie首次分離出來而以引用的方式納入本文。
[0176]MAPC的分離和培養(yǎng)
[0177]MAPC分離方法是本領域已知的。參見例如美國專利7，015，037，并且這些方法連同MAPC(表型)的表征以引用的方法納入本文。MAPC可從多個源分離，所述源包括但不限于骨髓、胎盤、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髓、血液或皮膚。因此，可能獲得骨髓抽吸物、腦或肝臟活檢組織和其他器官，并且使用本領域技術(shù)人員可獲得的陽性或陰性選擇技術(shù)，依賴這些細胞表達(或者不表達)的基因(例如，通過功能性或形態(tài)學測定，例如上文參考的申請中公開的那些，所述申請以引用的方式納入本文)分離所述細胞。
[0178]MAPC 還可以 通過在 Breyer et al., ExperimentalHematology, 34:1596-1601 (2006)和 Subramanian et al.，Cellular Programmingand Reprogramming:Methods and Protocols;S.Ding(ed.), Methods in MolecularBiology, 636:55-78(2010)中描述的改進方法來獲得，所述文獻因為這些方法以引用的方式納入本文。
[0179]美國專利7.015.037中描沭的來自人骨髓的MAPC
[0180]MAPC不表達共有的白細胞抗原⑶45或成紅血細胞特異的血型糖蛋白_A(Gly_A)。將細胞的混合群進行Ficoll Hypaque分離。然后，以使用抗⑶45的抗體和抗Gly-A的抗體的陰性選擇對細胞進行處理，耗盡CD45+和Gly-A+細胞的群，然后回收剩余的約0.1%的骨髓單核細胞。還可將細胞鋪板于纖連蛋白包被的孔中，并且如下文所述培養(yǎng)2-4周以耗盡0)45+和Gly-A+細胞。在附 著的骨髓細胞(adherent bone marrow cell)的培養(yǎng)中，很多附著基質(zhì)細胞在細胞倍增約30次時發(fā)生復制衰老，更同質(zhì)的細胞群繼續(xù)擴增并且保持長的端粒。
[0181]或者，可以經(jīng)細胞特異性標志物的組合使用陽性選擇來分離細胞。陽性和陰性選擇技術(shù)都是本領域技術(shù)人員可以得到的，并且本領域中可得到適于陰性選擇目的的很多單克隆和多克隆抗體(參見，例如，Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds.(1995)Oxford University Press),其可從許多來源市購得到。
[0182]從細胞群混合物中分離哺乳細胞的技術(shù)也已經(jīng)由Schwartz et al.在美國專利5, 759, 793 中(磁性分離)、Basch et al., 1983 (免疫親和層析)和 Wysocki and Sato, 1978(熒光激活的細胞分選)記載。
[0183]細胞可在低血清或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)MAPC的無血清培養(yǎng)基記載于美國專利7，015，037中。通常使用的生長因子包括但不限于血小板衍生的生長因子和表皮生長因子。參見，例如，美國專利 N0.7，169,610,7, 109,032,7,037, 721,6,617, 161、6，617，159,6, 372，210,6, 224，860,6, 037，174,5, 908，782,5, 766，951,5, 397，706 和4，657，866 ;全部以引用的方式納入本文用于教導在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0184]另外的培養(yǎng)方法
[0185]在另外的實驗中，培養(yǎng)MAPC的密度可以是從約100個細胞/cm2或約150個細胞/cm2至約10000個細胞/cm2變化，包括約200個細胞/cm2至約1500個細胞/cm2至約2000個細胞/cm2。所述密度可隨種類的不同而變化。此外，最佳密度可依賴于培養(yǎng)條件和細胞來源而變化。本領域普通技術(shù)人員能夠確定對于給定培養(yǎng)條件和細胞的組合的最佳密度。
[0186]同樣，在培養(yǎng)中，在MAPC的分離、生長和分化過程中的任何時間都可以使用低于約10%，包括約1-5%，尤其是3-5%的有效大氣氧濃度。
[0187]可在多種血清濃度下(例如約2-20%)培養(yǎng)細胞?？梢允褂锰ヅＱ濉８叩难蹇梢耘c更低的氧張力結(jié)合使用，例如約15-20%。不必在附著至培養(yǎng)皿之前選擇細胞。例如，在Ficoll梯度后，可以將細胞以例如250000-500000/cm2直接鋪板。可以挑出附著集落，可以將其合并并且擴增。
[0188]在一個實施方案中，在實施例的實驗方法中使用的高血清(約15-20%)和低氧(約3-5%)條件被用于細胞培養(yǎng)。特別地，將來自集落的附著細胞以約1700-2300個細胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(含TOGF和EGF)中鋪板并傳代。
[0189]在特異針對MAPC的實施方案中，補充物是允許MAPC保持分化為多于一個胚胎譜系例如所有三個譜系的細胞類型的能力的細胞因子或組分。這可以通過未分化狀態(tài)的特定標志物例如0ct3/4 (0ct3A)和/或高擴增能力標志物(例如端粒末端轉(zhuǎn)移酶)的表達來指示。
[0190]細朐培養(yǎng)
[0191]對于下文列出的全部組分，參見U.S.7，015，037，其因?qū)@些組分的教導而以引用的方式納入本文。
[0192]總的來說，可以在本領域熟知并且可以得到的培養(yǎng)基中維持并且擴增用于本發(fā)明的細胞。還考慮含哺乳動物血清的細胞培養(yǎng)基的補充物。還可以有利地使用其他補充物來為細胞提供必需微量元素用于最優(yōu)地生長和擴增。還可以有利地將激素用于細胞培養(yǎng)。還可以依賴于細胞類型和分化細胞的命運來使用脂質(zhì)和脂質(zhì)載體以補充細胞培養(yǎng)基。還考慮使用飼養(yǎng)細胞層。
[0193]干細胞經(jīng)常需要促進其附著于固體支持物的額外因子，例如層粘連蛋白、I型和II型膠原、硫酸軟骨素、纖連蛋白、“超纖連蛋白(superfibronectin) ”和纖連蛋白樣聚合物、明膠、聚-D-和聚-L-賴氨酸、血小板反應蛋白和玻連蛋白?？墒褂没诨虬啄碓吹牡鞍踪|(zhì)混合物的其他適合的包被層材料。這些中的一些可商購，例如基質(zhì)膠(Matrigel)。包被層可使用細胞外基質(zhì)蛋白及其合適的衍生物，以及這些蛋白的混合物。本發(fā)明的一個實施方案利用了纖連蛋白。參見，例如Ohashi et al., Nature Medicine, 13:880-885(2007);Matsumoto et al., J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354(2008);Kirouac et al., Cell Stem Cell, 3:369-381(2008);Chua et al., Biomaterials, 26:2537-2547(2005);Drobinskaya et al., Stem Cells,26:2245-2256(2008);Dvir-Ginzberget al., FASEB J, 22:1440-1449(2008);Turner et al., J Biomed Mater Res Part B:AppIBiomater, 82B:156-168(2007);和 Miyazawa et al., Journal of Gastroenterology andHepatology, 22:1959-1964(2007)。
[0194]一旦在培養(yǎng)中建立，細胞可被新鮮使用或者使用例如含20%_40%FCS和10%DMS0的DMEM冷凍并儲存為冷凍儲液。在一個實施方案中，使用20%FCS。對于培養(yǎng)的細胞制備冷凍儲液的其他方法也是本領域技術(shù)人員可獲得的。
[0195]為了本申請的目的，關于上述的培養(yǎng)基組分和條件，另外的培養(yǎng)方法以及其他的培養(yǎng)方法也適用于所述生物反應器方法。例如，在一個示例性實施方案中，氧氣的濃度為5%，血清為約19%并將EGF和TOGF加入到培養(yǎng)基中。
[0196]藥物制劑
[0197]U.S.7，015，037因為對藥物制劑的教導而以引用的方式納入本文。在一些實施方案中，細胞群存在于組合物中，所述組合物被改造適合且適于遞送，即是生理學相容的。
[0198]在一些實施方案中，用于給予受試者的細胞(或條件培養(yǎng)基)的純度是約100% (基本上同質(zhì))。在其他實施方案中，純度是95%至100%。在一些實施方案中，純度是85%至95%。特別地，對于與其他細胞的混合物的情況，所述百分比可以是約10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%_35%、35%_40%、40%_45%、45%_50%、60%_70%、70%_80%、80%-90% 或90%-95%?；蛘?，分離/純度可以細胞倍增的方式表示，其中所述細胞已經(jīng)經(jīng)歷了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的細胞倍增。
[0199]對于給定應用，用于給予所述細胞的制劑的選擇將依賴于多種因素。其中主要的因素是受試者的種類；待治療的病癥的性質(zhì)、其狀態(tài)和在所述受試者中的分布；正給予的其他療法和試劑的性質(zhì)；給藥的最佳途徑；經(jīng)所述途徑的存活力；劑量方案；和對于本領域技術(shù)人員來說明顯的其他因素。例如，合適載體和其他添加劑的選擇將依賴于確切的給藥途徑和具體劑型的性質(zhì)。
[0200]細胞/培養(yǎng)基的水性懸液的最終制劑一般包括將所述懸液的離子強度調(diào)節(jié)至等滲(即約0.1至0.2)并且至生理pH (即約？冊.8至7.5)。最終制劑一般還會包含流體潤滑劑。
[0201]在一些實施方案中，細胞/培養(yǎng)基被配制為單位劑量的可注射形式的制劑，所述的可注射形式例如溶液劑、懸液劑或乳劑。適于注射細胞/培養(yǎng)基的藥物制劑一般是無菌的水性溶液和分散液。用于可注射制劑的載體可以是包含例如以下物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì):水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。
[0202]本領域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明方法中給予的組合物中的細胞和任選的添加劑、賦形物和/或載體的量。一般地，任意添加劑(除所述細胞之外)的存在量為在溶液中(例如在磷酸鹽緩沖鹽水中)0.001至50wt%?；钚猿煞忠晕⒖酥梁量说牧考壌嬖冢鐬榧s0.0001至約5wt%，優(yōu)選約0.0001至約lwt%，最優(yōu)選為約0.0001至約0.05wt%或者約0.001至約20wt%，優(yōu)選約0.01至約10wt%，最優(yōu)選為約0.05至5wt%。
[0203]實施例
[0204]實施例1.借助中宇纖維牛物反應器細朐擴增系統(tǒng)擴增來自細朐庫的MultiStem
[0205]使用基本上如U.S.2008/0220523和Antwiler等所述的細胞擴增系統(tǒng)擴增MultiStem的輸入群(基本為同質(zhì)群)。所述系統(tǒng)命名為Quantum CES0它提供了尤其可用于自體擴增的臺式擴增系統(tǒng)。(但是它也可用于異體擴增。)基于本申請中示出的結(jié)果，可從單個供體獲得多于108個`細胞。
[0206]Mult1-Stem被儲存在冷凍細胞庫中后，將所述Mult1-Stem解凍。對于兩個實驗，將IOX IO6個MultiStem接種到連續(xù)流生物反應器中，所述生物反應器具有184ml的內(nèi)部流體容積和303ml的外部流體容積，含有1.1 X IO4根中空纖維，所述中空纖維具有約2.lm2(3255in2)的總表面積(毛細管內(nèi))，50 μ m的壁厚度，215 μ m的內(nèi)徑和295mm的總長度(平均每個纖維30mm,范圍10-50mm)?？壮叽缇哂屑s16kDa的截留。所述細胞附著到所述中空纖維的內(nèi)部。將培養(yǎng)細胞6天。從相同的接種原液開始的三個獨立實驗產(chǎn)生了 752 X 106、753 X IO6 和 782 X IO6 個細胞。
[0207]流速是可變的，但是通常隨著細胞增殖增加，使得提供足夠量的營養(yǎng)物并以足夠的量除去廢物。通常，流速可以增加約10倍。但是，這個參數(shù)是通過監(jiān)控培養(yǎng)基中的廢物(例如乳酸和葡萄糖水平)來調(diào)整。
[0208]所述壁材料是PA/PAES/PVP復合材料。
[0209]并且，在這個具體的實施方案中，所述纖維包被有纖連蛋白。
[0210]對于已建立細胞(即來源于預先分離、擴增、基本純化的培養(yǎng)物的細胞)，使用5mg的纖連蛋白并包被過夜。然后洗去包被物，并替換為培養(yǎng)基。接種后，裝置內(nèi)環(huán)路無流動的情況下，細胞附著24小時。然后以約0.1ml/分鐘的進料速率起始?；谌樗崴胶图毎谋对鏊俾?，約每24小時將進料速率加倍。在最初三天中，發(fā)明人嘗試將乳酸水平保持在約0.5g/l。在最后三天中，將乳酸水平保持在約lg/Ι，最大為1.5g/l。最后一天(即當所述細胞擴增到其最大值時)進料速率為約3mL/分鐘。
[0211]使用約200ml2.5%的胰蛋白酶以2.5分鐘的孵育時間和約500ml的收獲體積收獲細胞。
[0212]當使用骨髓抽吸物時，使用約IOmg纖連蛋白以48小時的附著時間包被毛細管內(nèi)表面。這樣調(diào)整進料速率，使得如果乳酸水平上升到0.4-0.5g/l，就將進料速率加倍。與從已經(jīng)建立細胞庫的細胞開始的培養(yǎng)相比，所述速率通常不那么高。在一個實施方案中，使用約25-30ml的骨髓抽吸物，產(chǎn)生約4X IO6個來自總BMMC的細胞。因此，對骨髓進行蔗聚糖梯度以除去無核細胞。
[0213]詳情見于圖5。該流程圖包括2個環(huán)路:毛細管內(nèi)(IC)環(huán)路和毛細管外(EC)環(huán)路。所述IC環(huán)路具有3個入口管線:細胞管線、試劑管線和IC培養(yǎng)基管線。袋子與這些管線連接用于加入細胞、包被劑、胰蛋白酶和培養(yǎng)基。每個管線由具有開或關兩種狀態(tài)的閥控制。入口速率由IC入口泵(I)控制。所述系統(tǒng)內(nèi)的循環(huán)由IC循環(huán)泵(2)控制。所述IC回路含有150mL。所述EC環(huán)路具有2個入口管線:洗滌(溶液)管線和EC培養(yǎng)基管線。袋子與這些管線連接用于以PBS洗滌和將培養(yǎng)基加入所述EC環(huán)路。所述EC入口速率由EC入口泵(3)控制，這個回路中的循環(huán)由EC循環(huán)泵(4)控制。EC環(huán)路中存在氧合器。該氧合器與外部氣瓶(對于MultiStem這為90%N2 ；5%02 ；5%C02)連接，并為EC培養(yǎng)基維持氣體濃度。由于氣體通過所述生物反應器中膜的擴散，IC培養(yǎng)基達到平衡狀態(tài)。所述EC回路含有約250ml。溶液/細胞有兩種方式離開所述系統(tǒng):在廢物袋中或在收獲袋中。所述IC及EC環(huán)路與由閥控制的廢物袋連接。所述收獲袋僅與所述IC環(huán)路相連，并且也由閥控制。
[0214]比較了輸入群和輸出群。具體地，評價了所述輸入群的某些選定的基因的基因表達，并將其與所述輸出群比較。此外，比較了形態(tài)學和倍性。就所測量的參數(shù)而言，所述輸出群與所述輸入群基本上相同。
[0215]實施例2.在中宇纖維牛物反應器細朐擴增系統(tǒng)中從骨髓產(chǎn)牛MultiStem
[0216]上述的細胞擴增系統(tǒng)用于從骨髓單核細胞產(chǎn)生MultiStem。擴增結(jié)果示于圖6。在一個可能的方案中，從骨髓抽吸物開始，可以在17天內(nèi)建立MultiStem原始細胞庫。這進行了一次從骨髓到15次群體倍增的運行、到該收獲物的擴增運行以達到18.5次的群體倍增和平均10次運行以產(chǎn)生原始細胞庫(200管，每管2000萬個細胞)。然后，這200管可用于產(chǎn)生工作細胞庫。示意圖示于圖7。然而，可增加或減少所述原始細胞庫，例如最高達10倍的細胞或最低至十分之一的細胞。
[0217] 擴增之后，輸出細胞具有與MultiStem相關的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，并表達端粒末端轉(zhuǎn)移 酶。
【權(quán)利要求】
1.一種擴增離體細胞的方法，所述方法包括如下步驟:a)將所述細胞接種在中空纖維基質(zhì)上，使得所述細胞附著在所述基質(zhì)上山)擴增所述基質(zhì)上附著的細胞；和c)從所述基質(zhì)取下所擴增的細胞，其中所述細胞是非胚胎干細胞、非生殖細胞，其中所述細胞表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶、未被轉(zhuǎn)化并具有正常核型。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括d)將所述取下的細胞重新接種在相同或不同的基質(zhì)上；和e)重復步驟b)-d)直到達到需要的擴增細胞數(shù)。
3.權(quán)利要求2的方法，還包括將所述取下的細胞給予受試者。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述中空纖維基質(zhì)在封閉的連續(xù)灌注生物反應器中。
5.權(quán)利要求3的方法，其中將所述細胞擴增約10-100倍。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中所述中空纖維被包被。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述包被物是纖連蛋白。
8.權(quán)利要求7的方法，其中纖維中的壁材料是PA/PAES/PVP。
9.權(quán)利要求1-8的方法，其中在步驟(a)中的細胞包括基本上同質(zhì)的群。
10.權(quán)利要求1-8的方法，其中步驟(a)包括接種來自組織的細胞，所述組織選自骨髓、臍帶血、臍帶基質(zhì)、外周血、胎盤、胎盤血、肌肉、腦、腎或其他實體器官。
11.權(quán)利要求1的方法，其 所述非胚胎干細胞、非生殖細胞還表達oct4、rex-l、rox-l或sox-2中的一種或多種。
12.權(quán)利要求1和權(quán)利要求11的方法，其中所述非胚胎干細胞、非生殖細胞可分化成內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的至少兩個中的至少一種細胞類型。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述非胚胎干細胞、非生殖細胞可分化成內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的每個中的至少一種細胞類型。
【文檔編號】C12M3/06GK103732733SQ201280038305
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月6日
【發(fā)明者】J·A·M·皮恩克斯特倫, D·克雷耶 申請人:里珍西斯私人有限公司