用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及作為用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物的微RNA。本發(fā)明也涉及用于該目的的方法、裝置和試劑盒。
【專利說明】用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法和裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法、裝置和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]對得自患者的腫瘤樣品進(jìn)行基因表達(dá)分析已經(jīng)被用于促進(jìn)癌癥預(yù)后和診斷?；虮磉_(dá)譜可以揭示患者中癌癥的存在，其類型、分期階段和起源，以及是否涉及基因突變?；虮磉_(dá)甚至可能在預(yù)測化學(xué)療法的效力中起作用。
[0003]近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一類新的調(diào)節(jié)分子，即微RNA。確定它們在癌細(xì)胞中的濃度或表達(dá)已經(jīng)揭示了其在癌癥中的作用。已經(jīng)證實(shí)，微RNA的檢測可以用于確定癌癥的起源部位，且可以用于區(qū)分侵襲性癌癥和非侵襲性癌癥。在基因和微RNA的表達(dá)水平中所含的信息是互補(bǔ)的，在 預(yù)測或診斷方法中組合該信息可以產(chǎn)生在臨床上更準(zhǔn)確的和有用的結(jié)果。
[0004]肺癌是具有高死亡率的疾病。即使在外科手術(shù)以后，大多數(shù)肺癌患者經(jīng)歷復(fù)發(fā)和死亡。如果切除的腫瘤的直徑超過3 cm，護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是給患者提供化學(xué)療法以預(yù)防復(fù)發(fā)。如果腫瘤的直徑小于3 cm且沒有觀察到腫瘤的擴(kuò)散(也被稱作Ia期)，則不給患者提供進(jìn)一步治療。仍然有超過半數(shù)的肺癌患者經(jīng)歷復(fù)發(fā)，并在5年內(nèi)死亡。
[0005]需要在一種或多種針對癌癥的醫(yī)學(xué)治療(包括外科手術(shù))以后預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明包括用于在一種或多種癌癥治療(例如，外科手術(shù)、放射療法和/或化學(xué)療法)之前或之后預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，所述方法通過確定至少一種生物標(biāo)志物(例如，超過一種生物標(biāo)志物，諸如2、3或4種或更多種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平進(jìn)行，其中所述生物標(biāo)志物與 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 (分別是SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及或者單一地或者以2種、3種或所有4種生物標(biāo)志物的任意組合(同時(shí)地或依次地)確定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，所述生物標(biāo)志物具有 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b 和 hsa-miR-1307 中的任一個(gè)的序列。
[0007]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括:確定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa_miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(或與 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物標(biāo)志物)的配對組合的表達(dá)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括:確定hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(或與 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物標(biāo)志物)的三聯(lián)或四聯(lián)組合的表達(dá)水平。本發(fā)明的方法可以包括:同時(shí)或依次確定2種或更多種生物標(biāo)志物(例如，2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平。
[0008]本發(fā)明的方法包括:確定得自癌癥患者的樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。所述樣品可以是血液樣品或組織樣品，例如，腫瘤樣品。本發(fā)明的方法可以用于在癌癥患者的第一癌癥治療之前或之后預(yù)測任意類型的癌癥(例如，肺癌，諸如非小細(xì)胞肺癌)的復(fù)發(fā)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法可以發(fā)生在第一癌癥治療之后。可替換地，所述預(yù)測可以發(fā)生在第一癌癥治療之前。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)測可以發(fā)生在在第一治療之后但是在第二治療之前?？商鎿Q地，所述預(yù)測可以發(fā)生在第二癌癥治療之后。在本發(fā)明中描述的癌癥治療可以包括以下的一種或多種:外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法和/或本領(lǐng)域已知的用于治療癌癥的任意其它療法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，化學(xué)治療劑可以包括以下的一種或多種:藥物、抗體和寡核苷酸。
[0009]在所述方法的一個(gè)方面，至少一種生物標(biāo)志物(例如，與hsa-miR_513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 (分別是 SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平的增加或下降，指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后?？商鎿Q地，一種或多種生物標(biāo)志物(例如，與 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 (分別是 SEQ IDNO: 1-4)中的任一個(gè)的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平的增加或下降指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后。
[0010]本發(fā)明的方法可以包括:基于癌癥患者樣品中的至少一種生物標(biāo)志物(例如，與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 (分別是 SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平與得自正?；颊叩臉悠坊虻米缘谝?或后續(xù))癌癥治療以后的患者的樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的對比，預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)?？商鎿Q地，一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)的檢測會單獨(dú)提供足夠預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的信息。
[0011]本發(fā)明的方法可以包括:從患者(例如，癌癥患者)樣品(例如，組織樣品，諸如腫瘤樣品)收集核酸分子，并任選地使用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來擴(kuò)增核酸分子，隨后檢測樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)，或確定樣品中的至少一種生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平。
[0012]本發(fā)明涉及裝置，其可以用于檢測至少一種生物標(biāo)志物(例如，超過一種生物標(biāo)志物，諸如2、3或4種或更多種生物標(biāo)志物)的表達(dá)或確定所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，且可以包括:至少一種(例如，超過一種，諸如2、3或4種或更多種)單鏈核酸分子(也被稱作寡核苷酸探針)，所述單鏈核酸分子與生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。所述生物標(biāo)志物的序列包括hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 (分別是 SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列的至少5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè))連續(xù)核苷酸。例如，所述裝置可以包括寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針可以用于檢測得自患者(例如，癌癥患者)的組織樣品中的 hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)或與這些生物標(biāo)志物互補(bǔ)的序列中的任一個(gè)的表達(dá)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置包括寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針與hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的任意一個(gè)或多個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體序列具有至少100%序列同一性。所述裝置可以包括寡核苷酸探針的配對、三聯(lián)或四聯(lián)組合，所述寡核苷酸探針與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性。
[0014]所述裝置允許所述裝置的單鏈核酸分子(例如，寡核苷酸探針)與一種或多種生物標(biāo)志物或它的一個(gè)或多個(gè)補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。所述裝置包括至少一種單鏈核酸分子，所述單鏈核酸分子具有在10-100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的長度(例如，10、20、25、30、40、60、80或100個(gè)核苷酸的長度，或在5-50、20-50或20-100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的長度)。當(dāng)使所述裝置與從樣品制備的不同核酸分子群體在允許雜交的條件下接觸時(shí)，所述裝置中的寡核苷酸探針與它們的靶生物標(biāo)志物雜交，并且可以檢測至少一種生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)在樣品(例如，患者組織樣品)中的存在?？商鎿Q地，所述裝置可以用于確定一種或多種(例如，1、2、3或4種)上述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置是微陣列裝置。
[0015]本發(fā)明包括用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，所述方法通過下述進(jìn)行:使用上述裝置來檢測患者樣品(例如，腫瘤樣品)中的至少一種生物標(biāo)志物(例如，與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 (分別是 SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的生物標(biāo)志物)或確定所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，使得一種或多種(例如，1、2、3或4種)生物標(biāo)志物的檢測或表達(dá)水平預(yù)示患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。所述樣品可以得自被診斷出本文中描述的任一種癌癥(例如，肺癌，更具體地，非小細(xì)胞肺癌)的患者。所述裝置可以用于在第一癌癥治療之前或之后預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)?？商鎿Q地，所述裝置可以用于在第一癌癥治療之后、但是在第二治療之前預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述裝置可以用于在第二癌癥治療之后預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)。
[0016]所述方法的裝置可以用于檢測至少一種上述生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平的增加或下降，所述增加或下降指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后。可替換地，所述裝置可以用于檢測一種或多種上述生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平的增加或下降，所述增加或下降指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后。
[0017]所述裝置可以用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)，這基于癌癥患者樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與得自正常患者的樣品或得自第一癌癥治療之后的患者的樣品中的表達(dá)水平的對比?？商鎿Q地，所述裝置對一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)的檢測，可以用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)。
[0018]本發(fā)明也涉及試劑盒，其可以包括:用于從得自癌癥患者的樣品收集核酸分子的試劑，用于擴(kuò)增從樣品收集的核酸分子以產(chǎn)生擴(kuò)增的樣品的試劑，和至少一種用于檢測擴(kuò)增的樣品中的至少一種生物標(biāo)志物(例如，1、2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平的裝置，所述生物標(biāo)志物具有SEQ ID NO: 1-4中的任一個(gè)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來產(chǎn)生擴(kuò)增的樣品。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括關(guān)于基于至少一種生物標(biāo)志物(例如，具有SEQ ID NO: 1-4中的任一個(gè)的序列的生物標(biāo)志物的一種或多種或全部)的表達(dá)水平來預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的說明書。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包括上述的裝置(例如，微陣列裝置)，以檢測樣品中的至少一種(例如，1、2、3或4種)生物標(biāo)志物(例如，具有SEQ ID NO: 1_4中的任一個(gè)的序列的生物標(biāo)志物)，或確定樣品中的至少一種(例如，1、2、3或4種)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括關(guān)于將從樣品收集的核酸分子應(yīng)用于所述裝置的說明書，和/或關(guān)于檢測至少一種寡核苷酸探針與至少一種生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列的雜交以便檢測樣品中的至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)或確定所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的說明書。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括關(guān)于基于使用所述裝置檢測的所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平來預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的說明書。
[0020]與預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)有關(guān)的生物標(biāo)志物被鑒別為，在需要(warranted)預(yù)測的相關(guān)組之間差異表達(dá)的那些。例如，可以針對本發(fā)明的生物標(biāo)志物測定得自癌癥患者的樣品，以根據(jù)患者在癌癥治療(例如，外科手術(shù)、放射療法和/或化學(xué)療法)以后是否經(jīng)歷復(fù)發(fā)而將患者分組。從樣品提取總RNA (包括mRNA和微RNA)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行標(biāo)記。用一個(gè)或多個(gè)DNA微陣列(其含有與所述mRNA和/或微RNA互補(bǔ)的探針)測量得自每個(gè)已知基因的mRNA的量，或得自每個(gè)已知微RNA物種的微RNA的量。
[0021 ] 該方案可以用于mRNA生物標(biāo)志物以及用于微RNA生物標(biāo)志物。預(yù)后是基于mRNA生物標(biāo)志物、微RNA生物標(biāo)志物或它們的組合，其都是使用一個(gè)或多個(gè)DNA微陣列(或RT-PCR)針對提取自得自患者腫瘤的樣品的標(biāo)記的RNA來進(jìn)行測量的。
[0022]本發(fā)明的方法可以用于在治療之前或之后預(yù)測癌癥(例如，肺癌)復(fù)發(fā)。目前沒有良好且準(zhǔn)確的方法確定癌癥會否復(fù)發(fā)。本文所述的方法可以被例如腫瘤科醫(yī)生使用，以基于個(gè)別腫瘤的基因構(gòu)成選擇 對于患者而言最適當(dāng)?shù)闹委煛Ｖ獣詮?fù)發(fā)的可能性將允許腫瘤科醫(yī)生選擇一種或多種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)療法方案，或外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法的組合。
[0023]本文中使用的“癌癥患者”表示主體，例如，人類主體，其患有或曾患有癌癥,且可能已經(jīng)或尚未針對該癌癥進(jìn)行治療。
[0024]本文中使用的核酸序列的“補(bǔ)體”或“互補(bǔ)”核酸序列表示這樣的寡核苷酸:當(dāng)它與核酸序列對齊時(shí)，處于“反向平行締合”，使得一個(gè)序列的5’末端與另一個(gè)序列的3’末端配對。核苷酸和其它堿基可以具有補(bǔ)體，且可以存在于互補(bǔ)核酸中。可以被包括在本發(fā)明的核酸中的天然核酸中不常見的堿基包括，例如，肌苷和7-脫氮鳥嘌呤?！盎パa(bǔ)性”可以是不完美的；互補(bǔ)核酸的穩(wěn)定雙鏈體可以包含錯(cuò)配堿基對或未配對堿基。核酸【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)考慮許多變量來確定雙鏈體穩(wěn)定性，所述變量包括例如寡核苷酸的長度、寡核苷酸中胞嘧啶和鳥嘌呤堿基的濃度百分比、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對的發(fā)生率。
[0025]當(dāng)互補(bǔ)核酸序列形成穩(wěn)定雙鏈體時(shí)，它們被說成“雜交的”或彼此“雜交”，或者說“雜交”已發(fā)生。如果核酸包含根據(jù)沃森-克里克堿基配對規(guī)則(例如，G與C、A與T，或A與U)可以形成氫鍵的核苷酸或核苷酸類似物或其它氫鍵合基序(例如二氨基嘌呤與T、5-甲基C與G、2-硫胸苷與A、肌苷與C、假異胞嘧啶與G等)，則所述核酸被稱為“互補(bǔ)的”。反義RNA可以與其它寡核苷酸(例如，mRNA)互補(bǔ)。
[0026]本文中使用的“生物標(biāo)志物”表示基因或主體的遺傳材料的其它部分:其以可以測量的形式表達(dá)(例如，作為mRNA、微RNA或蛋白質(zhì))，且其表達(dá)指示患者中的癌癥復(fù)發(fā)的良好或不良預(yù)后。
[0027]本文中使用的“標(biāo)記基因”或“生物標(biāo)記基因”是指細(xì)胞中的基因，所述基因的表達(dá)與細(xì)胞(且因此與從其獲得細(xì)胞的患者)對治療(例如，暴露于化合物)的敏感性或抗性關(guān)聯(lián)。
[0028]本文中使用的“微陣列”是指由任何每次定量一種或多種受試寡核苷酸(例如，DNA或RNA，或其類似物)的方法所采用的裝置。微陣列的一個(gè)示例性種類由附著于玻璃或石英表面的DNA探針組成。例如，許多微陣列(包括由Affymetrix制備的那些)使用幾種探針來確定單一基因的表達(dá)。DNA微陣列可以包含寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針可以是例如與RNA互補(bǔ)的全長cDNA，或與RNA的一部分雜交的cDNA片段。DNA微陣列還可以含有修飾形式的DNA或RNA，諸如鎖定核酸或LNA。示例性的RNA包括mRNA、miRNA和miRNA前體。示例性微陣列還包括具有多個(gè)與底物結(jié)合的核酸的“核酸微陣列”，與多個(gè)被結(jié)合的核酸中的每一個(gè)的雜交是可分別檢測的。底物可以是固體或多孔的、平面或非平面的、歸一(unitary)或分散的。示例性核酸微陣列包括在下述參考文獻(xiàn)中通常描述的所有裝置=Schena(編)，DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series),Oxford University Press (1999) ; Nature Genet.21 (I)(增刊):1-60 (1999) ; Schena(編)，Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000)。此外，示例性核酸微陣列包括多個(gè)與底物結(jié)合的核酸，其中多個(gè)核酸設(shè)置在多個(gè)珠上而不是歸一的平面底物上，如特別是Brenner等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 97 (4): 1665-1670 (2000)中描述的。核酸微陣列的例子可以在下述美國專利號中找到:6，391，623,6, 383，754,6, 383，749,6, 380，377,6, 379，897、6，376，191,6, 372，431、6，351，712 6，344，316,6, 316，193,6, 312，906,6, 309，828、6，309，824,6, 306，643,6, 300，063,6, 287，850,6, 284，497,6, 284，465,6, 280，954、6，262，216、6，251, 601、6，245, 518、6，263, 287、6，251，601、6，238, 866、6，228, 575、6，214，587,6,203，989,6, 171，797,6, 103，474,6,083，726,6,054，274,6,040，138、6，083，726,6, 004，755,6, 001，309,5, 958，342,5, 952，180,5, 936，731,5, 843，655、5，814，454,5, 837，196,5, 436，327,5, 412，087,5, 405，783，它們的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。
[0029]示例性微陣列還可以包括具有多個(gè)與底物結(jié)合的多肽的“肽微陣列”或“蛋白質(zhì)微陣列”，寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)與多個(gè)被結(jié)合的多肽中每一個(gè)的結(jié)合是可分別檢測的?？商娲?，肽微陣列可以具有多個(gè)結(jié)合劑，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、噬菌體展示結(jié)合劑、酵母雙雜交結(jié)合劑、適體，其可以特異性地檢測特定寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)的結(jié)合。肽陣列的例子可以在 WO 02/31463、WO 02/25288、WO 01/94946、WO 01/88162、WO 01/68671、WO 01/57259、WO 00/61806、WO 00/54046、WO 00/47774、WO 99/40434、WO99/39210,WO 97/42507 和美國專利號 6，268，210,5, 766，960,5, 143，854 中找到，它們的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。
[0030]本文中使用的“基因表達(dá)”是指在細(xì)胞、組織、生物體或主體中的基因產(chǎn)物的量，例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)的量，DNA、RNA或蛋白質(zhì)的修飾(例如剪接、磷酸化、乙酰化或甲基化)的量，或與給定基因相關(guān)的DNA、RNA或蛋白質(zhì)的活性的量。
[0031]“ 治療”或“醫(yī)學(xué)治療”是指給主體或活生物體施用化合物或使細(xì)胞或腫瘤暴露于化合物(例如，藥物、蛋白質(zhì)、抗體、寡核苷酸、化學(xué)治療劑和放射性試劑)或用于治療或預(yù)防癌癥(例如，肺癌)或癌癥征狀的某些其它形式的醫(yī)學(xué)干預(yù)(例如，冷凍療法和放射療法)。放射療法包括給患者施用輻射，所述輻射從諸如粒子加速器和相關(guān)的醫(yī)學(xué)裝置來源產(chǎn)生，所述相關(guān)的醫(yī)學(xué)裝置發(fā)射X射線、Y射線或電子(β射線)束。治療可以進(jìn)一步包括外科手術(shù)，例如從主體或活生物體除去腫瘤。
[0032]從以下的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求書會看到本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1的圖顯示了使用60-微RNA模型在留一法(leave-one-out)交叉驗(yàn)證中預(yù)測的78位非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的復(fù)發(fā)的卡普蘭-邁耶圖。
[0034]圖2的圖顯示了使用4-微RNA模型在獨(dú)立驗(yàn)證中預(yù)測的30位NSCLC患者的總存活率的卡普蘭-邁耶圖。
[0035]詳細(xì)描述
本發(fā)明涉及用于在癌癥治療(例如，外科手術(shù)和/或使用一種或多種，并優(yōu)選2種或更多種化學(xué)治療劑和/或輻射的治療)之前或之后確定得自患者樣品的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平以預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法。本發(fā)明也涉及包括核酸探針的裝置(例如，微陣列)，所述核酸探針可以檢測來自患者樣品的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)。所述裝置可以用于在治療之前或之后預(yù)測患者中的癌癥是否將復(fù)發(fā)。本發(fā)明也涉及試劑盒，其用于確定來自患者樣品的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平以預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用在儀器上運(yùn)行的軟件來實(shí)現(xiàn)，所述儀器與檢測裝置(諸如微陣列)結(jié)合地用于測量基因表達(dá)。被包含在用于處理得自主體的腫瘤樣品的試劑盒中的檢測裝置(例如，微陣列，諸如DNA微陣列)，以及用于讀出所述裝置和將結(jié)果轉(zhuǎn)換成主體的預(yù)后的儀器，可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0036]癌癥
本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒可以用于預(yù)測患者的癌癥復(fù)發(fā)，所述患者遭受或被診斷出癌癥，例如，乳房、前列腺、肺(例如，非小細(xì)胞肺癌)、支氣管、結(jié)腸、直腸、膀胱、皮膚、腎、胰腺、□腔、咽、卵巢、甲狀腺、副甲狀腺、胃、腦、食管、肝、肝內(nèi)膽管、子宮頸、喉、心臟、睪丸、小腸、大腸、肛門、肛管、肛門直腸、外陰、膽囊、胸膜、骨、關(guān)節(jié)、下咽、眼和/或眼眶、鼻、鼻腔、中耳、鼻咽、輸尿管、腹膜、網(wǎng)膜、腸系膜和/或胃腸的癌癥，以及任意形式的癌癥，包括，例如，慢性骨髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、癌、基底細(xì)胞癌、惡性間皮瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、類癌瘤、急性腫瘤和/或軟組織肉瘤(例如，優(yōu)選地，癌癥是膀胱、乳房、結(jié)腸、直腸、子宮、腎、肺、皮膚(例如，黑素瘤)、胰腺、前列腺、血液和/或骨髓(例如，白血病)、淋巴細(xì)胞(例如，非霍奇金淋巴瘤)和/或甲狀腺的癌癥)。
[0037]癌癥治療
本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒可以用于在第一治療之前或之后確定癌癥患者(例如，肺癌患者)中的癌癥的復(fù)發(fā)潛力。所述第一治療可以包括，例如，外科手術(shù)、放射療法和/或化學(xué)療法中的一種或多種。所述化學(xué)療法可以包括，施用一種或多種(例如，2種或更多種)下述藥劑:長春新堿、順鉬、依托泊苷、氮雜鳥嘌呤、卡鉬、阿霉素、阿柔比星、米托蒽醌、米托蒽醌、絲裂霉素、紫杉醇、吉西他濱、泰索帝、地塞米松、阿糖胞苷、甲潑尼龍、甲氨蝶呤、博來霉素、丙酮雙脒腙、貝林司他、卡鉬、5-fu (5-氟尿嘧啶)、伊達(dá)比星、美法侖、IL4-PR38、丙戊酸、全反式視黃酸(ATRA)、環(huán)磷酰胺、托泊替康、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA，伏立諾他)、縮酚酸肽(FR901228)、硼替佐米、瘤可寧、氟達(dá)拉濱、長春堿、白消安、達(dá)卡巴嗪、奧沙利鉬、羥基脲、替加氟、柔紅霉素、雌莫司汀、氮芥、鏈佐星、卡莫司汀、洛莫司汀、巰嘌呤、替尼泊苷、更生霉素、維A酸、異環(huán)磷酰胺、他莫昔芬、伊立替康、氟尿苷、硫鳥嘌呤、PSC 833、厄洛替尼(erlotinib)、赫賽汀、貝伐單抗、塞來考昔、氟維司群、易瑞沙、阿那曲唑、來曲唑、西妥昔單抗、利妥昔單抗、輻射、組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制劑和5-氮雜-2’-脫氧胞苷(地西他濱)。
[0038]本發(fā)明的一個(gè)有益方面是，所述方法、裝置和試劑盒可以用于在一種/次或多種/次針對癌癥的治療(例如，2、3、4、5、10、20、30種/次或更多種/次針對癌癥的治療)之前或之后如下所述預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā):同時(shí)或依次測定一種或多種(例如，2、3或4種)選自 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。已經(jīng)確定，這些生物標(biāo)志物中的每一種的表達(dá)預(yù)示患者的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。可以用于預(yù)測患者的癌癥復(fù)發(fā)的其它生物標(biāo)志物包括在下面表1和2中列出的生物標(biāo)志物中的一種或多種。[0039]本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒還可以用于鑒別對一種或多種治療有應(yīng)答的患者亞群，所述治療被認(rèn)為對于治療一般群體中的疾病(例如，癌癥)是無效的。更一般而言，用一種或多種療法治療的癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)測，可以通過使用生物標(biāo)志物的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，不論對患者的先前癌癥治療的認(rèn)識如何。本發(fā)明的方法可以使用在儀器上運(yùn)行的軟件來實(shí)現(xiàn)，所述儀器與微陣列結(jié)合地用于測量基因表達(dá)。本發(fā)明的裝置(例如，微陣列，諸如DNA和/或RNA微陣列)可以被包含在用于處理得自主體的腫瘤樣品(例如，細(xì)胞、組織或器官樣品，其含有腫瘤或腫瘤細(xì)胞)的試劑盒中，以及用于讀出所述裝置和將結(jié)果轉(zhuǎn)換成主體的預(yù)后譜(prognosis profile)的儀器可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0040]本發(fā)明的生物標(biāo)志物
本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物，其與 hsa-miR-513b (5’ UUCACAAGGAGGUGUCAUUUAU3’ ；SEQ ID NO:1)、hsa-miR-650 (5，AGGAGGCAGCGCUCUCAGGAC3，；SEQ ID NO: 2)、hsa-miR-324-3p (5， ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG3， ；SEQ ID NO: 3)，和 hsa-miR-1307(ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG ;SEQ ID NO 4)中的任一個(gè)的序列具有至少 85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。在下面的表1和2中列出了可以用于本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒中的其它生物標(biāo)志物。這些其它生物標(biāo)志物可以單獨(dú)使用，或者與特定生物標(biāo)志物聯(lián)合使用，所述特定生物標(biāo)志物與hsa-miR_513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p和hsa-miR-1307中的任一個(gè)的序列具有85%或更多的序列同一性(例如，100%序列同一性)。優(yōu)選地,本發(fā)明的生物標(biāo)志物具有hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b和hsa-miR-1307的序列，且可以用在下述的任意組合中(同時(shí)或依次)。此外，這4種生物標(biāo)志物的任意組合可以與在表1和2中列出的一種或多種生物標(biāo)志物一起使用(同時(shí)或依次)。
[0041]所述方法的生物標(biāo)志物可以用在下述的方法、裝置和試劑盒中，以在一種或多種針對癌癥的治療(諸如上面列出的癌癥治療)之前或之后確定患者的癌癥(例如，肺癌)的復(fù)發(fā)潛力。
[0042]使用本發(fā)明的生物標(biāo)志物預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法
本發(fā)明涉及用于在一種或多種針對癌癥的治療(例如，外科手術(shù)、放射療法和/或化學(xué)療法)之前或之后預(yù)測患有癌癥的患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，所述方法通過測量一種或多種(例如，1、2、3或4種)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行，所述生物標(biāo)志物與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 中的任一個(gè)的序列具有至少 85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。優(yōu)選地，所述方法涉及單獨(dú)地或以2種、3種或所有4種的任意組合(同時(shí)或依次)，確定具有hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307 (分別是SEQ ID NO: 1_4)中的任一個(gè)的序列的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。優(yōu)選地，在至少一種針對癌癥的治療以后在患者中執(zhí)行所述方法。
[0043]例如，本發(fā)明的方法可以包括:確定hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p、hsa-miR_513b和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(或與 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b 和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物標(biāo)志物)的配對組合的表達(dá)水平。具體地，可以同時(shí)或依次測量下述生物標(biāo)志物配對組合的表達(dá)水平:
1)hsa_miR-513b 和 hsa-miR-650 ；
2)hsa_miR-513b 和 hsa-miR-324_3p ；
3)hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 ；
4)hsa-miR-650 和 hsa_miR-513b ；
5)hsa-miR-650 和 hsa-miR-324_3p ；
6)hsa-miR-650 和 hsa-miR-1307 ；
7)hsa-miR-324_3p 和 hsa_miR-513b ；
8)hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-650 ；
9)hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 ；
10)hsa-miR-1307 和 hsa_miR-513b ；
11)hsa-miR-1307 和 hsa-miR-650 ;和
12)hsa-miR-1307 和 hsa-miR-324_3p。
[0044]本發(fā)明的方法也可以包括:確定hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(或與 hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物標(biāo)志物)的三聯(lián)組合的表達(dá)水平。具體地，可以同時(shí)或依次測量下述生物標(biāo)志物三聯(lián)組合的表達(dá)水平:
1)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p ；
2)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307；
3)hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650 ；
4)hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307；
5)hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-650 ；
6)hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p ；
7)hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p ；
8)hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307 ；
9)hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513 ；
10)hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307 ；11)hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b ；
12)hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p ；
13)hsa-miR- 324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-650 ；
14)hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307 ；
15)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650、hsa-miR-513 ；
16)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307 ；
17)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b ；
18)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650 ；
19)hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-650 ；
20)hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p ；
21)hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa_miR-513b ；
22)hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p ；
23)hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b ;和
24)hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-6500
[0045]本發(fā)明的方法也可以包括:確定 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(或與 hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性的生物標(biāo)志物)的四聯(lián)組合的表達(dá)水平。具體地，可以同時(shí)或依次確定下述生物標(biāo)志物四聯(lián)組合的表達(dá)水平:
1)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307 ；
2)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p ；
3)hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307 ；
4)hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650 ；
5)hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p ；
6)hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650 ；
7)hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307 ；
8)hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p ；
9)hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307 ；
10)hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b ；
11)hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p ；
12)hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b ；
13)hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307 ；
14)hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307、hsa-miR-1307 ；
15)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-1307 ；
16)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b ；
17)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-650 ；
18)hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa_miR-513b ；
19)hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p ；
20)hsa-miR-1307、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-650 ；21)hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p ；
22)hsa-miR-1307、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b ；
23)hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b、hsa-miR-650 ;和
24)hsa-miR-1307、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-650m、hsa-miR-513b。[0046]本發(fā)明的方法可以包括:從樣品(例如，組織樣品)收集核酸樣品。所述樣品優(yōu)選地是得自癌癥患者的腫瘤樣品。例如，所述樣品可以得自肺癌患者，諸如患有非小細(xì)胞肺癌的患者。本發(fā)明的方法可以任選地包括:使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增核酸分子，以產(chǎn)生擴(kuò)增的溶液。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括:使用從樣品收集的核酸分子，或使用上述的擴(kuò)增的溶液，在熱循環(huán)儀中執(zhí)行qRT-PCR，以測量樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。用于執(zhí)行qRT-PCR的操作描述在例如美國專利號7，101，663和美國專利申請?zhí)?006/0177837和2006/0088856中，它們中的每一篇通過引用并入本文?？梢栽谙嗤磻?yīng)中同時(shí)確定樣品中的 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的2種或更多種(和任選地，在表1和2中列出的一種或多種其它生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平?？商鎿Q地，可以在不同反應(yīng)中同時(shí)確定樣品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的2種或更多種(和任選地，在表1和2中列出的一種或多種其它生物標(biāo)志物，如果需要的話)的表達(dá)水平。此外，可以在相同反應(yīng)或分開的反應(yīng)中相繼地確定 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的2種或更多種(以及在表1和2中列出的一種或多種其它生物標(biāo)志物，如果需要的話)的表達(dá)水平。
[0047]本發(fā)明的方法還可以包括，在一種或多種癌癥治療(例如，外科手術(shù)、放射療法和/或化學(xué)療法)以后，基于樣品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的一種或多種(和任選地，在表1和2中列出的一種或多種其它生物標(biāo)志物，如果需要的話)的表達(dá)水平，預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)。
[0048]例如，一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加可以指示一種或多種癌癥治療(諸如上述的那些治療)以后沒有復(fù)發(fā)的良好預(yù)后?？商鎿Q地，一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降可以指示一種或多種癌癥治療(諸如上述的那些治療)以后沒有復(fù)發(fā)的良好預(yù)后。此外，一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加可以指示一種或多種癌癥治療以后癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后?？商鎿Q地，一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降可以指示一種或多種癌癥治療以后癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后?？商鎿Q地，檢測任一種生物標(biāo)志物的表達(dá)可以單獨(dú)地指不癌癥治療以后癌癥患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
[0049]良好預(yù)后表示這樣的情況:其中患者在第一癌癥治療之后將存活至少5年(例如，
4、5、6、7、8、10或12年或更多年)，而不良預(yù)后表示這樣的情況:其中患者在第一癌癥治療之后可能不會存活至少5年?？ㄆ仗m-邁耶曲線可以用于對比隨時(shí)間的存活，如圖1和2所示。
[0050]在用于預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法中，可以相對于正常細(xì)胞中的表達(dá)水平，或相對于得自已經(jīng)經(jīng)歷第一療程的患者的癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，確定一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
[0051]使用本發(fā)明的生物標(biāo)志物進(jìn)行癌癥預(yù)后的裝置和方法
本發(fā)明涉及包括一種或多種寡核苷酸探針的裝置，所述寡核苷酸探針具有的序列與hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的一種或多種的序列的至少5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè)；優(yōu)選22個(gè))連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)相同或互補(bǔ)。所述裝置的寡核苷酸探針還可以包括這樣的序列:與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè)；優(yōu)選22個(gè))連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85% (例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性的序列。例如，所述裝置可以包括這樣的寡核苷酸探針:其可以用于檢測得自患者的組織樣品中的hsa-miR_513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的任意一種或多種(例如，任意組合)或與這些生物標(biāo)志物互補(bǔ)的序列的存在或表達(dá)水平。
[0052]優(yōu)選地，本發(fā)明的裝置包括這樣的寡核苷酸探針:其具有的序列與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQ ID NO: 1-4)中的一種或多種的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%序列同一性。更優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針:其與hsa-miR-513b、hsa-miR-650>hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任意一個(gè)或多個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體具有至少100%序列同一性。所述裝置可以包括這樣的探針:其可以用于檢測僅一種生物標(biāo)志物的存在或表達(dá)水平，或者它們可以包括這樣的探針:其可以用于檢測2、3或4種生物標(biāo)志物的組合的存在或表達(dá)水平。
[0053]例如，所述裝置 可以包括寡核苷酸探針的下述配對組合，所述寡核苷酸探針與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè)；優(yōu)選22個(gè))連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性:
1)hsa_miR-513b 和 hsa-miR-650 ；
2)hsa_miR-513b 和 hsa-miR-324_3p ；
3)hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 ；
4)hsa-miR-650 和 hsa-miR-324_3p ；
5)hsa-miR-650 和 hsa-miR-1307 ；
6)hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307。
[0054]優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針的配對組合，所述寡核苷酸探針與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%序列同一性。更優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針的配對組合，所述寡核苷酸探針與 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少100%序列同一'丨生。
[0055]所述裝置還可以包括寡核苷酸探針的下述三聯(lián)組合，所述寡核苷酸探針與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè))連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性:
1)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p ；
2)hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-1307 ；
3)hsa_miR-513b、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307 ;和
4)hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-1307。
[0056]優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針的三聯(lián)組合，所述寡核苷酸探針與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是 SEQID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%序列同一性。更優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針的三聯(lián)組合，所述寡核苷酸探針與 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少100%序列同一'丨生。[0057]所述裝置還可以包括這樣的寡核苷酸探針:其與hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1_4)中的每一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約5個(gè)(例如，5、6、7、8、10、12、15、20或22個(gè))連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%序列同一性。優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針:其與 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p 和 hsa-miR-1307生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的每一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少85%序列同一性。更優(yōu)選地，所述裝置包括這樣的寡核苷酸探針:其與 hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物(分別是SEQ ID NO: 1-4)中的每一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體在至少約22個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)內(nèi)具有至少100%序列同一'丨生。
[0058]上述裝置的寡核苷酸探針可以具有例如5-20、25、5-50、5-100、25-100、50-100個(gè)
或超過100個(gè)核苷酸的長度。所述寡核苷酸探針可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA) ο
[0059]本發(fā)明也涉及使用上述裝置檢測患者樣品中的hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物之一、或者 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的2種或更多種的任意組合的表達(dá)或者確定其表達(dá)水平從而在癌癥治療以后預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的方法。
[0060]本發(fā)明的含有一種或多種寡核苷酸探針的裝置可以是微陣列裝置。所述微陣列裝置可以含有寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針可以是，例如，與RNA (例如，mRNA)或微RNA對應(yīng)或互補(bǔ)的cDNA，或者所述寡核苷酸探針可以是與RNA (例如，mRNA)或微RNA的一部分雜交的cDNA片段。示例性的RNA包括miRNA和miRNA前體。示例性的微陣列也包括具有多個(gè)與底物結(jié)合的核酸的“核酸微陣列”，與所述多個(gè)結(jié)合的核酸中的每一個(gè)的雜交是可單獨(dú)檢測的。
[0061]本發(fā)明的微陣列可以包括一種或多種寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針的核苷酸序列與 hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa_miR-513b 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物的例如至少5、8、12、20、22、30、40、60、80、100、150或200個(gè)連續(xù)核苷酸(或核苷酸類似物)相同或互補(bǔ)，和/或與下面表1和2列出的一種或多種生物標(biāo)志物相同或互補(bǔ)。所述寡核苷酸探針可以具有在例如5-20、5-50、25-50、5-100、25-100、50-100個(gè)或超過100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的長度。所述寡核苷酸探針可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其類似物，諸如LNA。用作對癌癥治療的應(yīng)答性的生物標(biāo)志物的寡核苷酸探針內(nèi)的連續(xù)核苷酸(例如，5-20、25、5-50、50-100，或超過100個(gè)連續(xù)核苷酸)也可以作為本文描述的一種或多種基因中的連續(xù)核苷酸出現(xiàn)，其始于下面表1和2中列出的基因的例如第I個(gè)、第10個(gè)、第20個(gè)、第30個(gè)、第40個(gè)、第50個(gè)、第60個(gè)、第70個(gè)、第80個(gè)、第90個(gè)、第100個(gè)、第150個(gè)、第200個(gè)、第500個(gè)或第1000個(gè)核苷酸處或附近。
[0062]當(dāng)將從樣品(例如，患者樣品)制備的不同核酸分子群體應(yīng)用于上述裝置時(shí)，樣品中的一種或多種靶核酸分子與所述裝置上的一種或多種探針雜交。這種雜交允許檢測樣品中的一種或多種靶核酸分子(例如，本文中描述的一種或多種生物標(biāo)志物)和/或確定所述靶核酸分子的量，并提供一種或多種靶核酸分子的表達(dá)水平的讀出。所述一種或多種靶核酸分子可以是上述的 hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的任一個(gè)，以及還可以包括下面表1和2中描述的任意一種或多種生物標(biāo)志物。上述裝置可以用于同時(shí)地(或依次地)檢測這些生物標(biāo)志物中的一種或多種或確定其表達(dá)水平。任選地，在使用本發(fā)明的裝置進(jìn)行檢測之前，可以使用例如PCR擴(kuò)增從樣品分離出的核酸分子，以產(chǎn)生擴(kuò)增的樣品。然后可以將擴(kuò)增的樣品應(yīng)用于本發(fā)明的裝置。
[0063]本發(fā)明的裝置可以用在這樣的方法中，所述方法在一種或多種癌癥治療之前和/或之后,確定樣品中的 hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p 和 hsa-miR-1307 生物標(biāo)志物中的一種或多種的表達(dá)水平以預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)。所述裝置可以用于同時(shí)地(或依次地)確定多種生物標(biāo)志物(例如，2、3或4種生物標(biāo)志物)的表達(dá)水平，并使用該信息來確定患者的癌癥 復(fù)發(fā)預(yù)后。
[0064]在一個(gè)實(shí)施例中，在處理之前，將細(xì)胞/組織樣品在液氮中快速冷凍。按照生產(chǎn)商的說明書，使用例如得自Invitrogen的Trizol試劑,可以提取RNA。按照生產(chǎn)商的說明書，使用例如得自Ambion Inc.的MessageAmp試劑盒,可以擴(kuò)增RNA。使用例如RecoverAll(Ambion Inc.),可以從福爾馬林固定的石臘包埋樣品提取微RNA,并使用例如GenisphereHSR (GenisPhere Inc.)進(jìn)行標(biāo)記。使用生產(chǎn)商的說明書,使用例如得自Affymetrix Inc的HG-U133A GeneChip和相容的儀器(例如，得自Affymetrix的GCS3000Dx)，可以定量擴(kuò)增的RNA。使用Affymetrix miRNA 1.0或2.0版，可以定量微RNA。
[0065]可以進(jìn)一步處理得到的基因表達(dá)測量結(jié)果，例如，如在實(shí)施例1-3中所述。使用可從R-Project得到的R軟件,并補(bǔ)充可從Bioconductor得到的包,可以實(shí)現(xiàn)描述的操作。
[0066]就肺癌預(yù)后而言，hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p和 hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)可足以給出準(zhǔn)確預(yù)測。優(yōu)選地，使用hsa-miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324-3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的2種或更多種。另外，3_50種mRNA或微RNA生物標(biāo)志物(諸如在表1和2中列出的那些)可以用于提供甚至更準(zhǔn)確的預(yù)測。鑒于所需的生物標(biāo)志物的數(shù)目相對地小，可以執(zhí)行諸如定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)等操作，以更大精確度確定在樣品中表達(dá)的生物標(biāo)志物的量。這將提供上述裝置的使用的替代或補(bǔ)充。例如，可以單獨(dú)地或與本文中描述的微陣列聯(lián)合地執(zhí)行qRT-PCR。
[0067]用于在癌癥治療以后預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的試劑盒本發(fā)明也涉及用于在一種或多種癌癥治療以后預(yù)測癌癥患者(例如，肺癌患者)的癌癥復(fù)發(fā)的試劑盒。所述試劑盒可以包括用于從得自患者的樣品收集核酸分子的試劑。例如，所述試劑盒可以包括用于裂解患者樣品的試劑，和/或用于從患者樣品分離和純化RNA的試劑。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括用于例如通過PCR擴(kuò)增從患者樣品分離出的核酸分子的試劑。所述試劑盒可以包括使用本領(lǐng)域已知的測定(例如，qRT-PCR)來確定一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的試劑，所述生物標(biāo)志物與hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR-513b和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的任一個(gè)的序列或它們的補(bǔ)體具有至少85%(例如，85%、90%、95%、97%、99%或100%)序列同一性。所述試劑盒可以包括引物和探針，所述引物和探針用于執(zhí)行qRT-PCR以確定上述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。所述試劑盒可以包括基于使用所述試劑盒確定的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平而預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的說明書。
[0068]所述試劑盒可以進(jìn)一步包括上述裝置中的任一種，可以向其應(yīng)用得自患者的核酸樣品或擴(kuò)增的溶液，使得所述裝置上的探針可以與樣品中的靶生物標(biāo)志物雜交，并提供樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物(例如，hsa_miR-513b、hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p和hsa-miR-1307生物標(biāo)志物中的一種或多種)的表達(dá)水平的讀出。所述裝置允許同時(shí)(或依次)測量樣品中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。所述試劑盒中的裝置可以是微陣列裝置。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括，關(guān)于基于使用上述裝置確定的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平而預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)(例如，良好預(yù)后或不良預(yù)后)的說明書。另外，所述試劑盒的裝置可以與基于qRT-PCR的測定聯(lián)合使用，以確定一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。此外，所述試劑盒可以包括基于生物標(biāo)志物的表達(dá)水平而預(yù)測癌癥復(fù)發(fā)的軟件程序。[0069]在一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒可以包括用于從腫瘤提取RNA的試劑(例如，得自Invitrogen Inc 的 Trizol),用于擴(kuò)增 RNA 的試劑(例如，得自 Ambion Inc 的 MessageAmp),用于確定基因表達(dá)的微陣列(例如，得自Affymetrix Inc的HG-U133A GeneChip)，微陣列雜交站和掃描儀(例如，得自Affymetrix Inc的GeneChip System 3000Dx),和用于分析如本文中所述的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的軟件(例如，在得自R-Project的R或得自Insightful Corp.的 S-Plus 中實(shí)現(xiàn))。
實(shí)施例
[0070]實(shí)施例1:可用于肺癌預(yù)后的微RNA
將得自79位具有病理學(xué)第I期NSCLC的患者的福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織樣本用于分析。從Roswell Park Cancer Institute的腫瘤登記收集臨床數(shù)據(jù)，并通過病歷審查(chart review)進(jìn)行驗(yàn)證。將組織脫臘,并提取miRNA。在提取的RNA的質(zhì)量控制評估以后，執(zhí)行與基于鎖定核酸(LNA)的陣列平臺(Exiqon Inc.)的雜交,所述平臺含有針對miRBase 11版中的所有miRs的探針。對得自陣列的數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和Loess標(biāo)準(zhǔn)化。在留一法交叉驗(yàn)證中，使用多重檢驗(yàn)校正(剩下0.1%的假發(fā)現(xiàn)率)，用t-檢驗(yàn)選擇在具有復(fù)發(fā)的患者和沒有復(fù)發(fā)的患者之間差異表達(dá)的miRNA。對得到的miRNA進(jìn)行主組分分析，并將5個(gè)最重要的組分用于訓(xùn)練使用分類算法K最近鄰、最近形心、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和支持向量機(jī)的多變量分類器。通過分類算法中的大多數(shù)投票，將留出的樣品預(yù)測為良好或不良預(yù)后。針對良好和不良預(yù)后組，制備到復(fù)發(fā)的時(shí)間的卡普蘭-邁耶圖。進(jìn)行2個(gè)組之間的差異的統(tǒng)計(jì)顯著性的對數(shù)秩檢驗(yàn)。[0071]結(jié)果-在79個(gè)樣品中，78個(gè)樣品通過了雜交的質(zhì)量控制條件。如上詳述地進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析導(dǎo)致60種微RNA被所有78個(gè)分類器選擇。表1顯示所述60種微RNA并連同在所有78個(gè)樣品的分析中統(tǒng)計(jì)上顯著的共157種微RNA (FDR=1%)，并為其計(jì)算P-值和log2倍數(shù)變化。60-基因模型以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式預(yù)測出結(jié)果(圖1)。
[0072]實(shí)施例2:可用于肺癌預(yù)后的微RNA
使用少至2或3種微RNA來得到如在實(shí)施例1中描述的肺癌樣品的分類是可能的。如果所述 2 或 3 種微 RNA 是選自 hsa-miR-141、hsaiiR-22、hsa_miR-200b*、hsa-miR-630、hsa-miR-27a、hsa-miR-510、hsa-miR-30c-l*的名單，可以實(shí)現(xiàn)與圖1所示的結(jié)果類似的分類表現(xiàn)。具有O的截止值的第一主要組分可以單獨(dú)地用于預(yù)測復(fù)發(fā)或非復(fù)發(fā)。也可以使用基于選自表1的2或3種微RNA的表達(dá)的其它分類方法。
[0073]實(shí)施例3:使用具有與微RNA互補(bǔ)的DNA探針的Affyme trix陣列
實(shí)施例1和2涉及使用得自Exiqon的鎖定核酸平臺來鑒別微RNA，所述微RNA可以用于區(qū)分具有良好預(yù)后和不良預(yù)后的患者?；贒NA的平臺(諸如Affymetrix)具有不同的物理和化學(xué)性能，并且將產(chǎn)生用于相同目的的不同的最佳微RNA名單。在AffymetrixGeneChip?miRNA 1.0陣列上，分析了在實(shí)施例1中使用的相同的FFPE樣品。對于每個(gè)樣品，使用恒定總RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用支持向量機(jī)svm (得自www.bioconductor.0rR的文庫el071，具有默認(rèn)參數(shù))來訓(xùn)練預(yù)測器。在交叉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，在Affy平臺上的下述3種微RNA探針會最佳地分離不良預(yù)后與良好預(yù)后的患者:hsa- hsa-miR-650、hsa-miR-324_3p、hsa-miR_513b。在這些中，hsa_miR-513b對預(yù)后的貢獻(xiàn)最大，其次是hsa-miR-650,再其次是hsa-miR-324-3p (它的重要性最低)。如果需要第四種miR，可以使用hsa-miR-1307，并且可以提高一些數(shù)據(jù)集的表現(xiàn)。
[0074]實(shí)施例4:得自實(shí)施例3的4-微RNA譜的獨(dú)立驗(yàn)證
在31位處于Ia期的NSCLC患者的組群中，獨(dú)立地驗(yàn)證了得自實(shí)施例3的3-微RNA譜(圖2)。以與實(shí)施例3中的組群相同的方式將該組群標(biāo)準(zhǔn)化。使用在得自實(shí)施例3的組群上訓(xùn)練過的支持向量機(jī)，預(yù)測患者具有良好預(yù)后或不良預(yù)后。在圖2中的卡普蘭-邁耶曲線顯示了 2個(gè)預(yù)測組的總存活率。在良好和不良預(yù)后組之間存在存活率的統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(在對數(shù)秩檢驗(yàn)中，P=0.0001)。
[0075]表1.表示在miRCURY LNA陣列(V.10.0, Exiqon)上的miRNA的探針I(yè)D的名單。60-基因表示在留一法交叉驗(yàn)證中該miRNA是否被所有分類器選擇。“是”的值指示該miRNA是更可靠和重要的。
ID 名稱log2(FC) P-值 60-基因
17327hsa-miR-630 -0.421 2.74e_09 是 17859 hsa-miR-200b* -0.438 8.78e_09 是 42834 hsa-miR-219-2-3p -0.606 1.lle-07 否 42682 hsa-miR-25 0.979 1.47e_07 否 42957 hsa-miR-323-3p -0.536 2.99e_07 否 42702 hsa-miR-30c-l* -0.426 3.22e_07 是 42593 hsa-miR-623 -0.551 3.23e_07 是
5250 hsa-miR-105 1.14 3.75e_07 否
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括確定得自患者的樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平,該生物標(biāo)志物與SEQ ID NO:1的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)示所述患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物包含SEQID NO:1的序列。
3.一種用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括確定得自患者的樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平,該生物標(biāo)志物與SEQ ID NO: 2的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)示所述患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物包含SEQID NO: 2的序列。
5.一種用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括確定得自患者的樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)水平,該生物標(biāo)志物與SEQ ID NO: 3的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)示所述患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物包含SEQID NO: 3的序列。
7.一種用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括確定得自患者的樣品中至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，該生物標(biāo)志物與SEQ ID NO: 1-3中的任一個(gè)的序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)示所述患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物包含SEQID NO: 1_3中的任一個(gè)的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括確定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，該生物標(biāo)志物與SEQ ID NO: 4的序列具有至少85%序列同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法進(jìn)一步包括確定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，該生物標(biāo)志物具有SEQ ID NO: 4的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求ι-?ο中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣品是組織樣品。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中該樣品是腫瘤樣品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該癌癥是肺癌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該肺癌是非小細(xì)胞肺癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之后，在所述患者中發(fā)生。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之前，在所述患者中發(fā)生。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之后，但是在第二癌癥治療之前，在所述患者中發(fā)生。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第二癌癥治療之后，在所述患者中發(fā)生。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-18中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包括外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法中的一種或多種。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后，或者其中所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后，或者其中所述一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中的任一項(xiàng)所述的方法，其中如下確定所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平:從所述樣品收集核酸分子，并任選地，使用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來擴(kuò)增所述核酸分子。
23.一種用于檢測至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的裝置，該裝置包含至少一種單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的序列包含SEQ ID NO:1的序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中該裝置分別允許所述單鏈核酸分子和所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，其中該至少一種單鏈核酸分子包含SEQID NO:1的序列或它的補(bǔ)體序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。
25.一種用于檢測至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的裝置，該裝置包含至少一種單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的序列包含SEQ ID NO: 2的序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中該裝置分別允許所述單鏈核酸分子和所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的裝置，其中該至少一種單鏈核酸分子包含SEQID NO: 2的序列或它的補(bǔ)體序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。
27.用于檢測至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的裝置，該裝置包含至少一種單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的序列包含SEQ ID NO: 3的序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中該裝置分別允許所述單鏈核酸分子和所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其中該至少一種單鏈核酸分子包含SEQID NO: 3的序列或它的補(bǔ)體序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。
29.一種用于檢測至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的裝置，該裝置包含至少一種單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的序列包含SEQ ID NO: 1-3中的任一個(gè)的序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中該裝置分別允許所述單鏈核酸分子和所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其中該至少一種單鏈核酸分子包含SEQID NO: 1-3中的任一個(gè)的序列或它的補(bǔ)體序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求23-30中的任一項(xiàng)所述的裝置，該裝置進(jìn)一步包括至少一種單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物的序列或它的補(bǔ)體序列具有至少85%序列同一性，其中所述生物標(biāo)志物的序列包含SEQ ID NO: 4的序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中該裝置分別允許所述單鏈核酸分子和所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列之間的特異性雜交。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其中該至少一種單鏈核酸分子包含SEQID NO: 4的序列或它的補(bǔ)體序列的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求23-32中的任一項(xiàng)所述的裝置，其中所述至少一種單鏈核酸分子具有在10-100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的長度。
34.根據(jù)權(quán)利要求23-33中的任一項(xiàng)所述的裝置，所述裝置當(dāng)在允許發(fā)生雜交的條件下與從樣品制備的不同核酸分子群體接觸時(shí)，允許確定所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。
35.根據(jù)權(quán)利要求23-34中的任一項(xiàng)所述的裝置，其中該裝置是微陣列裝置。
36.一種用于預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括使用權(quán)利要求23-35中的任一項(xiàng)所述的裝置，確定患者樣品中的至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中所述生物標(biāo)志物的表達(dá)水平預(yù)示所述患者中的癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)后。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中該樣品是組織樣品。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中該樣品是腫瘤樣品。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中該癌癥是肺癌。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其 中該癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
41.根據(jù)權(quán)利要求36-40中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之后，在所述患者中發(fā)生。
42.根據(jù)權(quán)利要求36-40中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之前，在所述患者中發(fā)生。
43.根據(jù)權(quán)利要求36-40中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第一癌癥治療之后，但是在第二治療之前，在所述患者中發(fā)生。
44.根據(jù)權(quán)利要求36-40中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該預(yù)測在第二癌癥治療之后，在所述患者中發(fā)生。
45.根據(jù)權(quán)利要求41-44中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包括外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法中的一種或多種的任意組合。
46.根據(jù)權(quán)利要求36-45中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后，或者其中所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降指示沒有癌癥復(fù)發(fā)的良好預(yù)后。
47.根據(jù)權(quán)利要求36-45中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的增加指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后，或者其中所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的下降指示癌癥復(fù)發(fā)的不良預(yù)后。
48.一種試劑盒，其包含用于從得自患者的樣品收集核酸分子的試劑、用于擴(kuò)增從所述樣品收集的所述核酸分子以產(chǎn)生擴(kuò)增的樣品的試劑，和至少一種用于檢測所述擴(kuò)增的樣品中的至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的裝置，該生物標(biāo)志物具有SEQ ID NO: 1-4中的任一個(gè)的序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中使用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來產(chǎn)生所述擴(kuò)增的樣品。
50.根據(jù)權(quán)利要求48-49中的任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括關(guān)于基于所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平而預(yù)測所述癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的說明書。
51.根據(jù)權(quán)利要求48-50中的任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述裝置是權(quán)利要求23-47中的任一項(xiàng)所述的裝置。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括關(guān)于將從樣品收集的核酸分子應(yīng)用于所述裝置的說明書，和/或關(guān)于通過檢測所述至少一種單鏈核酸分子與所述生物標(biāo)志物或它的補(bǔ)體序列的雜交來確定所述至少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平的說明書。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括關(guān)于基于使用所述裝置檢測出的所述至 少一種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平來預(yù)測癌癥患者的癌癥復(fù)發(fā)的說明書。
【文檔編號】C12Q1/68GK103930563SQ201280038428
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月1日
【發(fā)明者】S.克努森, W.梅津 申請人:醫(yī)學(xué)預(yù)后研究所