用于痤瘡的新th17分化標(biāo)志物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了RORγt或RORα的用途以及其用于診斷痤瘡和/或篩選Th17分化的抑制劑，特別是在抑制RORγt或RORα中的用途以及這些篩選到的抑制劑在痤瘡治療中的用途。
【專利說明】用于痤瘡的新TH17分化標(biāo)志物及其用途
[0001]本發(fā)明涉及一種首次通過鑒定Thl7細(xì)胞參與炎癥性過程來表征痤瘡的新方法，并且本發(fā)明還涉及靶向Thl7細(xì)胞在痤瘡中的功能的治療性應(yīng)用。
[0002]更具體的，本發(fā)明提供了 ROR Y t (也稱為RAR-相關(guān)孤兒受體C或視黃酸-相關(guān)孤兒受體(ROR) Y ] t或ROR C變體2或ROR Y 2)或ROR α (也稱為RORA或RAR-相關(guān)孤兒受體Α)的用途，以及其用于診斷痤瘡和/或篩選Thl7分化的抑制劑，特別是抑制ROR Y t或RORa中的用途以及所篩選的抑制劑在痤瘡治療中的用途。
[0003]痤瘡是最常見的皮膚狀況，影響著全球數(shù)百萬人?；加袊?yán)重痤瘡的患者常常由于與該疾病相關(guān)的癥痕而面臨嚴(yán)峻的心理和情緒問題。尋常痤瘡(acnevulgaris)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不被人所完全理解。
[0004]炎癥是痤瘡發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素之一。對革蘭氏陽性微生物痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)的免疫反應(yīng)可能在炎癥反應(yīng)起始中發(fā)揮主要作用(De YoungLMj Young JMj Ballaron SJj Spires DAj Puhvel SM.1ntradermal injection ofPropionibacterium acnes: a mode I of inflammation relevant to acne.J Invest Dermatol.1984Nov;83 (5):394-8 ； Jappe U，Ingham Ej Henwood Jj HollandKT.Propionibacterium acnes and inflammation in acne;P.acnes has T—cellmitogenic activity.Br J Dermatol.2002Feb;146(2):202-9)。最近發(fā)表的研究報告也指出Toll樣受體2 (TLR-2)參與炎癥性痤瘡(Fathy A，Mohamed RWj IsmaelNA，El—Akhra s MA.Expression of toll—like receptor2on peripheral bloodmonocytes of patients with inflammatory and noninflammatory acne vulgaris.Egypt J Immunol.2009;16(I):127-34 ；Nagy I, Pivarcsi A, Koreck A,Szell Mj UrbanEj Kemeny L.Distinct strains of Propionibacterium acnes induce selective humanbeta-defensin_2and interleukin_8expression in human keratinocytes throughtoll-like receptors.J Invest Dermatol.2005May;124(5):931-8)0
[0005]最近的報告表明，作為皮膚先天免疫的一部分，皮膚在應(yīng)對病原體增殖時表達(dá)多種抗菌妝(Braff MHj Bardan A, Nizet V, Gallo RL.Cutaneous defensemechanisms by antimicrobial peptides.J Invest Dermatol.2005Jul;125 (I):9-13 ；Schroder JM.Epithelial antimicrobial peptides: local innate defenseeffector molecules].Ann Dermatol Venereo1.2004Apr;131 (4):411-6 ；SelstedME，Ouellette AJ.Mammalian defensins in the antimicrobial immune response.Nat Immunol.2005Jun; 6 (6): 551-7) 0這類抗微生物劑中的重要成員包括人β防御素家族成員和衍生自顆粒溶素的肽(Deng et al, 2005 ；Harder et al, 2004 ；Mclnturffet al，2005)。人β防御素_1和2 (HBD-1和HBD-2)表達(dá)于毛囊皮脂腺單元并且在痤瘡病變中其表達(dá)上調(diào)(Chixrnnell et al，2001)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，選擇痤瘡丙酸桿菌的菌株可以通過TLRs激活HBD-2，這進(jìn)一步證實了這些肽在炎癥性痤瘡中的重要性(Nagy I,Pivarcsi A，Koreck A,Szell Mj Urban Ej Kemeny L.Distinct strainsof Propionibacterium acnes induce selective human beta-defensin_2andinterleukin-8expression in human keratinocytes through toll-like receptors.JInvest Dermatol.2005May;124(5):931-8) 0
[0006] 申請人:基于實驗證據(jù)首次提出了靶向Th-17細(xì)胞分化這樣一種新的炎癥性過程來治療和/或診斷痤瘡。
[0007]因此，本發(fā)明涉及編碼ROR Y t的DNA或mRNA以及相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途；和編碼RORa的DNA或mRNA以及相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途。本發(fā)明還涉及至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23A、IL-26、CCL20的標(biāo)志物作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
[0008]本發(fā)明提供了一種用于診斷痤瘡的方法，包括以下步驟:
[0009]a)檢測取自個體的樣品中的至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物(R0R Y t或RORa )和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0010]b)檢測取自健康個體的樣品中的至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL_22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0011]c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于個體中的表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的；
[0012]d)將步驟c)中至少一種標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
[0013]本發(fā)明還提供 了用于診斷痤瘡的方法，其還可以包括以下步驟:
[0014]a)檢測取自個體的樣品中的至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0015]b)檢測取自健康個體的樣品中的至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0016]c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于個體中的表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的；
[0017]d)將步驟c)中至少一種標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
[0018]本發(fā)明提供了用于監(jiān)測痤瘡進(jìn)展的方法，其包括以下步驟:
[0019]a)從個體取得生物樣品，
[0020]b)分析所取得的樣品中至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，并且至少一種標(biāo)記物的表達(dá)變化是痤瘡進(jìn)展的指示物。痤瘡進(jìn)展可以是從以粉刺為主到以更強(qiáng)炎性主導(dǎo)的狀態(tài)，也可以是向具體的痤瘡亞型發(fā)展，如結(jié)節(jié)囊腫性痤瘡或聚合性痤瘡(acne conglobata)。進(jìn)展也可以以其它方向發(fā)生，從較嚴(yán)重形式的痤瘡發(fā)展到較不嚴(yán)重形式的痤瘡。
[0021]本發(fā)明還提供了用于監(jiān)測旨在治療痤瘡的治療的功效的方法，包括如下步驟:
[0022]a)對經(jīng)鑒定具有一種或多種痤瘡癥狀的個體施用所需的治療，
[0023]b)從所述個體取得生物樣品，
[0024]c)分析至少一種本發(fā)明所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中至少一種標(biāo)記物表達(dá)的變化是痤瘡治療的指示物。
[0025]本發(fā)明涉及用于治療痤瘡的Th-17細(xì)胞分化抑制劑的體外篩選方法，包括測定所述候選物抑制或下調(diào)本發(fā)明所提出的標(biāo)志物(R0R Y t或ROR α )之一的表達(dá)或生物活性的能力。
[0026]更具體地，本發(fā)明涉及用于候選藥物的Thl7細(xì)胞分化抑制劑的體外篩選方法，包括如下步驟:[0027]a)收集至少兩種生物樣品:一種模擬痤瘡病變，一種模擬健康情況；
[0028]b)使至少一種樣品或樣品混合物與一種或多種待測候選藥物相接觸；
[0029]c)檢測b)中獲得的生物樣品或混合物中至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL_22、CCL20的表達(dá)標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能；
[0030]d)選擇能夠抑制在b)中獲得的所述樣品或混合物中測定的至少一種所提出的標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的表達(dá)標(biāo)志物的表達(dá)的候選藥物，并與未混合候選藥物的樣品的水平相比較。
[0031]在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于候選藥物的Thl7細(xì)胞抑制劑的體外篩選方法，包括如下步驟:
[0032]a)收集至少兩種生物樣品:一種模擬痤瘡病變，一種模擬健康情況；
[0033]b)使至少一種樣品或樣品混合物與一種或多種待檢測的候選藥物相接觸；
[0034]c)檢測b)步驟中獲得的生物樣品或混合物中至少一種所提出的標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能；
[0035]d)選擇能夠抑制在b)步驟中獲得的所述樣品或混合物中測定的至少一種選自所提出的標(biāo)志物的標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能的候選藥物，并與未混合候選藥物的樣品水平相比較。
[0036]本發(fā)明還涉及 通過如上所定義的篩選方法鑒定的抑制劑用于制備治療痤瘡和/或痤瘡相關(guān)疾病的組合物中的用途。更具體地，本發(fā)明包括通過篩選方法鑒定的所提出的標(biāo)志物的抑制劑用于制備治療痤瘡或痤瘡相關(guān)疾病的組合物中的用途，例如N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4_[2, 2，2- 二氟-1-羥基-1-( 二氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺(N_(
2,2, 2-trifluoroethyI)-N-[4-[2, 2, 2-trifluoro-1-hydroxy-1-(trifluoromethyl)ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide)，2氧甾酉享(氧化甾醇)，特別是24S-羥基膽固醇、24 (S), 25-環(huán)氧膽固醇和7-氧化留醇，2-氰基-3，12- 二氧代齊墩果-1,9(11) 二烯-28-酸甲酯(Methyl2-cyano_3, 12-dioxooleana-l，9 (11)dien-28-oate)或甲基巴多索隆(Bardoxolone methyl) ；-(8S, 9R, 10R, 13R, 14S, 16R, 17R) _17_[ (E, 2R)-2，6-二羥基-6-甲基 _3-氧代庚 _4-稀 ~2~ 基]-2, 16- 二羥基-4，4, 9, 13, 14-五甲基-8，10, 12, 15, 16, 17- Tn氫-7H-環(huán)戊二烯并[a]菲 _3，11- 二酮(-(8S, 9R, 10R, 13R, 14S, 16R, 17R)-17- [ (E, 2R)-2,6-dihydroxy-6-methyl-3-oxohept-4-en-2-yl]-2, 16-dihydroxy-4, 4, 9, 13, 14-pentamethyl-8, 10, 12, 15, 16, 17-hexahydro-7H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,11-dione)；5-(4-氯苯基)-6-乙基嘧啶-2，4-二胺；Y-D-谷氨?；?L-色氨酸；8_羥基-3-甲基-3, 4_ 二氫-2H-苯并[a]惠-1, 7, 12-三麗(8-hydroxy-3-methyl-3, 4-dihydro-2H-benzo[a]anthracene-1, 7, 12-trione) ；5, 7_ 二羥基-2-(4-羥基苯基)-4-氧代 _4H_ 色烯-3-釀鹽(5，7_dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-3_olate)；甲基-N- [4-(三氟甲基)苯基]-1，2-噁唑-4-甲酰胺或來氟米特(Leflunomide)；N-[(E)-(3-甲基苯基)亞甲基氨基]-6-嗎啉-4-基-2-(2-吡啶-2-基乙氧基)嘧啶_4_胺(N-[(E) -(3-methylphenyl)methylideneamino]-6-morpholin-4-yl_2-(2-pyridin-2-ylet hoxy)pyrimidin-4-amine) o
[0037]發(fā)明詳述
[0038]實際上，Thl7細(xì)胞是最初來自于原初⑶4+T細(xì)胞的分化的獨特的Th譜系，并且產(chǎn)生針對包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的多種細(xì)胞外病原體的免疫。有趣的是，雖然痤瘡丙酸桿菌是存在于健康人類皮膚上的共生細(xì)菌，但它已被認(rèn)為是尋常痤瘡的致病因子之一。但是，目前還不清楚痤瘡丙酸桿菌是否確實是非炎癥性和炎癥性痤瘡病變發(fā)展的真正誘因(Shaheen B, Gonzalez M.A microbial aetiology of acne-what is the evidence?Br JDermatol.201IApr18)。
[0039]Thl7細(xì)胞還與各種炎癥和自身免疫性疾病如銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥相關(guān)(Peck A, Mellins ED.Precarious balance:Thl7cells in host defense.1nfectTmmun.2010Jan;78(I):32-8)。
[0040]在分子水平上，Thl7細(xì)胞的特征在于產(chǎn)生獨特的效應(yīng)細(xì)胞因子譜圖，IL-17A、IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和TNF α，并且其發(fā)育、存活和增殖依賴于IL-23。這些細(xì)胞因子激活不同類型的細(xì)胞，如角質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致它們過度增殖并進(jìn)一步產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和抗微生物肽，這反過來在炎性皮膚中招募并激活其它免疫細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)大。此外，IL-17A和IL-17F形成IL-17產(chǎn)物的自分泌調(diào)節(jié)，而IL-17產(chǎn)物負(fù)責(zé)促進(jìn)和維持Thl7 細(xì)胞分化(Wei et al.2007，J Biol.Chem.，September20)。IL17 還負(fù)責(zé) CCL20 的上調(diào)，CCL20是基質(zhì)細(xì)胞中TH17細(xì)胞的特征性受體的配體，可以吸引額外的Thl7細(xì)胞到炎癥組織中。
[0041 ] 原初⑶4T細(xì)胞分化成Thl7細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要TGFb-1與IL-21、與IL-1b和IL-23或與IL-lb, IL-23和IL-6組合，并導(dǎo)致類維生素A (retinoid)相關(guān)孤兒受體(RORC)和視黃酸相關(guān)孤兒受體a (RORA)的表達(dá)，這是促進(jìn)ΤΗ17分化和實質(zhì)上調(diào)IL-17A和IL-17F表達(dá)的2個轉(zhuǎn)錄因子(Chung Y et al.Criticalregulation of early Thl7cell differentiation by interleukin-lsignaling.1mmunity2009;30:576-87, Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ, Locksley RM, StockingerB.and Immunity2006Feb;24(2):179-89)。
[0042]下文中，“Th-17分化譜圖分子”指的是表征Thl7細(xì)胞分化的生物分子，即從原初T細(xì)胞到Th-17細(xì)胞的分化所依賴的細(xì)胞因子和/或因子，換言之IL-6、IL-26、IL-23和/或由Thl7細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和/或因子(IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNFa、CCL20)，和/或由Thl7細(xì)胞表達(dá)的受體(CCR6、IL-23R)。
[0043]動物實驗將mROR- Y t (人類ROR Y t的鼠直系同源物)列為Th_17分化的主要調(diào)節(jié)物。鼠中RORYt的缺陷導(dǎo)致Thl7活性的降低并且嚴(yán)重降低了 IL-17的表達(dá)(IvanovII, McKenzie BS, Zhou L, Tadokoro CE, Lepelley A, Lafaille JJ, Cua DJ, LittmanDR.The orphan nuclear receptor RORyt directs the differentiation program ofproinflammatory IL-17+T helper cells.Cell.2006Sep22;126 (6):1121-33)。
[0044]本發(fā)明提供了 RORYt或RORa，其為Thl7細(xì)胞分化的重要物質(zhì)，并且作為下列實例中用于表征痤瘡的新型標(biāo)志物。
[0045]在具體的實施方式中，本發(fā)明提供了編碼RORyt的DNA或mRNA及其相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
[0046]在具體的實施方式中，本發(fā)明提供了編碼ROR a的DNA或mRNA及其相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
[0047]在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自 IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21, IL-22, IL-23A、IL-26, TNF α 或 CCL20 的標(biāo)志物作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
[0048]在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL_22、CCL20的標(biāo)志物作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
[0049]基于本發(fā)明的目的，術(shù)語“標(biāo)志物”或“生物標(biāo)志物”是指與特定病理狀態(tài)存在或不存在相關(guān)的生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物是特定的蛋白、mRNA或DNA。
[0050]為了更加清楚，使用下列定義:術(shù)語“所提出的標(biāo)志物”是指RORyt和/或RORa。“R0R Y t”是指RORC變體2的表達(dá)產(chǎn)物，即ROR Y mRNA或蛋白或RORC基因本身。類似地，“RORa ”是指RORA基因的表達(dá)產(chǎn)物，即ROR a mRNA或蛋白或RORA基因本身。
[0051]術(shù)語“表達(dá)水平”或“表達(dá)”是指由基因標(biāo)志物編碼的mRNA或蛋白的水平。
[0052]表達(dá)水平的分析或檢測可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法進(jìn)行，如蛋白質(zhì)印跡、IHC、質(zhì)譜(MALD1-T0F和LC/MS分析)、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何其它方法或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法對mRNA進(jìn)行分析?；诶?用特定核苷酸探針的mRNA雜交的技術(shù)是最常規(guī)的(Northern印跡、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、定量RT-PCR (qRT-PCR)、RNA酶保護(hù))。
[0053]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及診斷痤瘡的方法，包括以下步驟:
[0054]a)檢測取自個體的樣品中的至少一種上述所提出的標(biāo)志物，和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20 的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0055]b)檢測取自健康個體的樣品中的至少一種上述標(biāo)志物，和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20 的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0056]c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于個體的樣品中的表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的；
[0057]d)將步驟c)中至少一種標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
[0058]診斷痤瘡的方法，其還可以包括以下步驟:
[0059]a)檢測取自個體的樣品中的至少一種所提出的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0060]b)檢測取自正常個體的樣品中的至少一種所提出的標(biāo)志物的表達(dá)水平，
[0061]c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于個體樣品中的表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的；
[0062]d)將步驟c)中至少一種標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
[0063]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測痤瘡的進(jìn)展或變化的方法，其包括以下步驟:
[0064]a)從個體取得生物樣品，
[0065]b)分析所取得的樣品的至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，并且至少一種標(biāo)記物的表達(dá)變化是痤瘡進(jìn)展的指示物。因此，本發(fā)明還涉及診斷痤瘡進(jìn)展或變化的方法。
[0066]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及監(jiān)測旨在治療痤瘡的治療的功效的方法，包括如下步驟:
[0067]a)對經(jīng)鑒定具有一種或多種痤瘡癥狀的個體施用所需的治療，
[0068]b)從所述個體取得生物樣品，[0069]c)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的技術(shù)，分析取自b)的樣品中的至少一種所提出的標(biāo)志物和/或一種選自IL6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的其它標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中至少一種標(biāo)志物的表達(dá)變化是痤瘡治療的指示物。優(yōu)選地，至少一種上述標(biāo)志物的表達(dá)減少或接近已知的健康個體的表達(dá)水平。
[0070]表述“一種因子或標(biāo)志物的過表達(dá)”是指表達(dá)水平增加了至少50%，優(yōu)選至少100%，甚至更優(yōu)選至少200%，或以相等的顯著性差異表達(dá)，至少2倍，或至少為正常個體水平的兩倍；這整體證明上述趨化因子、細(xì)胞因子和受體的過表達(dá)，從而代表了表征痤瘡的標(biāo)志物。
[0071]本發(fā)明中，生物樣品對應(yīng)于取自個體的任何類型的樣品，可以是組織樣品或液體樣品如血液、淋巴或間質(zhì)液。
[0072]根據(jù)一個具體的和優(yōu)選的實施方式，所述樣品是不同大小的(優(yōu)選直徑I至6mm)的活檢，或通過剝離帶(例如D-Squames)的方式取得的皮膚樣品，方法為以下:Wong R et al., "Analysis of RNA recovery and gene expression in the epidermisusing non-1nvasive tape stripping" ;J Dermatol Sc1.2006Nov;44(2):81-92 ；或Benson NR, et al., 〃An analysis of select pathogenic messages in lesional andnon-lesional psoriatic skin using non-1nvasive tape harvesting' J Invest Dermatol.20060ct; 126(10):2234-41 ;或者其他 Wong R et al., "Use of RT-PCR and DNAmicroarrays to characterize RNA recovered by non-1nvasive tape harvesting ofnormal and inflamed skin".J Invest Dermatol.2004Jul; 123 (I): 159-67。根據(jù)剝離帶的原理，所用產(chǎn)品包括柔性透光性聚合物支持物和粘合劑。所述產(chǎn)品可反復(fù)施用到病人的皮膚上，優(yōu)選直到粘合性消失。獲得的樣品僅涉及表皮的最外層的內(nèi)容。一種用于特別分析根據(jù)該取樣方法所獲得的 蛋白含量的方法描述于專利申請W02009/068825 (Galderma R&D)中，以監(jiān)測特異于病理性皮膚狀況的標(biāo)志物并指導(dǎo)診斷。由于該方法快速、非侵入性且相對廉價的檢測某些蛋白標(biāo)志物的存在、不存在或變化，對其尤其優(yōu)選。這種方法尤其表征為質(zhì)譜檢測、ELISA或蛋白定量領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的任何其它方法。在從柔性的粘性支持物上獲得的皮膚樣品中進(jìn)行定量，目的是檢測至少一種蛋白，該蛋白的存在、不存在或與標(biāo)準(zhǔn)值相比量或濃度的變化與具體病理性皮膚狀況的存在、進(jìn)展或不存在有關(guān)。
[0073]本發(fā)明的另一個實施方式是體外篩選Thl7細(xì)胞分化候選抑制劑的方法，包括測定所述候選物抑制和/或下調(diào)本發(fā)明所提出的標(biāo)志物(R0RYt或RORa)中至少一種的表達(dá)或生物活性或包括反式激活性質(zhì)的生物功能的能力。所鑒定的候選物將影響給定標(biāo)志物的生物功能或由標(biāo)志物調(diào)控的生物過程。例如，候選物對ROR Y t和/或ROR a的抑制可能影響ROR Y t的生物功能，包括誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞的分化以及Thl7細(xì)胞的功能。
[0074]基于篩選目的，生物樣品由轉(zhuǎn)染細(xì)胞組成，轉(zhuǎn)染細(xì)胞含有在啟動子控制下(完全或部分)操控的報告基因，啟動子控制上述基因表達(dá)?；蛘撸瑔幼涌梢允?，至少部分的為合成組裝的，并包含ROR-響應(yīng)元件。通過分析報告基因的表達(dá)，評估化合物調(diào)節(jié)所提出的標(biāo)志物的功能的能力。
[0075]轉(zhuǎn)染細(xì)胞可進(jìn)一步改造成表達(dá)至少一種所提出的標(biāo)志物。
[0076]報告基因可編碼酶，其與相應(yīng)的底物提供具有顏色的產(chǎn)物如CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、GAL ( β -半乳糖苷酶)或GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)。其可能是熒光素酶或GFP (綠色熒光蛋白)。
[0077]報道基因蛋白量或其活性通常通過比色、熒光或化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行評估。
[0078]根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，生物樣品是表達(dá)了目的基因的細(xì)胞，并且上述步驟c)提供了基因產(chǎn)物活性的測量。
[0079]在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及利用所述篩選方法鑒定到的抑制劑/拮抗劑/反激動劑用于制備治療痤瘡和/或痤瘡相關(guān)疾病的組合物中的用途。
[0080]特別是，Y t或RORa的抑制劑/拮抗劑/反激動劑可以從以下列表中選擇:
[0081]-N-(2，2，2_ 二氣乙基)-N-[4_[2，2，2_ 二氣-1-羥基-1-( 二氣甲基)乙基]苯基]苯磺酰胺；該化合物是一種新的視黃酸受體相關(guān)孤兒受體-α / Y反激動劑。(MolPharmacol.2010Feb;77(2):228-36))
[0082]-2氧甾醇(氧化甾醇)，特別是24S-羥基膽固醇、24(S)，25-環(huán)氧膽固醇和7-氧化留酉享[a second class of nuclear receptors for oxysterols:Regulation of RORa andRORY activity by24S-hydroxycholesteroI (cerebrosterol)-Wang Y et al.BiochimBiophys Acta.2010Aug;1801 (8):917-23.Epub2010Mar6] ；Wang Y et al.Modulation ofretinoic acid receptor-related orphan receptor a and gamma activity by7-oxygenatedsterol ligands.J Biol Chem.2010Febl2;285(7):5013-25)) 0
[0083]-2-氰基-3，12-二氧代齊墩果-1，9 (11) 二烯_28_酸甲酯或甲基巴多索隆(也被稱為“RTA402”和“CDDO-甲基酯)。
[0084]-(8S，9R，IORj 13R，14S，16R，17R)_17_[(E，2R)_2，6_ 二羥基 _6_ 甲基-3-氧代庚-4-烯-2-基]-2，16-二羥基-4，4，9，13，14-五甲基-8，10，12，15，16，17-六氫-7H-環(huán)戊二烯并[a]菲_3，11-二酮或SI_124(Blaskovich MAj Sun Jj Cantor A et al.Discovery ofJS-124(cucurbitacin I)，a selective Janus Kinase/Signal Transducer and Activatorof Transcription2signaling pathway inhibitor with potent antitumor activityagainst human and murine cancer cells in mice Cancer Res2003;63:1270-1279)。
[0085]-乙胺嘧啶:-5-(4-氯苯基)-6-乙基嘧啶-2，4_二胺或乙胺嘧啶(Dariprim)(W0/2008/156644)
[0086]- Y -D-谷氨酉先基-L-色氨酸或 SCV-07 (SciClone Pharmaceuticals)(Nagabhushanam V,Subbarao K，Ramachandran M et al Inhibition of STAT3driven geneexpression in melanoma cells by SCV-07J Clin 0ncol2008;26 (May20，suppl):14619)。
[0087]8-羥基-3-甲基-3，4- 二氫 _2H_ 苯并[a]蒽 _1，7，12-三酮或 STA-21 (SongH, Wang Rj Wang S et al.A 1w-molecular~weight compound discovered throughvirtual database screening inhibits Stat3function in breast cancer cellsPNAS2005;102:4700-4705)。
[0088]-天然黃酮醇:如5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)_4_氧代-4H-色烯 _3_ 酌.鹽或山奈酌.(Kaempferol)(Bruno RDj Njar VC.Targeting cytochromeP450enzymes: a new approach in anticancer drug development.Bioorg MedChem.2007Augl;15(15):5047-60.Epub2007May23)。[0089]-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1，2-噁唑-4-甲酰胺或來氟米特(O’DonnellEFj Saili KSj Koch DC，Kopparapu PR，F(xiàn)arrer D，Bisson WHj Mathew LK，SenguptaS,Kerkvliet NI, Tanguay RL, Kolluri SK.The ant1-1nflammatory drug leflunomide isan agonist of the aryl hydrocarbon receptor.PLoS One.20100ctl;5(10)。
[0090] N-[(E)-(3-甲基苯基)亞甲基氨基]-6-嗎啉-4-基-2-(2-吡啶-2-基乙氧基)丨密 P定-4-胺或 STA5326 (Apilimod Synta pharmaceuticals) Wada et al: Selectiveabrogation of Thl response by STA-5326, a potent IL-12/IL-23inhibitor.Blood, 2007, 109 (3), 1 156-1164.；ffada et al:1L-12/1L-23inhibitors: apromising approach to the treatment of inflammatory disorders.DrugsFut.2008，33(1)，49-63。
[0091 ] - [ (3S, 5R, 8R, 9S, 10S, 12R, 13S, 14S) -3-[ (2S, 4S, 5R, 6R) ~5~ [ (2S, 4S, 5R, 6R) ~5~ [(2S, 4S, 5R, 6R) -4，5- 二羥基-6-甲基-環(huán)氧乙基-2-基]氧基-4-羥基-6-甲基-環(huán)氧乙基-2-基]氧基-4-羥基-6-甲基-環(huán)氧乙基-2-基]氧基-12，14- 二羥基-10，13- 二甲基-1，2，3，4，5，6，7，8，9，11，12，15，16，17-四-十氫環(huán)戊烷并[a]菲-17-基]_5H_ 呋喃-2-酮(-[(3S, 5R, 8R, 9S, 10S, 12R, 13S, 14S) -3- [ (2S, 4S, 5R, 6R) ~5~ [ (2S, 4S, 5R, 6R) ~5~[(2S, 4S, 5R, 6R)-4, 5-dihydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-12, 14-dihydroxy-10, 13-dimethyl-l, 2, 3,4,5,6,7,8,9, 11, 12, 15, 16, 17-tetra decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl] -5H-furan-2-one)或地高辛和其衍生物。
[0092]在另一個方面，抑制劑可能是多肽、DNA或反義RNA、s1-RNA或PNA ( “肽核酸”，即多肽鏈被嘌呤和嘧啶堿基取 代并具有用于與后者雜交的DNA樣結(jié)構(gòu))。
[0093]調(diào)節(jié)物可以是抗體，并且優(yōu)選單克隆抗體。有利的是，給患者施用足夠量的單克隆抗體，使測量血衆(zhòng)濃度為約0.01 μ g/ml至約100 μ g/ml,優(yōu)選約I μ g/ml至約5 μ g/ml。
[0094]本發(fā)明的目的是用于治療痤瘡。痤瘡可以理解為，所有的痤瘡形式，特別是簡單痤瘡(simple acne)、面皰性痤瘡(comedonic acne)、丘疫胺皰痤瘡(papulopustular acne)、丘疫粉刺痤瘡(papulocomedonic acne)、結(jié)節(jié)囊性痤瘡(nodulocystic acne)、聚合性痤瘡(acne conglobata)、頸背的癒痕瘤性痤瘡(cheloid acne of the nape of the neck)、反復(fù)發(fā)作的粟粒狀痤瘡(recurrent miliary acne)、壞死性痤瘡(necrotic acne)、新生兒痤瘡(neonatal acne)、職業(yè)性痤瘡(occupational acne)、玫瑰痤瘡(acne rosacea)、老年性痤瘡(senile acne)、日光 痤瘡(solar acne)和藥物相關(guān)的痤瘡(medication-relatedacne)以及更多的痤瘡有關(guān)病癥(如皮脂分泌過多)。
[0095]以下實施例說明本發(fā)明但不限制本發(fā)明的范圍。
[0096]表1:通過Affymetrix技術(shù)測定的mRNA表達(dá)。
[0097]分析Thl7分化譜圖分子IL-17A、IL-17F、IL-26、IL-6和所提出的標(biāo)志物RORA和RORC,以及IL-5、IL-4、IL-13 (通常被認(rèn)為是Th2細(xì)胞因子)。
[0098]表2:通過qRT-PCR(TaqMan低密度陣列技術(shù))測定mRNA的表達(dá)。分析Thl7分化譜圖分子IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、CCL20、IL-6和R0RC，所提出的標(biāo)志物之一，以及IL-5、IL-4和IL-13 (通常被認(rèn)為是Th2細(xì)胞因子)的表達(dá)。
[0099]表3:Thl7分化譜圖分子的蛋白表達(dá)(Luminex分析)。分析IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23a、CCL20 和 TNFa，以及 IL-5, IL-4 和 IL-13 (通常被認(rèn)為是 Th2 細(xì)胞因子)。[0100]圖1:痤瘡病變:T淋巴細(xì)胞免疫組化檢測(單獨⑶3)
[0101]圖2:痤瘡病變:Τ淋巴細(xì)胞中的IL-17表達(dá)(⑶3/IL17共定位)。
[0102]實施例1:與患有痤瘡的患者的非損傷皮膚比較，所述患者的損傷皮膚中的Thl7分子譜圖的調(diào)節(jié):分析 IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23A、IL-26、TNFa、CCL20和所提出的標(biāo)志物RORA和RORC的表達(dá)。
[0103]病人的選擇和組織活檢:
[0104]根據(jù)良好的臨床實踐，從12例痤瘡患者的炎癥性丘疹和非損傷皮膚取得痤瘡患者的皮膚活檢。(根據(jù) Wilkin et al.，2002，J.Am.Acad.Dermatol.Vol46, pages584_587 的分類進(jìn)行痤瘡亞型的臨床描述)。
[0105]為了評估基因在表達(dá)水平上的變化，對相同受試者(n=12)的損傷皮膚中的表達(dá)水平與非損傷皮膚中的表達(dá)水平相比較。
[0106]mRNA提取、標(biāo)記和雜交至探針陣列:
[0107]用RNeasy提取試劑盒(Quigen Inc.，Valencia, CA)從皮膚中分離mRNA,并用Agilent的2100生物分析儀對質(zhì)量進(jìn)行評估。利用T7-寡核苷酸引物和Affymetrix的一個循環(huán)cDNA合成試劑盒產(chǎn)生雙鏈cDNA(即體外轉(zhuǎn)錄過程)之后，通過基因芯片IVT標(biāo)記試劑盒對mRNA的表達(dá)進(jìn)行評估。RNA用乙醇沉淀來濃縮樣品，然后用分光光度計定量。利用T7-oligo(dt)引物(一個循環(huán)cDNA合成試劑盒,Affymetrix)從每個樣品中的約200ng的高質(zhì)量總RNA[RNA指示數(shù)(RIN)≥7]產(chǎn)生雙鏈cDNA。將通過體外轉(zhuǎn)錄(基因芯片IVT標(biāo)記試劑盒，Affymetrix)產(chǎn)生的生物素化的cRNA片段化并雜交到Affymetrix人U133A2.0+微點陣上。點陣在基因芯片射流站450(Gene Chip Fluidics Station450)上進(jìn)行處理并在Affymetrix基因芯片掃描儀(Santa Clara, CA)上進(jìn)行掃描。
[0108]基于Affymetrix基因芯片的mRNA表汰統(tǒng).計學(xué)分析:
[0109]將來自Affymetrix基因芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)用RMA(強(qiáng)大的多陣列分析)方法進(jìn)行歸一化。原始強(qiáng)度值經(jīng)背景校正、log2轉(zhuǎn)化以及分位數(shù)歸一化。接著將線性模型擬合至歸一化的數(shù)據(jù)，以獲得針對每個陣列上的每個探針組的表達(dá)測量。為了鑒定在不同痤瘡亞型樣品中受顯著調(diào)節(jié)的基因，用 JMP7.0.1 (SAS Institute)和 irMF3.5 (National Institute ofStatistical Sciences, NISS)軟件進(jìn)行帶有Benj amin1-Hochberg多重校正的單因素方差分析。
[0110]qRT-PCR 檢測 mRNA 的表汰:
[0111]通過qRT-PCR檢測Thl7譜圖的表達(dá)。
[0112]下列表格中，通過痤瘡患者的非損傷皮膚中和損傷皮膚中單獨基因的平均Ct (循環(huán)閾值)記錄表達(dá)水平。Ct值與給定基因的mRNA的量成反比。
[0113]細(xì)胞因子的提取和分析:
[0114]從12例痤瘡患者的炎癥性丘疫和非損傷皮膚中提取蛋白。通過Luminex分析(Millipore&Procarta細(xì)胞因子劑量試劑盒)量化蛋白提取物中的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的量相對蛋白總濃度歸一化。對每種細(xì)胞因子計算成對P值。
[0115]利用Affymetrix 技術(shù)(表 I)和 qRT-PCR(表 2)測量 Thl7 譜圖分子 IL-17A、IL-17F、IL-26、CCL20和所提出的標(biāo)志物ROR A和ROR C的mRNA表達(dá)。
[0116]通過Affymetrix (表1)或qRT-PCR(表2)技術(shù)測量的表征Thl7細(xì)胞分化的特異性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-26的mRNA在損傷皮膚中顯著上調(diào)。而且，在這些表中，IL5、IL4和IL13的mRNA表達(dá)未被檢測到或未發(fā)生改變，這表明痤瘡的炎癥反應(yīng)不是由Th2細(xì)胞驅(qū)動的。
[0117]表3證明，與非損傷皮膚相比較，損傷皮膚中IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22和TNFa的蛋白表達(dá)水平上調(diào)。
[0118]因此，Th-17細(xì)胞分化過程中顯示的細(xì)胞因子的這些表達(dá)差異證明了抑制或靶向Thl7細(xì)胞分化用于治療或診斷痤瘡的意義。
[0119]意外的是，轉(zhuǎn)錄因子ROR A和ROR C的mRNA水平在痤瘡中略有下降，但其在人皮膚中的表達(dá)得到明確證實。因此，它們作為標(biāo)志物用于診斷痤瘡和/或篩選Thl7細(xì)胞分化的抑制劑是有意義的。出于診斷目的，可以將其單獨或與至少一種前述的Thl7細(xì)胞分化譜圖分子組合使用。
[0120]實施例2:免疫組化分析:
[0121]在正常皮膚中，我們幾乎觀察不到任何淋巴細(xì)胞浸潤，然而在損傷區(qū)域的活檢中發(fā)現(xiàn)大量的浸潤。在這種情況下，利用免疫組化技術(shù)在這些損傷區(qū)域的浸潤中進(jìn)行IL17檢測。
[0122]為了檢測T淋巴細(xì)胞，使用第一抗體(抗⑶3)，再使用第二抗體(特異于IL-17)。
[0123]這些抗體分別與結(jié)合有紅色熒光基團(tuán)(TRITC)或綠色熒光基團(tuán)(FITC)的二級抗體反應(yīng)。
[0124]圖1所示的是⑶3表達(dá)的結(jié)果。陽性細(xì)胞(黑色)證實浸潤主要由T淋巴細(xì)胞組成。
[0125]圖2證明，⑶3陽性T淋巴細(xì)胞的亞群共表達(dá)IL-17。這種陽性IL-17染色表明了痤瘡病變中存在Thl7細(xì)胞。
[0126]
【權(quán)利要求】
1.編碼RORy t的DNA或mRNA以及相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
2.編碼RORa的DNA或mRNA以及相應(yīng)蛋白作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
3.至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23A、IL_26、CCL20的標(biāo)志物作為痤瘡標(biāo)志物的用途。
4.診斷痤瘡的方法，包括以下步驟: a)檢測取自個體的樣品中至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物，和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL_22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平， b)檢測取自健康個體的樣品中至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物，和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平， c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的； d)將步驟c)中至少一種 標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
5.診斷痤瘡的方法，其還可以包括以下步驟: a)檢測取自個體的樣品中至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物的表達(dá)水平， b)檢測取自健康個體的樣品中至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物的表達(dá)水平， c)比較至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異，并且對于表達(dá)水平顯著高于健康個體中的表達(dá)水平的； d)將步驟c)中至少一種標(biāo)志物的過表達(dá)作為痤瘡的指示物，由此診斷痤瘡。
6.監(jiān)測痤瘡的進(jìn)展或變化的方法，其包括以下步驟: a)從個體取得生物樣品， b)分析所取得的樣品中至少一種所提出的標(biāo)志物，和/或至少一種選自IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的標(biāo)志物的表達(dá)水平，并且其中，至少一種標(biāo)記物的表達(dá)變化是痤瘡進(jìn)展的指示物。
7.監(jiān)測旨在治療痤瘡的治療的功效的方法，包括如下步驟: a)對經(jīng)鑒定具有一種或多種痤瘡癥狀的個體施用所需的治療， b)從所述個體取得生物樣品， c)分析至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物和/或至少一種其它標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中至少一種標(biāo)志物的表達(dá)變化是痤瘡治療功效的指示物，所述其它標(biāo)志物選自IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20。
8.Th-17細(xì)胞分化抑制劑的體外篩選方法，包括測定所述候選物抑制或下調(diào)權(quán)利要求1或2所述的一種標(biāo)志物的表達(dá)的能力和/或抑制權(quán)利要求1或2所述的一種標(biāo)志物的包括反式激活活性在內(nèi)的生物功能的能力。
9.用于鑒定候選藥物的Thl7細(xì)胞分化抑制劑的體外篩選方法，包括以下步驟: a)收集至少兩種生物樣品:一種模擬痤瘡病變，一種模擬健康狀況； b)使至少一種樣品或樣品混合物與一種或多種待測試的候選藥物相接觸； c)檢測b)中獲得的生物樣品或混合物中至少一種所提出的標(biāo)志物和/或至少一種選自IL-17A、IL-17F、IL_22、CCL20的表達(dá)標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能； d)選擇能夠抑制在b)中獲得的所述樣品或混合物中測定的IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20的表達(dá)或生物功能的候選藥物，并與未混合所述候選藥物的樣品的水平相比較。
10.用于候選藥物鑒定的Thl7細(xì)胞抑制劑的體外篩選方法，包括如下步驟: a)收集至少兩種生物樣品:一種模擬痤瘡病變，一種模擬健康狀況； b)使至少一種樣品或樣品混合物與一種或多種待測試的候選藥物相接觸； c)檢測步驟b)中獲得的生物樣品或混合物中至少一種權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物的表達(dá)或生物功能； d)選擇能夠抑制在步驟b)中獲得的所述樣品或混合物中測定的至少一種選自權(quán)利要求I或2所述的標(biāo)志物的標(biāo)志物的表達(dá)或生物學(xué)功能的候選藥物，并與未混合候選藥物的樣品的水平或生物學(xué)功能相比較。
11.通過權(quán)利要求10所述的篩選方法鑒定的抑制劑用于制備治療痤瘡和/或痤瘡相關(guān)疾病的組合物中的用途。
12.通過篩選方法鑒定的權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)志物的抑制劑用于制備治療痤瘡或痤瘡相關(guān)疾病的組合物中的用途，例如N-(2，2，2-三氟乙基)-N-[4-[2，2，2-三氟-1-羥基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺，2氧留醇(氧化留醇)，特別是24S-羥基膽固醇、24 (S), 25-環(huán)氧膽固醇和7-氧化留醇，2-氰基-3，12- 二氧代齊墩果-1,9(11) 二烯-28-酸甲酯或甲基巴多索隆，-(8S, 9R, 10R, 13R, 14S, 16R, 17R)_17_[(E，2R) -2，6- 二羥基-6-甲基-3-氧代庚-4-烯-2-基]-2，16- 二羥基 _4，4，9，13，14-五甲基-8，10, 12, 15, 16, 17-六氫-7H-環(huán)戍二烯并[a]菲-3，11- 二酮,5- (4-氯苯基)-6-乙基嘧啶-2，4- 二胺，Y -D-谷氨酰基-L-色氨酸，8-羥基-3-甲基-3，4- 二氫-2H-苯并[a]蒽-1，7，12-三酮，5，7- 二羥基-2-(4-羥基苯基)-4_氧代-4H-色烯-3-酚鹽，甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1，2-噁唑-4-甲酰胺或來氟米特，N-[(E)-(3-甲基苯基)亞甲基氨基]-6-嗎啉-4-基-2-(2-吡啶-2-基乙氧基)嘧啶-4-胺。
【文檔編號】C12Q1/68GK103930565SQ201280041848
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月27日
【發(fā)明者】伊莎貝爾·卡拉旺 申請人:高德美研究及發(fā)展公司