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      用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的組合物和方法

      文檔序號:511198閱讀:459來源:國知局
      用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的組合物和方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了已被工程化改造以單獨地或與一種或多種香草醛生物合成酶類或UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)組合地表達突變體AROM多肽和/或突變體兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶多肽的重組微生物、植物和植物細胞。這樣的微生物、植物或植物細胞可以生產(chǎn)香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷。
      【專利說明】用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的組合物和方法
      [0001]發(fā)明簡介
      [0002]本申請要求分別提交于2011年8月8日和2011年8月10日的美國臨時申請?zhí)?1/521,090和61/522,096的優(yōu)先權(quán)利益,所述臨時申請的內(nèi)容整體通過參考并入本文。
      【背景技術(shù)】
      [0003]香草醛是世界上最重要的香料化合物之一,全球市場為1.8億美元。天然的香草醛源自于香草蘭(扁葉香果蘭(Vanilla planifolia))的熟化種莢,但是世界上大多數(shù)的香草醛從石化產(chǎn)品或木漿木質(zhì)素合成。從香草豆莢生產(chǎn)天然香草醛是費力且緩慢的過程,其需要對花進行手工授粉和將收獲到的綠色香草豆莢熟化1-6個月(Ramachandra&Ravishankar (2000)J.Sc1.Food Agric.80:289-304)。生產(chǎn) I 千克(kg)香草醛需要大約500kg香草豆莢,對應(yīng)于授粉大約40,000朵花。目前,每年銷售的香草醛中僅有約0.25% (16,000噸中的40噸)源自于香草豆莢,而其余的大多數(shù)從木質(zhì)素或化石烴類、尤其是愈創(chuàng)木酚化學(xué)合成。合成生產(chǎn)的香草醛售價約為每千克$15,與此相比天然香草醛的價格為每千克 $1200-4000 (Walton 等,(2003) Phytochemistry63:505-515)。
      [0004]發(fā)明概述
      [0005]本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷的方法。本發(fā)明的方法包括下列步驟:(a)提供能夠生產(chǎn)香草醛的重組宿主,其中所述重組宿主帶有編碼突變體Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突變體兒茶酚_0_甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)多肽的異源核酸;(b)將所述重組宿主培養(yǎng)足以使所述重組宿主產(chǎn)生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的時間;以及(c)從所述重組宿主或從所述培養(yǎng)上清液分離香草醛和/或香草醛葡萄糖苷,由此生產(chǎn)香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。
      [0006]在一種實施方式中,提供了突變體AROM多肽,其中所述突變體相對于缺少所述突變的相應(yīng)AROM多肽具有降低的莽草酸脫氫酶活性。根據(jù)這種實施方式,所述突變體AROM多肽可以在結(jié)構(gòu)域5中具有一個或多個突變、缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分或缺少結(jié)構(gòu)域5。
      [0007]在另一種實施方式中,所述突變體AROM多肽是融合多肽,其包括(i )本文描述的AROM多肽,例如,包含缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分的AROM多肽、或缺少結(jié)構(gòu)域5的AROM多肽;以及(ii)具有3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)活性的多肽。
      [0008]在其他實施方式中,提供了突變體COMT多肽,其中所述突變體具有一種或多種改進的性質(zhì)。具體來說,本發(fā)明提供了傾向于在原兒茶酸和/或原兒茶醛和/或原兒茶醇的間位而不是對位處催化甲基化的突變體COMT多肽。
      [0009]本文描述的任何多肽還可以在所述多肽的N-端或C-端包括純化標簽、葉綠體轉(zhuǎn)運肽、線粒體轉(zhuǎn)運肽、造粉體肽、信號肽或分泌標簽。
      [0010] 在某些實施方式中,所述宿主可以是微生物,例如酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)?;蛘?所述宿主可以是植物或植物細胞(例如小立碗蘚屬(Physcomitrella)植物或植物細胞、或煙草植物或植物細胞)。
      [0011]本文描述的任何宿主還可以包含編碼芳香族羧酸還原酶(ACAR)、3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)、尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)、磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase )、野生型AROM和/或野生型O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)的基因。
      [0012]還提供了編碼突變體COMT多肽或突變體AROM多肽的分離的核酸。
      [0013]附圖簡述
      [0014]圖1是香草醛(4)的從頭生物合成的示意圖,以及在表達3DSD、ACAR、OMT和UGT以及磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase)的生物體中發(fā)現(xiàn)的不同的香草醛降解產(chǎn)物和代謝副產(chǎn)物,即脫氫莽草酸(I)、原」L茶酸(2 )、原兒茶醛(3 )、香草酸(5 )、原兒茶醇(6 ),香草醇
      (7)和香草醛β-D-葡萄糖苷(8)的概述。空心箭頭示出了酵母中的主要代謝反應(yīng);黑色箭頭示出了通過代謝工程引入的酶反應(yīng);對角條紋箭頭示出了酵母固有的不想要的代謝反應(yīng)。
      [0015]圖2是使用野生型AROM多肽(左側(cè))和缺少結(jié)構(gòu)域5的突變體AROM多肽(右側(cè))細胞生物合成芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的示意圖。
      [0016]圖3Α示出了在表達各種突變體COMT多肽的酵母菌株中香草醛(VG)和異香草醛(IsoVg)的生產(chǎn)。
      [0017]圖3Β和圖3C示出 了與人類OMT (Hs-OMT)和人類L198Y OMT突變體(HS-0MTL198Y)相比,從各種來源分離的COMT多肽的香草醛(VG)和異香草醛(IsoVg)生產(chǎn)。致病疫霉(Phytophthera infestans) (PI),長春花(Catharanthus roseus) (CR),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) (YL),玻璃海鞘(Ciona intestinalis) GENBANK 登記號XP_002121420 和 XP_002131313 (C1-1 和 C1-2),Capsasproa owczarzaki (CO),嗜熱毛殼菌(Chaetomium therophilum) (CT),盧西坦棒抱酵母(Clavispora Iusitaniae (CL),副球抱子菌屬物種(Paracoccidioides sp) ‘lutzii’ PbOl (PL),扁葉香果蘭(Vanillaplanifolia) (VP),阿拉比卡咖啡樹(Coffea Arabica) (CA),大鼠(Rattus norvegicus)(RN),小鼠(Mus musculus) (MM),泉古菌(Crenarchaeote) (CREN), Mycobacteriumvanbaleeni (MV),或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (SP)0
      [0018]圖4不出了在增補有3mM香草醇的表達簡青霉(Penicillium simplicissium)(PS)或Rhodococcus jostii (RJ)香草醇氧化酶(VAO)的酵母菌株中香草醒葡萄糖苷、香草醛、香草醇葡萄糖苷和香草醇的水平。
      [0019]圖5示出了在增補有3mM香草酸的培養(yǎng)基中生長的表達N.1owensis ACAR或粗糙脈孢霉(N.crassa) ACAR和大腸桿菌磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase)或粟酒裂殖酵母(S.pombe) PPTase的酵母菌株中香草酸、香草醒和香草醒葡萄糖苷的水平。
      [0020]發(fā)明詳述
      [0021]本發(fā)明是基于下述發(fā)現(xiàn),即突變體AROM多肽可用于在重組宿主中提高3-脫氫莽草酸(3-DHS)積累。3-DHS是香草醛生物合成的前體,并且如果更多的細胞內(nèi)3-DHS可用,則在香草醛生物合成途徑的第一個關(guān)鍵步驟中可以制造更多的原兒茶酸。參見圖1。在酵母中,AROM是由AROl基因編碼的五功能酶復(fù)合物。所述基因長為4764bp,并編碼長度為1588個氨基酸的相應(yīng)多肽。AROM執(zhí)行5個連續(xù)的酶促轉(zhuǎn)化,即將DAHP (3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸)轉(zhuǎn)變成3-DHQ (3-脫氫奎尼酸),其被轉(zhuǎn)變成3-DHS (3-脫氫莽草酸),其被轉(zhuǎn)變成莽草酸,其被轉(zhuǎn)變成莽草酸-3-P (莽草酸3-磷酸),其被轉(zhuǎn)變成EPSP(5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸),它們?nèi)荚诜枷阕灏被崂野彼?、色氨酸和苯丙氨酸的細胞生物合成途徑?參見圖2)。
      [0022] AROM的5種催化功能在于AROl編碼的多肽的5個不同結(jié)構(gòu)域。AROM多肽的功能結(jié)構(gòu)域的次序,與在DAHP至EPSP的5步轉(zhuǎn)化中需要它們所具有的次序不同(參見圖2)。因此,結(jié)構(gòu)域I對應(yīng)于催化活性1,結(jié)構(gòu)域2對應(yīng)于催化活性5,結(jié)構(gòu)域3對應(yīng)于催化活性4,結(jié)構(gòu)域4對應(yīng)于催化活性2,并且最后的結(jié)構(gòu)域5對應(yīng)于催化活性3 (參見圖1)。
      [0023]含有AROM多肽的結(jié)構(gòu)域5變體(例如在結(jié)構(gòu)域5中具有一個或多個突變的AROM多肽或一部分結(jié)構(gòu)域5被缺失的AROM多肽)的重組宿主,與表達野生型AROM多肽的相應(yīng)宿主相比可以具有提高的3-DHS水平。這樣的宿主也可以具有增加的原兒茶酸生產(chǎn)。
      [0024]可選替地或此外,突變體COMT多肽可用于提高香草醛β -D-葡萄糖苷的生物合成。例如,本文描述的突變體COMT多肽可以具有下列性質(zhì)中的一個或多個:提高的周轉(zhuǎn);傾向于在間位(3’)而不是對位(4’)處甲基化,以便相對于異香草醛更有利于香草醛的生產(chǎn);或?qū)ο悴萑┩緩降孜镌瓋翰杷岷驮瓋翰枞┑母玫奶禺愋浴?br> [0025]因此,本發(fā)明提供了突變體AROM和突變體COMT多肽和編碼這樣的多肽的核酸及其在香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的生物合成中的使用。所述方法包括下述步驟:提供能夠在碳源存在下生產(chǎn)香草醛的重組宿主,其中所述重組宿主帶有編碼突變體COMT多肽和/或突變體AROM多肽的異源核酸;將所述重組宿主在碳源存在下進行培養(yǎng);以及從所述重組宿主或從所述培養(yǎng)上清液純化香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
      [0026]本文描述的重組宿主可用于生產(chǎn)香草醛或香草醛葡萄糖苷的方法。例如,如果重組宿主是微生物,方法可以包括將重組微生物在培養(yǎng)基中,在表達香草醛和/或香草醛葡萄糖苷生物合成基因的條件下生長。重組微生物可以在分批、補料分批或連續(xù)過程或其組合中生長。通常,重組微生物在處于確定溫度下的發(fā)酵罐中,在適合的營養(yǎng)源例如碳源存在下生長所需時間長度,以生產(chǎn)所需量的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
      [0027]在本方法中使用的碳源包括可以被重組宿主細胞代謝以促進生長和/或香草醛和/或香草醛葡萄糖苷生產(chǎn)的任何分子。適合的碳源的實例包括但不限于蔗糖(例如在糖蜜中存在的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纖維素、淀粉、纖維二糖或其他含葡萄糖聚合物。例如,在使用酵母作為宿主的實施方式中,諸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖的碳源是適合的。碳源可以在整個培養(yǎng)時間段中提供給宿主生物體,或者生物體可以在另一種能量源例如蛋白質(zhì)存在下生長一段時間,然后僅在分批補料階段中提供碳源。
      [0028]在一種實施方式中,這種方法的微生物帶有編碼突變體AROM多肽和任選地野生型COMT多肽的核酸。在另一種實施方式中,這種方法的微生物帶有編碼突變體COMT多肽和任選地野生型AROM多肽的核酸。在又一種實施方式中,這種方法的微生物帶有編碼突變體AROM多肽和任選地突變體COMT多肽的核酸。取決于方法中使用的具體微生物,也可以存在并表達編碼3DSD、ACAR、UGT或PPTase的其他重組基因。因此,在一種實施方式中,重組宿主可以是帶有編碼3DSD、ACAR、UGT或PPTase的一種或多種異源核酸或上述任一者的與其具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%序列同一性的功能同源物的微生物。產(chǎn)物、底物和中間體例如脫氫莽草酸、原兒茶酸、原兒茶醛、香草醛和香草醛β -D-葡萄糖苷的水平,可以通過從培養(yǎng)基提取樣品并按照已發(fā)表的方法進行分析來確定。[0029]在將重組微生物在培養(yǎng)基中生長所需時間長度后,可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)從培養(yǎng)基回收香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷,例如通過萃取、真空蒸餾和從水性溶液多步重結(jié)晶以及超濾進行分離和純化(Boddeker等,(1997) J.MembraneSc1.137:155-158 ;Borges da Silva 等,(2009) Chem.Eng.Des.87:1276-1292)。 使用巰基化合物例如二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、谷胱甘肽或L-半胱氨酸(美國專利號5,128,253)或堿性KOH溶液(W094/13614)的兩相萃取方法,已被用于香草醛的回收及其與其他芳香物質(zhì)的分離。使用聚醚-聚酰胺共聚物膜從生物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基吸附和滲透蒸發(fā)香草醛,也已被描述(Bdddeker 等,(1997)同上;Zucchi 等,(1998) J.Microbiol.Biotechnol.8:719-722)。具有交聯(lián)聚苯乙烯骨架的大孔吸附樹脂,也已被用于從水性溶液回收溶解的香草醒(Zhang等,(2008)Eur.Food Res.Technol.226:377-383)。也已評估了超濾和膜接觸器(MC)技術(shù)用于回收香草醛(Zabkova等,(2007) J.Membr.Sc1.301:221-237 ;Scuibba等,(2009)Desalination241:357-364)?;蛘撸梢允褂贸R?guī)技術(shù)例如滲濾或超臨界二氧化碳萃取和反滲透進行濃縮。如果重組宿主是植物或植物細胞,可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)從植物組織提取香草醛或香草醛葡萄糖苷。
      [0030]在某些實施方式中,香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷可以使用用含前體分子的原材料喂養(yǎng)的完整細胞來生產(chǎn)。原材料可以在細胞生長期間或細胞生長之后進料。完整細胞可以是懸浮的或固定化的。完整細胞可以在發(fā)酵液中或在反應(yīng)緩沖液中。在某些實施方式中,可能需要滲透劑將底物有效轉(zhuǎn)移到細胞中。
      [0031]在某些實施方式中, 香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷被分離和純化至均質(zhì)(例如純度至少90%、92%、94%、96%或98%)。在其他實施方式中,香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷被分離為重組宿主的提取物。在這種情況下,香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷可以被分離但不必純化至均質(zhì)。理想情況下,生產(chǎn)的香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的量可以為約Img/I至約20,000mg/L或更高。例如,可以生產(chǎn)約I至約100mg/L、約30至約100mg/L、約50至約 200mg/L、約 100 至約 500mg/L、約 100 至約 I, 000mg/L、約 250 至約 5,000mg/L、約 I, 000至約15,000mg/L或約2,000至約10,000mg/L的香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷。一般來說,更長的培養(yǎng)時間產(chǎn)生更大量的產(chǎn)物。因此,可以將重組微生物培養(yǎng)I天至7天、I天至5天、3天至5天、約3天、約4天或約5天。
      [0032]應(yīng)該認識到,本文中討論的各個基因和模塊可以存在于兩種或更多種重組微生物而不是單種微生物中。當使用多種重組微生物時,它們可以在混合培養(yǎng)中生長以生產(chǎn)香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
      [0033]分離和任選地純化的香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的提取物可用于香料消費品例如食品、飲食增補劑、營養(yǎng)品、藥物組合物、牙齒衛(wèi)生組合物和化妝品中。
      [0034]當在本文中使用時,短語“食品”包括但不限于水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、培根和香腸,蛋制品、水果濃縮物、明膠和明膠狀產(chǎn)品例如果醬、果凍、蜜餞等,乳制品例如冰激凌、酸奶油和果子露,糖霜、糖漿包括糖蜜,玉米、小麥、黑麥、大豆、燕麥、大米和大麥制品,堅果仁和堅果制品,蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖?和巧克力,口香糖、薄荷糖、奶油、糖霜、冰激凌、派和面包,飲料例如咖啡、茶、碳酸軟飲料例如可口可樂和百事可樂、非碳酸軟飲料、果汁和其他水果飲料、運動飲料例如GAT0RADE、咖啡、茶、冰茶、可樂,含酒精飲料例如啤酒、葡萄酒和白酒以及K00L-AID。[0035]食品還包括調(diào)味品例如藥草、香料和佐料、增味劑。食品還包括制備的包裝產(chǎn)品,例如飲食甜味劑、液體甜味劑、在用水重構(gòu)后提供非碳酸飲料的顆粒調(diào)味混合物、即溶布丁混合物、速溶咖啡和茶、咖啡伴侶、麥乳精混合物、寵物食品、牲畜飼料、煙草和用于烘烤應(yīng)用的材料,例如用于制備面包、曲奇、蛋糕、薄煎餅、甜甜圈等的粉末烘烤混合物。食品還包括含有很少或不含蔗糖的飲食或低卡路里食物和飲料。本發(fā)明設(shè)想的食品的其他實例描述在下面以及整個本說明書中。
      [0036]在另一種實施方式中,食品是水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、培根和香腸,蛋制品、水果濃縮物、明膠和明膠狀產(chǎn)品例如果醬、果凍、蜜餞等,乳制品例如冰激凌、酸奶油和果子露,糖霜、糖漿包括糖蜜,玉米、小麥、黑麥、大豆、燕麥、大米和大麥制品,堅果仁和堅果制品,蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖?和巧克力,奶油、糖霜、冰激凌、派和面包。
      [0037]在另一種實施方式中,消費品是藥物組合物。優(yōu)選的組合物是含有香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物。這些藥物組合物可用于配制含有發(fā)揮生物效應(yīng)的一種或多種活性劑的藥品。就此而言,藥物組合物優(yōu)選地還包括發(fā)揮生物效應(yīng)的一種或多種活性劑。這樣的活性劑包括具有活性的藥劑和生物劑。這樣的活性劑在本領(lǐng)域中是公知的。參見例如《醫(yī)生桌面參考》(The Physician’s DeskReference)。這樣的組合物可以按照本領(lǐng)域中已知的程序來制備,例如在《Remington制藥學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences) , Mack Publishing C0., Easton, PA, USA中所描述的。在一種實施方式中,這樣的活性劑包括支氣管擴張藥、減食欲藥、抗組胺藥、營養(yǎng)增補劑、緩瀉藥、鎮(zhèn)痛劑、麻醉劑、解酸劑、H2-受體拮抗劑、抗膽堿能類藥物、止瀉藥、緩和劑、止咳藥、止惡心藥、抗微生物劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、祛痰藥、消炎藥、退熱 劑及其混合物。在一種實施方式中,活性劑是退熱劑或鎮(zhèn)痛劑,例如布洛芬、對乙酰氨基酚或阿司匹林;緩瀉藥例如酚酞二辛基磺基琥珀酸鈉;食欲抑制劑例如安非他命、苯丙醇胺、苯丙醇胺鹽酸鹽或咖啡因;解酸劑例如碳酸鈣;平喘藥例如茶堿;抗利尿劑例如鹽酸地芬諾酯;有抗胃腸氣脹活性的藥劑例如西甲硅油;偏頭痛藥例如酒石酸麥角胺;精神病藥理學(xué)藥劑例如氟呱啶醇;解痙劑或鎮(zhèn)靜藥例如苯巴比妥;抗運動功能亢進藥例如甲基多巴或哌醋甲酯;鎮(zhèn)定劑例如苯并二氮卓類、hydroxinmeprobramates或吩噻嗪類;抗組胺藥例如阿司咪唑、馬來酸氯苯那敏、馬來酸吡拉明、琥珀酸多西拉敏、馬來酸溴苯那敏、檸檬酸苯托沙敏、鹽酸氯環(huán)嗪、馬來酸非尼拉敏和酒石酸苯茚胺;解充血藥例如鹽酸苯丙醇胺、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸偽麻黃堿、硫酸偽麻黃堿、重酒石酸苯丙醇胺和麻黃堿;β -受體阻斷劑例如普萘洛爾;用于戒酒的藥劑例如雙硫侖;止咳藥例如苯佐卡因、氫溴酸右美沙芬、諾斯卡品、檸檬酸咳必清和鹽酸氯苯達諾;氟增補劑例如氟化鈉;局部抗生素例如四環(huán)素或氯潔霉素;皮質(zhì)留類增補劑例如潑尼松或潑尼松龍;抗甲狀腺腫形成藥劑例如秋水仙素或別嘌呤醇;抗癲癇藥例如苯妥英鈉;抗脫水藥劑例如電解質(zhì)增補劑;防腐劑例如氯化鯨蠟基吡啶;NSAID例如對乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生或其鹽;胃腸活性劑例如洛哌丁胺和法莫替丁 ;各種生物堿類例如磷酸可待因、硫酸可待因或嗎啡;微量元素增補劑例如氯化鈉、氯化鋅、碳酸鈣、氧化鎂和其他堿金屬鹽和堿土金屬鹽;維生素;離子交換樹脂例如消膽胺;膽甾醇抑制藥和降脂物質(zhì);抗心律不齊藥例如N-乙酰普魯卡因酰胺;以及祛痰藥例如愈創(chuàng)木酚甘油醚。[0038]具有特別令人不快的味道的活性物質(zhì)包括抗細菌劑例如環(huán)丙沙星、氧氟沙星和培氟沙星;抗癲癇藥例如唑尼沙胺;大環(huán)內(nèi)酯類抗生素例如紅霉素;β -內(nèi)酰胺類抗生素例如青霉素類和頭孢菌素類;治療精神病的活性物質(zhì)例如氯丙嗪;活性物質(zhì)例如安乃近;以及具有抗?jié)兓钚缘乃巹├缥鬟涮娑 ?br> [0039]本發(fā)明的藥物組合物以適合于實現(xiàn)它們所打算的目的的任何形式給藥于對象。然而,優(yōu)選地,組合物是可以通過頰或口部給藥的組合物?;蛘?,藥物組合物可以是口或鼻噴劑。對象是任何動物例如人類,盡管本發(fā)明不打算僅限于此。其他適合的動物包括犬科動物、貓科動物、狗、貓、牲畜、馬、牛、綿羊等。當在本文中使用時,獸用組合物是指適用于非人類動物的藥物組合物。這樣的獸用組合物在本領(lǐng)域中是已知的。
      [0040]在另一種實施方式中,藥物組合物是用于口服給藥的液體劑型,包括可藥用乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑。除了活性化合物之外,液體劑型可以含有本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑例如水或其他溶劑,增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了活性化合物之外,懸液還可以包含懸浮劑例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇的酯類、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃耆樹膠及其混合物。
      [0041]本發(fā)明的藥物組合物可以采取可咀嚼片劑的形式??删捉榔瑒┰诒绢I(lǐng)域中是已知的。參見例如美國專利號4,684,534和6,060, 078,其每個以其全部內(nèi)容通過參考并入本文??梢詫⑷魏晤愋偷乃幬锇诳删捉榔瑒┲校瑑?yōu)選為具有苦味的藥物、天然植物提取物或其他有機化合物。更優(yōu)選地,可以在核心中包含維生素例如維生素Α、維生素B、維生素B1、維生素Β2、維生素Β6、維生素C、維生素E和維生素K ;天然植物提取物例如 Sohgunjung-tang 提取物、Sipchundaebo-tang 提取物和刺五加片(Eleutherococcussenticosus)提取物;有機化合物例如茶苯海明、氯苯甲嗪、對乙酰氨基酹、阿司匹林、苯丙醇胺和氯化鯨蠟基吡啶;或胃腸藥劑例如干燥的氫氧化鋁凝膠、多潘立酮、可溶性甘菊環(huán)烴、L-谷氨酰胺和水滑石。
      [0042]本發(fā)明的藥物組合物可以是口服崩解組合物。口服崩解片劑在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如美國專利號6,368,625和6,316,029,其每個以其全部內(nèi)容通過參考并入本文。
      [0043]本發(fā)明的藥物組合物可以是固體劑型,包括香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷和水和/或唾液激活的泡騰顆粒,例如具有可控泡騰速率的泡騰顆粒。泡騰組合物還可以包含藥物活性化合物。泡騰藥物組合物在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如美國專利號6,649,186,其全部內(nèi)容通過參考并入本文。泡騰組合物可用于以下應(yīng)用:制藥、獸醫(yī)、園藝、家用、食品、烹飪、殺蟲、農(nóng)業(yè)、化妝品、除草、工業(yè)、清潔、甜食和調(diào)味。含有包含香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷的泡騰組合物的制劑還可以包括一種或多種其他佐劑和/或活性成分,其選自本領(lǐng)域中已知的成分,包括調(diào)味劑、稀釋劑、著色劑、粘合劑、填充劑、表面活性劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、壓實介質(zhì)和非泡騰崩解劑。
      [0044]藥物組合物可以是膜狀或薄片狀藥物組合物。這樣的膜狀或薄片狀藥物組合物可以被配置成例如快速崩解的給藥形式,例如在I秒直至3分鐘的時間段內(nèi)崩解的給藥形式,或配置成緩慢崩解的給藥形式,例如在3至15分鐘的時間段內(nèi)崩解的給藥形式。通過使用例如具有不同的崩解或溶解特性的形成基質(zhì)的聚合物,可以將所示崩解時間設(shè)定到上述范圍。因此,通過混合相應(yīng)的聚合物組分,可以調(diào)節(jié)崩解時間。此外,將水“抽取”到基質(zhì)內(nèi)并引起基質(zhì)從內(nèi)部迸裂的崩解劑是已知的。因此,本發(fā)明的某些實施方式包括這樣的崩解劑以便調(diào)整崩解時間。
      [0045]用于膜狀或薄片狀藥物組合物的適合聚合物包括纖維素衍生物、聚乙烯醇(例如M0W10L)、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素醚例如乙基纖維素,以及聚乙烯醇、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯以及上述聚合物的衍生物和共聚物。
      [0046]在某些實施方式中,本發(fā)明的膜狀或薄片狀藥物組合物的總厚度優(yōu)選地為5μπι直到IOmm,優(yōu)選地30 μ m至2mm,特別優(yōu)選地0.1mm至1mm。藥物制劑可以是圓形、卵形、橢圓形、三角形、四邊形或多邊形,但它們也可以具有任何圓滑的形狀。
      [0047]本發(fā)明的藥物組合物可以采取氣溶膠形式。氣溶膠組合物還可以包含藥物活性劑。氣溶膠組合物在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如美國專利號5,011,678,其全部內(nèi)容通過參考并入本文。作為非限制性實例,本發(fā)明的氣溶膠組合物可以包括醫(yī)學(xué)有效量的藥物活性物質(zhì)、香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷和生物相容的推進劑,例如烴/氟碳化合物推進劑。
      [0048]在本發(fā)明的一種實施方式中,藥物組合物是營養(yǎng)組合物。具有不想要的味道的營養(yǎng)組合物的實例包括但不必定限于用于治療營養(yǎng)缺陷、創(chuàng)傷、手術(shù)、克羅恩病、腎病、高血壓、肥胖癥等的腸營養(yǎng)品,用于促進運動性能、肌肉增強或綜合健康狀況或先天性代謝障礙例如苯丙酮尿癥的腸營養(yǎng)品。具體來說,這樣的營養(yǎng)制劑可以含有具有苦味或金屬味或回味的一種或多種氨基酸 。這樣的氨基酸包括但不限于必需氨基酸例如亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸的L-異構(gòu)體。
      [0049]在一種實施方式中,本發(fā)明的消費品是含有香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷的牙齒衛(wèi)生組合物。牙齒衛(wèi)生組合物在本領(lǐng)域中是已知的,包括但不必定限于牙膏、漱口液、牙斑沖洗液、牙線、牙痛緩解劑(例如ANBES0L)等。
      [0050]在另一種實施方式中,本發(fā)明的消費品是含有香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷的化妝品。例如但不是限制性地,化妝品可以是面霜、口紅、唇彩等。本發(fā)明的其他適合的組合物包括潤唇膏例如CHAPSTICK或BURT’ S BEESWAX潤唇膏,其還包含香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷。
      [0051]Arom多功能酶(AROM)多肽
      [0052]AROM多肽的非限制性實例包括具有SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多妝(GENBANK登記號X06077),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)多妝(GENBANK登記號NP_594681.1), Schizosaccharomycesjaponicas 多妝(GENBANK 登記號 XP_002171624),粗糖脈抱霉(Neurospora crassa)多妝(GENBANK 登記號 XP_956000)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)多肽(GENBANK 登記號 XP_505337)。
      [0053]當在本文中使用時,術(shù)語“AR0M多肽”是指與SEQ ID NO:4中顯示的序列具有至少80% (例如至少85、90、95、96、97、98、99或100%)的同一性,并具有釀酒酵母AROM多肽的5
      種酶活性即3-脫氫奎尼酸脫水酶活性、3-脫氫奎尼酸合成酶活性、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶活性、莽草酸3-脫氫酶(NADP+)活性和莽草酸激酶活性中的至少4種活性的任意氨基酸序列。
      [0054]根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式,AROM多肽是具有降低的莽草酸脫氫酶活性的突變體AROM多肽。當在重組宿主中表達時,突變體AROM多肽將代謝流從芳香族氨基酸生產(chǎn)重新導(dǎo)向香草醛前體生產(chǎn)(圖2)。降低的莽草酸脫氫酶活性可以使用LC-MS,從表達突變體AROM多肽的重組宿主中脫氫莽草酸的積累推斷出來。
      [0055]本文描述的突變體AROM多肽可以在結(jié)構(gòu)域5中具有一個或多個突變(例如一個或多個氨基酸的置換,一個或多個氨基酸的缺失,一個或多個氨基酸的插入,或置換、缺失和插入的組合)。例如,突變體AROM多肽可以在結(jié)構(gòu)域5的至少一部分中具有缺失(例如整個結(jié)構(gòu)域5即SEQ ID NO:4中的氨基酸序列的1305至1588位氨基酸的缺失),或者可以在結(jié)構(gòu)域5中具有一個或多個氨基酸置換,從而使得突變體AROM多肽具有降低的莽草酸脫氫酶活性。缺少結(jié)構(gòu)域5的示例性的突變體AROM多肽提供在SEQ ID N0:2中。在結(jié)構(gòu)域5中具有至少一個氨基酸置換的示例性突變體AROM多肽包括分別顯示在SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:24 中的 AROM 多肽 A1533P、P1500K、R1458W、V1349G、T1366G、I1387H、W1571V、T1392K、K1370L 和 A1441P。
      [0056]特別有用的氨基酸置換可以存在于例如與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349、1366、1370、1387、1392、1441、1458、1500、1533 或 1571 位置對齊的一個或多個位置處。例如,修飾的AROM多肽可以在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置或1392位置對齊的位置處具有置換。
      [0057]例如,修飾的AROM多肽可以具有一個或多個下列氨基酸:在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349位置對齊的位置處,纈氨酸之外的氨基酸(例如甘氨酸);在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1366位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸(例如甘氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置對齊的位置處,賴氨酸之外的氨基酸(例如亮氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1387位置對齊的位置處,異亮氨酸之外的氨基酸(例如組氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1392位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸(例如賴氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1441位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸(例如脯氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1458位置對齊的位置處,精氨酸之外的氨基酸(例如色氨酸);在與SEQ IDNO:4中顯示的氨基酸序列的1500位置對齊的位置處,脯氨酸之外的氨基酸(例如賴氨酸);在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1533位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸(例如脯氨酸);或在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1571位置對齊的位置處,色氨酸之外的氨基酸(例如纈氨酸)。
      [0058]在某些實施方式中,將修飾的AROM多肽融合到催化香草醛生物合成的第一關(guān)鍵步驟的多肽3-脫 氫莽草酸脫水酶(3DSD)。具有3DSD活性并且適用于融合多肽中的多妝包括來自于 Podospora pauciseta、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、Rhodoicoccusjosti1、不動桿菌屬物種(Acinetobacter sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)或粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的 3DSD 多肽。參見 GENBANK 登記號 CAD60599、ΧΡ_001905369.1、XP_761560.UABG93191.UAAC37159.1 和 XM_001392464。[0059]例如,可以將修飾的缺少結(jié)構(gòu)域5的AROM多肽融合到具有3DSD活性的多肽(例如Podospora pauciseta3DSD)。SEQ ID NO:26顯示了這樣的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,SEQ IDNO:27顯示了編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列。
      [0060]兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)多肽
      [0061]在某些實施方式中,本發(fā)明的COMT多肽可以是咖啡?;?O-甲基轉(zhuǎn)移酶。在其他實施方式中,COMT多肽優(yōu)選地是兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。更優(yōu)選地,本發(fā)明的COMT多肽是相對于具有SEQ ID NO:27中顯示的氨基酸序列的智人(Homo sapiens)C0MT具有提高的原兒茶醛、原兒茶酸和/或原兒茶醇的間位羥基甲基化的突變體(COMT)多肽。
      [0062]可以根據(jù)本發(fā)明進行突變的COMT多肽的非限制性實例,包括分類在EC編號
      2.1.1.6下的家族中的COMT多肽,例如具有SEQ ID NO:27中顯示的氨基酸序列的智人(Hs)多肽(也參見GENBANK登記號NM_000754),具有SEQ ID NO:53中顯示的氨基酸序列的擬南芥(Arabidopsis thaliana)多肽(GENBANK 登記號 AY062837),或具有 SEQ ID NO:54 中顯示的氨基酸序列的草莓(Fragaria x ananassa)多肽(GENBANK登記號AF220491 )。人類COMT多肽存在幾種變體,并且COMT多肽可以是這些變體中的任一個,然而在優(yōu)選實施方式中,人類COMT多肽是SEQ ID N0:27或SEQ ID NO:55。其他適合用于本發(fā)明的哺乳動物COMT多肽包括但不限于從下述物種分離到的COMT多肽:黑猩猩(Pan troglodytes)(GENBANK 登記號 XP_514984),普通獼猴(Macaca mulatta) (GENBANK 登記號 AFJ70145),家馬(Equus caballus) (GENBANK 登記號 NP_001075303),家犬(Canis lupus familiaris)(GENBANK登記號 AAR20324),黑線倉鼠(Cricetulus griseus)(GENBANK登記號 EGV97595),野豬(Sus scrofa) (GENBANK 登記號 ΝΡ_001182259)和家牛(Bos taurus) (GENBANK 登記號ΝΡ_001095787)。來自于植物和微生物來源的其他示例性COMT多肽包括但不限于從下列物種分離的COMT多肽:月季(Rosa chinensis) (GENBANK登記號CAD29457),扁桃(Prunus dulcis) (GENBANK 登記號 CAA58218),陸地棉(Gossypium hirsutum) (GENBANK 登記號 ACT32028),麻風(fēng)樹(Jatropha curcas)(GENBANK 登記號 ACT87981),赤按(Eucalyptuscamaldulensis) (ADB82906), Candida orthopsilosis (GENBANK 登記號 CCG25047),樹干畢赤酵母(Pichia stipitis) (GENBANK 登記號 ABN67921)和 Spathaspora passalidarum(GENBANK登記號EGW29958)。在某些實施方式中,本發(fā)明的COMT多肽從下述物種獲得:致病疫霉(Phytophthera infestans) (GENBANK 登記號 XP_002899214),長春花(Catharanthusroseus) (GENBANK 登記號 EGS21863),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) (GENBANK登記號 XP_500451),玻璃海鞘(Ciona intestinalis) (GENBANK 登記號 XP_002121420或 XP_002131313),Capsasproa owczarzaki (GENBANK 登記號 EFW46044),嗜熱毛殼菌(Chaetomium therophilum) (GENBANK 登記號 EGS21863),盧西坦棒抱酵母(Clavisporalusitaniae) (GENBANK 登記號 XP_002899214),副球抱子菌屬物種(Paracoccidioidessp) ‘lutzii’PbOl (GENBANK 登記號 XP_002793380),扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)(SEQ ID NO:56),阿拉比卡咖啡樹(Coffea Arabica) (GENBANK 登記號 AAN03726),大鼠(Rattus norvegicus) (GENBANK 登記號 NP_036663),小鼠(Mus musculus) (GENBANK 登記號 NP_031770),泉古菌(Crenarchaeote) (GENBANK 登記號 ABZ07345), Mycobacteriumvanbaleeni (GENBANK 登記號 ABM14078),或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(GENBANK登 記號NP_001018770),其已被顯示表現(xiàn)出所需的COMT活性(圖3B和3C)。[0063]當在本文中使用時,術(shù)語“C0MT多肽”是指與SEQ ID N0:27中顯示的Hs COMT序列具有至少80% (例如至少85、90、95、96、97、98、99或100%)的同一性并具有野生型Hs COMT多肽的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的任意氨基酸序列。
      [0064]在一種實施方式中,當在本文中使用時,術(shù)語“突變體COMT多肽”是指其具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:27中顯示的Hs COMT序列具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%的同一性,并且能夠催化原兒茶酸和/或原兒茶醛的間位處的-OH基團的甲基化的任意多肽,其中所述突變體COMT多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:27的差別為至少一個氨基酸。此外,突變體COMT多肽的氨基酸序列應(yīng)該與SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54和SEQ ID N0:55有至少一個氨基酸的差別。優(yōu)選地,突變體COMT多肽與任意野生型COMT多肽的任意序列有至少一個氨基酸的差別。
      [0065]在本發(fā)明的另一種實施方式中,術(shù)語“突變體COMT多肽”是指其具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%的同一性,并且能夠催化原兒茶酸和/或原兒茶醛的間位處的-OH基團的甲基化的多肽,其中所述突變體COMT多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中的每一個具有至少一個氨基酸的差別。
      [0066]本文描述的突變體COMT多肽在例如底物結(jié)合位點中可以具有一個或多個突變(例如一個或多個氨基酸的置換,一個或多個氨基酸的缺失,一個或多個氨基酸的插入,或置換、缺失和插入的組合)。例如,突變體COMT多肽可以在人類COMT的底物結(jié)合位點中具有一個或多個氨基酸置換。
      [0067]在某些實施方 式中,本發(fā)明的“突變體COMT多肽”與SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55僅有一個或兩個氨基酸殘基的差別,其中所述突變體與野生型蛋白質(zhì)之間的差別在底物結(jié)合位點中。
      [0068]正如本文所描述的,突變體COMT多肽可用于提高香草醛葡萄糖苷的生物合成。例如,突變體COMT多肽可以具有下述性質(zhì)中的一個或多個:提高的周轉(zhuǎn);傾向于在間位(3’)而不是對位(4’ )處甲基化,以便相對于異香草醛更有利于香草醛的生產(chǎn);或?qū)ο悴萑┩緩降孜镌瓋翰杷岷驮瓋翰枞┑母玫奶禺愋?。突變體COMT多肽可以在體外使用甲基化分析法表征,或者在重組宿主體內(nèi)基于香草酸、香草醛或香草醛葡萄糖苷的生產(chǎn)來表征。
      [0069]異香草醛、香草醛、異香草酸和香草酸的結(jié)構(gòu)如下所示。
      [0070]
      【權(quán)利要求】
      1.一種用于生產(chǎn)香草醒和/或香草醒β -D-葡萄糖苷的方法,所述方法包括: Ca)提供能夠生產(chǎn)香草醛的重組宿主,其中所述重組宿主帶有編碼突變體Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突變體兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)多肽的異源核酸; (b)將所述重組宿主培養(yǎng)足以使所述重組宿主產(chǎn)生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的時間;以及 (c)從所述重組宿主或從所述培養(yǎng)上清液分離香草醛和/或香草醛葡萄糖苷,由此生產(chǎn)香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中所述突變體AROM多肽相對于野生型AROM多肽表現(xiàn)出降低的莽草酸脫氫酶活性。
      3.權(quán)利要求1或2的方法,其中所述突變體AROM多肽包含下述突變中的一個或多個: (a)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349位置對齊的位置處,纈氨酸之外的氨基酸;(b)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1366位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸;(c)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置對齊的位置處,賴氨酸之外的氨基酸; (d)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1387位置對齊的位置處,異亮氨酸之外的氨基酸;(e)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1392位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸;(f)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1441位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸;(g)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1458位置對齊的位置處,精氨酸之外的氨基酸;(h)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1500位置對齊的位置處,脯氨酸之外的氨基酸; (i)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1533位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸;以及 (j)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1571位置對齊的位置處,色氨酸之外的氨基酸。
      4.權(quán)利要求1或2的方法,其中所述突變體AROM多肽包含下述突變中的一個或多個:(a)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349位置對齊的位置處的甘氨酸殘基;(b)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1366位置對齊的位置處的甘氨酸殘基;(c)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置對齊的位置處的亮氨酸殘基;(d)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1387位置對齊的位置處的組氨酸殘基;(e)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1392位置對齊的位置處的賴氨酸殘基;(f)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1441位置對齊的位置處的脯氨酸殘基;(g)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1458位置對齊的位置處的色氨酸殘基;(h)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1500位置對齊的位置處的賴氨酸殘基;(i)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1533位置對齊的位置處的脯氨酸殘基;以及 (j)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1571位置對齊的位置處的纈氨酸殘基。
      5.權(quán)利要求1或2的方法,其中所述突變體AROM多肽缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分。
      6.權(quán)利要求1、2或5的方法,其中所述突變體AROM多肽缺少結(jié)構(gòu)域5。
      7.權(quán)利要求1、2、5或6的方法,其中所述突變體AROM多肽是融合多肽,其包含: (i)缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分;并且 (ii)具有3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)活性。
      8.權(quán)利要求1的方法,其中所述突變體COMT多肽能夠催化原兒茶酸的-OH基團的甲基化,其中所述甲基化導(dǎo)致產(chǎn)生與異香草酸相比至少4倍多的香草酸。
      9.權(quán)利要求1或8的方法,其中所述突變體COMT多肽具有在SEQID NO:27的整個長度上確定的與SEQ ID NO:27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列;并且其具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:27的差別為至少一個氨基酸殘基。
      10.權(quán)利要求1、8或9的方法,其中所述突變體COMT多肽在SEQID NO:27中顯示的氨基酸序列中包含I至10個氨基酸置換。
      11.權(quán)利要求1、8、9或10的方法,其中所述突變體COMT多肽在SEQID NO:27的198位置處包含具有比亮氨酸更低的親水指數(shù)的氨基酸。
      12.權(quán)利要求1、8、9、10或11的方法,其中所述突變體COMT多肽在SEQID NO:27的198位置處包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Glu、Gin、Gly、His、Lys> Met> Phe> Pro、Ser> Thr>Trp 和 Tyr。
      13.權(quán)利要求1或8-12的方法,其中所述突變體COMT多肽在SEQID NO:27的199位置處包含在PH7.4下具有中性或正的側(cè)鏈電荷的氨基酸。
      14.權(quán)利要求1或8-13的方法,其中所述突變體COMT多肽在SEQID NO:27的199位置處包含 Ala、Arg、Asn、Cys> Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp>Tyr 和 Val。
      15.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述突變體AROM多肽或突變體COMT多肽還在所述多肽的N-端或C-端包含純化標簽、葉綠體轉(zhuǎn)運肽、線粒體轉(zhuǎn)運肽、造粉體肽、信號肽或分泌標簽。
      16.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述宿主是微生物。
      17.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述宿主是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。
      18.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述宿主是包含pdcl缺失、gdhl缺失并且過表達谷氨酸脫氫酶2 (GHD2)的釀酒酵母(S.cerevisiae)。
      19.權(quán)利要求1-15任一項的方法,其中所述宿主是植物或植物細胞。
      20.權(quán)利要求1-15或19任一項的方法,其中所述宿主是小立碗蘚屬(Physcomitrella)植物或植物細胞、或煙草植物或植物細胞。
      21.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述宿主還包含編碼3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)的基因、編碼芳香族羧酸還原酶(ACAR)的基因、編碼尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)的基因、編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase)的基因和/或編碼香草醇氧化酶(VAO)的基因。
      22.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述宿主帶有編碼突變體COMT多肽的異源核酸,并且還包含編碼野生型AROM多肽的基因。
      23.權(quán)利要求1-21任一項的方法,其中所述宿主帶有編碼突變體AROM多肽的異源核酸,并且還包含編碼野生型O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)的基因。
      24.一種提取物,其包含通過前述任一方法生產(chǎn)的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
      25.一種消費品,其包含權(quán)利要求24的提取物。
      26.權(quán)利要求25的消費品,其中所述消費品是食品、藥物組合物、飲食增補劑、營養(yǎng)品、牙齒衛(wèi)生組合物、餐桌甜味劑或化妝品。
      27.一種分離的突變體Arom多功能酶(AROM)多肽或突變體兒茶酚_0_甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)多肽,其中所述突變體AROM多肽相對于野生型AROM多肽表現(xiàn)出降低的莽草酸脫氫酶活性,并且所述突變體COMT多肽能夠催化原兒茶酸的-OH基團的甲基化,其中所述甲基化導(dǎo)致產(chǎn)生與異香草酸相比至少4倍多的香草酸。
      28.權(quán)利要求27的分離的突變體AROM多肽,其中所述突變體AROM多肽包含下述突變中的一個或多個: (a)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349位置對齊的位置處,纈氨酸之外的氨基酸; (b)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1366位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸; (c)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置對齊的位置處,賴氨酸之外的氨基酸; (d)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1387位置對齊的位置處,異亮氨酸之外的氨基酸; (e)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1392位置對齊的位置處,蘇氨酸之外的氨基酸; (f)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1441位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸; (g)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1458位置對齊的位置處,精氨酸之外的氨基酸; (h)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1500位置對齊的位置處,脯氨酸之外的氨基酸; (i)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1533位置對齊的位置處,丙氨酸之外的氨基酸;以及 (j)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1571位置對齊的位置處,色氨酸之外的氨基酸。
      29.權(quán)利要求27或28的分離的突變體AROM多肽,其中所述突變體AROM多肽包含下述突變中的一個或多個: (a)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1349位置對齊的位置處的甘氨酸殘基;(b)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1366位置對齊的位置處的甘氨酸殘基; (c)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1370位置對齊的位置處的亮氨酸殘基; (d)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1387位置對齊的位置處的組氨酸殘基; (e)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1392位置對齊的位置處的賴氨酸殘基; (f)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1441位置對齊的位置處的脯氨酸殘基; (g)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1458位置對齊的位置處的色氨酸殘基; (h)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1500位置對齊的位置處的賴氨酸殘基; (i)在與SEQID NO:4中顯示的氨基酸序列的1533位置對齊的位置處的脯氨酸殘基;以及 (j)在與SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的1571位置對齊的位置處的纈氨酸殘基.
      30.權(quán)利要求27的分離的突變體AROM多肽,其中所述突變體AROM多肽缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分。
      31.權(quán)利要求27或30的分離的突變體AROM多肽,其中所述突變體AROM多肽缺少結(jié)構(gòu)域5。
      32.權(quán)利要求27、30或31的分離的突變體AROM多肽,其中所述突變體AROM多肽是融合多肽,其包含: (i)缺失結(jié)構(gòu)域5的至少一部分;并且 (ii)具有3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)活性。
      33.權(quán)利要求27的分離的突變體COMT多肽,其中所述突變體COMT多肽具有在SEQIDNO:27的整個長度上確定的與SEQ ID NO:27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列;并且其具有的氨基酸序列與SEQ ID NO ,21的差別為至少一個氨基酸殘基。
      34.權(quán)利要求27或33的分離的突變體COMT多肽,其在SEQID NO:27中顯示的氨基酸序列中包含I至10個氨基酸置換。
      35.權(quán)利要求27、33或34任一項的分離的突變體COMT多肽,其中所述突變體COMT多肽在SEQ ID NO ,21的198位置處包含具有比亮氨酸更低的親水指數(shù)的氨基酸。
      36.權(quán)利要求27或33-35任一項的分離的突變體COMT多肽,其中所述突變體COMT多肽在 SEQ ID NO:27 的 198 位置處包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys, Glu、Gin、Gly、His、Lys,Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp 和 Tyr。
      37.權(quán)利要求27或33-36任一項的分離的突變體COMT多肽,其中所述突變體COMT多肽在SEQ ID NO:27的199位置處包含在pH7.4下具有中性或正的側(cè)鏈電荷的氨基酸。
      38.權(quán)利要求27或33-37任一項的分離的突變體COMT多肽,其中所述突變體COMT多肽在 SEQ ID NO:27 的 199 位置處包含 Ala、Arg、Asn、Cys, Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys,Met、Phe> Pro、Ser、Thr、Trp> Tyr 和 Val。
      39.權(quán)利要求27-38任一項的分離的突變體多肽,其中所述突變體AROM多肽和/或突變體COMT多肽還在所述多肽的N-端或C-端包含純化標簽、葉綠體轉(zhuǎn)運肽、線粒體轉(zhuǎn)運肽、造粉體肽、信號肽或分泌標簽。
      40.一種分離的核酸,其編碼權(quán)利要求27-39任一項的突變體AROM多肽和/或突變體COMT多肽。
      41.一種重組宿主,其包含編碼權(quán)利要求27-39任一項的突變體AROM多肽和/或突變體COMT多肽的異源核酸。
      42.權(quán)利要求41的重組宿主,其中所述重組宿主還包含編碼3-脫氫莽草酸脫水酶(3DSD)多肽的核酸、編碼芳香族羧酸還原酶(ACAR)多肽的核酸、編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase)多肽的核酸、編碼尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)多肽的核酸和/或編碼香草醇氧化酶(VAO)的核酸。
      43.權(quán)利要求41或42的重組宿主,其中所述宿主帶有編碼突變體COMT多肽的異源核酸,并且還包含編碼野生型AROM多肽的基因。
      44.權(quán)利要求41或42的重組宿主,其中所述宿主帶有編碼突變體AROM多肽的異源核酸,并且還包含編碼野生型O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)的基因。
      45.權(quán)利要求41-44任一項的重組宿主,其中所述重組宿主是微生物。
      46.權(quán)利要求41-45任一項的重組宿主,其中所述重組宿主是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。
      47.權(quán)利要求41-44任一項的重組宿主,其中所述宿主是植物或植物細胞。
      48.權(quán)利要求41-44或47任一項的重組宿主,其中所述宿主是小立碗鮮屬(Physcomitrella)植物或植物細胞、或煙草植物或植物細胞。
      【文檔編號】C12P1/04GK103987840SQ201280048260
      【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月8日
      【發(fā)明者】于爾根·漢森, 埃斯本·哈爾克耶爾·漢森, 霍尼·泊盧爾, 約瑟夫·M·謝里登, 喬納森·R·希爾, 威廉·D.O.·漢密爾頓 申請人:國際香料香精公司, 伊沃華公司
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