用于植物基因表達(dá)的終止子序列的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了能用于植物中調(diào)控基因表達(dá)的多核苷酸序列。公開(kāi)了來(lái)源于高粱(Sorghum?bicolor)的在植物中起作用的終止子序列。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于植物基因表達(dá)的終止子序列
[0001]相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本專(zhuān)利申請(qǐng)要求提交于2011年8月2日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61 / 514，055的權(quán)益,其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。更具體地，其涉及用于調(diào)控植物基因表達(dá)的新型植物終止子序列及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0004]植物基因工程近來(lái)的進(jìn)步已打開(kāi)了工程化植物以具有改善的特性或性狀的新的大門(mén)。這些轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中典型地具有重組DNA構(gòu)建體，其具有可操作地連接至多個(gè)調(diào)控區(qū)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，所述調(diào)控區(qū)使轉(zhuǎn)基因準(zhǔn)確的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物中一些幫助調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件的例子為啟動(dòng)子、內(nèi)含子、終止子、增強(qiáng)子和沉默子。
[0005]植物基因工程已發(fā)展至將多種性狀引入商業(yè)上重要的植物中，也叫基因堆積。這是通過(guò)多基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的，其中多種基因被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生可表達(dá)復(fù)合表型或多種表型的轉(zhuǎn)基因植物。然而最優(yōu)化地調(diào)節(jié)或控制每種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是重要的。調(diào)控元件需要多種多樣的，以避免導(dǎo)入相同的轉(zhuǎn)基因植物重復(fù)序列，相同的轉(zhuǎn)基因植物重復(fù)序列與對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性的不可取的負(fù)面影響是相關(guān)聯(lián)的(Peremarti等人(2010)Plant Mol Biol73:363-378 ；Mette 等人(1999)EMBO J18:241-248 ；Mette 等人(2000)EMBO J19:5194-5201 ；Mourrain等人(2007)Planta225:365_379、美國(guó)專(zhuān)利N0.7632982、美國(guó)專(zhuān)利N0.7491813、美國(guó)專(zhuān)利N0.7674950,PCT專(zhuān)利申請(qǐng)N0.PCT/US2009 / 046968)。因此，發(fā)現(xiàn)和表征能被用于在重要的農(nóng)作物物種中表達(dá)異源性核酸的新型調(diào)控元件是重要的。各種不同的調(diào)控區(qū)能夠被用于最優(yōu)化地控制每種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
[0006]調(diào)控序列位于編碼區(qū)的下游，所述編碼區(qū)包含用于轉(zhuǎn)錄終止和Y mRNA加工的所需信號(hào)，并被稱為終止子序列。所述終止子序列在mRNA加工、定位、穩(wěn)定性和翻譯中起關(guān)鍵作用(Proudfoot, N, (2004) Curr.0p.Cell Biol 16:272-278 ；Gilmartin, 2005)。包含在終止子序列中的所述3'調(diào)控序列能夠影響基因的表達(dá)水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞中嵌合基因的優(yōu)化表達(dá)依賴于合適的3'序列的存在(Ingelbrecht，1.L.W.等人(1989)PlantCelll:671-680)。通過(guò)基因的滲漏終止子的通讀轉(zhuǎn)錄可導(dǎo)致從另一個(gè)基因的啟動(dòng)子的一個(gè)轉(zhuǎn)基因的無(wú)益轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的雙向、趨同轉(zhuǎn)錄也可由于分離的趨同基因的滲漏轉(zhuǎn)錄終止或來(lái)自基因組啟動(dòng)子而發(fā)生。趨同、重疊轉(zhuǎn)錄可降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)、或生成反義RNA (Bieri, S.等人(2002)Molecular BreedinglO:107-117)。這強(qiáng)調(diào)了發(fā)現(xiàn)新型和高效轉(zhuǎn)錄終止子的重要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及用于調(diào)控植物基因表達(dá)的調(diào)控序列。具體地，本發(fā)明涉及終止子序列。本發(fā)明提供了包含終止子序列的重組DNA構(gòu)建體。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含:(a)如SEQ IDNO:1 或 SEQ ID NO: 18 所示的序列；(b)與 SEQ ID NO:1 或 SEQ IDNO: 18 具有至少 95%的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是包含分離的多核苷酸序列的重組構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸序列包含:(a)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18所示的序列；(b)與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18具有至少95%的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。這個(gè)重組構(gòu)建體還可包含啟動(dòng)子和異源多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子和異源多核苷酸可操作地連接至分離的多核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:(a)將上文所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞；(b)由(a)的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及(C)由步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物和子代植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并且表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
[0010]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組DNA構(gòu)建體的載體、病毒、細(xì)胞、微生物、植物、或種子，所述重組DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的終止子序列。
[0011]本發(fā)明涵蓋了包含上文所述的重組DNA構(gòu)建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物、由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、Tl和后續(xù)的世代。所述轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、組織、植株和種子可以包含至少一種所關(guān)注的重組DNA構(gòu)建體。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明所述終止子序列的植物或種子是單子葉植物或種子。在另一個(gè)實(shí)施例中， 包含本發(fā)明所述終止子序列的植物或種子是玉米植物或種子。
[0013]在另一個(gè)實(shí)施例中，任何表達(dá)異源多核苷酸的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞，例如，玉米植物細(xì)胞。
[0014]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】和序列表
[0015]根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。此序列表中以單個(gè)字母表示核苷酸，以三個(gè)字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal219(N0.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-1UBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，其以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0016]圖1顯示了 PHP31801的圖譜、用于在擴(kuò)增后克隆SB-GKAF終止子的載體。
[0017]圖2顯示了 PHP34074的圖譜、用于測(cè)試SB-GKAF終止子的載體。
[0018]圖3顯示了在瞬時(shí)測(cè)定中SB-GKAF終止子相對(duì)于PINII終止子的測(cè)試結(jié)果。其顯示了用PHP34074 (SB-GKAF終止子)和PHP34005 (PINII終止子)轉(zhuǎn)化的BMS細(xì)胞中⑶S報(bào)告基因表達(dá)的定量分析。
[0019]圖4A 和圖 4B 顯示了 用 SB-GKAF (PHP34074)和 PINII (PHP34005)終止子構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系中⑶S報(bào)告基因表達(dá)的定量分析。圖4A顯示了在蛋白水平測(cè)定的GUS報(bào)告基因表達(dá)，圖4B顯示了用qRT-PCR(定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))測(cè)定的GUS報(bào)告基因表達(dá)。[0020]圖5顯示了采用SB-GKAF終止子和PINII終止子下游的兩套引物，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Gaspe Flint來(lái)源的玉米品系的qRT-PCR測(cè)定結(jié)果。
[0021]圖6A-6C 顯示了克隆的 SB-GKAF 終止子(SEQIDN0:1)和 NCBI GI NO:671655 (SEQID NO:18)的1863至2322位核苷酸的比對(duì)。共有序列顯示于頂部，與共有序列完全匹配的殘基加框。
[0022]SEQ ID NO:1 是 459bp SB-GKAF 終止子的序列。
[0023]SEQ ID NO:2和3是用于擴(kuò)增SB-GKAF終止子的正向和反向引物的序列。
[0024]SEQ ID NO:4是PHP31801的核苷酸序列，在PCR擴(kuò)增后用于克隆SB-GKAF終止子的載體。
[0025]SEQ ID NO:5是PHP34074的核苷酸序列，用于測(cè)試SB-GKAF終止子的載體。
[0026]SEQ ID NO:6是PHP34005的核苷酸序列，作為PINII終止子對(duì)照的測(cè)試載體。
[0027]如表2所述，SEQ ID NOS:7_9是在轉(zhuǎn)基因玉米植物中用于通過(guò)qRT_PCR測(cè)定⑶S表達(dá)的正向引物、反向引物和探針的序列。
[0028]如表3所述，SEQ ID NOS:10_17是在轉(zhuǎn)基因玉米植物中用于以qRT_PCR定量通讀轉(zhuǎn)錄通過(guò)SB-GKAF和PINII終止子的引物序列。
[0029]SEQ ID NO:18 對(duì)應(yīng)于 NCBI GI NO:671655 的 1863 至 2322 位核苷酸。 【具體實(shí)施方式】
[0030]本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均全文以引用方式并入本文。
[0031]如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書(shū)中的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵義包括多株此類(lèi)植物，“細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的它們的等同物等等。
[0032]如本文所用:
[0033]術(shù)語(yǔ)“單子葉植物”和“單子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括禾本科植物。
[0034]術(shù)語(yǔ)“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括以下科:十字花科(Brassicaceae)植物、豆科(Leguminosae)植物、和爺科(Solanaceae)植物。
[0035]術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)互補(bǔ)序列”和“全長(zhǎng)的互補(bǔ)序列”本文互換使用，是指給定核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100 %互補(bǔ)的。
[0036]“轉(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(諸如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植株部分或植株，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類(lèi)的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。
[0037]“基因組”在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(例如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器DNA。
[0038]“植物”包括整個(gè)植株、植物器官、植物組織、植物繁殖體、種子和植物細(xì)胞以及相同的子代。植物細(xì)胞無(wú)限制地包括來(lái)自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細(xì)胞。
[0039]“繁殖體”包括能夠繁殖新的植株的減數(shù)分裂和有絲分裂的全部產(chǎn)物，包括但不限于種子、孢子以及作為營(yíng)養(yǎng)生殖的途徑的植物的部分，諸如球莖、塊莖、側(cè)枝、或纖匐枝。繁殖體還包括接枝，在其中植株的一部分被枝接至不同的植株(甚至是不同的物種的植株)的另外的部分以產(chǎn)生活的生物體。繁殖體還包括通過(guò)克隆或集合減數(shù)分裂產(chǎn)物、或允許減數(shù)分裂產(chǎn)物(天然地或在人工干預(yù)下)集合在一起以形成胚芽或受精卵，而產(chǎn)生的全部植株和種子。
[0040]“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。
[0041]“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如，異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。
[0042]基因改良種質(zhì)的商業(yè)開(kāi)發(fā)也已經(jīng)進(jìn)展至向農(nóng)作物導(dǎo)入多個(gè)性狀的階段，其通常稱為基因堆疊法(gene stacking approach)。在該方法中，可將賦予不同所關(guān)注特性的多種基因?qū)胫参?。基因堆疊可通過(guò)許多方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化以及具有不同轉(zhuǎn)基因的品系的雜交。
[0043]“轉(zhuǎn)基因植物”還包括對(duì)在其基因組中包含超過(guò)一種異源多核苷酸的植物。各異源多核苷酸均可賦予所述轉(zhuǎn)基因植物不同的性狀。
[0044]相對(duì)序列而言的“異源”意指來(lái)自外來(lái)物種的序列，或者如果來(lái)自相同物種，則指通過(guò)蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
[0045]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用它們的單字母名稱指代如下:“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥(niǎo)苷酸或脫氧鳥(niǎo)苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
[0046]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。
[0047]“信使RNA(mRNA) ”指無(wú)內(nèi)含子并且可由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。
[0048]“cDNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。
[0049]“編碼區(qū)”是指編碼蛋白質(zhì)或多肽的信使RNA的部分(或另外的核酸分子如DNA分子的對(duì)應(yīng)的部分)?！胺蔷幋a區(qū)”是指信使RNA或其他核酸分子的不是編碼區(qū)的全部部分，包括但不限于例如，啟動(dòng)子區(qū)域、5'非翻譯區(qū)(“UTR”)、3, UTR、內(nèi)含子和終止子。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”和“編碼序列”本文中可互換使用。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”和“非編碼序列”本文中可互換使用。[0050]“表達(dá)序列標(biāo)簽”(“EST”)是得自cDNA文庫(kù)的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常由通過(guò)cDNA插入序列的單個(gè)序列獲得。將完整的cDNA插入序列稱為“全長(zhǎng)插入序列”(“FIS”)。“重疊群”序列是由選自但不限于由EST、FIS和PCR序列組成的基團(tuán)的兩種或更多種序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)，該序列能得自FIS或重疊群。
[0051]“成熟”蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或原肽的多肽。
[0052]“前體”蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級(jí)產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。
[0053]“分離的”指物質(zhì)，例如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)是該物質(zhì)被從所述組分去除。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
[0054]“重組體”是指例如通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合。
[0055]“重組體”也指已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對(duì)細(xì)胞或載體的改變，例如沒(méi)有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些。
[0056]“重組DNA 構(gòu)建體”指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來(lái)源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語(yǔ)“重組DNA構(gòu)建體”和“重組構(gòu)建體”本文可互換使用。
[0057]術(shù)語(yǔ)“入門(mén)克隆”和“入門(mén)載體”本文可互換使用。
[0058]“調(diào)控序列”或“調(diào)控元件”可互換使用，并且指位于編碼序列的上游(5,非編碼序列)、中間或下游C非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識(shí)別序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換使用。
[0059]“啟動(dòng)子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
[0060]“在植物中有功能的啟動(dòng)子”指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無(wú)論其是否來(lái)源于植物細(xì)胞。
[0061]“組織特異性啟動(dòng)子”和“組織優(yōu)選啟動(dòng)子”可以互換使用，并且指主要但非必須專(zhuān)一地在一種組織或器官中表達(dá),但是也可以在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0062]“發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動(dòng)子。
[0063]在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。
[0064]可誘導(dǎo)啟動(dòng)子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如通過(guò)化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操作地連接的DNA序列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動(dòng)子的例子包括但不限于受光、熱、壓力、水澇或干旱、病原體、植物激素、創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類(lèi)的化學(xué)品調(diào)控的啟動(dòng)子。[0065]“增強(qiáng)子序列”是指能夠增加基因表達(dá)的序列。這些序列能夠位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的上游、內(nèi)含子內(nèi)、或下游。轉(zhuǎn)錄區(qū)域由外顯子和居間的內(nèi)含子組成，從啟動(dòng)子直至轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。基因表達(dá)的增強(qiáng)能夠通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，包括但不限于提高轉(zhuǎn)錄效率、成熟mRNA的穩(wěn)定化和翻譯的強(qiáng)化。
[0066]“內(nèi)含子”是基因的居間序列，其被轉(zhuǎn)錄至RNA，然后在產(chǎn)生成熟mRNA的過(guò)程中被切除。該術(shù)語(yǔ)也用于切除的RNA序列?！巴怙@子”是被轉(zhuǎn)錄的基因序列的一部分，存在于得自該基因的成熟信使RNA中，并且不是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的必需部分。
[0067]術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動(dòng)子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接。
[0068]“表達(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。
[0069]“過(guò)表達(dá)”是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中超過(guò)在來(lái)自相同實(shí)驗(yàn)的沉默分離(或非轉(zhuǎn)基因)生物中的水平的生產(chǎn)。
[0070]“表型”是指細(xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特征。
[0071]術(shù)語(yǔ)“雜交的”或“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合(例如細(xì)胞、種子或植物)。該術(shù)語(yǔ)包括有性雜交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如當(dāng)花粉和胚珠來(lái)自相同植物時(shí))。術(shù)語(yǔ)“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
[0072]“有利等位基因”為位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的細(xì)胞壁消化性，或作為另外一種選擇，為允許具有降低的細(xì)胞壁消化性的植物的鑒定的等位基因，其中所述植物可從育種計(jì)劃或種植中被篩除(“反選擇”)。標(biāo)記的有利等位基因是與有利表型分離的標(biāo)記等位基因，或者作為另外一種選擇，與不利植物表型分離，從而提供鑒定植物的有益效果。
[0073]術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”指將核酸(例如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中的手段。導(dǎo)入包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時(shí)提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此,將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0074]“抑制DNA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時(shí)，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對(duì)該植物來(lái)說(shuō)，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對(duì)靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語(yǔ)“抑制”、“抑制性”以及“沉默”，包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止?！俺聊被颉盎虺聊辈淮_定機(jī)理并且包括而且不限于反義、共抑制、病毒抑制、發(fā)夾抑制、莖環(huán)抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNA的方法。
[0075] 本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有更全面的描述:Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E.F.和 Mamatis, T.Molecular Cloning:ALaboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, 1989 (下文稱為 “Sambrook” )。
[0076]“轉(zhuǎn)錄終止子”、“終止序列”或“終止子”是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的聚腺苷酸化識(shí)別序列和其他序列。聚腺苷酸化信號(hào)通常其特征在于影響聚腺苷酸區(qū)域添加到mRNA前體的3'末端。不同的3'非編碼序列的使用示例于Ingelbrecht, 1.L.等人，Plant Celll:671-680 (1989)中。具有“終止子活性”的多核苷酸序列指當(dāng)被可操作地連接至待表達(dá)的第二多核苷酸序列的3,端時(shí)，能夠終止從所述第二多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄的終止是通過(guò)RNA聚合酶的RNA合成被停止并且RNA和所述酶均從DNA模板上釋放的過(guò)程。
[0077]RNA轉(zhuǎn)錄物的錯(cuò)誤終止能夠影響RNA的穩(wěn)定性，并從而能夠影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可變性有時(shí)歸因于終止效率的可變性(Bieri等人(2002)MolecularBreedinglO:107-117)。
[0078]本文可互換使用術(shù) 語(yǔ)“SB-GKAF終止子”、“GKAF終止子”和“ Y-高粱醇溶蛋白終止子”，每個(gè)是指編碼高粱(Sorghum Bicolor) Y -高粱醇溶蛋白基因的3 '非翻譯區(qū)(3' UTR)的序列和從所述3' UTR下游約300bp的序列。在SEQ ID NO:1中給出了 SB-GKAF終止子的序列。高粱(Sorghum Bicolor) Y-高粱醇溶蛋白基因編碼Y-谷醇溶蛋白，在NCBI GI NO:671655中給出了該基因的序列。谷醇溶蛋白是許多谷類(lèi)的主要儲(chǔ)存蛋白。高粱Y -高粱醇溶蛋白，其為高粱的Y -谷醇溶蛋白，占高粱胚乳中總谷醇溶蛋白的約2-5 %，是由 27kDa 的單條多肽組成的(de Freitas FA等人(1994)Mol Gen Genetics245 (2):177-86)。
[0079]本發(fā)明包括本文所公開(kāi)的終止子序列的功能性片段和變體。
[0080]終止子的“功能性片段”被定義為本文所公開(kāi)的終止子序列的連續(xù)核苷酸的任何子集，其能夠?qū)嵤┡c本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)終止子序列相同或基本上相似的功能。與本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)終止子具有基本上相似功能的“功能性片段”，是指在很大程度上保持在全長(zhǎng)終止子序列相同水平的終止轉(zhuǎn)錄能力的功能性片段。包含可操作地連接至本文所公開(kāi)的終止子序列的“功能性片段”的異源性多核苷酸的重組構(gòu)建體，表現(xiàn)出與包含可操作地連接至全長(zhǎng)終止子序列的異源性多核苷酸的對(duì)應(yīng)重組構(gòu)建體基本上相似的異源性多核苷酸表達(dá)水平。
[0081]如本文所用，“變體”是包含改變的終止子的序列或終止子的功能性片段的序列，其中原始序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被刪除、添加、和/或替換，同時(shí)基本上維持了終止子的功能。一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)能夠在終止子內(nèi)部被插入、刪除、或替換，而不會(huì)影響其活性。片段和變體能夠通過(guò)例如定點(diǎn)誘變和合成構(gòu)建的方法獲得。
[0082]這些終止子功能性片段可包含本文所公開(kāi)的特定終止子核苷酸序列的至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425 或 450 個(gè)連續(xù)的核苷酸。此類(lèi)片段可以通過(guò)使用限制性酶來(lái)裂解天然存在的本文所公開(kāi)的終止子核苷酸序列；通過(guò)合成來(lái)自天然存在的終止子DNA序列的核苷酸序列獲得；或可通過(guò)使用PCR技術(shù)而獲得。具體參見(jiàn) Mullis 等人，Methods Enzymol.155:335-350(1987)和 Higuchi, R.1n PCRTechnology:Principles 和 Applications for DNA Amplifications ；Erlich, H.A.編輯；Stockton Press Inc.:New York, 1989)。同樣,這些終止子片段的變體,例如產(chǎn)生自定點(diǎn)誘變的那些，包括在本發(fā)明的組合物之中。
[0083]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上類(lèi)似于”和“基本上相當(dāng)?shù)摹笔侵负怂崞?，尤其是終止子序列，其中在一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基中的改變基本上不改變終止子終止轉(zhuǎn)錄的能力。這些術(shù)語(yǔ)還指本發(fā)明的核酸序列的修改形式，包括缺失和變異，所述修改形式是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失或插入，其基本上不改變所產(chǎn)生的終止子相對(duì)于初始的未修改的終止子的功能特性。因此，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，本發(fā)明涵蓋的不僅僅是具體的示例性序列。
[0084]如對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的，任何受關(guān)注的異源性多核苷酸均能夠被可操作地連接至本發(fā)明所描述的終止子序列。能夠被可操作地連接至本發(fā)明所描述的終止子序列的受關(guān)注的多核苷酸的例子包括但不限于，包含調(diào)控元件諸如內(nèi)含子、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列，蛋白質(zhì)編碼區(qū)如疾病和抗昆蟲(chóng)性基因、賦予營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基因、賦予產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢(shì)的提高的基因、賦予雄性和/或雌性不育性的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因等等的多核苷酸。同樣地，本發(fā)明所描述的終止子序列能夠被用于終止任何控制基因表達(dá)的核酸的轉(zhuǎn)錄。能夠被用于控制基因表達(dá)的核酸的例子包括但不限于反義寡核苷酸、抑制性DNA構(gòu)建體或編碼轉(zhuǎn)錄因子的核酸。
[0085]本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)可包含至少一種調(diào)控序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本文所公開(kāi)的調(diào)控序列可操作地連接至任何其它調(diào)控序列。
[0086]多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子，并且可包括用 于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子。
[0087]本文可互換使用術(shù)語(yǔ)“實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR) ”、“定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR) ”、“定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR) ” 和“QPCR”，代表用于定量樣品中的DNA或RNA的標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的變型。使用序列特異性引物和探針，測(cè)定特定DNA或RNA序列的相對(duì)數(shù)量或拷貝數(shù)。使用術(shù)語(yǔ)相對(duì)是因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)比較了不同基因相對(duì)于特定內(nèi)參基因的相對(duì)拷貝數(shù)。通過(guò)測(cè)量在PCR過(guò)程中的每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，量化升高。使用熒光水解探針，測(cè)量對(duì)于每個(gè)后續(xù)PCR循環(huán)增加的熒光以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的量化。Ct(循環(huán)閾值)被定義為對(duì)于熒光信號(hào)超過(guò)閾值(即超過(guò)背景水平)所需的循環(huán)數(shù)。來(lái)自具有更高拷貝數(shù)基因的DNA / RNA會(huì)在更少的PCR循環(huán)后出現(xiàn)；因此Ct值越低，在特定樣品中存在的拷貝越多。為了定量RNA，在QPCR或?qū)崟r(shí)PCR之前為反轉(zhuǎn)錄mRNA至cDNA的步驟。本文這被稱為“實(shí)時(shí)RT-PCR”或“定量RT-PCR”或“定量RT-PCR” 或 “qRT-PCR”。
[0088]PCR產(chǎn)物定量的Taqman方法使用熒光報(bào)告基因探針。由于設(shè)計(jì)的探針是序列特異性的，并僅結(jié)合至特異性PCR產(chǎn)物上，因此這是更精確的。即使存在非特異性DNA擴(kuò)增，探針特異性使定量成為可能。這使多重(定量)成為可能，其通過(guò)使用具有不同發(fā)射光譜的探針在同一試管中定量多個(gè)基因。通過(guò)Taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性降解探針，除去淬滅劑，使得PCR產(chǎn)物被檢測(cè)到。
[0089]當(dāng)繪制在一個(gè)線性標(biāo)度時(shí)，所述熒光射線隨著PCR循環(huán)數(shù)增加而增加呈S型，具有指數(shù)期和平臺(tái)期。平臺(tái)期是由主混合物中的引物量而非核苷酸模板量確定的。通常垂直標(biāo)度是以對(duì)數(shù)形式繪制的，使得曲線圖與閾值的交集呈線性，更易于可視化。理論上，在指數(shù)期每個(gè)循環(huán)DNA的量加倍，但這受到所用引物效率的影響。正對(duì)照使用內(nèi)參基因，例如，在所有細(xì)胞類(lèi)型中相對(duì)豐富的“持家基因”，它的使用也使得樣品間的比較成為可能。通過(guò)將結(jié)果與通過(guò)已知濃度的DNA / RNA連續(xù)稀釋制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測(cè)定DNA / RNA的量。
[0090]本發(fā)明包括多核苷酸，所述多核苷酸包含:(i)基于Clustal V(或Clustal W)比對(duì)方法，在與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18進(jìn)行比較時(shí)，具有至少90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的序列同一性的核酸序列；或(ii)基于Clustal V (或Clustal W)比對(duì)方法，在與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的功能性片段進(jìn)行比較時(shí),具有至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%的序列同一性的核酸序列；或(iii) (i)或(ii)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，其中所述多核苷酸在植物細(xì)胞中作為終止子。
[0091]序列比對(duì)和同一性百分比計(jì)算可用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源序列的多種比較方法來(lái)測(cè)定，這些方法包括但不限于LASERGENE?生物信息計(jì)算包(DNASTAR? Inc.，
Madison,WI)的Megalign?程序。除非另外說(shuō)明，本文提供的序列的多重比對(duì)用Clustal V
比對(duì)方法(Higgins和Sharp (1989)，CABI OS.5:151-153)進(jìn)行，默認(rèn)參數(shù)(空位罰分(GAPPENALTY) = 10，空位長(zhǎng)度罰分(GAP LENGTH PENALTY) = 10)。使用 Clustal V 方法進(jìn)行配對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1、GAP PENALTY = 3、WINDOW = 5、以及 DIAGONALS SAVED = 5。對(duì)于核酸，這些參數(shù)為 KTUPLE = 2、GAP PENALTY=5、WINDOW = 4、以及DIAGONALS SAVED = 4。用Clustal V程序比對(duì)序列后，可以通過(guò)查看同一程序中的“序列距離”表來(lái)獲得“百分比同一性”和“趨異度”值。除非另外說(shuō)明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計(jì)算的。
[0092]作為另外一種選擇，可以使用Clustal ff比對(duì)方法。Clustal ff比對(duì)方法(描述于Higgins 和 Sharp, CAB 10S.5:151-153(1989) ；Higgins, D.G.等人，Comput.Appl.Biosc1.8:
189-191(1992))可見(jiàn)于LASERGENE?生物信息計(jì)算包(DNASTAR* Inc.,Madison,ffis.)的MegAlign?v6.1程序。用于多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)對(duì)應(yīng)GAP PENALTY = 10、GAPLENGTH PENALTY = 0.2、Delay Divergent Sequences = 30%、DNA Transition Weight =
0.5、Protein Weight Matrix = Gonnet Series、DNA Weight Matrix = IUB。用于配對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)是 Alignment = Slow-Accurate (緩慢-準(zhǔn)確)、Gap Penalty = 10.0、Gap Length=0.10、Protein Weight Matrix = Gonnet250、以及 DNA Weight Matrix = IUB。用 ClustalW程序比對(duì)序列后，可以通過(guò)查看同一程序中的“序列距離”表來(lái)獲得“百分比同一性”和“趨異度”值。
[0093]本發(fā)明的實(shí)施例包括:
[0094]本發(fā)明涉及終止子序列。本發(fā)明提供了包含終止子序列的重組DNA構(gòu)建體。
[0095]本發(fā)明一個(gè)的實(shí)施例是分離的多核苷酸序列，所述分離的多核苷酸序列包含(a)如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:18 所示的序列；(b)與 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:18 具有至少95%的序列同一性的序列；或(c)包含(a)或(b)的功能性片段的序列，其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為終止子起作用。在另一方面，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子、至少一個(gè)異源核酸片段和本發(fā)明的任何終止子、或終止子元件的組合，其中所述啟動(dòng)子、至少一個(gè)異源核酸片段和終止子被可操作地連接起來(lái)。
[0096]在另一個(gè)實(shí)施例中，功能性片段可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:18的至少450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175 或 150 個(gè)連續(xù)核苷酸。[0097]通過(guò)將本發(fā)明的核酸片段，如SEQ ID NO:1或18中所示的終止子序列或如SEQ IDNO:1或18中所示的核苷酸序列的功能性片段，可操作地連接至異源核酸片段，可構(gòu)建重組DNA構(gòu)建體。
[0098]另一個(gè)實(shí)施例是轉(zhuǎn)化細(xì)胞(或微生物)的方法，所述方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞(或微生物)。(本發(fā)明)也包括用這個(gè)方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(或微生物)。在特定實(shí)施例中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞，或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。所述微生物可為農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。
[0099]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:將上文所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
[0100]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:將上文所述的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞；從上文所述的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物；以及從轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物和子代植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并且表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
[0101]在另一個(gè)實(shí)施例中，任何表達(dá)異源多核苷酸的方法，其中所述植物細(xì)胞是單子葉的或雙子葉植物，例如，玉米或大豆植物細(xì)胞。植物細(xì)胞還可來(lái)自向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗或柳枝稷。 [0102]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含重組DNA構(gòu)建體的載體、病毒、細(xì)胞、微生物、植物、或種子，所述重組DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明所述的終止子序列。
[0103]本發(fā)明包括包含上文所描述的重組DNA構(gòu)建體的再生的、成熟的和能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物、從其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子、Tl和后續(xù)的世代。所述轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、組織、植株和種子可以包含所關(guān)注的至少一種重組DNA構(gòu)建體。
[0104]在一個(gè)實(shí)施例中，包含本發(fā)明所述的終止子序列的所述植物(或來(lái)源于所述植物的種子)是單子葉或雙子葉植物，例如，玉米或大豆植物。所述植物還可以是向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗或柳枝稷。所述植物可為近交植物或雜交植物。
[0105]實(shí)M
[0106]本發(fā)明將在下面的實(shí)例中進(jìn)一步說(shuō)明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說(shuō)明。應(yīng)該理解，盡管這些實(shí)例說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施例，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各種用法和條件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
[0107]實(shí)例I
[0108]擴(kuò)曾矛口克降高梁(Sorghum bicolor) y _高梁酉享溶蛋白終lh子序歹!I
[0109]根據(jù)高粱(Sorghum bicolor)基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物(SEQ ID NOS:2和3)用于擴(kuò)增來(lái)自高粱(Sorghumbicolor)的Y-高粱醇溶蛋白基因(SB-GKAF)的終止子。下文給出了所述引物序列，帶下劃線的區(qū)域是與基因組模板不同源的:
[0110]TMS2039(正向引物；SEQ IDNO:2):
[0111]CAGATCTGATATCGATGGGCCCACTAACTATCTATACTGTAATAATGTTGTATAG
[0112]TMS2040(反向引物；SEQ IDNO:3):
[0113]CGGACCGGGTGACCAAGCTTAAGCGAACATATGTCCCTC
[0114]使用這些引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出504bp的產(chǎn)物，其包含465bp SB-GKAF終止子序列(SEQ ID NO:1) ο 產(chǎn)物被克隆至 pGEMTeasy (Promega) (PHP31801 ;圖1 ；SEQ ID NO:4)并確認(rèn)序列?？寺〉腟B-GKAF終止子包括165bp的預(yù)測(cè)的SB-GKAF的3'非翻譯區(qū)(UTR)以及約300bp的下游序列。然后將擴(kuò)增的SB-GKAF終止子(SEQ ID NO:1)序列克隆至農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化載體(PHp34074 ;圖2 ；SEQ ID NO:5)，其在不同方向具有下列表達(dá)盒:
[0115]SB-GKAF TERMINATOR KUSINT:BSV PRO 和
[0116]UB1-PRO:UBI INTRON:M0PAT:PINII TERM。
[0117]BSV PRO是香蕉條紋病毒啟動(dòng)子，是強(qiáng)效組成型啟動(dòng)子。將以馬鈴薯PINII終止子(Keil 等人(1986)Nucleic Acids Res.14:5641-5650)代替了 SB-GKAF 終止子的構(gòu)建體用作對(duì)照(PHP34005 ；SEQ ID NO:6)。 [0118]實(shí)例2
[0119]瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以測(cè)試SB-GKAF終丨h(huán)子的功效
[0120]在重組構(gòu)建體中測(cè)試分離的SB-GKAF終止子序列(SEQ ID NO:1)有效充當(dāng)終止子起作用的能力。通過(guò)其終止轉(zhuǎn)錄的能力和通過(guò)其增加蛋白表達(dá)的能力測(cè)試其作為終止子的功效。由于不正確的終止子可導(dǎo)致mRNA的:T末端的不正確加工，從而影響RNA穩(wěn)定性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)終止子影響蛋白表達(dá)水平。已經(jīng)表明不同終止子可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率有至多 100 倍的變化(Bieri 等人，(2002) Molecular BreedinglO:107-117 ；An 等人(1989)Plant Celll:115-122 ；Ingelbrecht 等人(1989)，Plant Cell, 1:671-680 ；Ali 和Taylor (2001) Plant Mol.Bi0.,46:251-261)。從而我們對(duì)于 SB-GKAF 序列(SEQ ID NO:1)與熟知的PINII終止子相比增加蛋白表達(dá)的能力進(jìn)行了測(cè)試。使用實(shí)例I所述的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化載體 PHP34074 (SEQ ID NO:5)和 PHP34005 (SEQ ID NO:6)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化BMS (墨西哥黑甜玉米，Black Mexican Sweet)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化5天后收獲細(xì)胞并用于量化⑶S活性(MUG測(cè)定)。當(dāng)⑶S表達(dá)歸一化至MOPAT表達(dá)(圖3 ;表1)時(shí)，SB-GKAF構(gòu)建體(PHP34074 ；SEQ ID NO:5)表達(dá)比 PINII 構(gòu)建體(PHP34005, SEQ ID NO:6)高~35%。通過(guò)使得蛋白表達(dá)等于或高于PINII終止子的蛋白表達(dá)，這個(gè)信息表明分離的SB-GKAF序列(SEQID NO:1)有效地充當(dāng)終止子的能力。
[0121]表1
[0122]
【權(quán)利要求】
1.包含分離的多核苷酸序列的重組構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸序列包含: (a)包含如SEQID NO:1或SEQ ID NO:18中所示序列的核苷酸序列； (b)包含與如SEQID NO:1或SEQ ID NO:18中所示序列具有至少95%的同一性的序列的核苷酸序列；或 (c)包含(a)或(b)的功能性片段的核苷酸序列； 其中所述分離的多核苷酸序列在植物細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄終止子起作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組構(gòu)建體，其中所述分離的多核苷酸可操作地連接至啟動(dòng)子和異源多核苷酸序列。
3.植物，包含權(quán)利要求1或2所述的重組構(gòu)建體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
6.種子，包含權(quán)利要求1或2所述的重組構(gòu)建體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的種子，其中所述種子來(lái)源于單子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的種子，其中所述種子來(lái)源于玉米植物。
9.在植物中表達(dá)異源多核苷酸的方法，包括以下步驟: (a)將權(quán)利要求2的重組構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中； (b)由步驟(a)的可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求2的重組構(gòu)建體；以及 (c)由步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述子代植物包含權(quán)利要求2的重組構(gòu)建體并且表現(xiàn)出所述異源多核苷酸的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述植物是玉米植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104024416SQ201280048439
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月2日
【發(fā)明者】S.E.阿比特, R.容 申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司