利用乙酰乙酰輔酶a合酶產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組微生物以及利用這種重組微生物以較高效率產(chǎn)生異戊二烯。在本發(fā)明中，將編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的酶的乙酰乙酰輔酶A合酶基因和一種或多種涉及使得能由乙酰乙酰輔酶A合成異戊二烯的異戊二烯生物合成的基因引入宿主微生物中。
【專利說明】利用乙酰乙酰輔酶A合酶產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯
[0001]相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年8月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/515，300的權(quán)益，將該臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明總體涉及用于由培養(yǎng)的細(xì)胞和包含這些培養(yǎng)細(xì)胞的組合物產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]甲羥戊酸依賴性途徑的產(chǎn)物是異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是異戊二烯以及類異戊二烯的前體。
[0006]異戊二烯(2-甲基-1，3- 丁二烯)是多種合成聚合物(最值得注意的是合成橡膠)的關(guān)鍵原料。異戊二烯由多種微生物、植物和動(dòng)物物種自然產(chǎn)生。具體地講，已鑒定了兩條進(jìn)行異戊二烯生物合成的途徑:甲羥戊酸(MVA)途徑和非甲羥戊酸(DXP)途徑。然而，天然存在的生物體的異戊二烯產(chǎn)率沒有商業(yè)吸引力。也可以通過分餾石油獲得異戊二烯，但該材料的純化昂貴而且耗時(shí)。C5烴流的石油裂解僅生成約15%的異戊二烯。每年大約有800, 000噸順式聚異戊二烯由異戊二烯的聚合反應(yīng)產(chǎn)生；這種聚異戊二烯大部分用于輪胎和橡膠工業(yè)。異戊二烯還通過共聚反應(yīng)用作其他產(chǎn)品中的合成彈性體，這些產(chǎn)品例如為鞋類、機(jī)械產(chǎn)品、醫(yī)療產(chǎn)品 、體育用品和膠乳。
[0007]類異戊二烯是衍生自類異戊二烯前體分子IPP和DMAPP的化合物。已鑒定了超過29，000種類異戊二烯化合物并且每年都發(fā)現(xiàn)新的類異戊二烯。類異戊二烯可分離自天然產(chǎn)物，例如將類異戊二烯前體分子用作基礎(chǔ)構(gòu)造塊以形成類異戊二烯的相對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微生物和植物物種。類異戊二烯對(duì)大多數(shù)活生物體和細(xì)胞是至關(guān)重要的，為維持細(xì)胞膜流動(dòng)性和電子傳遞提供了手段。在自然界，類異戊二烯發(fā)揮的作用多種多樣，從作為植物中的天然殺蟲劑到促成與肉桂、丁香和生姜相關(guān)的香味。此外，制藥和化學(xué)界將類異戊二烯用作藥品、保健營(yíng)養(yǎng)品、調(diào)味劑和農(nóng)業(yè)害蟲防治劑。鑒于它們?cè)谏锵到y(tǒng)中的重要性以及在廣泛應(yīng)用中的有用性，類異戊二烯已成為倍受科學(xué)家重視的焦點(diǎn)。
[0008]因此，需要更多經(jīng)濟(jì)的方法來生產(chǎn)異戊二烯和/或類異戊二烯。具體地講，所希望的是以足以滿足穩(wěn)健商業(yè)化工藝要求的速率、滴度和純度來由廉價(jià)的可再生原料生產(chǎn)異戊二烯和/或類異戊二烯的方法。
[0009]本文通過對(duì)重組微生物及其在生產(chǎn)異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯方法中的用途的公開來提供這些改進(jìn)。
[0010]在整篇本說明書中，參考了多個(gè)專利、專利申請(qǐng)以及其他類型的出版物(如雜志文章)。特此將本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011 ] 本發(fā)明特別是提供重組微生物的組合物、制備這些重組微生物的方法以及使用這些重組微生物生產(chǎn)異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的方法。所述重組微生物包含能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的酶，該乙酰乙酰輔酶A然后可用于制備異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯。這些重組微生物包含能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A以產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A的酶，而不是能夠由兩個(gè)乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的乙酰乙酰輔酶A硫解酶。
[0012]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組微生物，該重組微生物包含一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸以及一種或多種編碼如下多肽的核酸:(a)異戊二烯合酶多肽，其中該異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和(b) 一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽，其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物可提供所述多肽的產(chǎn)生以及異戊二烯的合成。在一個(gè)方面，該一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸為乙酰乙酰輔酶A合酶基因。在另一個(gè)方面，該乙酰乙酰輔酶A合酶基因?yàn)閬碜苑啪€菌的基因。在另一個(gè)方面,該乙酰乙酰輔酶A合酶基因來自鏈霉菌屬(Streptomyces)。在另一個(gè)方面,該乙酰乙酰輔酶A合酶基因編碼具有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì):
[0013]MTDVRFRIIGTGAYVPER IVSNDEVGAPAGVDDDWITRKTGIRQRRWAADDQATSDLATAAGRAALKAAGITPEQLTVIAVATSTPDRPQPPTAAYVQHHLGATGTAAFDVNAVCSGTVFALSSVAGTLVYRGGYALVIGADLYSRILNPADRKTVVLFGDGAGAMVLGPTSTGTGPIVRRVALHTFGGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMDGREVRRFVTEHLPQLIKGFLHEAGVDAADISHFVPHQANGVMLDEVFGELHLPRATMHRTVETYGNTGAASIPITMDAAVRAGSFRPGELVLLAGFGGGMAASFALIEff(SEQ ID NO:1)?
[0014]在另一個(gè)方面，乙酰乙酰輔酶A合酶基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80%或更高同一性且具有由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能。
[0015]在本文的任何方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。在本文的任何方面，該異戍二烯合酶多肽為來自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜種銀白楊(Populus alba)x歐洲山楊(Populus tremula)的多肽。在本文的任何方面,異戍二烯合酶多妝選自山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria 1bata)、美洲山楊(Populustremuloides)、銀白楊、黑楊(Populus nigra)和毛果楊(Populus trichocarpa) ? 在另一方面，植物異戊二烯合酶多肽為葛(kudzu)異戊二烯合酶多肽。
[0016]在本文的任何方面，編碼一種或多種MVA途徑多肽的一種或多種核酸為異源核酸。在本文的任何方面，編碼多種MVA途徑多肽的一種或多種核酸為內(nèi)源核酸拷貝。在本文的任何方面，一種或多種MVA途徑多肽選自(a)使乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG輔酶A的酶(如HMG合酶)；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；以及(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。
[0017]在本文的任何方面，將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶可選自馬氏甲燒八疊球菌(M.mazei)甲輕戍酸激酶、乳桿菌(Lactobacillus)甲輕戍酸激酶多肽、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)甲輕戍酸激酶多肽、酵母甲輕戍酸激酶多肽、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲輕戍酸激酶多妝、鏈球菌(Streptococcus)甲輕戍酸激酶多肽、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)甲輕戍酸激酶多肽以及鏈霉菌(Streptomyces)甲輕戍酸激酶多肽或鏈霉菌CL190 (Streptomyces CL190)甲輕戍酸激酶多肽。在本文的任何方面，使甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
[0018]在本文的任何方面，該重組微生物可還包含編碼一種或多種1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑多肽的一種或多種核酸。在一個(gè)方面，編碼一種或多種DXP途徑多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸為異源核酸。在另一方面，編碼一種或多種DXP途徑多肽的一種或多種核酸為內(nèi)源核酸拷貝。在另一方面，一種或多種DXP途徑多肽選自(a) 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b) 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、(c) 4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶(MCT)、(d) 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶(CMK)、(e)2C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(MCS)、(f) 1-羥基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基-4- 二磷酸合酶(HDS)和(g) 1-羥基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸還原酶(HDR)。在另一方面，DXP途徑多肽為DXS。
[0019]在本文的任何方面，將該一種或多種異源核酸置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子之下。在本文的任何方面，將該一種或多種異源核酸克隆進(jìn)一種或多種多拷貝質(zhì)粒中。在本文的任何方面，將該一種或多種異源核酸整合進(jìn)細(xì)胞的染色體中。
[0020]在本文的任何方面，微生物為細(xì)菌、藻類、真菌、酵母或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)方面，微生物為細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，細(xì)菌細(xì)胞選自埃希氏桿菌屬(Escherichia)物種(例如大腸桿菌)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、朽1檬泛菌(P.citrea)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.1entus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.1autus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、棒桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)(例如谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum))、多糖降解菌 2-40 (S.degradans2_40)、Alginovibr1 aqualiticus、交替單胞菌屬(Alteromonas)標(biāo)準(zhǔn)參考菌株 KLIA、Asteromyces cruciatus、海貝內(nèi)克菌(Beneckea pelagia)、棒桿菌屬物種、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、海洋鹽單胞菌(Halmonas marina)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)物種(ATCC433367)、葉氏假交替單胞菌(Pseudoalteromonas elyakovii)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(例如，Pseudomonas alginovora、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida))、溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)、鮑魚腸弧菌(Vibr1 hal1ticol)、哈維氏弧菌(Vibr1 harveyi)、白色鏈霉菌(S.albus)、變鉛青鏈霉菌(S.1ividans)、天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)、灰色鏈霉菌(S.griseus)以及產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。在一個(gè)方面，微生物為藻類細(xì)胞 。在另一個(gè)方面，藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。在一個(gè)方面，微生物為真菌細(xì)胞。在另一方面，真菌細(xì)胞為絲狀真菌。在另一個(gè)方面，微生物為酵母細(xì)胞。在另一個(gè)方面，酵母細(xì)胞選自酵母菌屬(Saccharomyces)物種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)物種、畢赤酵母屬(Pichia)物種或假絲酵母屬(Candida)物種。在另一方面，酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
[0021]在另一方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生類異戊二烯的重組微生物，該重組微生物包含一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸以及一種或多種編碼如下多肽的核酸:(a)編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶的一種或多種核酸；和(b)編碼一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽的一種或多種核酸，其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物可提供所述多肽的產(chǎn)生以及一種或多種類異戊二烯的合成。在一個(gè)方面，(b)的編碼一種或多種MVA途徑多肽的一種或多種核酸為異源核酸。在本文的任何方面，一種或多種MVA途徑多肽選自(a)將乙酰乙酰輔酶-輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG-Co-A的酶；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；以及(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。
[0022]在本文的任何方面，將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。在一個(gè)方面，將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
[0023]在本文的任何方面，將該一種或多種異源核酸置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子之下。在本文的任何方面，將該一種或多種異源核酸克隆進(jìn)一種或多種多拷貝質(zhì)粒中。在本文的任何方面，將該 一種或多種異源核酸整合進(jìn)細(xì)胞的染色體中。
[0024]在一個(gè)方面，微生物為細(xì)菌、藻類、真菌、酵母或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)方面，微生物為細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面,細(xì)菌細(xì)胞選自埃希氏桿菌屬(例如大腸桿菌)、嗜酸乳桿菌、朽1檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、棒桿菌屬物種(例如谷氨酸棒桿菌)、多糖降解菌2-40、Alginovibr1 aqualiticus、交替單胞菌屬標(biāo)準(zhǔn)參考菌株 KLIA、Asteromyces cruciatus、海貝內(nèi)克菌、棒桿菌屬物種、陰溝腸桿菌、海洋鹽單胞菌、肺炎克雷伯菌、發(fā)光桿菌屬物種(ATCC433367)、葉氏假交替單胞菌、假單胞菌屬物種(例如，Pseudomonas alginovora、銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌、惡臭假單胞菌)、溶藻弧菌、鮑魚腸弧菌、哈維氏弧菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及產(chǎn)堿假單胞菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。在一個(gè)方面，微生物為藻類細(xì)胞。在另一個(gè)方面，藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。在一個(gè)方面，微生物為真菌細(xì)胞。在另一方面，真菌細(xì)胞為絲狀真菌。在另一個(gè)方面，微生物為酵母細(xì)胞。在另一個(gè)方面，酵母細(xì)胞選自酵母菌屬、裂殖酵母屬物種、畢赤酵母屬物種或假絲酵母屬物種。在另一方面，酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
[0025]在本文的任何方面，類異戊二烯選自單萜類化合物、二萜類化合物、三萜類化合物、四萜類化合物、倍半萜類化合物和多萜類化合物。在一個(gè)方面，類異戊二烯為倍半萜類化合物。在另一方面，類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合歡烯、α-金合歡烯、β -金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、β_菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯和瓦倫西亞桔烯。
[0026]在另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括:(a)培養(yǎng)重組微生物，該重組微生物包含(i) 一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸，和一種或多種編碼如下多肽的核酸:(ii)異戊二烯合酶多肽，其中該異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和(iii) 一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽，以及(b)產(chǎn)生異戊二烯。在一個(gè)方面，所述方法還包括回收該重組微生物所產(chǎn)生的異戊二烯。
[0027]在另一個(gè)方面，該一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸為乙酰乙酰輔酶A合酶基因。在另一方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。在另一方面，該一種或多種MVA途徑多肽選自(a)將乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG-Co-A的酶；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；以及(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，重組微生物還包含編碼一種或多種1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑多肽的一種或多種核酸。
[0028]在另一個(gè)方面，微生物為細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在另一個(gè)方面，微生物為細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，微生物為酵母細(xì)胞。在另一方面，酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
[0029]在另一方面，本 文提供一種產(chǎn)生類異戊二烯的方法，該方法包括:培養(yǎng)重組微生物，該重組微生物包含(i) 一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸，和一種或多種編碼如下多肽的核酸:(ii)聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽，其中該聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽由異源核酸編碼；和(iii) 一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽，以及產(chǎn)生所述類異戊二烯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1 為 Strep CL190Upper 的質(zhì)粒圖譜。
[0031]圖2為pMCM1187的質(zhì)粒圖譜。
[0032]圖3 為分離自菌株 MCM1320 和 MCM1321 的 pCL-Ptrc-mvaR-mvaS_nphT7 的質(zhì)粒圖
-1'TfeP曰。
[0033]圖4為經(jīng)工程改造以編碼乙酰乙酰輔酶A(NphT7)的菌株所產(chǎn)生的異戊二烯的水平的圖。使用氣相色譜-火焰電離檢測(cè)器檢測(cè)異戊二烯水平。與經(jīng)由DXP途徑產(chǎn)生異戊二烯的MCM1686菌株相比，經(jīng)由乙酰乙酰輔酶A產(chǎn)生MVA的菌株MCM1684和MCM1685產(chǎn)生了顯著更高水平的異戊二烯。
[0034]圖5為構(gòu)建體pMCM1221的載體圖譜。
[0035]圖6為構(gòu)建體nphT7with S suis HMGRS/pCL的載體圖譜。在該圖中突出顯示了編碼MVA上游途徑酶的基因以及控制3基因操縱子的表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)型Trc啟動(dòng)子。HMG輔酶A還原酶(HMGR)和HMG輔酶A合酶(HMGS)由源自豬鏈球菌(Streptococcus suis)的基因編碼，并且NphT7乙酰乙酰輔酶A合酶由源自鏈霉菌屬菌株CL190的nphT7基因編碼。為PCL1920載體骨架所共有的壯觀霉素抗性基因(aadAl)和編碼質(zhì)粒復(fù)制所需要的R印A蛋白的基因(repA)包括在構(gòu)建體中，但在圖中未示出。
[0036]圖7為繪出了所測(cè)試的每種培養(yǎng)物的，由黑色條棒和灰色條棒表示的異戊二烯比生產(chǎn)率(單位:ug/L0Dhr.)以及表示為黑色菱形的光學(xué)密度(0D600nm)的圖。攜帶由豬鏈球菌HMGR和HMGS連同NphT7乙酰乙酰輔酶A合酶組成的MVA上游途徑酶的菌株的異戊二烯數(shù)據(jù)由黑色條棒描繪(在圖中標(biāo)記為NphT7a-c，分別表示REM C8_25、REM C9_25和REMDl_25);攜帶由源自鏈霉菌屬菌株CL190的nphT5、nphT6和nphT7基因所編碼的MVA上游途徑酶的菌株的異戊二烯數(shù)據(jù)由灰色條棒描繪(標(biāo)記為MCM1684和MCM1685);缺少外源MVA上游途徑酶的對(duì)照菌株的異戊二烯數(shù)據(jù)也以灰色顯示(標(biāo)記為IspS alone)。異戊二烯比生產(chǎn)率表示在左邊I軸上。OD測(cè)量值在相關(guān)基因表達(dá)的IPTG誘導(dǎo)后3.5小時(shí)取得并且表示在右邊y軸上。
[0037]圖8為顯示來自偶聯(lián)的NphT7、HMG輔酶A合酶和HMG輔酶A還原酶的催化活性測(cè)定法的NADP+/時(shí)間/OD的圖。菌株nphT7測(cè)試菌株1_3分別對(duì)應(yīng)于REM C8_25、REM C9_25和 REM Dl_25。Control-Parental-1spS alone 菌株為 REM F3_25。這些結(jié)果與 NphT7 活性對(duì)乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A的存在的依賴一致。
[0038]圖9為顯示 來自使用菌株nphT7測(cè)試菌株1_3的催化測(cè)定法的異戊二烯/時(shí)間/OD的圖，所述測(cè)試菌株1-3分別對(duì)應(yīng)于REM C8_25、REM C9_25和REM Dl_25。Contro1-Parental-1spS alone 菌株為 REM F3_25。
【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明尤其提供了用于增加重組微生物中異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)量的組合物和方法，所述重組微生物已經(jīng)經(jīng)工程改造來表達(dá)能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的酶，作為將碳通量導(dǎo)向異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯生產(chǎn)的第一步驟。
[0040]誦用摶術(shù)
[0041]除非另外指明，否則對(duì)本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中有完整解釋:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)”，第三版(Sambrook等人，2001) ,Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》)，，(M.J.Gait 編輯，1984) ;“Animal Cell Culture:A practical approach (《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng):實(shí)用方法》)”，第三版(J.R.Masters編輯,2000) ,Methods in Enzymology (《酶學(xué)方法》)，，(美國(guó)學(xué)術(shù)出版社(Academic Press, Inc.) ) ；uCurrent Protocols in MolecularB1logy (《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南》)”(F.M.Ausubel等人編輯，1987，以及定期更新版本)；iiPCR:The Polymerase Chain React1n(((PCR:聚合酶鏈反應(yīng)》)”，(Mullis 等人編輯，1994)。Singleton 等人，Dict1nary of Microb1logy and Molecular B1logy3rd revised ed.,(《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典第三修訂版》)，約翰威立父子出版公司(J.Wiley&Sons)(紐約州紐約市，2006 年)以及 March，s Advanced Organic Chemistry React1ns, Mechanismsand Structure6th ed.(《馬奇高級(jí)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、機(jī)理和結(jié)構(gòu),第六版》),約翰威立父子出版公司(紐約州紐約市，2007年)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了關(guān)于本申請(qǐng)中所用的許多術(shù)語的一般性指導(dǎo)。
[0042]定義
[0043]術(shù)語“異戍二稀”是指2-甲基-1，3~ 丁二稀(CAS#78-79-5)。其可以是由3，3- _.甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最終的揮發(fā)性C5烴產(chǎn)物。其可能不涉及IPP分子與DMAPP分子的連接或聚合。除非本文中另外指明，否則術(shù)語“異戊二烯”通常不旨在受其產(chǎn)生方法的限制。
[0044]如本文所用，術(shù)語“多肽”包括多肽、蛋白質(zhì)、肽、多肽片段和融合多肽。
[0045]如本文所用，“分離的多肽”不是多肽文庫(如2種、5種、10種、20種、50種或更多種不同多肽的文庫)的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分離的多肽可例如通過編碼該多肽的重組核酸的表達(dá)來獲得。
[0046]所謂“異源多肽”意指由衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細(xì)胞的核酸序列編碼的多肽。在一些實(shí)施例中，異源多肽不同于存在于自然界中相同宿主細(xì)胞內(nèi)的野生型多肽。
[0047]如本文所使用，“核酸”是指單股或雙股形式的共價(jià)連接在一起的兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0048]所謂“重組核酸 ”意指這樣的所關(guān)注核酸，其缺少在該所關(guān)注核酸旁側(cè)的、所關(guān)注核酸所源自的有機(jī)體的天然存在的基因組中的一種或多種核酸(例如基因)。因此，該術(shù)語包括(例如)摻入載體中、摻入自主復(fù)制型質(zhì)?；虿《局谢驌饺朐松锘蛘婧松锏幕蚪MDNA中，或者獨(dú)立于其他序列作為單獨(dú)的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)存在的重組DNA。
[0049]所謂“異源核酸”意指衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細(xì)胞的核酸序列。在一些實(shí)施例中，異源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主細(xì)胞內(nèi)存在的野生型核酸。
[0050]如本文所用，“表達(dá)控制序列”意指引導(dǎo)所關(guān)注核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可以為啟動(dòng)子(例如組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)或增強(qiáng)子。表達(dá)控制序列可以是“天然的”或異源的。天然的表達(dá)控制序列衍生自與所表達(dá)基因相同的生物體、物種或株系。異源表達(dá)控制序列衍生自與所表達(dá)基因不同的生物體、物種或株系?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動(dòng)子。
[0051]所謂“有效連接的”意指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子)與第二核酸序列之間的功能性連接，其中該表達(dá)控制序列引導(dǎo)對(duì)應(yīng)于該第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0052]如本文所用，術(shù)語“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞有可能生長(zhǎng)所需的最少營(yíng)養(yǎng)物，通常不存在氨基酸的培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基通常含有:(I)用于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源；(2)各種鹽，其可因宿主物種和生長(zhǎng)條件而變動(dòng)；和(3)水。從簡(jiǎn)單的糖如葡萄糖到其他生物質(zhì)的較復(fù)雜水解產(chǎn)物如酵母提取物，碳源可以有很大變化，如下文更詳細(xì)論述的。鹽通常提供必需元素如鎂、氮、磷和硫以允許細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸?；九囵B(yǎng)基還可補(bǔ)充有選擇劑，例如抗生素，以針對(duì)某些質(zhì)粒的維持等進(jìn)行選擇。例如，如果微生物對(duì)某一抗生素例如氨芐青霉素或四環(huán)素具有抗性，則可將該抗生素添加至培養(yǎng)基以便防止缺乏該抗性的細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)基可在必要時(shí)補(bǔ)充有其他化合物以選擇所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。[0053]如本文所用，術(shù)語“類異戊二烯”是指數(shù)量大且多樣的一類天然存在的一類有機(jī)化合物，其由兩個(gè)或更多個(gè)烴單元構(gòu)成，每個(gè)單元由以特定模式排列的五個(gè)碳原子組成。如本文所用，明確地將“異戊二烯”從“類異戊二烯”的定義中排除。
[0054]如本文所用，術(shù)語“萜類化合物”是指數(shù)量大且多樣的一類有機(jī)分子，該分子衍生自以多種方式組裝和修飾并且根據(jù)組成員中所用的類異戊二烯單元的數(shù)目分組的五碳類異戊二烯單元。半萜類化合物具有一個(gè)類異戊二烯單元。單萜類化合物具有兩個(gè)類異戊二烯單元。倍半萜類化合物具有三個(gè)類異戊二烯單元。二萜類化合物具有四個(gè)異戊二烯單元。二倍半萜類具有五個(gè)異戊二烯單元。三萜類化合物具有六個(gè)類異戊二烯單元。四萜類化合物具有八個(gè)類異戊二烯單元。多萜類化合物具有超過八個(gè)類異戊二烯單元。
[0055]如本文所用，“類異戊二烯前體”是指生物體用于萜類化合物或類異戊二烯的生物合成的任何分子。類異戊二烯前體分子的非限制性例子包括例如異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
[0056]如本文所用，術(shù)語“質(zhì)量產(chǎn)率”是指宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量除以宿主細(xì)胞所消耗的葡萄糖的質(zhì)量乘以100。
[0057]所謂“比生產(chǎn)率”，其意指宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量除以產(chǎn)生產(chǎn)物的時(shí)間、宿主細(xì)胞密度和培養(yǎng)物體積。
[0058]所謂“滴度”，其意指宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量除以培養(yǎng)物的體積。
[0059]如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)(CPI) ”是指宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量除以培養(yǎng)物中產(chǎn)生的宿主細(xì)胞的質(zhì)量。
[0060]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所一般理解的含義相同的含義。
[0061]如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。
[0062]在本說明書通篇中給出的每一最大數(shù)值限度旨在包括每一較低數(shù)值限度，就如同此類較低數(shù)值限度在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一最小數(shù)值限度將包括每一較高數(shù)值限度，就如同此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一個(gè)數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一個(gè)較窄數(shù)值范圍，就如同此類較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。
[0063]能夠產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體或類異戊二烯的重組微生物
[0064]甲羥戊酸依賴性生物合成途徑(MVA途徑)是所有高等真核生物和某些細(xì)菌中存在的關(guān)鍵代謝途徑。除了對(duì)蛋白質(zhì)異戊二烯化、細(xì)胞膜維持、蛋白質(zhì)錨定和N-糖基化等各種各樣的過程中所用的分子的產(chǎn)生是重要的外，甲羥戊酸途徑還提供類異戊二烯前體分子DMAPP和IPP的主要來源，這些分子充當(dāng)萜烯、萜類化合物、類異戊二烯和異戊二烯的生物合成的基礎(chǔ)。
[0065]如本文所用，MVA途徑的上游部分利用細(xì)胞代謝期間產(chǎn)生的乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A作為 初始底物，用于通過具有乙酰乙酰輔酶A合酶、HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶酶活性的多肽的作用產(chǎn)生甲羥戊酸。首先，乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A通過乙酰乙酰輔酶A合酶的作用轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A。接著，乙酰乙酰輔酶A通過HMG輔酶A合酶的酶促作用轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG輔酶A)。該輔酶A衍生物通過HMG輔酶A還原酶還原成甲羥戊酸，這是產(chǎn)生類異戊二烯的甲羥戊酸途徑的限速步驟。甲羥戊酸然后經(jīng)由甲羥戊酸激酶的作用轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸-5-磷酸，其隨后通過磷酸甲羥戊酸激酶的酶活性轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸-5-焦磷酸。最后，通過酶甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶的活性由甲羥戊酸-5-焦磷酸形成IPP。
[0066]因此，本發(fā)明的重組微生物是具有產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體或類異戊二烯能力的重組微生物，其中所述重組微生物包含編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的酶的基因(例如，乙酰乙酰輔酶A合酶基因或nphT7)以及涉及使得能在宿主微生物中由乙酰乙酰輔酶A合成異戊二烯或類異戊二烯的異戊二烯生物合成或類異戊二烯生物合成的一組基因中的一者或多者。
[0067]乙酰乙酰輔酶A合酶基因
[0068]乙酰乙酰輔酶A合酶基因(亦稱nphT7)為編碼具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性以及具有極低的從兩個(gè)乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的活性(如無該活性)的酶的基因。參見例如Okamura等人，PNAS (《美國(guó)科學(xué)院院刊》)第107卷，第25期，第11265-11270頁(2010)，將其關(guān)于nphT7的教導(dǎo)內(nèi)容明確地并入本文。來自鏈霉菌屬CL190菌株的放線菌的乙酰乙酰輔酶A合酶基因在日本專利公布(特開平)N0.2008-61506A和US2010/0285549中有所描述。乙酰乙酰輔酶A合酶還可被稱為乙酰輔酶A:丙二酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶?？梢允褂玫拇硇缘囊阴Ｒ阴］o酶A合酶(或乙酰輔酶A:丙二酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶)為Genbank AB540131.1。
[0069]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的乙酰乙酰輔酶A合酶經(jīng)由不可逆反應(yīng)從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A。利用乙酰乙酰輔酶A合酶來生成乙酰輔酶A具有額外的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵摲磻?yīng)是不可逆的而乙酰乙酰輔酶A硫解酶從兩個(gè)乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的作用是可逆 的。因此，利用乙酰乙酰輔酶A合酶來從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A與利用硫解酶來生成相同終產(chǎn)物相比，可導(dǎo)致異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的生產(chǎn)率有顯著改善。
[0070]此外，利用乙酰乙酰輔酶A合酶來產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯提供了另一優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橐阴Ｒ阴］o酶A合酶可經(jīng)由丙二酰輔酶A的脫羧反應(yīng)將丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。因而，起始底物的儲(chǔ)存不受乙酰輔酶A的起始量限制。當(dāng)起始底物僅為丙二酰輔酶A時(shí)，仍可發(fā)生由乙酰乙酰輔酶A合酶合成乙酰乙酰輔酶A。在一個(gè)實(shí)施例中，通過使用具有更多丙二酰輔酶A的宿主菌株來增加起始丙二酰輔酶A的庫存量。這種增加的庫存量可天然存在或通過分子操縱進(jìn)行工程改造。參見例如，F(xiàn)owler等人,Applied andEnvironmental Microb1logy (《應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)》)，第75卷，第18期，第5831-5839頁(2009), Zha 等人，Metabolic Engineering (《代謝工程》)，11:192-198 (2009), Xu 等人，Metabolic Engineering (《代謝工程》)，(2011) do1: 10.1016/j.ymben.2011.06.008,Okamura 等人，PNAS (《美國(guó)科學(xué)院院刊》)107:11265-11270 (2010)，以及 US2010/0285549,將這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容明確地以引用的方式全文并入本文。
[0071 ] 在本文所述任何方面或?qū)嵤├校梢允褂镁哂杏杀］o酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的能力的酶。本文描述了這種酶的非限制性例子。在本文所述的某些實(shí)施例中，可以使用來源于鏈霉菌屬的放線菌、具有由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合酶基因。[0072]這種乙酰乙酰輔酶A合酶基因的一個(gè)例子是編碼具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的這種蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)于具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的活性以及不具有從兩個(gè)乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的活性的乙酰乙酰輔酶A合酶。
[0073]在一個(gè)實(shí)施例中，編碼具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因可通過核酸擴(kuò)增方法(如PCR)將從鏈霉屬物種CL190菌株的放線菌獲得的基因組DNA用作模板和使用可參照日本專利公開(特開平)N0.2008-61506A設(shè)計(jì)的一對(duì)引物而獲得。
[0074]如本文所述，用于本發(fā)明的乙酰乙酰輔酶A合酶基因不限于來自鏈霉屬物種CL190菌株的放線菌的編碼具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。編碼具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的能力并且不從兩個(gè)乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的蛋白質(zhì)的任何基因可用于本發(fā)明所述的方法。在某些實(shí)施例中，乙酰乙酰輔酶A合酶基因可以是編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列與SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有高相似性或與之實(shí)質(zhì)上相同，并且具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能。表述“高相似性”或“實(shí)質(zhì)上相同”是指例如，至少約80%同一性、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%和至少約99%同一性。如上文所用，同一性值對(duì)應(yīng)于一不同氨基酸序列和SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的氨基酸殘基之間的同一性百分比，其通過使用用于搜索序列相似性的程序進(jìn)行SEQ ID NO:1的氨基酸序列與該不同氨基酸序列的比對(duì)來計(jì)算。
[0075]在其他實(shí)施例中，乙酰乙酰輔酶A合酶基因可以是編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)具有通過置換、缺失、添加或插入I個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列并 且具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能。在本文中，表述“多個(gè)氨基酸”是指例如，2至30個(gè)氨基酸，優(yōu)選2至20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選2至10個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選2至5個(gè)氨基酸。
[0076]在其他實(shí)施例中，乙酰乙酰輔酶A合酶基因可由能夠在嚴(yán)格條件下與具有與編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸的一部分或全部雜交并且能夠編碼具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸組成。在本文中，在嚴(yán)格條件下雜交對(duì)應(yīng)于在60攝氏度、2 X SSC下洗滌的條件下保持結(jié)合。雜交可通過常規(guī)上已知的方法例如在如下文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行J.Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (《分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》),第3版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory) (2001)。
[0077]如本文所述，編碼具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合酶的基因可分離自可能任何生物體，例如不獲自鏈霉物種CL190菌株的放線菌。另外，用于本文的乙酰乙酰輔酶A合酶基因可通過以本領(lǐng)域已知的方法修飾編碼SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多核苷酸來獲得?？赏ㄟ^已知的方法如Kunkel方法或缺口雙鏈體方法(gapped duplex method)或者通過類似于它們?nèi)我徽叩姆椒ㄟM(jìn)行對(duì)核苷酸序列的誘變。例如，可使用誘變?cè)噭┖?如產(chǎn)品名=Mutant-K和Mutant-G (寶生物工程株式會(huì)社(TAKARAB1)),用于定點(diǎn)誘變；產(chǎn)品名:LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(寶生物工程株式會(huì)社)等等)來進(jìn)行誘變。[0078]可如下所述評(píng)價(jià)具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的乙酰乙酰輔酶A合酶的活性。具體而言，首先將編碼待評(píng)價(jià)的蛋白質(zhì)的基因引入宿主細(xì)胞使得該基因可在其中表達(dá)，然后通過諸如色譜之類的技術(shù)純化該蛋白質(zhì)。將丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A作為底物添加至含有所獲得的待評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的緩沖液，然后例如在所需的溫度(如10°C至60°C)下溫育。在反應(yīng)完成后，測(cè)定底物損失和/或所產(chǎn)生的產(chǎn)物(乙酰乙酰輔酶A)的量。因而，評(píng)價(jià)所測(cè)蛋白質(zhì)是否具有從丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能以及評(píng)價(jià)合成的程度是可能的。在這種情形中，通過將單獨(dú)的乙酰輔酶A作為底物添加至含有所獲得的待評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的緩沖液中并以類似方式測(cè)定底物損失的量和/或所產(chǎn)生的產(chǎn)物的量來檢驗(yàn)蛋白質(zhì)是否具有從乙酰輔酶A分子合成乙酰乙酰輔酶A的能力是可能的。
[0079]MVA涂徑核酸和多狀
[0080]可與乙酰乙酰輔酶A合酶結(jié)合使用的示例性MVA途徑多肽包括但不限于:3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMG輔酶A合酶)多肽(例如，mvaS編碼的酶)、3_羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG輔酶A還原酶)多肽(例如，mvaR編碼的酶或mvaE編碼的經(jīng)修飾為硫解酶缺陷型、但仍保留其還原酶活性的酶)、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽 、IPP異構(gòu)酶多肽、IDI多肽，以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具體地講，MVA途徑多肽包括具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途徑核酸包括編碼具有MVA途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途徑多肽和核酸包括來自本文所述任何來源生物體的天然多肽和核酸。另外，也可使用能夠獲得更好的異戊二烯產(chǎn)量的MVA途徑多肽變體。
[0081]可使用的MVA途徑多肽的非限制性例子在國(guó)際專利申請(qǐng)公開N0.W02009/076676、W02010/003007和W02010/148150中描述，將這些專利公開的內(nèi)容明確地以引用的方式并入本文。
[0082]示例件3-羥某-3-甲某戊二酰輔酶A還原酶(HMG輔酶A還原酶)多fit和核酸
[0083]可使用催化將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸多肽的反應(yīng)的酶，例如3_羥基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG輔酶A還原酶)。另一例子為mvaE編碼的經(jīng)修飾為硫解酶缺陷型、但仍保留其還原酶活性的酶。據(jù)報(bào)道m(xù)vaE基因編碼既具有硫解酶又具有HMG輔酶A還原酶活性的多肽。由mvaE基因編碼的多肽的硫解酶活性將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A，而該多肽的HMG輔酶A還原酶酶活性將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸?？捎糜诒景l(fā)明的示例性mvaE多肽和核酸包括來自本文所述任何來源生物體的不具有硫解酶活性但具有HMG輔酶A還原酶酶活性的天然存在的或經(jīng)修飾的多肽和核酸。
[0084]經(jīng)修飾的mvaE多肽包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)歷氨基酸置換但保留HMG輔酶A還原酶活性而同時(shí)具有極小或沒有硫解酶活性的那些。氨基酸置換可以是保守的或非保守的，并且此類置換的氨基酸殘基可以為或可以不為由遺傳密碼編碼的殘基。標(biāo)準(zhǔn)的二十種氨基酸的“字母表”已經(jīng)根據(jù)其側(cè)鏈的相似性而劃分成為化學(xué)家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有化學(xué)上相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基替換(即，將具有堿性側(cè)鏈的氨基酸替換為具有堿性側(cè)鏈的另一種氨基酸)的置換?！胺潜Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有化學(xué)上不同的側(cè)鏈的氨基酸殘基替換(即，將具有堿性側(cè)鏈的氨基酸替換為具有芳族側(cè)鏈的另一種氨基酸)的置換。
[0085]可在mvaE多肽中引入氨基酸置換以改善該分子的功能性。例如，可在硫解酶缺陷型mvaE多肽中引入改善其將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的能力的氨基酸置換。在一些方面，硫解酶缺陷型mvaE多肽含有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換。
[0086]在一個(gè)方面，不被降解或較不易降解的硫解酶缺陷型mvaE蛋白可用于產(chǎn)生甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯。可使用的不被降解或較不易降解的mvaE的基因產(chǎn)物的例子包括但不限于來自生物體屎腸球菌(E.faecium)、鵓雞腸球菌(E.gal I inarum)、鉛黃腸球菌(E.casseliflavus)、幾腸球菌(E.faecalis)和格氏李斯特菌(Lgrayi)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)mvaE蛋白并尋找片段的缺失。例如，可使用本文所述的檢測(cè)方法在Hig標(biāo)簽介導(dǎo)的純化后或當(dāng)在產(chǎn)甲羥戊酸、異戊二烯或類異戊二烯的大腸桿菌BL21中表達(dá)時(shí)在Safestain染色的SDS-PAGE凝膠上鑒定片段的不存在。
[0087]可使用例如Hedl等人(J Bacter1l.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)2002年4月；184⑶:2116-2122)描述的那些標(biāo)準(zhǔn)方法，通過測(cè)量乙酰乙酰輔酶A硫解酶活性的不存在和/或HMG輔酶A還原酶活性的存在來確定一種多肽是否具有硫解酶缺陷型、HMG CoA還原酶健全型mvaE活性。在示例性的測(cè)定法中，通過分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)302nm下的吸光度變化來測(cè)量乙酰乙酰輔酶A硫解酶活性，該吸光度變化伴隨著乙酰乙酰輔酶A的形成或硫解。測(cè)定乙酰乙酰輔酶A的合成的每個(gè)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法條件是ImM乙酰輔酶A、10mM MgCl2、50mMTris, ρΗΙΟ.5，并且通過添加酶引發(fā)反應(yīng)。測(cè)定法可采用200 μ I的終體積。對(duì)于該測(cè)定法，I個(gè)酶單位(eu)代表1分鐘內(nèi)合成或硫解I μ mol的乙酰乙酰輔酶A。在另一示例性測(cè)定法中，HMG輔酶A還原酶活性可在340nm下通過分光光度計(jì)根據(jù)NADP (H)的出現(xiàn)和消失來監(jiān)測(cè)。對(duì)于測(cè)量以顯示HMG輔酶A還原脫酰基為甲羥戊酸的每個(gè)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件為0.4mMNADPH、1.0mM (R, S) -HMG 輔酶 A、10mM KCl 和 10mM KxPO4, ρΗ6.5。測(cè)定法采用 200 μ I 的終體積。通過添加酶引發(fā)反應(yīng)。對(duì)于該測(cè)定法，Ieu代表1分鐘內(nèi)周轉(zhuǎn)I μ mol的NADP(H)。這對(duì)應(yīng)于0.5 μ mol的HMG輔酶A或甲羥戊酸的周轉(zhuǎn)。
[0088] 或者，甲羥戊酸在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量可通過(不限于)氣相色譜法(參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開N0.:US2005/0287655A1)或HPLC (參見美國(guó)專利申請(qǐng)N0.: 12/978，324)來測(cè)量。作為示例性測(cè)定法，可將培養(yǎng)物接種于容納有補(bǔ)充有一種或多種抗生素的LB肉湯中的搖管中并在34°C下以250rpm溫育14小時(shí)。接著，可將培養(yǎng)物稀釋進(jìn)容納有TM3培養(yǎng)基的孔板中至最終OD為0.2，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物和200 μ M IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified B1tech公司)密封該板并在搖動(dòng)器/溫育箱中以600rpm在34°C下溫育24小時(shí)。然后將ImL的每份培養(yǎng)物以3，OOOXg離心5分種。然后將上清液添加至20%硫酸并在冰上溫育5分鐘。然后將混合物以3000Xg離心5分鐘，收集上清液用于HPLC分析。通過與甲羥戊酸(西格瑪公司(Sigma))的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來測(cè)定樣品中甲羥戊酸的濃度。另外可通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行葡萄糖氧化酶測(cè)定法測(cè)量葡萄糖濃度。利用HPLC，可通過將每份樣品的折射率響應(yīng)與通過運(yùn)行已知濃度的多種含甲羥戊酸溶液所產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相比較來定量甲羥戊酸的水平。
[0089]HMG輔酶A還原酶可在宿主細(xì)胞中在多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。質(zhì)粒可以是高拷貝質(zhì)粒、低拷貝質(zhì)粒或中等拷貝質(zhì)粒?；蛘撸蓪MG輔酶A還原酶整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體中。對(duì)于HMG輔酶A還原酶在質(zhì)粒上或作為宿主細(xì)胞染色體的整合部分的兩種異源表達(dá)而言，可以用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是HMG輔酶A還原酶的表達(dá)的強(qiáng)驅(qū)動(dòng)子，可以是表達(dá)的弱驅(qū)動(dòng)子，或可以是表達(dá)的中等驅(qū)動(dòng)子。
[0090]示例性HMG輔酶A合酶多肽和核酸
[0091]可使用催化將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為HMG輔酶A的酶(例如，HMG輔酶A合酶或HMGS )。在一個(gè)實(shí)施例中，可使用mvaS基因編碼的多肽。mvaS基因編碼具有HMG輔酶A合酶活性的多肽。該多肽可將 乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG輔酶A)。示例性的mvaS多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述來源生物體的具有mvaS多肽的至少一種活性的突變多肽和核酸。
[0092]突變mvaS多肽包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)歷氨基酸置換而仍保持mvaS多肽活性(即將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的能力)的那些?？稍趍vaS多肽中引入氨基酸置換以改善該分子的功能性。例如，可將可增加mvaS多肽對(duì)其底物的結(jié)合親和力或可改善其將乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的能力的氨基酸置換引入mvaS多肽中。在一些方面，突變mvaS多肽含有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸置換。
[0093]可使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如Quant等人(B1chem J.,(《生物化學(xué)雜志》)，1989，262:159-164)中所述的那些，通過測(cè)量HMG輔酶A合酶活性，來確定多肽是否具有mvaS活性。在示例性的測(cè)定法中，HMG輔酶A合酶活性可通過監(jiān)測(cè)在303nm下的吸光度改變以分光光度法測(cè)量乙酰乙酰輔酶A的烯醇形式的消失來測(cè)定?？商砑訕?biāo)準(zhǔn)的Iml測(cè)定體系，該測(cè)定體系含有 50mm-Tris/HCl, pH8.0、10mM_MgC12 和 0.2mM- 二巰基丁二醇，30°C ；5mM-乙酰磷酸、10，M-乙酰乙酰輔酶A和5ul提取物樣品，然后同時(shí)添加乙酰輔酶A (10uM)和10單位PTA。然后將HMG輔酶A合酶活性測(cè)量為在添加乙酰輔酶之前和之后的速率差值。乙酰乙酰輔酶A在所用的條件(pH8.0, 10mM-MgC12)下的吸收系數(shù)為12.2 X 10 3 M-1 cm-1通過定義，I單位酶活性引起每分鐘轉(zhuǎn)化Iumol乙酰乙酰輔酶Α。
[0094]或者，甲羥戊酸在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量可通過(不限于)氣相色譜法(參見美國(guó)專利申請(qǐng)公開N0.:US2005/0287655A1)或HPLC (參見美國(guó)專利申請(qǐng)N0.: 12/978，324)來測(cè)量。作為示例性測(cè)定法，可將培養(yǎng)物接種于容納有補(bǔ)充有一種或多種抗生素的LB肉湯中的搖管中并在34°C下以250rpm溫育14小時(shí)。接著，可將培養(yǎng)物稀釋進(jìn)容納有TM3培養(yǎng)基的孔板中至最終OD為0.2，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物和200 μ M IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified B1tech公司)密封該板并在搖動(dòng)器/溫育箱中以600rpm在34°C下溫育24小時(shí)。然后將ImL的每份培養(yǎng)物以3，OOOXg離心5分種。然后將上清液添加至20%硫酸并在冰上溫育5分鐘。然后將混合物以3000Xg離心5分鐘，收集上清液用于HPLC分析。通過與甲羥戊酸(西格瑪公司)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來測(cè)定樣品中甲羥戊酸的濃度。另外可通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行葡萄糖氧化酶測(cè)定法測(cè)量葡萄糖濃度。利用HPLC，可通過將每份樣品的折射率響應(yīng)與通過運(yùn)行已知濃度的多種含甲羥戊酸溶液所產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線相比較來定量甲羥戊酸的水平。
[0095]mvaS核酸可在宿主細(xì)胞中在多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。質(zhì)?？梢允歉呖截愘|(zhì)粒、低拷貝質(zhì)粒或中等拷貝質(zhì)粒?；蛘?，mvaS核酸可整合進(jìn)宿主細(xì)胞的染色體中。對(duì)于mvaS核酸在質(zhì)粒上或作為宿主細(xì)胞染色體的整合部分的兩種異源表達(dá)而言，可以用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是mvaS核酸的表達(dá)的強(qiáng)驅(qū)動(dòng)子，可以是表達(dá)的弱驅(qū)動(dòng)子，或可以是表達(dá)的中等驅(qū)動(dòng)子。
[0096]編碼MVA下游途徑的多肽的核酸
[0097]在本發(fā)明的一些方面，任何本文所述組合物或方法中描述的細(xì)胞還一種或多種編碼甲羥戊酸(MVA)下游途徑多肽的核酸。在一些方面，MVA下游途徑多肽為內(nèi)源多肽。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的內(nèi)源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的內(nèi)源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的內(nèi)源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一特定方面，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造以相對(duì)于野生型細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源MVA下游途徑多肽。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的內(nèi)源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。
[0098]甲羥戊酸下游生物合成途徑包含甲羥戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)。在一些方面，MVA下游途徑可還包含異戊烯二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。本文提供的細(xì)胞可包含至少一種編碼異戊二烯合酶、一種或多種MVA上游途徑多肽和/或一種或多種MVA下游途徑多肽的核酸。MVA下游途徑的多肽可以是(a)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊 酸；(b)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸5-焦磷酸；和(c)將甲羥戊酸5-焦磷酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的任何酶。更具體而言，將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶可來自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽和布氏擬甲烷球菌(M.Burtonii)甲羥戊酸激酶多肽。在另一方面，將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
[0099]在一些方面，MVA下游途徑多肽為異源多肽。在一些方面，該細(xì)胞包含不止一個(gè)拷貝的編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一些方面，編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。在一些方面，異源MVA下游途徑多肽為來自釀酒酵母、糞腸球菌或馬氏甲烷八疊球菌的多肽。
[0100]編碼MVA下游途徑多肽的核酸可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組中或可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。編碼MVA下游途徑多肽的核酸另外可位于載體上。
[0101]還在下面提供了示例性的MVA下游途徑多肽:⑴甲羥戊酸激酶(MVK) ； (ii)磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD);以及(iv)異戊烯二磷酸異構(gòu)酶(IDI)。具體地講,下游MVK多肽可以來自甲燒八疊球菌屬(Methanosarcina),并且更具體地講，下游MVK多肽可以來自馬氏甲烷八疊球菌。MVA下游途徑多肽的另外的例子可見于美國(guó)專利申請(qǐng)公開2010/0086978，將上述專利公開關(guān)于MVK下游途徑多肽和MVK下游途徑多肽變體的內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。
[0102]本文所述的細(xì)胞中的任一者可包含IDI核酸(如編碼IDI的內(nèi)源或異源核酸)。異戊烯二磷酸異構(gòu)酶多肽(異戊烯基-二磷酸S-異構(gòu)酶或IDI)催化異戊烯二磷酸(IPP)與二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互轉(zhuǎn)化(如將IPP轉(zhuǎn)化為DMAPP和/或?qū)MAPP轉(zhuǎn)化為IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如本文所述的那些)通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)使IPP與DMAPP相互轉(zhuǎn)化的能力來確定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括編碼具有IDI多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然多肽和核酸以及衍生自任何本文所述來源生物體的突變多肽和核酸。
[0103]MVA下游途徑多肽包括具有MVA下游途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA下游途徑核酸包括編碼具有MVA下游途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的MVA下游途徑多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然存在的多肽和核酸。此外，也還可使用能獲得更好異戊二烯產(chǎn)量的MVA下游途徑多肽的變體。
[0104]在一些方面，MVA下游途徑多肽是來自釀酒酵母、糞腸球菌或馬氏甲烷八疊球菌的多肽。在一些方面，該MVK多肽選自乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽和馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶多肽。本文所述啟動(dòng)子中的任一者(如本文所述的以及在本公開的實(shí)例中所鑒 定的啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子)均可用于驅(qū)動(dòng)任何本文所述MVA多肽的表達(dá)。
[0105]異戊二烯合酶-核酸和多肽
[0106]在本發(fā)明的一些方面，在任何本文所述的組合物或方法中所述的重組細(xì)胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽或具有異戊二烯合酶活性的多肽的一種或多種核酸。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為內(nèi)源多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一些方面，使用不止一種編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸(如，2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)拷貝的編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸)。在特定方面，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造以相對(duì)于野生型細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源異戊二烯合酶途徑多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種例如銀白楊X歐洲山楊的多肽。
[0107]在一些方面，異戊二烯合酶多肽為異源多肽。在一些方面，細(xì)胞包含不止一個(gè)拷貝的編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。
[0108]編碼異戊二烯合酶多肽的核酸可整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，或者可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。編碼異戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于載體上。
[0109]示例性異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化成異戊二烯。示例性的異戊二烯合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然多肽和核酸。此外，異戊二烯合酶的變體可具有改善的活性例如改善的酶活性。在一些方面，異戊二烯合酶變體具有其他改善的特性，例如改善的穩(wěn)定性(如熱穩(wěn)定性)和/或改善的溶解性。
[0110]可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過測(cè)量多肽在體外、在細(xì)胞提取物中或在體內(nèi)將DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯的能力，來測(cè)定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性。細(xì)胞提取物中的異戍二烯合酶多肽活性可例如按如下文獻(xiàn)中所描述的進(jìn)行測(cè)量:Silver等人，J.B1l.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)270:13010-13016，1995。在一個(gè)示例性的測(cè)定法中，可在氮?dú)饬飨聦MAPP(西格瑪公司)蒸發(fā)至干燥并在10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.2)中將其再水化至10mM的濃度，并保存于_20°C下。為了進(jìn)行該測(cè)定法，可將5mLlMMgCl2、lmM(250mg/ml)DMAPP、65mL植物提取物緩沖液(Plant Extract Buffer, PEB) (50mM Tris-HCl, pH8.0、20mM MgCl2,5% 甘油和2mMDTT)的溶液添加至20ml頂空小瓶(安捷倫科技公司(Agilent Technologies))中的25 μ L細(xì)胞提取物中并在振動(dòng)下于37°C培養(yǎng)15分鐘，其中該小瓶具有金屬旋蓋和涂有特氟龍的硅隔膜。反應(yīng) 可通過加入200 μ L的250mM EDTA進(jìn)行淬滅并通過GC/MS進(jìn)行定量。
[0111]在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自楊屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為楊異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。
[0112]在一些方面，異戍二烯合酶多肽或核酸來自豆科(Fabaceae),例如蝶形花亞科(Faboideae)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸為來自如下的多肽或核酸或其變體:山葛(葛)(Sharkey 等人,Plant Phys1logy (《植物生理學(xué)》)137:700-712，2005)、野葛、楊(例如銀白楊、黑楊、毛果楊或銀白楊X歐洲山楊(CAC35696) (Miller等人，Planta (《植物學(xué)》)213:483-487，2001 )、山楊(例如美洲山楊)(Silver等人，JBC270 (22): 13010-1316，1995)、英國(guó)橡樹(夏櫟(Quercusrobur)) (Zimmer 等人，W098/02550 )。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自山葛、野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊或毛果楊的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自銀白楊的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，編碼異戊二烯合酶(如來自銀白楊的異戊二烯合酶或其變體)的核酸經(jīng)密碼子優(yōu)化。
[0113]在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽為天然存在的多肽或核酸(例如，來自楊屬的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型的或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的變體(例如，來自楊屬的野生型或天然存在的多肽或核酸的變體)。
[0114]在一些方面，異戊二烯合酶多肽為變體。在一些方面，異戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性(如催化活性)的增加可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一者。在一些方面，諸如催化活性之類的活性的增加為至少約I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，諸如催化活性之類的活性的增加為約10%至約100倍(如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約I倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍)。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的溶解性。溶解性的增加可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一者。溶解性的增加可為至少約I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加為約10%至約100倍(如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約I倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽為天然存在的異戊二烯合酶的變體，并與天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的穩(wěn)定性(如熱穩(wěn)定性)。
[0115]在一些方面，變體具有野生型或天然存在的異戊二烯合酶的活性的至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%。變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或 99.9% 中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的異戊二烯合酶的變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有約70%至約99.9%、約 75%至約99%、約80%至約98%、約85%至約97%或約90%至約95%中的任一者的氨基酸序列同一性。
[0116]在一些方面，變體在野生型或天然存在的異戊二烯合酶中包含突變。在一些方面，變體具有至少一個(gè)氨基酸置換、至少一個(gè)氨基酸插入和/或至少一個(gè)氨基酸缺失。在一些方面，變體具有至少一個(gè)氨基酸置換。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶之間的不同氨基酸殘基的數(shù)量可為一個(gè)或多個(gè)，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。天然存在的異戊二烯合酶可包括來自植物的任何異戊二烯合酶，例如葛異戊二烯合酶、楊異戊二烯合酶、英國(guó)櫟異戊二烯合酶和柳樹異戊二烯合酶。在一些方面，變體為來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體具有至少一個(gè)氨基酸置換、至少一個(gè)氨基酸插入和/或至少一個(gè)氨基酸缺失。在一些方面，變體為截短的銀白楊異戊二烯合酶。在一些方面，編碼變體(如來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體)的核酸為密碼子優(yōu)化的(例如，基于在其中表達(dá)異源異戊二烯合酶的宿主細(xì)胞而進(jìn)行密碼子優(yōu)化的)。
[0117]本文提供的異戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146、W02012/058494和美國(guó)專利申請(qǐng)公開N0.:2010/0086978中所述的任何異戊二烯合酶或異戊二烯合酶變體，將這些專利關(guān)于異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內(nèi)容明確地以引用的方式全文并入本文。
[0118]本文所述啟動(dòng)子中的任一種(例如，本文所述的以及在本公開的實(shí)例中所鑒定的啟動(dòng)子，包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子)均可用于驅(qū)動(dòng)任何本文所述的異戊二烯合酶的表達(dá)。
[0119]合適的異戊二烯合酶包括但不限于Genbank登錄號(hào)AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所標(biāo)示的那些?？捎糜诒疚乃鼋M合物或方法(包括產(chǎn)生編碼異戊二烯合酶的微生物的方法)中的任一者的異戊二烯合酶類型也在國(guó)際專利申請(qǐng)公開 N0.W02009/076676、W02010/003007、W02009/132220、W02010/031062、W02010/031068、W02010/031076, W02010/013077, W02010/031079, W02010/148150, W02010/124146,W02010/078457、W02010/148256和W02012/058494中描述，將這些專利公開關(guān)于異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內(nèi)容明確地以引用的方式全文并入本文。
[0120]編碼DXP途徑多肽的核酸
[0121]在本發(fā)明的一些方面，在任何本文所述的組合物或方法中描述的重組細(xì)胞還包含一種或多種編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的異源核酸。在一些方面，細(xì)胞還包含編碼DXS多肽或其他DXP途徑多肽的內(nèi)源核酸的染色體拷貝。在一些方面，大腸桿菌細(xì)胞還包含一種或多種編碼IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽的核酸。在一些方面，一種核酸編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，一個(gè)質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽。在一些方面，多個(gè)質(zhì)粒編碼異戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途徑多肽。
[0122]示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴?biāo) 準(zhǔn)方法(如本文所述的那些)通過測(cè)量多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測(cè)量DXS活性的方法在國(guó)際專利公開N0.W02009/076676、美國(guó)專利申請(qǐng)N0.12/335,071 (美國(guó)公開N0.2009/0203102)、TO2010/003007、美國(guó)公開 N0.2010/0048964、W02009/132220 以及美國(guó)公開N0.2010/0003716中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。
[0123]示例性的DXP途徑多肽包括但不限于如下多肽中的任一者:DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽和具有DXP途徑多肽中的一種、兩種或更多種的活性的多肽(如融合多肽)。具體地講，DXP途徑多肽包括具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途徑核酸包括編碼具有DXP途徑多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途徑多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述來源生物體的突變多肽和核酸。示例性的DXP途徑多肽和核酸以及測(cè)量DXP途徑多肽活性的方法在國(guó)際公開N0.:W02010/148150中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。
[0124]示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法(如本文所述的那些)通過測(cè)量多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力來確定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及測(cè)量DXS活性的方法在國(guó)際專利公開N0.W02009/076676、美國(guó)專利申請(qǐng)N0.12/335,071 (美國(guó)公開N0.2009/0203102)、TO2010/003007、美國(guó)公開 N0.2010/0048964、TO2009/132220 以及美國(guó)公開N0.2010/0003716中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。
[0125]具體地講，DXS多肽將丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1_脫氧-d_木酮糖-5-磷酸(DXP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力，確定多肽是否具有DXS多肽活性。
[0126]DXR多肽將1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)轉(zhuǎn)化為2_C_甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化DXP的能力來確定多肽是否具有DXR多肽活性。
[0127]MCT多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_4_磷酸(MEP)轉(zhuǎn)化為4_ (胞苷_5’ - 二磷酸)-2-甲基-D-赤蘚醇(CDP-ME)。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化MEP的能力來確定多肽是否具有MCT多肽活性。
[0128]CMK多肽將4-(胞苷-5’ - 二磷酸)~2~C~甲基-D-赤蘚醇(OTP-ME)轉(zhuǎn)化為2_磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(⑶P-MEP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-ME的能力來確定多肽是否具有CMK多肽活性。
[0129]MCS多肽將2-磷酸-4-(胞苷_5’ - 二磷酸)~2~C~甲基-D-赤蘚醇(CDP-MEP)轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸(ME-CPP或cMEPP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化CDP-MEP的能力來確定多肽是否具有MCS多肽活性。
[0130]HDS多肽將2-C-甲基-D-赤蘚醇_2，4_環(huán)二磷酸轉(zhuǎn)化為(E) _4_羥基_3_甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸 (HMBPP或HDMAPP)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化ME-CPP的能力來確定多肽是否具有HDS多肽活性。
[0131]HDR多妝將(E)_4_羥基_3_甲基丁 _2_烯-1-基二憐酸轉(zhuǎn)化為異戍烯二憐酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)定多肽在體外、在細(xì)胞提取物內(nèi)或體內(nèi)轉(zhuǎn)化HMBPP的能力來確定多肽是否具有HDR多肽活性。
[0132]MVA涂徑、異戊二烯合酶、IDI和DXP涂徑多狀的來源牛物體
[0133]異戊二烯合酶、ID1、DXP途徑和/或MVA途徑核酸(不包括將兩個(gè)乙酰乙酰輔酶A分子縮合為乙酰輔酶A的酶，例如乙酰乙酰輔酶A硫解酶或AACT)、MVA途徑多肽(不包括將兩個(gè)乙酰乙酰輔酶A分子縮合為乙酰輔酶A的酶，例如AACT河從天然含有異戊二烯合酶、IDI,DXP途徑和/或MVA途徑核酸的任何生物體獲得。異戊二烯由多種生物體(例如細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物)天然地形成。一些生物含有產(chǎn)生異戊二烯的MVA途徑。異戊二烯合酶核酸可例如從任何含有異戊二烯合酶的生物體獲得。MVA途徑核酸可例如從任何含有MVA途徑的生物體獲得。IDI和DXP途徑核酸可例如從含有IDI和DXP途徑的任何生物體獲得。
[0134]異戊二烯合酶、DXP途徑、IDI和/或MVA途徑核酸的核酸序列可分離自細(xì)菌、真菌、植物、藻類或藍(lán)細(xì)菌。示例性的來源生物體包括例如:酵母如酵母菌屬的物種(如釀酒酵母)、細(xì)菌如埃希氏桿菌屬的物種(如大腸桿菌)或甲烷八疊球菌屬的物種(如馬氏甲烷八疊球菌)、植物如葛或楊(如銀白楊或銀白楊X歐洲山楊CAC35696 )或山楊(如美洲山楊)?？墒褂玫漠愇於┖厦浮DI和/或MVA途徑多肽的示例性來源也在國(guó)際專利公開 N0.W02009/076676、N0.W02010/003007、N0.W02009/132220、N0.W02010/031062、N0.W02010/031068, N0.W02010/031076, N0.W02010/013077, N0.W02010/031079,N0.W02010/148150、N0.W02010/078457 和 N0.W02010/148256 中描述。
[0135]在某些方面，來源生物體是酵母，如酵母菌屬物種、裂殖酵母屬物種、畢赤酵母屬物種或假絲酵母屬物種。
[0136]在一些方面，來源生物體為細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌株如地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、泛菌屬(Pantoea)的菌株如朽1檬泛菌、假單胞菌屬的菌株如產(chǎn)堿假單胞菌、鏈霉菌屬的菌株如變鉛青鏈霉菌或銹赤鏈霉菌(Streptomyces rubiginosus)、埃希氏桿菌屬的菌株如大腸桿菌、腸桿菌屬(^Enterobacter)的菌株、鏈球菌屬(Streptococcus)的菌株或古細(xì)菌(Archaea)的菌株如馬氏甲燒八疊球菌。
[0137]如本文所用，“芽孢桿菌屬”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“芽孢桿菌屬”內(nèi)的所有物種，包括但不限于例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，芽孢桿菌屬還在繼續(xù)進(jìn)行分類學(xué)整理。因此，意在使該屬包括已經(jīng)重新分類的種，包括(但不限于)諸如現(xiàn)在命名為“嗜熱脂肪地芽孢桿菌”(Geobacillus stearothermophiIus)的嗜熱脂肪芽孢桿菌之類的生物體。在存在氧氣的情況下產(chǎn)生抗性內(nèi)生孢子被視為芽孢桿菌屬的定義性特征，但該特性還適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌屬(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、短芽抱桿菌屬(Brevibacillus)、線芽抱桿菌屬(Filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)、嗜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、鹽芽抱桿菌屬(Salibacillus)、熱芽抱桿菌屬(Thermobacillus)、服芽抱桿菌屬(Ureibacillus)和枝芽抱桿菌屬(Virgibacillus)。
[0138]在某些方面，源 生物體是革蘭氏陽性菌。非限制性例子包括鏈霉菌屬的菌株(例如變鉛青鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌或灰色鏈霉菌)和芽孢桿菌。在一些方面，來源生物體為革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌或假單胞菌屬物種。在一些方面，來源生物體為嗜酸乳桿菌。
[0139]在一些方面，來源生物體為植物，例如來自豆科如蝶形花亞科的植物。在一些方面，來源生物體為葛、楊(例如銀白楊X歐洲山楊CAC35696)、山楊(例如美洲山楊)或夏櫟。
[0140]在某些方面，源生物體是藻類，例如綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。
[0141]在一些方面，來源生物體為藍(lán)細(xì)菌，例如基于形態(tài)分類成如下任何組的藍(lán)細(xì)菌:色球藻目(Chroococcales)、寬球藻目(Pleurocapsales)、_藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)0
[0142]示例性的宿主細(xì)胞
[0143]本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行設(shè)計(jì)，以包含優(yōu)化某些宿主菌株的基因表達(dá)的某些元件。此類優(yōu)化元件包括但不限于復(fù)制起始區(qū)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。本文提及的載體和元件僅出于示例性目的進(jìn)行描述，且不旨在縮小本發(fā)明的范圍。
[0144]任何微生物或其子代可用于表達(dá)本文所述的任何基因(異源或內(nèi)源)。包括革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌在內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞可用于表達(dá)本文所述的任何基因。具體地講，本文描述的基因可在由如下組成的組中的任一者中表達(dá):埃希氏桿菌屬(例如大腸桿菌)、嗜酸乳桿菌、檸檬泛菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、棒桿菌屬物種(例如谷氨酸棒桿菌)、多糖降解菌2-40、Alginovibr1 aqualiticus、交替單胞菌屬標(biāo)準(zhǔn)參考菌株KLIA、Asteromyces cruciatus、海貝內(nèi)克菌、陰溝腸桿菌、海洋鹽單胞菌、肺炎克雷伯菌、發(fā)光桿菌屬物種(ATCC433367)、葉氏假交替單胞菌、假單胞菌屬物種(例如，Pseudomonasalginovora、銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌、惡臭假單胞菌)、溶藻弧菌、鮑魚腸弧菌、哈維氏弧菌、白色鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及產(chǎn)堿假單胞菌細(xì)胞。在一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。存在許多類型的可在本發(fā)明的組合物和方法中用作宿主細(xì)胞的厭氧細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在本文所述的任何組合物或方法中所述的細(xì)胞為專性厭氧細(xì)胞及其子代。專性厭氧菌在存在氧的條件下通常生長(zhǎng)不良，或根本不生長(zhǎng)。應(yīng)當(dāng)理解，可以存在少量的氧，也就是說，存在專性厭氧菌對(duì)低水平氧的一定耐受度。在一個(gè)方面，經(jīng)工程改造以產(chǎn)生甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯的專性厭氧菌可作為本文所述的任何方法和/或組合物的宿主細(xì)胞，并在實(shí)質(zhì)上無氧的條件下生長(zhǎng)，其中氧的存在量對(duì)厭氧菌的生長(zhǎng)、維持和/或發(fā)酵無害。
[0145]在本發(fā)明的另一方面，在本文所述的任何組合物或方法中所述和/或所用的宿主細(xì)胞為兼性厭氧細(xì)胞及其子代。兼性厭氧菌可在存在氧時(shí)通過有氧呼吸(例如利用TCA循環(huán))生成細(xì)胞ATP。然而，兼性厭氧菌也可在不存在氧的情況下生長(zhǎng)。這與在存在較高氧含量下死亡或生長(zhǎng)不良的專性厭氧菌形成對(duì)照。在一個(gè)方面，因此，兼性厭氧菌可作為本文提供的任何組合物和/或方法的宿主細(xì)胞，并可經(jīng)工程改造以產(chǎn)生甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊 二烯。兼性厭氧宿主細(xì)胞可在實(shí)質(zhì)上無氧的條件下生長(zhǎng)，其中氧的存在量對(duì)厭氧菌的生長(zhǎng)、維持和/或發(fā)酵無害，或者作為另外一種選擇可在存在較高氧含量的情況下生長(zhǎng)。
[0146]宿主細(xì)胞另外可以為絲狀真菌細(xì)胞及其子代。(參見例如Berka和Barnett,B1technology Advances,(《生物技術(shù)進(jìn)展》)，(1989)，7 (2): 127-154)。在一些方面，絲狀真菌細(xì)胞可以為如下任一者:長(zhǎng)梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、青霉屬(Penicillium)物種、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola Ianuginose)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)、金抱子菌屬(Chrysosporium)物種、Chrysosporium lucknowense、粘帚霉屬(Gl1cladium)物種、曲霉屬(Aspergillus)物種(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori))、鐮刀霉屬(Fusarium)物種(例如粉紅鍵刀菌(Fusarium roseum)、禾赤鍵刀菌(Fusarium graminum)、谷類鍵刀菌(Fusariumcerealis)、尖抱鍵刀菌(Fusariumoxysporuim)或壤片鍵刀菌(Fusarium venenatum))、脈孢菌屬(Neurospora)物種(例如粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa))、肉座菌屬(Hypocrea)物種、毛霉屬(Mucor)物種(例如米黑毛霉(Mucor miehei))、根霉屬(Rhizopus)物種或翅孢霉屬(Emericella)物種。在一些方面，真菌為構(gòu)巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、綠色木霉、尖孢鐮刀菌或爺腐皮鐮孢霉(Fusarium solani)。在某些實(shí)施例中，供本發(fā)明使用的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒元件包括美國(guó)專利公開N0.US2011/0045563中所述的那些。
[0147]宿主細(xì)胞也可以為酵母，例如酵母屬物種、裂殖酵母屬物種、畢赤酵母屬物種或假絲酵母屬物種。在一些方面，酵母菌屬物種為釀酒酵母(參見例如Romanos等人,Yeast(《酵母》)，(1992),8(6):423-488)ο在某些實(shí)施例中，用于本文的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒組分包括在美國(guó)專利No, 7，659，097和美國(guó)專利公開N0.US2011/0045563中描述的那些。
[0148]宿主細(xì)胞還可以為藻類物種，例如綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。(參見例如 Saunders 和 Warmbrodt, “Gene Express1n in Algae andFungi, Including Yeast (《藻類和真菌(包括酵母沖的基因表達(dá)》)”(1993)，馬里蘭州貝爾茨維爾的美國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)圖書館(Nat1nalAgricultural Library, Beltsville, MD))。在某些實(shí)施例中，供本發(fā)明使用的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒元件包括美國(guó)專利公開N0.US2011/0045563中所述的那些。在一些方面，宿主細(xì)胞為藍(lán)細(xì)菌，例如基于形態(tài)學(xué)分類成以下任何組的藍(lán)細(xì)菌:綠球藻目、寬球藻目、顫藻目、念珠藻目或真枝藻目(參見例如Lindberg等人，Metab.Eng.(《代謝工程》)，(2010) 12(1): 70-79 )0在某些實(shí)施例中，供本發(fā)明使用的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒元件包括如下專利文獻(xiàn)中描述的那些:美國(guó)專利公開N0.US2010/0297749 ；US2009/0282545和國(guó)際專利申請(qǐng) N0.W02011/034863 ο
[0149]在某些實(shí)施例中，大腸桿菌宿主細(xì)胞可用于表達(dá)本文所述的任何基因。在一個(gè)方面，宿主細(xì)胞為能夠產(chǎn)生甲羥戊酸的大腸桿菌菌株的重組細(xì)胞或其子代，其表達(dá)編碼乙酰乙酰輔酶A合酶的一種或多種核酸。所述大腸桿菌宿主細(xì)胞可產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體(例如甲羥戊酸)和/或類異戊二烯，所產(chǎn)生的異戊二烯、類異戊二烯前體(例如甲羥戊酸)和/或類異戊二烯的量、峰值滴度和細(xì)胞生產(chǎn)率高于缺少一種或多種異源表達(dá)的編碼乙酰乙酰輔酶A合酶的核酸的相同細(xì)胞的該量、峰滴度和細(xì)胞生產(chǎn)率。此外，大腸桿菌中的該一種或多種異源表達(dá)的編碼乙酰乙酰輔酶A合酶的核酸可以是染色體拷貝(例如，整合進(jìn)大腸桿菌染色體中)。在其他方面，該大腸桿菌細(xì)胞是在培養(yǎng)物中。
[0150]轉(zhuǎn)化方法
[0151]編碼乙酰乙酰輔酶A合酶(一種由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A合酶的酶)、非硫解酶MVA途徑多肽、DXP途徑多肽、異戊二烯合酶、ID1、聚異戊二烯焦磷酸合酶以及產(chǎn)生異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯所需要的任何其他酶的核酸可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)引入宿主細(xì)胞(如植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)中。
[0152]可使用用于將DNA構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如轉(zhuǎn)化、電穿孔、細(xì)胞核顯 微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(如，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或者使用重組噬菌體病毒的轉(zhuǎn)染)、使用磷酸鈣-DNA沉淀進(jìn)行溫育、用DNA包被的微粒進(jìn)行高速轟擊以及原生質(zhì)體融合。通用的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Current Protocols inMolecular B1logy (《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)(F.M.Ausubel等人(編輯)第9章，1987 ；Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)，第 3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor), 2001 ;以及 Campbell 等人，Curr.Genet.(《當(dāng)代遺傳學(xué)》)16:53-56, 1989)。所引入的核酸可整合進(jìn)染色體DNA中或作為染色體外復(fù)制型序列維持?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法選擇轉(zhuǎn)化體。適于選擇轉(zhuǎn)化體的方法在國(guó)際公開 N0.TO2009/076676、美國(guó)專利申請(qǐng) N0.12/335，071 (美國(guó)公開 N0.2009/0203102)、W02010/003007、美國(guó)專利公開 N0.2010/0048964、W02009/132220 以及美國(guó)專利公開N0.2010/0003716 中進(jìn)行了描述。
[0153]在一個(gè)實(shí)施例中，使用諸如大腸桿菌之類的細(xì)菌作為宿主。在此實(shí)施例中，可對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行選擇和/或工程改造以能夠在這種細(xì)菌中自主復(fù)制。除本文所列出的基因外，表達(dá)載體中還可以包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止序列。任選地，表達(dá)載體可含有控制啟動(dòng)子活性的基因。
[0154]可使用任何啟動(dòng)子，只要它能在如大腸桿菌的宿主中表達(dá)即可。可使用的這種啟動(dòng)子例子包括來自大腸桿菌的trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子等以及來自噬菌體的T7啟動(dòng)子。另外，可使用人工設(shè)計(jì)的或經(jīng)修飾的啟動(dòng)子，如tac啟動(dòng)子。
[0155]用于引入表達(dá)載體的方法沒有特別的限制，只要由此將DNA引入細(xì)菌中即可。其例子包括使用鈣離子的方法(Cohen, S.N.等人:Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA (《美國(guó)科學(xué)院院刊》)，69:2110-2114 (1972))和電穿孔法。
[0156]當(dāng)酵母用作宿主時(shí)，可使用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等。在此情況下，啟動(dòng)子沒有特別的限制，只要它能在酵母中表達(dá)即可。其例子包括gall啟動(dòng)子、gallO啟動(dòng)子、熱休克蛋白啟動(dòng)子、MFa I啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子和AOXl啟動(dòng)子。
[0157]用于將重組載體引入酵母中的方法沒有特別的限制，只要由此將DNA引入酵母中即可。其例子包括電穿孔法(Becker, D.M.等人Methods.Enzymol.(《酶學(xué)方法》)，194:182-187(1990))、原生質(zhì)球法(Hinnen，A.等人:Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA (《美國(guó)科學(xué)院院刊》)，75:19 29-1933 (1978))和乙酸鋰法(Itoh，H.: J.Bacter1l.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)，153:163-168(1983))。
[0158]具體地講，可能優(yōu)選的是使用具有相對(duì)高的丙二酰輔酶A含量的微生物作為宿主微生物。丙二酰輔酶A是用于脂肪酸生物合成的物質(zhì)并且存在于所有微生物中。前述的乙酰乙酰輔酶A合酶由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A。因此，可以通過使用具有高的丙二酰輔酶A含量的宿主微生物來改善異戊二烯/類異戊二烯生產(chǎn)率。
[0159]
[0160]可將合適的載體用于任何本文所述組合物和方法。例如，合適的載體可用于優(yōu)化一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼HMG輔酶A還原酶、異戊二烯合酶、聚異戊二烯焦磷酸合酶和/或一種或多種非硫解酶MVA途徑多肽的基因的表達(dá)。在某些方面，載體包含選擇標(biāo)記。可選標(biāo)記的例子包括(但不限于)抗生素抗性核酸(如，卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博萊霉素、新霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢(shì)(如營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì))的核酸。在一些方面，一個(gè)或多個(gè)拷貝的HMG輔酶A還原酶、異戊二烯合酶、聚異戊二烯焦磷酸合酶和/或一種或多種非硫解酶MVA途徑多肽核酸整合進(jìn)沒有選擇標(biāo)記的宿主細(xì)胞基因組中?？墒褂帽竟_的實(shí)例中表征或使用的載體中的任一者。
[0161]宿主細(xì)胞突變
[0162]本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有增加起始丙二酰輔酶A的細(xì)胞內(nèi)池的突變的宿主微生物的用途。這些經(jīng)修飾的宿主菌株為乙酰乙酰輔酶A合酶提供了增加的底物可利用性(如丙二酰輔酶A)，這可導(dǎo)致乙酰乙酰輔酶及其下游產(chǎn)物如異戊二烯和/或類異戊二烯的產(chǎn)量增加。在某些實(shí)施例中，宿主微生物可包含減弱或缺失檸檬酸循環(huán)基因sdhCDAB和citE、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白brnQ和丙酮酸消耗者adhE的活性的基因操縱。在其他實(shí)施例中，宿主微生物可包含導(dǎo)致一種或多種基因過表達(dá)從而引起細(xì)胞內(nèi)丙二酰輔酶A水平增加的基因操縱，所述一種或多種基因包括但不限于:乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPD)和/或丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(I3DH)。參見例如，F(xiàn)owler 等人，Applied and Environmental Microb1logy (《應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)》)，第 75卷，第 18 期，第 5831-5839 頁(2009), Zha 等人，Metabolic Engineering (《代謝工程》)，11:192-198 (2009)，Xu 等人，Metabolic Engineering (《代謝工程》)，(2011) do1: 10.1016/j.ymben.2011.06.008，Okamura 等人，PNAS (《美國(guó)科學(xué)院院刊》)107:11265-11270 (2010)，以及US2010/0285549，將這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容明確地以引用的方式全文并入本文。
[0163]本發(fā)明還設(shè)想可增加通過MVA途徑的碳通量的另外的宿主細(xì)胞突變。通過增加碳流量，可產(chǎn)生更多的異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯。還可對(duì)如本文所述的包含乙酰乙酰輔酶A合酶的重組細(xì)胞進(jìn)行工程改造來獲得增加的流向甲羥戊酸產(chǎn)生的碳通量，其中對(duì)一種或多種來自如下的酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié):(a)檸檬酸合酶；(b)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶；(C)乙酸激酶；(d)乳酸脫氫酶；(e)NADP依賴性蘋果酸酶；和(f)丙酮酸脫氫酶。
[0164]檸檬酸合酶途徑
[0165]檸檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰輔酶A的縮合以形成檸檬酸，其為三羧酸(TCA)循環(huán)的代謝物(Ner, S.等人，1983.B1chemistry (《生物化學(xué)》)22:5243-5249 ；Bhayana, V.和 Duckworth, H.1984.B1chemistry (《生物化學(xué)》)23:2900-2905)(圖 5)。在大腸桿菌中，這種由gltA編碼的酶在表現(xiàn)上與二聚亞基的三聚體相似。該六聚體形式允許該酶由NADH 別構(gòu)調(diào)節(jié)。該酶已得到了廣泛研究(Wiegand, G.和 Remington, S.1986.Annual Rev.B1physics B1phys.Chem.(《生物物理和生物物理化學(xué)年鑒》)15:97-117 ;Duckworth等人，1987.B1chem Soc Sy mp.(《生物化學(xué)協(xié)會(huì)文集》)54:83-92 ；Stockell, D.等人，2003.J.B1l.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)278:35435-43 ；Maurus, R.等人，2003.B1chemistry (《生物化學(xué)》).42:5555-5565)。為了避免NADH的別構(gòu)抑制，已考慮用枯草芽孢桿菌NADH非敏感型朽1樣酸合酶進(jìn)行替換或補(bǔ)充(Underwood等人,2002.Appl.Environ.Microb1l.(《應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)》)68:1071-1081 ； Sanchez 等人，2005.Met.Eng.(《代謝工程》)7:229-239)。
[0166]由檸檬酸合酶催化的反應(yīng)直接與催化甲羥戊酸途徑的第一個(gè)步驟的硫解酶競(jìng)爭(zhēng)，因?yàn)樗鼈兌家砸阴］o酶A作為底物(Hedl等人，2002.J.Bact.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)184:2116-2122)。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可調(diào)節(jié)檸檬酸合酶的表達(dá)(如，降低酶活性)以允許更多的碳通量進(jìn)入甲羥戊酸途徑，從而增加甲羥戊酸、異戊二烯和類異戊二烯的最終產(chǎn)量。檸檬酸合酶活性降低可以是與未進(jìn)行操縱時(shí)相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性的降低為降低至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。在一些方面，通過降低內(nèi)源檸檬酸合酶基因的活性來調(diào)節(jié)檸檬酸合酶的活性。這可通過用編碼NADH非敏感型檸檬酸合酶的轉(zhuǎn)基因?qū)?nèi)源檸檬酸合酶基因進(jìn)行染色體置換或通過使用衍生自枯草芽孢桿菌的編碼NADH非敏感型檸檬酸合酶的轉(zhuǎn)基因來實(shí)現(xiàn)。還可通過將內(nèi)源檸檬酸合酶基因啟動(dòng)子替換為合成的組成型低表達(dá)啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)(如降低)檸檬酸合酶的活性。檸檬酸合酶活性的降低可導(dǎo)致與檸檬酸合酶的表達(dá)不降低的微生物相比，更多的碳流入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0167]涉及磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和/或乙酸激酶的途徑
[0168]憐酸轉(zhuǎn)乙酸酶(pta)(Shimizu 等人，1969.B1chim.B1phys.Acta (《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》)191:550-558)催化乙酰輔酶A與乙酰磷酸(乙酰基-P)之間的可逆轉(zhuǎn)化，而乙酸激酶(ackA) (Kakuda, H.等人，1994.J.B1chem.(《生物化學(xué)雜志》)，11:916-922)使用乙?；?P來形成乙酸。這些基因可在大腸桿菌中作為操縱子而轉(zhuǎn)錄。它們一起催化乙酸的異化，同時(shí)釋放ATP。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過降低磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(如內(nèi)源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因)和/或乙酸激酶基因(如內(nèi)源乙酸激酶基因)的活性而增加可用乙酰輔酶A的量。一種實(shí)現(xiàn)降低的方式是通過缺失磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)。這可通過如下方式實(shí)現(xiàn):將一個(gè)或兩個(gè)基因替換為氯霉素表達(dá)盒，然后將該盒環(huán)出(loopingout)。乙酸由大腸桿菌因多種原因而產(chǎn)生(Wolfe, A.2005.Microb.Mol.B1l.Rev.(《微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論》)69:12-50)。不受理論的約束，由于ackA-pta利用乙酰輔酶A，因此缺失那些基因可能使碳不轉(zhuǎn)向乙酸并從而增加甲羥戊酸、異戊二烯或類異戊二烯的產(chǎn)率。
[0169]在一些方面，重組微生物與內(nèi)源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和/或內(nèi)源乙酸激酶基因的表達(dá)不減弱的微生物相比產(chǎn)生降低量的乙酸。所產(chǎn)生的乙酸的量的降低可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。乙酸減少的量與未進(jìn)行分子操縱時(shí)相比為至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0170]磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)的活性還可通過對(duì)酶進(jìn)行其他分子操縱來降低。酶活性降低可以是與未進(jìn)行操縱時(shí)相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性 的降低為降低至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。
[0171]在一些情況下，降低內(nèi)源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和/或內(nèi)源乙酸激酶基因的活性導(dǎo)致與內(nèi)源磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因和/或內(nèi)源乙酸激酶基因的表達(dá)不減弱的微生物相比更多的碳通量進(jìn)入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0172]涉及乳酸脫氫酶的途徑
[0173]在大腸桿菌中,D-乳酸通過酶乳酸脫氫酶(IdhA -圖5)由丙酮酸產(chǎn)生(Bunch, P.等人，1997.Microb1l.(《微生物學(xué)》)143:187-195)。乳酸的產(chǎn)生伴隨NADH的氧化，因此，當(dāng)氧被限制并且無法適應(yīng)所有還原當(dāng)量時(shí)，將產(chǎn)生乳酸。因此，乳酸的產(chǎn)生可能是碳消耗源。這樣，為了改善通向甲羥戊酸生產(chǎn)(以及異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯生產(chǎn)，如果需要的話)的碳流量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶的活性，例如通過降低該酶的活性來調(diào)節(jié)。
[0174]因此，在一個(gè)方面，可通過減弱內(nèi)源乳酸脫氫酶基因的活性來調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶的活性。這種降低可通過缺失內(nèi)源乳酸脫氫酶基因來實(shí)現(xiàn)。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的減弱乳酸脫氫酶基因活性的其他方式。通過操縱涉及乳酸脫氫酶的途徑，重組微生物與內(nèi)源乳酸脫氫酶基因的表達(dá)不減弱的微生物相比產(chǎn)生降低量的乳酸。所產(chǎn)生乳酸的量的降低可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)測(cè)定法測(cè)量。乳酸減少的量與未進(jìn)行分子操縱時(shí)相比為至少約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0175]乳酸脫氫酶的活性還可以通過對(duì)酶進(jìn)行其他分子操縱來降低。酶活性降低可以是與未進(jìn)行操縱時(shí)相比，比活性或總活性降低任何量。在一些情況下，酶活性的降低為降低至少約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0176]因此，在一些情況下，減弱內(nèi)源乳酸脫氫酶基因的活性導(dǎo)致與內(nèi)源乳酸脫氫酶基因表達(dá)不減弱的微生物相比，更多的碳通量進(jìn)入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0177]涉及蘋果酸酶的途徑
[0178]蘋果酸酶(在大腸桿菌中，為SfcA和maeB)是通過以下方程式催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸(使用NAD+或NADP+)的回補(bǔ)酶:
[0179]
(S)-蘋果酸 + NAD(P)+一丙酮酸+ CO2 + NAD(P)H
[0180]因此，該酶的 兩種底物為(S)-蘋果酸和NAD (P)+，而其三種產(chǎn)物為丙酮酸、CO2和NADPH0
[0181]NADP依賴性蘋果酸酶(maeB -圖5)的表達(dá)(Iwikura等人，1979.J.B1chem.(《生物化學(xué)雜志》)85:1355-1365)可通過如下方式有助于增加甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯產(chǎn)率:1)將碳從TCA循環(huán)帶回至甲羥戊酸途徑的丙酮酸即乙酰輔酶A的直接前體(乙酰輔酶A自己為甲羥戊酸的直接前體)，以及2)產(chǎn)生可用于HMG輔酶A還原酶反應(yīng)的額外 NADPHCOh, MK 等人，(2002) J.B1l.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)277:13175-13183);Bologna, F.等人(2007) J.Bact.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)189:5937-5946)。
[0182]這樣，可通過調(diào)節(jié)(例如增加)蘋果酸酶的活性和/或表達(dá)來實(shí)現(xiàn)更多的用于下游產(chǎn)生甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯的起始底物(丙酮酸和乙酰輔酶A)。NADP依賴性蘋果酸酶基因可以是內(nèi)源基因。實(shí)現(xiàn)此目的的一種非限制性方式是將內(nèi)源NADP依賴性蘋果酸酶基因啟動(dòng)子替換為合成的組成型表達(dá)啟動(dòng)子。另一種增加酶活性的非限制性方式是通過使用一種或多種編碼NADP依賴性蘋果酸酶多肽的異源核酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用易得的分子生物學(xué)技術(shù)在發(fā)酵或培養(yǎng)過程中監(jiān)測(cè)maeBRNA的表達(dá)。
[0183]因此，在一些實(shí)施例中，重組微生物與NADP依賴性蘋果酸酶基因的表達(dá)不增加的微生物相比產(chǎn)生增加量的丙酮酸。在一些方面，增加NADP依賴性蘋果酸酶基因的活性導(dǎo)致與NADP依賴性蘋果酸酶基因表達(dá)不增加的微生物相比更多的碳通量進(jìn)入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0184]所產(chǎn)生丙酮酸的量的增加可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)測(cè)定法測(cè)量。丙酮酸增加的量與未進(jìn)行分子操縱時(shí)相比可為至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0185]蘋果酸酶的活性還可以通過對(duì)酶進(jìn)行其他分子操縱來增加。酶活性增加可以是與尚未進(jìn)行操縱時(shí)相比，比活性或總活性增加任何量。在一些情況下，酶活性的增加為至少約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0186]涉及丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的途徑[0187]催化丙酮酸脫羧成乙酰輔酶A的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物由基因aceE、aceF和IpdA編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)成。那些基因的轉(zhuǎn)錄由數(shù)種調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性來增加乙酰輔酶A。調(diào)節(jié)可以是增加丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性和/或表達(dá)(例如，恒定表達(dá))。這可通過不同的方式實(shí)現(xiàn)，例如通過在操縱子前設(shè)置強(qiáng)組成型啟動(dòng)子如 PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg- λ 啟動(dòng)子，GenBank NC_001416 (SEQ ID NO: 2)),或使用一種或多種合成的組成型表達(dá)啟動(dòng)子。
[0188]因此，在一個(gè)方面，丙酮酸脫氫酶的活性通過增加丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的一種或多種基因的活性來調(diào)節(jié)，所述丙酮酸脫氫酶復(fù)合物由如下組成:(a)丙酮酸脫氫酶(E1)，(b) 二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶和(c) 二氫硫辛酸脫氫酶。應(yīng)當(dāng)理解，可操縱這些基因中的任何一種、兩種或三種以增加丙酮酸脫氫酶的活性。在另一方面，可通過減弱內(nèi)源丙酮酸脫氫酶復(fù)合物阻遏蛋白基因的活性來調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性，下文進(jìn)一步進(jìn)行了詳細(xì)描述。內(nèi)源丙酮酸脫氫酶復(fù)合物阻遏蛋白的活性可通過缺失內(nèi)源丙酮酸脫氫酶復(fù)合物阻遏蛋白基因來減弱。
[0189]在一些情況下，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的一種或多種基因?yàn)閮?nèi)源基因。增加丙酮酸脫氫酶復(fù)合物活性的另一種方式是通過向微生物引入一種或多種編碼一種或多種來自由如下酶組成的組的多肽的異源核酸:(a)丙酮酸脫氫酶(El)，(b) 二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙酰酶和(C) 二氫硫辛酸脫氫酶。
[0190]通過使用任何這些方法，重組微生物與其中丙酮酸脫氫酶活性未受調(diào)節(jié)的微生物相比可產(chǎn)生增加量的乙酰輔酶A。調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶活性可導(dǎo)致與丙酮酸脫氫酶表達(dá)未受調(diào)節(jié)的微生物相比，更多的碳通量進(jìn)入甲羥戊酸依賴性生物合成途徑。
[0191]突變的組合
[0192]應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本文所述的任何酶和/或酶途徑，明確地設(shè)想調(diào)節(jié)本文所述的酶和/或酶途徑(如其中兩者、三者、四者、五者或六者)的任何組合的分子操縱。為了便于對(duì)組合進(jìn)行表述，將檸檬酸合酶(gltA)定為A，將磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(ptaB)定為B，將乙酸激酶(ackA)定為C,將乳酸脫氫酶(IdhA)定為D,將蘋果酸酶(sfcA或maeB)定為E,并且將丙酮酸脫羧酶(aceE、aceF和/或IpdA)定為F。如上所述,丙酮酸脫羧酶復(fù)合物的aceE、aceF和/或IpdA酶可單個(gè)地使用、或三種酶中的兩種或三種酶中的三種一起使用，以增加丙酮酸脫羧酶活性。
[0193]因此，對(duì)于酶A-F的任何兩種的組合，可以使用的非限制性組合為:AB、AC、AD、AE、AF、BC、BD、BE、BF、CD、CE、CF、DE、DF和EF。對(duì)于酶A-F的任何三種的組合，可以使用的非限制性組合為:ABC、ABD、ABE、ABF、BCD、BCE、BCF、CDE、CDF、DEF、ACD、ACE、ACF、ADE、ADF、AEF、BDE, BDF, BEF和CEF。對(duì)于酶A-F的任何四種的組合，可以使用的非限制性組合為:ABCD、ABCE、ABCF、ABDE、ABDF、ABEF、BCDE、BCDF、CDEF、ACDE、ACDF、ACEF、BCEF、BDEF 和 ADEF。對(duì)于酶A-F的任何五種的組合，可以使用的非限制性組合為:ABCDE、ABCDF、ABDEF、BCDEF、ACDEF和ABCEF。在另一方面，使用所有六種酶的組合:AB⑶EF。
[0194]因此，與不在三羧酸(TCA)循環(huán)活性條件下培養(yǎng)的微生物相比本文所述的重組微生物可實(shí)現(xiàn)增加的甲羥戊酸產(chǎn)量，其中重組微生物中的代謝碳通量通過調(diào)節(jié)一種或多種來自由如下酶組成的組的酶的活性而被導(dǎo)向甲羥戊酸生產(chǎn):(a)檸檬酸合酶，(b)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和/或乙酸激酶，(C)乳酸脫氫酶，(d)蘋果酸酶和(e)丙酮酸脫羧酶復(fù)合物。
[0195]用于增加產(chǎn)暈的其他調(diào)節(jié)因子和因素
[0196]可將其他分子操縱用于增加流向甲羥戊酸生產(chǎn)的碳流量。一種方法是減少、降低或消除供料進(jìn)甲羥戊酸途徑的途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子的影響。例如，在一些情況下，基因aceEF-lpdA與第四個(gè)上游基因pdhR處于操縱子中。pdhR是其操縱子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)因子。在不存在丙酮酸的情況下，它結(jié)合其靶啟動(dòng)子并抑制轉(zhuǎn)錄。其還以相同的方式調(diào)節(jié)ndh和cyoABCD (Ogasawara, H.等人，2007.J.Bact.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)189:5534-5541 )。在一個(gè)方面，缺失pdhR調(diào)節(jié)因子可提高甲羥戊酸的供應(yīng)，并因而提高甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯的產(chǎn)量。
[0197]在其他方面，將6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(PGL)引入缺少PGL的微生物(例如多種大腸桿菌菌株)可用于提高甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和類異戊二烯的產(chǎn)量。PGL可使用染色體整合或染色體外載體(如質(zhì)粒)而引入。在某些實(shí)施例中，PGL可從表達(dá)內(nèi)源性PGL的微生物(例如多種大腸桿菌菌株)基因組中缺失，以提高甲羥戊酸和/或異戊二烯
的產(chǎn)量。
[0198]在本發(fā)明的一些方面，在任何本文所述組合物或方法中描述的重組細(xì)胞可還包含一種或多種編碼磷酸酮醇酶多肽或具有磷酸酮醇酶活性的多肽的核酸。在一些方面，磷酸酮醇酶多肽為內(nèi)源多肽。在一些方面，編碼磷酸酮醇酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼磷酸酮醇酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼磷酸酮醇酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一些方面，使用不止一種編碼磷酸酮醇酶多肽的內(nèi)源核酸(如2、3、4或更多個(gè)拷貝的編碼磷酸酮醇酶多肽的異源核酸)。在一特定方面，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造以相對(duì)于野生型細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源磷酸酮醇酶多肽。在一些方面，編碼磷酸酮醇酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。
[0199]磷酸酮醇酶酶可催化5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)化為甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸和/或6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為赤蘚糖4-磷酸和乙酰磷酸。在某些實(shí)施例中，磷酸酮醇酶酶能夠催化5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)化為甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸。在其他實(shí)施例中，磷酸酮醇酶酶能催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為赤蘚糖4-磷酸和乙酰磷酸。因而，不受理論的約束，本文所示的磷酸酮醇酶的表達(dá)可導(dǎo)致從碳水化合物源產(chǎn)生的乙酰磷酸的量增加。該乙酰磷酸可轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A然后可被MVA途徑的酶活性利用來產(chǎn)生甲羥戊酸、類異戊二烯前體分子、異戊二烯和/或類異戊二烯。因而可以增加從碳水化合物底物產(chǎn)生的這些化合物的量?；蛘?，乙酰磷酸和乙酰輔酶A的產(chǎn)量可以增加而該增加不反映在較高的細(xì)胞內(nèi)濃度方面。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞內(nèi)乙酰磷酸或乙酰輔酶A濃度將保持不變或甚至降低，盡管磷酸酮醇酶反應(yīng)正在進(jìn)行。
[0200]示例性的磷酸酮醇酶核酸包括編碼具有磷酸酮醇酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的磷酸酮醇酶多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述來源生物體的突變多肽和核酸。在一些方面，磷酸酮醇酶核酸為編碼磷酸酮醇酶多肽的異源核酸。
[0201 ] 可以用標(biāo)準(zhǔn)方法通過測(cè)量肽將D-6-磷酸果糖或D-5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸的能力來確定多肽是否具有磷酸酮醇酶肽活性。可然后將乙酰磷酸轉(zhuǎn)化成二茂鐵乙?；愝p月虧酸(ferryl acetyl hydroxamate),可以用分光光度法對(duì)二茂鐵乙?；愝pI虧酸進(jìn)行檢測(cè)(Meile等人，J.Bact.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)183:2929-2936，2001 )。如本文所述的鑒定為具有磷酸酮醇酶肽活性的任何多肽均適合用于本發(fā)明。
[0202]在其他方面，示例性的磷酸酮醇酶核酸包括例如分離自羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、巴利阿里鐵單胞菌(Ferrimonas balearica)、Pedobactor saltans、灰色鏈霉菌和/或達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocard1psis dassonvillei)的磷酸酮醇酶。可用于本發(fā)明的磷酸酮醇酶的另外例子在U.S.7，785，858中描述，將該專利以引用的方式并入本文。
[0203]能夠增加異戊二烯產(chǎn)暈的重組細(xì)胞
[0204]異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是在大量應(yīng)用中使用的重要有機(jī)化合物。例如，異戊二烯在多種化學(xué)組合物和聚合物的合成中，包括在合成橡膠的制備中用作中間體或原料。異戊二烯還是由許多植物和動(dòng)物天然合成的重要生物材料。
[0205]異戊二烯通過異戊二烯合酶的酶促作用從DMAPP產(chǎn)生。因此，不受理論的束縛，據(jù)認(rèn)為通過任何上述組合物和方法增加宿主細(xì)胞中甲羥戊酸的細(xì)胞產(chǎn)量將類似地導(dǎo)致產(chǎn)生較高量的異戊二烯。當(dāng)與甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊烯二磷酸異構(gòu)酶和用于異戊二烯和類異戊二烯產(chǎn)生的其他適當(dāng)酶的適當(dāng)酶活性水平組合時(shí)，增加從葡萄糖產(chǎn)生甲羥戊酸的摩爾產(chǎn)率可轉(zhuǎn)化為較高的從葡萄糖產(chǎn)生類異戊二烯前體和類異戊二烯(包括異戊二烯)的摩爾產(chǎn)率。
[0206]可通過使用任何本文所述的重組宿主細(xì)胞來進(jìn)行異戊二烯的產(chǎn)生，其中使用乙酰乙酰輔酶A合酶制備乙酰乙酰輔酶A以用于MVA途徑中的下游使用。乙酰乙酰輔酶A合酶的使用可增加甲羥戊酸產(chǎn)量，這繼而可用于產(chǎn)生異戊二烯。任何上述能夠增加甲羥戊酸產(chǎn)量的、表達(dá)一個(gè)或 多個(gè)拷貝的編碼MVA上游途徑多肽(包括但不限于HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶(如來自格氏李斯特菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌和/或糞腸球菌的mvaS多肽)的異源核酸的重組宿主細(xì)胞也可能夠增加異戊二烯的產(chǎn)量。在一些方面，這些細(xì)胞還包含一種或多種編碼MVA下游途徑的多肽的異源核酸和編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。
[0207]設(shè)想本文所述的重組細(xì)胞的組合物也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。應(yīng)理解，重組細(xì)胞也涵蓋子代細(xì)胞。
[0208]示例性的細(xì)胞培養(yǎng)基
[0209]如本文所用，術(shù)語“基本培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞可能生長(zhǎng)所需的最少營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基,通常但并非總?cè)绱?不存在一種或多種氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種氨基酸)?；九囵B(yǎng)基通常含有:(I)用于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源；(2)各種鹽，其可因宿主物種和生長(zhǎng)條件而變動(dòng)；和(3)水。從簡(jiǎn)單的糖如葡萄糖到其他生物質(zhì)的較復(fù)雜水解產(chǎn)物如酵母提取物，碳源可以有很大變化，如下文更詳細(xì)論述的。鹽通常提供必需元素如鎂、氮、磷和硫以允許細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸?；九囵B(yǎng)基還可補(bǔ)充有選擇劑，例如抗生素，以針對(duì)某些質(zhì)粒的維持等進(jìn)行選擇。例如，如果微生物對(duì)某一抗生素例如氨芐青霉素或四環(huán)素具有抗性，則可將該抗生素添加至培養(yǎng)基以便防止缺乏該抗性的細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)基可在必要時(shí)補(bǔ)充有其他化合物以選擇所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0210]任何基本培養(yǎng)基制劑均可用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。示例性的基本培養(yǎng)基制劑包括例如M9基本培養(yǎng)基和TM3基本培養(yǎng)基。每升M9基本培養(yǎng)基含有(I) 200ml無菌M9鹽(每升64gNa2HP04-7H20、15gKH2P04、2.5g NaCl 和 5.0gNH4Cl); (2) 2mllM MgSO4 (無菌);(3) 20ml20%(w/v)葡萄糖(或其他碳源);和(4) 10mllM CaCl2 (無菌)。每升TM3基本培養(yǎng)基含有(I) 13.6gK2HPO4 ； (2) 13.6g KH2PO4 ； (3) 2g MgS04*7H20 ； (4) 2g 檸檬酸一水合物；(5) 0.3g 檸檬酸鐵銨；
(6)3.2g (NH4)2SO4 ； (7)0.2g酵母提取物；和(8) Iml 1000X 痕量元素(Trace Elements)溶液；將pH調(diào)節(jié)至約6.8并將該溶液過濾滅菌。每升1000X痕量元素含有:(l)40g檸檬酸一水合物；(2) 30gMnS04*H20 ； (3) 1g NaCl ； (4) Ig FeS04*7H20 ； (4) Ig CoC12*6H20 ； (5) lgZnS04*7H20 ；(6) 10mg CuS04*5H20 ； (7) 10mg H3BO3 ;和(8) 100mgNaMo04*2H20 ;將 pH 調(diào)節(jié)至約 3.0。
[0211]另外的示例性基本培養(yǎng)基包括⑴磷酸鉀Κ2ΗΡ04、⑵硫酸鎂MgS04*7H20、(3)檸檬酸一水合物C6H807*H20、⑷檸檬酸鐵銨NH4FeC6H5Op (5)酵母提取物(來自思賓格公司(b1springer) )、(6) 1000X 改良痕量金屬溶液(Modified Trace Metal Solut1n)、(7)硫酸50%w/v> (8) foamblast882 (艾默羅德性能材料公司(Emerald Performance Materials))和
(9)宏量鹽溶液(Macro Salts Solut1n) 3.36ml。將所有組分一起添加并溶解于去離子H2O中，然后加熱滅菌。冷卻至室溫后，用氫氧化銨(28%)將pH調(diào)節(jié)至7.0，然后定容。滅菌和pH調(diào)節(jié)后添加維生素溶液和壯觀霉素。
[0212]任何碳源均可用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。術(shù)語“碳源”是指一種或多種能夠被宿主細(xì)胞或生物體代謝的含碳化合物。例如，用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基可包含任何適于維持生活力或培養(yǎng)宿主細(xì)胞的碳源。在一些方面，碳源為碳水化合物(例如單糖、二糖、寡糖或多糖)或轉(zhuǎn)化糖(如酶處理過的蔗糖糖漿)。
[0213]在一些方面，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一種或多種組分。在一些方面，酵母提取物的濃度為 0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v) 、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或 0.01%(w/v)酵母提取物。在一些方面，碳源既包括酵母提取物(或其一種或多種組分)又包括另一碳源，例如葡萄糖。
[0214]示例性的單糖包括葡萄糖和果糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纖維素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(如木糖或阿拉伯糖)。
[0215]示例性的細(xì)胞培養(yǎng)條件
[0216]下文，例如在實(shí)例部分中描述了適于本發(fā)明重組細(xì)胞維持和生長(zhǎng)的材料和方法。適于細(xì)胞培養(yǎng)物的維持和生長(zhǎng)的其他材料和方法是本領(lǐng)域所熟知的。示例性的技術(shù)可見于國(guó)際公開N0.W02009/076676、美國(guó)專利申請(qǐng)N0.12/335,071 (美國(guó)公開N0.2009/0203102)、W02010/003007、美國(guó)專利公開 N0.2010/0048964、TO2009/132220、美國(guó)專利公開 N0.2010/0003716 ；Manual of Methods for General Bacter1logy (《普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)》)Gerhardt等人編輯,華盛頓特區(qū)美國(guó)微生物協(xié)會(huì)(American Society forMicrob1logy, Washington, D.C.) (1994)；或 Brock,載于 B1technology:A Textbook ofIndustrial Microb1logy (《生物技術(shù):工業(yè)微生物學(xué)教材》),第二版(1989),馬薩諸塞州桑德蘭的 Sinauer Associates 公司(Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.)。在一些方面，將細(xì)胞在培養(yǎng)基中在允許由插入宿主細(xì)胞中的核酸編碼的一種或多種HMG輔酶A還原酶、HMG輔酶A合酶、異戊二烯合酶、DXP途徑(例如DXS)、ID1、MVA下游途徑多肽或PGL多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)。
[0217]可將標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件用于培養(yǎng)細(xì)胞(參見例如，W02004/033646及其中所引用的參考文獻(xiàn))。在一些方面，將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟?、氣體混合物和pH下(例如在約20°C至約37°C、在約6%至約84%C02和在約5至約9的pH下)培養(yǎng)和維持。在一些方面，在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中于35°C下培養(yǎng)細(xì)胞。在一些方面，發(fā)酵的pH范圍為約pH5.0至約pH9.0 (例如，約pH6.0至約pH8.0或約pH6.5至約7.0)?？筛鶕?jù)宿主細(xì)胞的需求在有氧、缺氧或無氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。此外，可將更多具體的細(xì)胞培養(yǎng)條件用于培養(yǎng)細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施例中，細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)表達(dá)一種或多種在低拷貝至中等拷貝質(zhì)粒中在強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的編碼HMG輔酶A還原酶的異源核酸并且在34°C培養(yǎng)。
[0218]可使用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件和發(fā)酵模式(如分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵)在如下專利文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述:國(guó)際公開N0.W02009/076676、美國(guó)專利申請(qǐng)N0.12/335,071 (美國(guó)公開 N0.2009/0203102)、W02010/003007、美國(guó)公開 N0.2010/0048964、W02009/132220、美國(guó)公開N0.2010/0003716。分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵是通用的并為本領(lǐng)域所熟知，其例子可在如下文獻(xiàn)中找到:Brock, B1technology:A Textbook of Industrial Microb1logy(《生物技術(shù):工業(yè)微生物學(xué)教材》)，第二版(1989) Sinauer Associates公司。
[0219]在一些方面，將細(xì)胞在限制葡萄糖條件下培養(yǎng)。所謂“限制葡萄糖條件”意指添加的葡萄糖的量低于細(xì)胞消耗的葡萄糖的量或約細(xì)胞消耗的葡萄糖的量的105% (例如約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%)。具體地講，在具體的一段時(shí)間，添加至培養(yǎng)基的葡萄糖的量與細(xì)胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面，通過限制所添加的葡萄糖的量使得細(xì)胞以細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖的量可支持的速率生長(zhǎng)來控制細(xì)胞生長(zhǎng)的速率。在一些方面，在培養(yǎng)細(xì)胞期間葡萄糖不積聚。在多個(gè)方面，將細(xì)胞在限制葡萄糖條件下培養(yǎng)超過或約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小時(shí)。在多個(gè)方面，將細(xì)胞在限制葡萄糖條件下培養(yǎng)超過或約培養(yǎng)該細(xì)胞的總時(shí)長(zhǎng)的5、10、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、95或100%。雖然無意于受任何特定理論束縛，但據(jù)信限制葡萄糖條件可允許對(duì)細(xì)胞進(jìn)行更有利的調(diào)節(jié)。
[0220]在一些方面，將宿主細(xì)胞分批培養(yǎng)。還可將宿主細(xì)胞分批補(bǔ)料培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。另外，可將宿主細(xì)胞在基本培養(yǎng)基(包括但不限于任何上述基本培養(yǎng)基)中培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基可還補(bǔ)充有1.0%(W/V)葡萄糖或任何其他六碳糖或更少。具體地講，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有 1% (w/V)、0.9% (w/V)、0.8% (w/V)、0.7% (w/v)、0.6% (w/v)、0.5% (w/v)、0.4% (w/v)、0.3% (w/v)、0.2%(w/v)或0.l%(w/v)葡萄糖。另外，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充0.l%(w/v)或更少的酵母提取物。具體地講，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或 0.01%(w/v)酵母提取物?；蛘?，基本培養(yǎng)基可補(bǔ)充有 l%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5% (w/v)、0.4%(w/v)、0.3% (w/v)、0.2% (w/v)或 0.l%(w/v)葡萄糖以及補(bǔ)充有 0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04% (w/v)、0.03%(w/v)、
0.02% (w/v)或 0.01% (w/v)酵母提取物。
[0221]使用重組細(xì)胞來產(chǎn)生異戊二烯的方法
[0222] 本文還提供產(chǎn)生異戊二烯的方法，其包括培養(yǎng)任何本文所述的重組微生物。在一個(gè)方面，異戊二烯可通過培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)產(chǎn)生，所述重組宿主細(xì)胞包含編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽(例如乙酰乙酰輔酶A合酶)的一種或多種核酸以及編碼如下多肽的一種或多種核酸:(a)異戊二烯合酶多肽，其中該異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和(b) —種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽。在一個(gè)方面，可使用編碼HMG輔酶A還原酶、MVA下游途徑多肽和異戊二烯合酶多肽的一種或多種異源核酸。在另一個(gè)方面，異戊二烯可通過培養(yǎng)包含編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶、MVA下游途徑多肽以及異戊二烯合酶多肽的一種或多種異源核酸的重組宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)產(chǎn)生。異戊二烯可從任何本文所述的和根據(jù)任何本文所述方法的細(xì)胞產(chǎn)生?？蓪⑷魏嗡黾?xì)胞用于從碳水化合物(包括六碳糖如葡萄糖)產(chǎn)生異戊二烯的目的。
[0223]該細(xì)胞可還包含一種或多種編碼上述MVA下游途徑多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述異戊二烯合酶多肽(如銀白楊異戊二烯合酶)的核酸分子。在一些方面，該宿主細(xì)胞可以是任何本文所述細(xì)胞。任何本文所述異戊二烯合酶或其變體、任何本文所述宿主細(xì)胞株系(如細(xì)菌株系)、任何本文所述啟動(dòng)子和/或任何本文所述載體也可用于利用任何本文所述能量來源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)來產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，產(chǎn)生異戊二烯的方法還包括回收異戊二烯的步驟。
[0224]在一些方面，在某個(gè)生產(chǎn)率時(shí)間點(diǎn)測(cè)量所產(chǎn)生的異戊二烯量。在一些方面，細(xì)胞的生產(chǎn)率為大約任何本文所公開的異戊二烯量。在一些方面，測(cè)量所產(chǎn)生的異戊二烯的累積總量。在一些方面，細(xì)胞的累積總生產(chǎn)率為大約任何本文所公開的異戊二烯量。
[0225]在一些方面，任何本文所述的細(xì)胞(例如培養(yǎng)物中的細(xì)胞)以大于約如下中的任一者或以約如下中的任 一者產(chǎn)生異戊二烯:1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000 或更多納摩爾的異戊二烯/克細(xì)胞濕重/小時(shí)(nmol/gwc;m/hr)。在一些方面，異戊二烯的量為約2至約 5，OOOnmol/gwail/hr,例如約 2 至約 100nmol/gwail/hr、約 100 至約 500nmol/gwail/hr、約 150至約 500nmol/gwem/hr、約 500 至約 1，000nmol/gwem/hr、約 1，000 至約 2，OOOnmoI/gwcm/hr 或約2，000至約5，OOOnmoI/gwcm/hr0在一些方面，異戊二烯的量為約20至約5，OOOnmoI/gwcm/hr、約 100 至約 5，000nmol/gwail/hr、約 200 至約 2，000nmol/gwail/hr、約 200 至約 1，OOOnmol/gwail/hr、約 300 至約 1，OOOnmoI/gwcm/hr 或約 400 至約 1，OOOnmoI/gwcm/hr0
[0226]在一些方面，培養(yǎng)物中的細(xì)胞以大于如下的量或以約如下的量產(chǎn)生異戊二烯:1、
10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1,500,1,750、2，000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000、10，000、100，000 或更多納克的異戊二烯 / 克細(xì)胞濕重 /hr (ng/gwcm/h)。在一些方面,異戍二烯的量為約2至約5，000ng/gwem/h,例如約2至約10ng/
約 100 至約 500ng/gwem/h、約 500 至約 1，000ng/gwem/h、約 1，000 至約 2，OOOng/gwcm/h或約2，000至約5，000ng/gwem/h。在一些方面，異戊二烯的量為約20至約5，000ng/gwem/h、約 100 至約 5，000ng/gwcm/h、約 200 至約 2，000ng/gwcm/h、約 200 至約 I, 000ng/gwcm/h、約 300至約 1，OOOng/gwcm/h 或約 400 至約 1，000ng/gwem/h。
[0227]在一些方面，培養(yǎng)物中的細(xì)胞以大于約如下量中的任一者或以約如下量中的任一者產(chǎn)生累積滴度(總量)的異戊二烯:1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000,5,000,10,000、50，000、100，000或更多毫克的異戊二烯/L發(fā)酵液(mg/Lss?，其中發(fā)酵液的體積包括細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的體積)。在一些方面，異戊二烯的量為約2至約5，000mg/Lssa，例如在約2至約100mg/L發(fā)酵液、約100至約500mg/L發(fā)酵液、約500至約I, 000mg/L發(fā)酵液、約I, 000至約2，000mg/L發(fā)酵液或約2，000至約5，000mg/L發(fā)酵液。在一些方面，異戊二烯的量為約20至約5，OOOmg/L發(fā)酵液、約100至約5，000mg/L發(fā)酵液、約200至約2，000mg/L發(fā)酵液、約200至約
I,000mg/L發(fā)酵液、約300至約1，000mg/L發(fā)酵液或約400至約1，000mg/L發(fā)酵液。
[0228]在一些方面，培養(yǎng)物中的細(xì)胞所產(chǎn)生的異戊二烯占發(fā)酵排氣的至少約1、2、5、10、
15、20或25體積％。在一些方面，異戊二烯占排氣的約I至約25體積％，例如約5至約15%、約15至約25%、約10至約20%或約I至約10%。
[0229]能夠增加類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)暈的重組細(xì)胞
[0230]類異戊二烯可在任何生物體中從類異戊二烯前體分子的合成產(chǎn)生，所述類異戊二烯前體分子是MVA途徑的終產(chǎn)物。如上所述，類異戊二烯代表重要的一類化合物并且包括例如食品和飼料補(bǔ)充劑、風(fēng)味和氣味化合物以及抗癌化合物、抗瘧疾化合物、抗真菌化合物和抗細(xì)菌化合物。
[0231]類異戊二烯作為一類分子，根據(jù)化合物中所包含的異戊二烯單位數(shù)對(duì)其進(jìn)行分類。單萜包含十個(gè)碳或兩個(gè)異戊二烯單位，倍半萜包含15個(gè)碳或三個(gè)異戊二烯單位，二萜包含20個(gè)碳或四個(gè)異戊二烯單位，二倍半萜包含25個(gè)碳或五個(gè)異戊二烯單位等等。類固醇(通常包含約27個(gè)碳)為裂解或重排的類異戊二烯產(chǎn)物。
[0232]類異戊二烯可由類異戊二烯前體分子IPP和DMAPP產(chǎn)生。這些各式各樣的化合物衍生自這些相當(dāng)簡(jiǎn)單的通用前體并且由成組的保守聚異戊二烯焦磷酸合酶合成(Hsieh等人，Plant Phys1l.(《植物生理學(xué)》)2011年3月;155 (3): 1079-90)。這些直鏈異戊二烯焦磷酸的各種鏈長(zhǎng)(反映它們獨(dú)特的生理學(xué)功能)通常由聚異戊二烯焦磷酸合酶高度發(fā)達(dá)的活性位點(diǎn)經(jīng)由烯丙 基底物(二甲基烯丙基二磷酸(C5-DMAPP)、香葉基焦磷酸(Cltl-GPP)、法尼基焦磷酸(C15-FPP)、香葉基香葉基焦磷酸(C2tl-GGPP))與對(duì)應(yīng)數(shù)目的異戊烯焦磷酸(C5-1PP)的縮合反應(yīng)決定(Hsieh等人，Plant Phys1l.(《植物生理學(xué)》)2011年3月；155(3):1079-90)。
[0233]類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)生可通過使用包含乙酰乙酰輔酶A合酶的任何重組宿主細(xì)胞進(jìn)行。此外，這些細(xì)胞可表達(dá)一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸以增加甲羥戊酸、異戊二烯、類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)量。任何上述能夠增加甲羥戊酸或異戊二烯產(chǎn)量的、表達(dá)一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸的重組宿主細(xì)胞也可以能夠增加類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)量。在一些方面，這些細(xì)胞還包含一種或多種編碼如上所述的MVA下游途徑的多肽、IDI和/或DXP途徑的異源核酸和編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸。不受理論的束縛，據(jù)認(rèn)為通過任何上述組合物和方法增加宿主細(xì)胞中甲羥戊酸的細(xì)胞產(chǎn)量將類似地導(dǎo)致產(chǎn)生較高量的類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯。當(dāng)與甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶、異戊烯二磷酸異構(gòu)酶和用于異戊二烯和類異戊二烯產(chǎn)生的其他適當(dāng)酶的適當(dāng)酶活性水平組合時(shí)，增加從葡萄糖產(chǎn)生甲羥戊酸的摩爾產(chǎn)率可轉(zhuǎn)化成較高的從葡萄糖產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯(包括異戊二烯)的摩爾產(chǎn)率。
[0234]類異戊二烯的類型
[0235]本發(fā)明的重組微生物能夠增加類異戊二烯和類異戊二烯前體分子DMAPP和IPP的產(chǎn)量。類異戊二烯的例子包括(不限于)半萜類化合物、單萜類化合物、倍半萜類化合物、二萜類化合物、二倍半萜類化合物、三萜類化合物、四萜類化合物和更高級(jí)的多萜類化合物。在一些方面，半萜類化合物為戊二烯醇(即3-甲基-2- 丁烯-1-醇)、異戊二烯醇(即3-甲基-3- 丁烯-1-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇或異戊酸。在一些方面，單萜類化合物可以為(不限于)香葉基焦磷酸、桉葉素、檸檬烯或菔烯。在一些方面，倍半萜類化合物為法尼基焦磷酸、青蒿素或沒藥醇。在一些方面，二萜類化合物可以為(不限于)香葉基香葉基焦磷酸、視黃醇、視黃醒、植醇、紫杉醇、毛喉素(forskolin)或阿非迪霉素(aphidicolin)。在一些方面，三萜類化合物可以為(不限于)角鯊烯或羊毛留醇。類異戊二烯還可選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合歡烯、α-金合歡烯、金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、β_菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯和瓦倫西亞桔烯。
[0236]在一些方面，四萜類化合物為番茄紅素或胡蘿卜素(類胡蘿卜素)。如本文所用，術(shù)語“類胡蘿卜素”是指一組天然存在的有機(jī)色素，其在植物、一些其他光合生物體如藻類的葉綠體和色質(zhì)體中、在某些類型的真菌以及在某些細(xì)菌中產(chǎn)生。類胡蘿卜素類包括含氧葉黃素類和非含氧胡蘿卜素類。在一些方面，類胡蘿卜素類選自葉黃素類和胡蘿卜素類。在一些方面，葉黃素類為葉黃素或玉米黃質(zhì)。在一些方面，類胡蘿卜素為α -胡蘿卜素、β -胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)或番茄紅素。
[0237]編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸
[0238]在本發(fā)明的一些方面，在本文任何組合物或方法中所述的包含乙酰乙酰輔酶A合酶的重組細(xì)胞還包含如本文所述編碼非硫解酶MVA途徑多肽的一種或多種核酸，以及編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的一種或多種核酸。該聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽可以為內(nèi)源多肽。編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的內(nèi)源核酸可有效連接至組成型啟動(dòng)子或可類似地有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的內(nèi)源核酸可另外有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子?；蛘?，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的內(nèi)源核酸可有效連接至弱啟動(dòng)子。具體地講，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改 造以相對(duì)于野生型細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽。
[0239]在一些方面，聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽為異源多肽。本發(fā)明的細(xì)胞可包含不止一個(gè)拷貝的編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸。在一些方面，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。在一些方面，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸有效連接至弱啟動(dòng)子。
[0240]編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸可整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中或可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸另外可位于載體上。
[0241]示例性的聚異戊二烯焦磷酸合酶核酸包括編碼具有聚異戊二烯焦磷酸合酶的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽將類異戊二烯前體分子轉(zhuǎn)化為更復(fù)雜的類異戊二烯化合物。示例性的聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽和核酸包括來自任何本文所述來源生物體的天然存在的多肽和核酸。此外，聚異戊二烯焦磷酸合酶的變體可具有改善的活性如改善的酶活性。在一些方面，聚異戊二烯焦磷酸合酶變體具有其他改善的特性，例如改善的穩(wěn)定性(如熱穩(wěn)定性)和/或改善的溶解性。示例性的聚異戊二烯焦磷酸合酶核酸可包括編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽例如(不限于)香葉基二磷酸(GPP)合酶、法尼基焦磷酸(FPP)合酶和香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)合酶或任何其他已知聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸。
[0242]在本發(fā)明的一些方面，任何本文組合物或方法中所述的細(xì)胞還包含一種或多種編碼法尼基焦磷酸(FPP)合酶的核酸。FPP合酶多肽可以為內(nèi)源基因編碼的內(nèi)源多肽。在一些方面，F(xiàn)PP合酶多肽由大腸桿菌中的內(nèi)源ispA基因編碼。編碼FPP合酶多肽的內(nèi)源核酸可有效連接至組成型啟動(dòng)子或可類似地有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。編碼FPP合酶多肽的內(nèi)源核酸可另外有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。具體地講，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造以相對(duì)于野生型細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源FPP合酶多肽。
[0243]在一些方面，F(xiàn)PP合酶多肽為異源多肽。本發(fā)明的細(xì)胞可包含不止一個(gè)拷貝的編碼FPP合酶多肽的異源核酸。在一些方面，編碼FPP合酶多肽的異源核酸有效連接至組成型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼FPP合酶多肽的異源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些方面，編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸有效連接至強(qiáng)啟動(dòng)子。
[0244]編碼FPP合酶多肽的核酸可整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中或者可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。編碼FPP合酶的核酸另外可位于載體上。
[0245]可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過測(cè)量多肽在體外、在細(xì)胞提取物中或在體內(nèi)將IPP轉(zhuǎn)化為更高級(jí)的類異戊二烯的能力，來確定該多肽是否具有聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽活性。這些方法是本領(lǐng)域所熟知的并且例如在如下參考文獻(xiàn)中進(jìn)行描述:美國(guó)專利 N0.: 7，915，026 ；Hsieh 等人，Plant Phys1l.(《植物生理學(xué)》)2011 年 3 月；155(3): 1079-90 ；Danner 等人,Phytochemistry.(《植物化學(xué)》)2011 年 4 月 12 日[印刷版之前的電子出版物]Jones等人，J B1l Chem.(《生物化學(xué)雜志》)2011年3月24日[印刷版之前的電子出版物]Reeling等人，BMC Plant B1l.(《BMC植物生物學(xué)》)2011年3月7H ；11:43 ;Martin 等人，BMC Plant B1l.(《BMC 植物生物學(xué)》)2010 年 10 月 21 日；10:226 ；Kumeta 和 Ito, Plant Phys1l.(《植物生理學(xué)》)2010 年 12 月；154(4): 1998-2007 ；以及KMner 和 Boland, J Org Chem.(《有機(jī)化學(xué)雜志》)2010 年 8 月 20 日；75(16): 5590-600。
[0246]使用重組細(xì)胞來產(chǎn)生類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子的方法
[0247]本文還提供的是產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法，該方法包括培養(yǎng)重組微生物(如重組細(xì)菌細(xì)胞)，所述重組微生物包含乙酰乙酰輔酶A合酶、聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽以及一種或多種編碼MVA途徑多肽的核酸，所述MVA途徑多肽包括但不限于:HMG輔酶A還原酶、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMG輔酶A合酶)多肽、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG輔酶A還原酶)多肽、甲羥戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC)多肽、異戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IPP異構(gòu)酶多肽、IDI多肽，以及具有兩種或更多種MVA途徑多肽的活性的多肽(如融合多肽)。
[0248]類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯可從任何本文所述和根據(jù)任何本文所述方法的細(xì)胞產(chǎn)生?？蓪⑷魏嗡黾?xì)胞用于從碳水化合物(包括六碳糖如葡萄糖)產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的目的。
[0249] 因此，本文提供制備類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法，該方法包括在適于產(chǎn)生異戊二烯以及產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的條件中，培養(yǎng)包含乙酰乙酰輔酶A合酶、聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽以及一種或多種編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸的重組宿主細(xì)胞。該細(xì)胞可還包含一種或多種編碼上述MVA下游途徑多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，該宿主細(xì)胞可以是任何本文所述細(xì)胞。任何本文所述的聚異戊二烯焦磷酸合酶或其變體、任何本文所述的宿主株系、任何本文所述的啟動(dòng)子和/或任何本文所述的載體也可用于利用任何本文所述能量來源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)來產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯。在一些方面，產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法還包括回收類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的步驟。
[0250]產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法可類似地包括如下步驟:(a)培養(yǎng)不內(nèi)源性地具有HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的宿主細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞)，其中宿主細(xì)胞異源性地表達(dá)一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的基因；以及(b)產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯，其中宿主細(xì)胞與不包含HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的產(chǎn)類異戊二烯和/或類異戊二烯前體的宿主細(xì)胞相比，產(chǎn)生更大量的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯。在某些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞(包括絲狀真菌)或酵母細(xì)胞。
[0251]用于產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的本發(fā)明方法與不包含HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的并且未經(jīng)工程改造來增加流向甲羥戊酸產(chǎn)生的碳通量的產(chǎn)類異戊二烯和/或類異戊二烯前體的宿主細(xì)胞相比，可產(chǎn)生高出至少5%的量的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯?；蛘?，該宿主細(xì)胞可產(chǎn)生高出約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯，包括這些百分?jǐn)?shù)。在一些方面，產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法還包括回收類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的步驟。
[0252]本文提供的 是使用任何上述細(xì)胞來增大類異戊二烯和/或類異戊二烯前體分子的產(chǎn)量的方法。由細(xì)胞產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的產(chǎn)量可通過表達(dá)乙酰乙酰輔酶A合酶以及一種或多種編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸、一種或多種編碼MVA下游途徑多肽的異源核酸和一種或多種編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽的異源核酸來增大。如本文所用，“增大的”類異戊二烯前體和/或類異戊二烯產(chǎn)量是指，與不具有一種或多種編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽、MVA下游途徑多肽、DXP途徑多肽和/或HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸且尚未經(jīng)工程改造來增加流向甲羥戊酸產(chǎn)生的碳通量的細(xì)胞相比，任何本文所述組合物和方法所描述的細(xì)胞增加的針對(duì)類異戊二烯前體和/或類異戊二烯產(chǎn)生的細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)(CPI)、增加的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的滴度、增加的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的質(zhì)量產(chǎn)率，和/或增加的類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的比生產(chǎn)率。類異戊二烯前體和/或類異戊二烯的產(chǎn)量可增大約5%至約1，000, 000倍。與不表達(dá)一種或多種編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸并且尚未經(jīng)工程改造來增加流向甲羥戊酸產(chǎn)生的碳通量的細(xì)胞的類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯產(chǎn)量相比，類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的產(chǎn)量可增大約10%至約I, 000，000倍(例如，約I至約500，000倍、約I至約50，000倍、約I至約5，000倍、約I至約1，000倍、約I至約500倍、約I至約100倍、約I至約50倍、約5至約100，000倍、約5至約10，000倍、約5至約1，000倍、約5至約500倍、約5至約100倍、約10至約50，000倍、約50至約10，000倍、約100至約5，000倍、約200至約I, 000倍、約50至約500倍或約50至約200倍)。
[0253]與不表達(dá)一種或多種編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的異源核酸并且尚未經(jīng)工程改造來增加流向甲羥戊酸產(chǎn)生的碳通量的細(xì)胞的類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯產(chǎn)量相比，類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的產(chǎn)量可增大至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、200 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍、5000 倍、10，000 倍、20，000 倍、50，000 倍、100，000 倍、200，000 倍、500，000倍或1，000，000倍中任一種。
[0254]此外，可將更具體的細(xì)胞培養(yǎng)條件用于培養(yǎng)本文所述方法中的細(xì)胞。例如，在一些方面，用于產(chǎn)生類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的方法包括如下步驟:(a)在34°C下培養(yǎng)不內(nèi)源性地具有HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的宿主細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞)，其中宿主細(xì)胞異源表達(dá)在低拷貝至中等拷貝質(zhì)粒上且處于強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的一個(gè)或多個(gè)拷貝的編碼HMG輔酶A還原酶和HMG輔酶A合酶的基因；以及
(b)產(chǎn)生甲羥戊酸。在一些方面，產(chǎn)生甲羥戊酸的方法還包括回收類異戊二烯前體分子和/或類異戊二烯的步驟。在某些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞(包括絲狀真菌)或酵母細(xì)胞。
[0255]示例性的純化方法
[0256]在一些方面，任何本文所述方法還包括回收所產(chǎn)生的化合物的步驟。在一些方面，任何本文所述方法還包括回收異戍二烯的步驟。在一些方面，通過吸收汽提(absorpt1nstripping)(參見例如美國(guó)申請(qǐng)N0.12/969，440)回收異戍二烯。在一些方面,任何本文所述方法還包括回收異源多肽的步驟。在一些方面，任何本文所述方法還包括回收萜類化合物或類胡蘿卜素的步驟。
[0257]合適的純化步驟在美國(guó)專利申請(qǐng)公開US2010/0196977A1中有更詳細(xì)描述。
[0258]通過參照以下實(shí)例能進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)例以舉例說明的方式提供而非旨在進(jìn)行限制。
[0259]SM
[0260]實(shí)例1:編碼用于通討乙酰乙酰輔酶A合酶(NDhT7)產(chǎn)牛MVA的MVA h游涂徑的質(zhì)粒的構(gòu)建
[0261]產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒以編碼分別表達(dá)乙酰乙酰輔酶A合酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶的nphT7基因、mvaS基因和mvaR基因。簡(jiǎn)單而言，合成正向引物和反向引物來由編碼鏈霉菌蛋白質(zhì)的合成基因擴(kuò)增mvaS基因(MCM489和MCM490)、mvaR基因(MCM491和MCM492)以及nphT7基因(MCM495和MCM496)(表1)。將MCM485正向引物和MCM486反向引物用于擴(kuò)增表達(dá)載體。用于載體擴(kuò)增的DNA模板是pMCMl225 (表2)。用于從鏈霉菌擴(kuò)增mvaS和mvaR的DNA模板是Str印CL190 (DNA2.0)，其含有編碼mvaS和mvaR的合成操縱子，也編碼乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(atoB)。將包括編碼帶組氨酸標(biāo)記的NphT7的合成基因的pMCM1187模板用于擴(kuò)增編碼NphT7的基因(Genbank BAJ10048)。
[0262]表1.用于構(gòu)律DMCM1320和DMCM1321的引物
[0263]
【權(quán)利要求】
1.一種能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組微生物，所述重組微生物包含一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸以及一種或多種編碼如下多肽的核酸: a.異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和 b.一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽， 其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物可產(chǎn)生所述多肽以及合成異戊二烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸為乙酰乙酰輔酶A合酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組微生物，其中所述乙酰乙酰輔酶A合酶基因?yàn)閬碜苑啪€菌的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組微生物，其中所述乙酰乙酰輔酶A合酶基因?yàn)閬碜枣溍咕鷮俚幕颉?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物，其中所述乙酰乙酰輔酶A合酶基因編碼具有SEQID NO:1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或氨基酸序列與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80%或更高同一性且具有由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的功能的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，其中所述異戊二烯合酶多肽為來自葛屬(Pueraria)或楊屬(Populus)或雜種銀白楊(Populus alba)x歐洲山楊(Populus tremula)的多肽或其變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，其中所述異戊二烯合酶多肽選自山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria 1bata)、美洲山楊(Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊(Populusnigra)和毛果楊(Populus trichocarpa)或其變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種編碼(b)中的一種或多種MVA途徑多肽的核酸為異源核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種編碼(b)中的一種或多種MVA途徑多肽的核酸為內(nèi)源核酸的拷貝。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種MVA途徑多肽選自(a)將乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG輔酶A的酶；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；和(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌(M.mazei)甲羥戊酸激酶、布氏擬甲烷球菌(M.burtonii)甲輕戍酸激酶多肽、乳桿菌(Lactobacillus)甲輕戍酸激酶多肽、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)甲輕戍酸激酶多肽、酵母甲輕戍酸激酶多肽、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲輕戍酸激酶多妝、鏈球菌(Streptococcus)甲輕戍酸激酶多肽、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)甲輕戍酸激酶多肽和鏈霉菌(Streptomyces)甲輕戍酸激酶多肽或鏈霉菌CL190甲輕戍酸激酶多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組微生物，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S異構(gòu)酶(IDI)多肽的核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其還包含一種或多種編碼一種或多種1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑多肽的核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組微生物，其中所述一種或多種編碼一種或多種DXP途徑多肽的核酸為異源核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組微生物，其中所述一種或多種編碼一種或多種DXP途徑多肽的核酸為內(nèi)源核酸的拷貝。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組微生物，其中所述一種或多種DXP途徑多肽選自(a)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b) 1-脫氧-D-木酮糖_5_磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、(c) 4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚醇合酶(MCT)、(d)4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶(CMK)、(e) 2C-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(MCS)、(f) 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(HDS)和(g) 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4- 二磷酸還原酶(HDR)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組微生物，其中所述DXP途徑多肽為DXS。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子之下。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被克隆進(jìn)一種或多種多拷貝質(zhì)粒中。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被整合進(jìn)所述細(xì)胞的染色體中。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組微生物，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)細(xì)胞、棒桿菌屬(Corynebacterium)物種細(xì)胞、朽1檬泛菌(P.citrea)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)細(xì)胞、遲緩芽孢桿菌(B.1entus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(B.brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)細(xì)胞、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)細(xì)胞、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulars)細(xì)胞、燦爛芽孢桿菌(B.1autus)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)細(xì)胞、白色鏈霉菌(S.albus)細(xì)胞、變鉛青鏈霉菌(S.1ividans)細(xì)胞、天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)細(xì)胞、灰色鏈霉菌(S.griseus)細(xì)胞、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種細(xì)胞以及產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為棒桿菌屬物種細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組微生物，其中所述微生物為藻類細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的藻類細(xì)胞，其中所述藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。
32.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組微生物，其中所述微生物為真菌細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞為絲狀真菌。
34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組微生物，其中所述微生物為酵母細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞選自酵母菌屬(Saccharomyces)物種、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)物種、畢赤酵母屬(Pichia)物種或假絲酵母屬(Candida)物種。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
37.一種能夠產(chǎn)生類異戊二烯的重組微生物，所述重組微生物包含一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸以及一種或多種編碼如下核酸的核酸: a.一種或多種編碼聚異戊二烯焦磷酸合酶的核酸；和 b.一種或多種編碼一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽的核酸，其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組微生物可產(chǎn)生所述多肽以及合成可回收量的類異戊二烯。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的重組微生物，其中(b)的所述一種或多種編碼一種或多種MVA途徑多肽的核酸為異源核酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求37-38中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種MVA途徑多肽選自(a)將乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG輔酶A的酶；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；和(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶選自馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、布氏擬甲烷球菌甲羥戊酸激酶多肽、乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、清酒乳桿菌甲羥戊酸激酶多肽、酵母甲羥戊酸激酶多肽、釀酒酵母甲羥戊酸激酶多肽、鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽、肺炎鏈球菌甲羥戊酸激酶多肽和鏈霉菌甲羥戊酸激酶多肽、鏈霉菌CL190甲羥戊酸激酶多肽。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的重組微生物，其中所述將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶為馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求37-41中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸S異構(gòu)酶(IDI)多肽的核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求37-42中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子之下。
44.根據(jù)權(quán)利要求37-43中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被克隆進(jìn)一種或多種多拷貝質(zhì)粒中。
45.根據(jù)權(quán)利要求37-43中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述一種或多種異源核酸被整合進(jìn)所述細(xì)胞的染色體中。
46.根據(jù)權(quán)利要求37-45中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的重組微生物，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞、嗜酸乳桿菌細(xì)胞、棒桿菌屬物種細(xì)胞、檸檬泛菌細(xì)胞、枯草芽孢桿菌細(xì)胞、地衣芽孢桿菌細(xì)胞、遲緩芽孢桿菌細(xì)胞、短芽孢桿菌細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌細(xì)胞、解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞、耐鹽芽孢桿菌細(xì)胞、巨大芽孢桿菌細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞、燦爛芽孢桿菌細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞、白色鏈霉菌細(xì)胞、變鉛青鏈霉菌細(xì)胞、天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞、灰色鏈霉菌細(xì)胞、假單胞菌屬物種細(xì)胞以及產(chǎn)堿假單胞菌細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為棒桿菌屬物種細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的重組微生物，其中所述微生物為藻類細(xì)胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的藻類細(xì)胞，其中所述藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰胞藻門、綠蜘藻、眼蟲、色藻界或腰鞭毛蟲。
55.根據(jù)權(quán)利要求46所述的重組微生物，其中所述微生物為真菌細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞為絲狀真菌。
57.根據(jù)權(quán)利要求46所述的重組微生物，其中所述微生物為酵母細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞選自酵母菌屬物種、裂殖酵母屬物種、畢赤酵母屬物種或假絲酵母屬物種。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
60.根據(jù)權(quán)利要求37-59中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述類異戊二烯選自單萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的重組微生物，其中所述類異戊二烯為倍半萜。
62.根據(jù)權(quán)利要求37-61中任一項(xiàng)所述的重組微生物，其中所述類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合歡烯、Ct-金合歡烯、β -金合歡烯、金合歡醇、香葉醇、香葉基香葉醇、芳樟醇、檸檬烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、廣藿香醇、β_菔烯、檜烯、Y-萜品烯、異松香烯和瓦倫西亞桔烯。
63.—種產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括: a.培養(yǎng)重組微生物，所述重組微生物包含一種或多種編碼(i)能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸，和一種或多種編碼如下多肽的核酸:(ii)異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和(iii) 一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽，以及 b.產(chǎn)生異戊二烯。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其還包括回收所述重組微生物產(chǎn)生的異戊二烯。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述一種或多種編碼能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸為乙酰乙酰輔酶A合酶基因。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽。
67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述一種或多種MVA途徑多肽選自(a)將乙酰乙酰輔酶A與乙酰輔酶A縮合以形成HMG輔酶A的酶；(b)將HMG輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的酶；(c)將甲羥戊酸磷酸化為5-磷酸甲羥戊酸的酶；(d)將5-磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為5-焦磷酸甲羥戊酸的酶；和(e)將5-焦磷酸甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸的酶。
68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸δ異構(gòu)酶(IDI)多肽的核酸。
69.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述重組微生物還包含一種或多種編碼一種或多種1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑多肽的核酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述微生物為細(xì)菌細(xì)胞。
72.根據(jù)權(quán)利要求7 1所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為嗜酸乳桿菌細(xì)胞。
75.根據(jù)權(quán)利要求72所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為棒桿菌屬物種細(xì)胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述微生物為酵母細(xì)胞。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中所述酵母細(xì)胞為釀酒酵母細(xì)胞。
78.—種產(chǎn)生類異戊二烯的方法，所述方法包括: a.培養(yǎng)重組微生物，所述重組微生物包含一種或多種編碼(i)能夠由丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的多肽的核酸，和一種或多種編碼如下多肽的核酸:(ii)聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽，其中所述聚異戊二烯焦磷酸合酶多肽由異源核酸編碼；和(iii)一種或多種甲羥戊酸(MVA)途徑多肽，以及 b.產(chǎn)生所述類異戊二烯。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK104039844SQ201280048738
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月4日
【發(fā)明者】I·S·阿爾多, Z·Q·貝克, M·C·米勒, C·M·派瑞斯 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司, 固特異輪胎和橡膠公司