微rna生物標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的主題提供了一種通過(guò)測(cè)定從個(gè)體的生物樣品分離的微囊泡中存在的一種或多種RNA的含量來(lái)表征和評(píng)價(jià)肺癌或頭頸癌的治療和/或進(jìn)展的方法。
【專利說(shuō)明】微RNA生物標(biāo)記物
[0001]本申請(qǐng)要求2011年8月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/515，620的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明公開的主題涉及用于表征和評(píng)價(jià)肺癌或頭頸癌的治療和/或進(jìn)展的方法。特別是，本發(fā)明公開的主題涉及基于測(cè)定來(lái)自個(gè)體的生物樣品中的與肺癌或頭頸癌相關(guān)的一種或多種外來(lái)體衍生的微-RNA的含量的方法。
[0003]引言
[0004]適用于癌癥早期檢測(cè)和診斷的癌癥生物標(biāo)記物的鑒定，對(duì)于改善個(gè)體的臨床結(jié)果有很大希望。這對(duì)于表現(xiàn)出不明確癥狀或沒(méi)有癥狀或患有相對(duì)難以進(jìn)行身體檢查的腫瘤的個(gè)體尤為重要。盡管針對(duì)早期檢測(cè)作出了相當(dāng)大的努力，但只研發(fā)了幾個(gè)可靠的且成本有效的可以在早期診斷癌癥的篩選測(cè)試。 [0005]頭頸癌(HNC)指的是一組生物上相似的源自上呼吸消化(aerodigestive)道的癌癥，包括唇部、口腔(嘴)、鼻腔、副鼻竇、咽和喉。頭頸癌通常是鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCC)，其源自這些區(qū)域的粘膜內(nèi)層(上皮)。頭頸癌常常擴(kuò)散至頸淋巴結(jié)，并且這常常是診斷時(shí)疾病的最初(并且有時(shí)候是唯一)表現(xiàn)。頭頸癌與特定的環(huán)境和生活方式風(fēng)險(xiǎn)因素密切相關(guān)，所述風(fēng)險(xiǎn)因素包括吸煙、飲酒、UV光和職業(yè)暴露，以及特定的病毒株，如性傳遞的人乳頭狀瘤病毒。這些癌癥在其生物學(xué)行為中常常是侵襲性的；患有這些類型的癌癥的患者常常產(chǎn)生第二種原發(fā)性腫瘤。如果早期檢測(cè)到，頭頸癌是高度可治愈的，通常使用一些形式的外科手術(shù)，盡管化療和放療也起到了重要作用。盡管早期頭頸癌(尤其是喉部和口腔)具有高治愈率，但高達(dá)50%的頭頸癌患者呈現(xiàn)為晚期和逐漸減少的預(yù)后。美國(guó)每年新增約40，000例NHC，并且全世界超過(guò)50萬(wàn)例。
[0006]非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括除了小細(xì)胞肺癌以外的肺部的任何上皮癌癥。主要在吸煙者中觀察肺癌。因?yàn)樗麄儗?duì)化療相對(duì)無(wú)應(yīng)答，主要通過(guò)外科切除來(lái)治療NSCLC。然而，新輔助療法(neoadjuvant)和輔助化療變得越來(lái)越常見，例如，順鉬。也使用放療。對(duì)于轉(zhuǎn)移性疾病，化療更常用，例如，EGFR酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼(gefitinib)。最常見類型的NSCLC是鱗狀上皮細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌。腺癌是不吸煙者中最常見的肺癌類型。
[0007]對(duì)幾乎所有癌癥(包括頭頸癌和肺癌)中改進(jìn)的生物標(biāo)記物的研發(fā)存在持續(xù)的需求。由于實(shí)用性和易于收集樣品，基于血液的試驗(yàn)仍然是有吸引力的目標(biāo)。癌癥的確定性診斷越早，將有助于越早且可能更有效地治療患者。對(duì)于HNC，通過(guò)如果發(fā)現(xiàn)早這樣的癌癥是高度可治療的事實(shí)強(qiáng)調(diào)了這一點(diǎn)，但只有癌癥擴(kuò)散至結(jié)才能檢測(cè)到。因此，對(duì)于新生物標(biāo)記物存在尚未滿足的需求，該新生物標(biāo)記物單獨(dú)地或結(jié)合其他生物標(biāo)記物或診斷形態(tài)傳送癌癥和其他增殖性疾病早期檢測(cè)和預(yù)后所需的敏感性和特異性生物標(biāo)記物。特別是，需要可以在容易獲得的生物流體上進(jìn)行的針對(duì)癌癥生物標(biāo)記物的簡(jiǎn)單試驗(yàn)。
[0008]發(fā)明概述
[0009]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于表征個(gè)體的癌癥的方法,其包括:a)從個(gè)體的生物樣品分離微囊泡山)測(cè)定來(lái)自分離微囊泡的一種或多種微RNA的含量；和c)將一種或多種微RNA的含量與參照相比，其中基于來(lái)自分離微囊泡的一種或多種微RNA含量與參照相比的可測(cè)量差異來(lái)表征癌癥。
[0010]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于評(píng)價(jià)個(gè)體的癌癥的療效和/或進(jìn)展的方法，其包括:a)從個(gè)體的生物樣品分離微囊泡；b)測(cè)定分離微囊泡中的一種或多種微RNA的含量；和c)將一種或多種微RNA的含量與參照相比，基于一種或多種微RNA含量與參照相比的可測(cè)量差異來(lái)評(píng)價(jià)癌癥的療效和/或進(jìn)展。
[0011]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于評(píng)價(jià)一種或多種微RNA的存在的方法，其包括:a)從個(gè)體的生物樣品分離微囊泡；b)測(cè)定分離微囊泡中的一種或多種微RNA的含量；和c)將一種或多種微RNA的含量與參照相比,其中基于一種或多種微RNA含量與參照相比的可測(cè)量差異來(lái)評(píng)價(jià)癌癥的療效和/或進(jìn)展。
[0012]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于評(píng)價(jià)肺癌miRNA印記或頭頸癌miRNA印記的一種或多種微RNA的存在或含量的方法，其包括從生物樣品分離微囊泡，并且測(cè)定所述微囊泡中的一種或多種微RNA的存在或含量。在一些實(shí)施方案中，微囊泡從肺癌或頭頸癌細(xì)胞脫落。
[0013]癌癥可以是頭頸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。癌癥可以是肺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。在其他實(shí)施方案中，癌癥是肺腺癌。個(gè)體可以是人。
[0014]在一些實(shí)施方案中，所述參照包括來(lái)自一個(gè)或多個(gè)未患癌癥的個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種微RNA的水平。當(dāng)生物樣品包含組織時(shí)，參照可以是來(lái)自個(gè)體的正常鄰近組織中的一種 或多種微RNA的水平。在其他實(shí)施方案中，參照包括在一定時(shí)間過(guò)程中從個(gè)體獲取的樣品中的一種或多種微RNA的水平。這允許隨著時(shí)間追蹤個(gè)體中一種或多種微RNA的水平。例如，參照可以是在開始癌癥治療和/或癌癥發(fā)作之前從個(gè)體收集的樣品，而生物樣品可以是治療開始或癌癥發(fā)作后收集的。例如，與癌癥相關(guān)的微RNA隨著時(shí)間的增加可以表示癌癥的無(wú)效治療或進(jìn)展，而與癌癥相關(guān)的微RNA隨著時(shí)間的減少可以表示癌癥的有效治療或癌癥沒(méi)有進(jìn)展。
[0015]生物樣品可以包括體液。例如，生物樣品可以包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液(cyst fluid)、胸膜液、腹膜液、腦脊髓液、淚液、尿液、唾液、痰液，或其組合。
[0016]各種技術(shù)可以用于分離微囊泡。如本文中所用的分離指的是目標(biāo)實(shí)體(例如，微囊泡或微RNA)與其他生物材料的部分或完全分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離微囊泡包括使用層析法，如尺寸排阻層析法。在這樣的情況中，分離微囊泡可以進(jìn)一步包括將包含微囊泡的層析級(jí)分離心。所述層析級(jí)分可以是空隙容積級(jí)分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用微囊泡表面抗原的結(jié)合劑，通過(guò)親和性選擇來(lái)分離微囊泡。例如，在一些實(shí)施方案中，使用細(xì)胞表面抗原的抗體，通過(guò)免疫吸附捕獲來(lái)分離微囊泡。抗體的實(shí)例包括抗-上皮細(xì)胞粘附分子(抗-EpCAM)抗體、抗-CD9抗體或抗-CD63抗體。在實(shí)施方案中，層析和免疫吸附捕獲結(jié)合使用。例如，可以使包含微囊泡的層析級(jí)分進(jìn)行免疫吸附捕獲。在一些實(shí)施方案中，分離微囊泡包括微囊泡的PEG-沉淀。
[0017]一種或多種微RNA獲自生物樣品，例如，來(lái)自分離的微囊泡內(nèi)。測(cè)定一種或多種微RNA的含量可以包括標(biāo)記一種或多種微RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中,測(cè)定一種或多種微RNA的含量包括用各自選擇性結(jié)合一種或多種微RNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲一種或多種微RNA。探針可以包括陣列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定一種或多種微RNA包括使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以定量一種或多種微RNA的含量。
[0018]一種或多種微 RNA 可以包括 let-7a、miR_133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR-15a、miR_18b、miR-378、Iet_7b、miR-205、miR-18la、miR-130a、miR-199a_3p、miR-140_5p、miR_20a、miR-146b_5p、miR-132、miR_193b、miR-183、miR-34c_5p、miR_30c、miR_148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR_135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR-18Id、miR_301a、miR_200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-1、miR-363、miR-150、let_71、miR_27b、miR_7、miR-127_5p、miR_29a、miR-191、let_7d、miR_9、let_7f、miR-10a、miR_181b、miR_15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR-34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR-19a、miR-193a-5p、miR-18a、miR-125b、miR-126、miR-27a、miR-372、miR-149、miR-23b、miR-203、miR-32和miR_181c中的一種或多種。例如，所述一種或多種微RNA可以包括 miR-16、miR-181c、miR-25、miR_15b、miR-150、miR_148b、miR_92a、miR-222、miR-96、miR-125a-5p、miR-335和miR-122中的一種或多種。作為另一個(gè)實(shí)例，所述一種或多種微RNA 可以包括 let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR142_5p、miR96、miR222、miR148b、miR92a、miR214、miR130a、miR29a、miR212、miR124、miR21、miR200c、miR100、miR155、miR181b和miR210中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示個(gè)體中存在癌癥，例如，頭頸癌和/或肺癌。該方法還可以包括測(cè)定在癌癥(例如，頭頸癌和/或肺癌)存在下表達(dá)不足的微RNA的水平。癌癥可以是鱗狀上皮細(xì)胞癌。
[0019]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括基于測(cè)定的一種或多種微RNA的含量來(lái)針對(duì)癌癥選擇治療或改變治療。本發(fā)明的方法可以在體外進(jìn)行。
[0020]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了用于實(shí)施本文中公開的方法的試劑的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了試劑盒，其包括用于實(shí)施本文中公開的方法的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑包括一個(gè)或多個(gè)用于擴(kuò)增上述一種或多種微RNA的引物對(duì)。
[0021]通過(guò)引用并入
[0022]本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文中，如同特意和單獨(dú)表示將每篇單獨(dú)的公開物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用并入的相同程度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]用所附權(quán)利要求中的特征列出了本發(fā)明的新特點(diǎn)。通過(guò)參照以下列出了說(shuō)明性實(shí)施方案(其中使用了本發(fā)明的原理)的詳細(xì)描述和附圖將更好地理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，其中:
[0024]圖1是顯示了用于層析分離癌癥衍生的微囊泡和來(lái)自微囊泡的miRNA、通過(guò)微陣列測(cè)定miRNA的含量和分析數(shù)據(jù)以確定所測(cè)試個(gè)體是否存在癌癥的示例性方法的示意圖。
[0025]圖2是顯示了用于分離癌癥衍生的微囊泡和來(lái)自微囊泡的miRNA、通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定miRNA的含量和分析數(shù)據(jù)以確定所測(cè)試個(gè)體是否存在癌癥和癌癥期的示例性方法的示意圖。
[0026]圖3是顯示了用于分離癌癥衍生的微囊泡和來(lái)自微囊泡的miRNA、通過(guò)微陣列測(cè)定miRNA的含量和分析數(shù)據(jù)以確定所測(cè)試個(gè)體是否存在癌癥的示例性方法的示意圖。在該圖中，用抗-EpCAM抗體捕獲微囊泡。也可以使用針對(duì)其他目標(biāo)囊泡生物標(biāo)記物的抗體。
[0027]圖4說(shuō)明了與利用從正常對(duì)照庫(kù)(“對(duì)照”)分離的外來(lái)體分離的小RNA針對(duì)特定微RNA的qRT-PCR的絕對(duì)CT值相比，來(lái)自患有頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌(“HN SCC")、肺鱗狀上皮小細(xì)胞癌(“肺SCC”)和肺腺癌(“肺腺病毒”)的患者的特定外來(lái)體miRNA的qRT-PCR的絕對(duì)CT值。
[0028]圖5A-B說(shuō)明了對(duì)于應(yīng)答患者(圖5A)對(duì)比無(wú)應(yīng)答患者(圖5B)的初始樣品和追蹤樣品(治療后)之間，來(lái)自代表性的患有HNSCC的患者的外來(lái)體miRNA譜的變化。從左至右，微 RNA 為 let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR142_5p、miR96、miR222、miR148b、miR92a、miR214、miR130a、miR29a、miR212、miR124、miR21、miR200c、miRlOO、miR155、miR181b、miR210。[0029]圖6A-K說(shuō)明了在初始樣品(“組1”，在外科手術(shù)那天，但在外科手術(shù)前獲得)和追蹤樣品(“組2”，在外科手術(shù)后3個(gè)月獲得)之間，來(lái)自代表性的患有頭頸癌患者的外來(lái)體miRNA譜的變化。外科手術(shù)后，患者接受了化療或化療和放療組合。還包括了對(duì)照數(shù)據(jù)，提供了使用從正常對(duì)照庫(kù)(“對(duì)照”)分離的外來(lái)體分離的小RNA獲得的外來(lái)體miRNA譜系?！皯?yīng)答者”的結(jié)果列于圖6A-D中，而“無(wú)應(yīng)答者”的結(jié)果列于圖6E-K中。認(rèn)為是應(yīng)答者的患者在初次外科手術(shù)后18個(gè)月時(shí)沒(méi)有患病跡象，而無(wú)應(yīng)答者在初次外科手術(shù)的18個(gè)月內(nèi)被診斷為疾病復(fù)發(fā)。從左至右，微RNA為let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR142_5p、miR96、miR222、miR148b、miR92a、miR214、miR130a、miR29b、miR212、miR124、miR21、miR200c、miRlOO、miR155、miR181b、miR210。
[0030]示例性實(shí)施方案的描述
[0031]在最近5年中，表達(dá)譜測(cè)定技術(shù)已經(jīng)鑒定出具有診斷應(yīng)用的新生物標(biāo)記物。一個(gè)這樣的生物標(biāo)記物組是一類小的非編碼RNA，稱為微RNA(miRNA) (1rio et al.2007;DeCecco et al.，2004; Calin&Croce, 2006)。微 RNA，小的(例如，長(zhǎng)度為 17-25 個(gè)核苷酸)非編碼RNA,通過(guò)結(jié)合其3’未翻譯區(qū)抑制祀mRNA的翻譯(Esquela-Kerscher&Slack, 2006; Bartel, 2004)?？梢酝ㄟ^(guò)同源mRNA的切割或通過(guò)蛋白質(zhì)合成的特異性抑制來(lái)進(jìn)行通過(guò)miRNA的靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。
[0032]通過(guò)miRNA譜分析的所有腫瘤已經(jīng)呈現(xiàn)出與來(lái)自同一組織的正常細(xì)胞相比明顯不同的 miRNA 印記(1rio et al.2007; Calin&Croce, 2006a; Calin&Croce, 2006b) ? Lu 等(2005)進(jìn)行了白血病和實(shí)體癌癥的分析，并且確定了 miRNA-表達(dá)譜可以根據(jù)發(fā)育世系和分化狀態(tài)將人癌癥進(jìn)行分類。現(xiàn)在已經(jīng)將個(gè)體miRNA和特定的miRNA印記的表達(dá)與許多人癌癥的診斷和預(yù)后相關(guān)聯(lián)。
[0033]使用組織樣品，1rio等(2007)證明了與正常卵巢相比，特定的miRNA在卵巢癌中異常表達(dá)，miR-141、miR-200a、miR-200b和miR_200c是最明顯過(guò)表達(dá)的。他們進(jìn)一步證明了卵巢腫瘤的低甲基化導(dǎo)致了與正常卵巢相比miR-21、miR-203和miR-205的上調(diào)。這些上調(diào)的miRNA中的兩種，miR-200a和miR_200c，在檢查的所有三種組織類型中都是增強(qiáng)的(漿液細(xì)胞、子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞和透明細(xì)胞)，而miR-200b和miR-141上調(diào)在子宮內(nèi)膜樣和漿液組織類型中都出現(xiàn)了。通常，將不同組織類型的卵巢癌(漿液細(xì)胞、子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞、透明細(xì)胞和其的混合)與正常組織相比獲得的miRNA印記在大部分情況中是重疊的。卵巢腫瘤的分析還證明了不存在與腫瘤期或級(jí)相關(guān)的不同表達(dá)的miRNA，這可能是由于他們這組樣品主要是源自晚期腫瘤。
[0034]在上調(diào)最明顯的miRNA中，miR_200a和miR-141屬于同一家族，miR-200b位于與miR-200a相同區(qū)域中的染色體1ρ36.33上，而miR_200c位于與miR-141相同區(qū)域中的染色體12ρ13.31上(1rio et al.(2007))。這種關(guān)聯(lián)與Zhang等(2006)的發(fā)現(xiàn)相一致,他們認(rèn)為特定miRNA的上調(diào)是miRNA基因的擴(kuò)增。使用基于高分辨率陣列的比較基因組雜交，異常高比例的含有miRNA基因的基因座(loci)呈現(xiàn)出DNA拷貝數(shù)改變。在卵巢癌中，37.1%的含有miRNA基因的基因組基因座與DNA拷貝數(shù)改變相關(guān)(Zhang et al.，2006)。在乳腺癌和黑素瘤中，甚至更高比例的這些基因座呈現(xiàn)出改變的DNA拷貝數(shù)(分別為72.8%和85.9%) (Zhang et al.，2006)。因此，miRNA表達(dá)模式,或印記,似乎是比mRNA表達(dá)模式更具特征性的腫瘤發(fā)育起源，并且可以與診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后和對(duì)治療的應(yīng)答相關(guān)。然而，作為癌癥診斷工具，在本發(fā)明公開的主題之前，miRNA印記的分析僅限于組織活檢。
[0035]最近描述的癌細(xì)胞的特征是它們釋放或脫落完整的、質(zhì)膜的囊泡部分的能力，在本領(lǐng)域稱為膜片段、膜囊泡或微囊泡。本文中公開的是與源自癌細(xì)胞的微囊泡(即，“癌癥衍生的微囊泡”)相關(guān)的miRNA。本發(fā)明公開的主題進(jìn)一步公開了從癌癥衍生的微囊泡分離的miRNA在患有 癌癥的個(gè)體中的表達(dá)水平不同于(例如，增加或減少)沒(méi)有癌癥的個(gè)體中測(cè)量的miRNA表達(dá)水平(在本文中稱為“miRNA對(duì)照水平”)。此外，本發(fā)明公開的主題提供了從測(cè)試個(gè)體容易獲得的生物流體分離癌癥衍生的微囊泡。因此，本發(fā)明公開的主題提供了基于從容易獲得的生物樣品收集和測(cè)定癌癥衍生的微囊泡miRNA水平來(lái)診斷和預(yù)后癌癥的方法，并且不需要癌細(xì)胞的直接取樣。
[0036]“外來(lái)體”是從各種不同細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)釋放的微囊泡(即“癌癥衍生的外來(lái)體”)。這些小的囊泡(直徑50-100nm)源自大的多囊泡內(nèi)體，并被分泌至細(xì)胞外環(huán)境中。外來(lái)體釋放/脫落的確切機(jī)制仍不清楚；然而，這種釋放是需要能量的現(xiàn)象，受細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)。它們的形成似乎是通過(guò)內(nèi)陷并從晚期內(nèi)體的限制膜(limiting membrane)芽出，形成含有胞質(zhì)溶膠并且在其表面上暴露膜結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)的胞外域的囊泡。使用電子顯微鏡，研究已經(jīng)表明多囊泡內(nèi)體與質(zhì)膜的融合譜，引起內(nèi)部囊泡向胞外環(huán)境的分泌。外來(lái)體釋放的速率在大部分腫瘤細(xì)胞中顯著增加，并持續(xù)發(fā)生。外來(lái)體釋放的增加及其聚積在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中似乎是重要的。除了癌細(xì)胞之外，外來(lái)體的釋放也被證明與胚胎源(例如胎盤)的細(xì)胞和激活的淋巴樣細(xì)胞有關(guān)。
[0037]盡管在特定生理?xiàng)l件下，外來(lái)體的胞外脫落也出現(xiàn)在其他類型的細(xì)胞中，但來(lái)自非腫瘤細(xì)胞的外來(lái)體的聚積很少在體內(nèi)觀察到。相反，由腫瘤細(xì)胞釋放的外來(lái)體會(huì)在生物流體中聚積，所述生物液體包括血清、腹水和胸膜液。外來(lái)體的釋放及其聚積似乎是惡性轉(zhuǎn)化的重要特征。脫落的癌癥衍生的外來(lái)體不必然反映出原始腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜的一般組成，而是表示具有增強(qiáng)的腫瘤抗原表達(dá)的“微圖譜”。
[0038]外來(lái)體的釋放似乎是細(xì)胞通訊的一個(gè)重要特征。由于釋放的外來(lái)體表達(dá)具有生物活性的分子(如Fas配體、PD-l、MICA/B、mdrl、MMP、⑶44和自身反應(yīng)性抗原)，已經(jīng)在多個(gè)模型中分析了這些微囊泡調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞功能的能力。已經(jīng)建立了這樣的理論:這些釋放的外來(lái)體通過(guò)模擬“激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡”(AICD)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能。淋巴樣細(xì)胞似乎在激活后釋放外來(lái)體，并且這些淋巴樣細(xì)胞似乎通過(guò)防止過(guò)度的免疫應(yīng)答和自身免疫力的發(fā)展在免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用。已經(jīng)假定了通過(guò)腫瘤細(xì)胞釋放外來(lái)體是胎細(xì)胞外來(lái)體的再表達(dá)并且二者組成通路，以繞過(guò)免疫監(jiān)視。
[0039]微RNA是天然存在的小的非編碼RNA，其生物活性形式的長(zhǎng)度為約17至約25個(gè)核苷酸堿基(nt)。通過(guò)抑制靶mRNA翻譯，miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)芐基因表達(dá)。認(rèn)為miRNA起到負(fù)調(diào)節(jié)劑的作用，即更大量的特異性miRNA將與較低水平的靶基因表達(dá)相關(guān)。
[0040]體內(nèi)存在三種形式的miRNA:初級(jí) miRNA (pr1-miRNA)、成熟前 miRNA (pre-miRNA)和成熟miRNA。初級(jí)miRNA(pr1-miRNA)被表達(dá)為約數(shù)百堿基至Ikb以上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物。該pr1-miRNA轉(zhuǎn)錄物在核內(nèi)被稱為Drosha的RNase II核酸內(nèi)切酶切割，該酶在莖環(huán)基部附近切割莖的兩條鏈。Drosha將RNA雙鏈體切割為交錯(cuò)切口，留出一個(gè)5'磷酸和3'端的2nt突出端。所述切割產(chǎn)物，即成熟前miRNA (pre-mi RNA),長(zhǎng)約60至約IlOnt,具有以折回方式形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Pre-miRNA通過(guò)Ran-GTP和Exportin_5從核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。Pre-miRNA在細(xì)胞質(zhì)中被另一種稱為Dicer的RNase II核酸內(nèi)切酶進(jìn)一步加工。Dicer識(shí)別5'磷酸和3'突出端，并且在莖環(huán)交匯處將環(huán)切離，以形成miRNA雙鏈體。該miRNA雙鏈體與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)結(jié)合，在此反義鏈優(yōu)先被降解，并且有義鏈的成熟miRNA指引RISC至其靶點(diǎn)。成熟miRNA是miRNA的生物活性形式，長(zhǎng)度約17至約25nt。[0041 ] 微RNA通過(guò)與其靶基因信使(mRNA)中的特異性序列進(jìn)行堿基配對(duì)(完全匹配或不完全匹配)來(lái)發(fā)揮功能。該miRNA降解或抑制mRNA的翻譯，引起靶基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)、抑制或沉默。在動(dòng)物中，miRNA不必然與其靶點(diǎn)完全同源，并且部分同源導(dǎo)致翻譯抑制，而在植物中，如果miRNA傾向于表現(xiàn)出與靶點(diǎn)完全同源，則信使(mRNA)的降解比較普遍。
[0042]微RNA廣泛分布于基因組中，控制基因調(diào)節(jié)并積極地參與許多生理或病理過(guò)程。例如，發(fā)現(xiàn)某些miRNA的調(diào)節(jié)形式是控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡；并且異常miRNA譜與腫瘤發(fā)生有關(guān)。另外，表明了病毒感染引起靶向沉默“原始細(xì)胞(pro-cell)存活”基因的miRNA的增加以及抑制與凋亡(程序性細(xì)胞死亡)相關(guān)基因的miRNA的減少，從而使得平衡向增大凋亡信號(hào)方向傾斜。
[0043]數(shù)千種mRNA處于迄今為止鑒定的數(shù)百種miRNA的這種選擇壓力下。這種選擇過(guò)程有助于抑制特定組的基因表達(dá)，例如其可能不再被需要，以使細(xì)胞將其生理程序?qū)蛐碌幕虮磉_(dá)通路。靶組基因表達(dá)的miRNA依賴性抑制是使細(xì)胞離開原來(lái)的程序并轉(zhuǎn)換成新的程序的一種強(qiáng)大且快速的調(diào)節(jié)。這一點(diǎn)的典型實(shí)例在胚胎發(fā)育過(guò)程中被證明，在該過(guò)程中一組特定的細(xì)胞被定向變成獨(dú)特的專門細(xì)胞類型，如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、肌肉等。
[0044]據(jù)認(rèn)為，大概有三分之一的人基因的表達(dá)水平受miRNA調(diào)節(jié)，并且獨(dú)特的基因表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)與每種特定細(xì)胞類型的特定信號(hào)傳遞通路有關(guān)。例如，細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞通路可以受到一組靶向以使促存活基因信使去穩(wěn)定的miRNA控制，使得備用的促凋亡基因處于優(yōu)勢(shì)地位并因此激活死亡程序。另一個(gè)實(shí)例是癌癥生長(zhǎng)的控制；最近的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)表明，miRNA在防止細(xì)胞變成腫瘤中也是至關(guān)重要的。例如，兩個(gè)致癌基因，cMyc和cRas，也被發(fā)現(xiàn)受一類miRNA的控制，該miRNA的表達(dá)在癌癥中是下調(diào)的。換言之，該miRNA的缺乏使得cMyc和cRas的表達(dá)不受控制，從而使這兩個(gè)基因在癌細(xì)胞中大量存在，使得癌細(xì)胞獲得不受控制的細(xì)胞增殖能力，并為腫瘤生長(zhǎng)作準(zhǔn)備。另外，已經(jīng)報(bào)道了 miRNA突變是造成比利時(shí)血統(tǒng)綿羊中肌肉發(fā)達(dá)表現(xiàn)型的原因，這表明與遺傳障礙相關(guān)的突變可以在miRNA中找到，而在啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)域和剪接位點(diǎn)(slicing sites)中沒(méi)有出現(xiàn)突變跡象。
[0045]多個(gè)通路的協(xié)調(diào)作用可能有助于控制特定的細(xì)胞狀態(tài)，其中可能涉及某些分子“核心”，它們通過(guò)層級(jí)順序和眾多的(redundancy)分子控制來(lái)發(fā)揮功能。事實(shí)上，數(shù)十種miRNA可以通過(guò)簡(jiǎn)單地抑制它們自身或它們的功能相反物(functional opponents)的表達(dá)起作用，以確保這些“核心”在細(xì)胞中可以執(zhí)行主要功能或次要功能。因此，一個(gè)基因產(chǎn)物在一個(gè)細(xì)胞類型中可以作為一個(gè)信號(hào)傳遞通路的主要“核心”發(fā)揮作用，并且在另一個(gè)細(xì)胞類型中，它可以為次要“核心”或者可根本不被使用。然后，微RNA對(duì)“核心”基因表達(dá)的控制可以是一種方便的機(jī)制以為多種分子提供這種多能性，以用作不同類型的細(xì)胞作用形式的主要“核心”或次要“核心”或者根本不作為“核心”。
[0046]鑒于miRNA在基因調(diào)控以及在許多生理和病理過(guò)程中的作用，需要獲得有關(guān)它們的相互作用方式及其表達(dá)模式的信息。定量和鑒定哪些組的推定miRNA在特定細(xì)胞類型中起作用或者與目標(biāo)特定過(guò)程或病癥有關(guān)的系統(tǒng)或方法可以提供這樣的信息，用于理解每種細(xì)胞狀態(tài)怎樣發(fā)展和維持，以及怎樣通過(guò)以下方式刺激功能障礙的維持:不適宜地降低或增加獨(dú)特組的miRNA以調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)。這些理解在多種障礙(包括癌癥)的診斷和表征中可被證明是有用的。
[0047]作為潛在的臨床診斷工具，已經(jīng)表明miRNA對(duì)許多但非全部癌癥是重要且精確的決定因素。越來(lái)越多 的證據(jù)顯示miRNA基因的表達(dá)在人癌癥中是不受調(diào)控的。miRNA的表達(dá)對(duì)組織和發(fā)展階段有高度特異性，并且最近已經(jīng)允許用于腫瘤的分子分型(molecularclassification)。迄今為止,所有通過(guò)miRNA作譜分析的腫瘤已經(jīng)顯示出與來(lái)自同一組織的正常細(xì)胞顯著不同的miRNA譜。流式細(xì)胞術(shù)miRNA作譜證明，miRNA表達(dá)譜根據(jù)腫瘤的發(fā)育世系和分化狀態(tài)將人癌癥分類。特定的過(guò)表達(dá)和表達(dá)不足已經(jīng)顯示與具體的腫瘤類型有關(guān)。微RNA過(guò)表達(dá)可以引起腫瘤抑制基因的下調(diào)，而它們的表達(dá)不足可以導(dǎo)致致癌基因上調(diào)。使用大規(guī)模微陣列分析，癌細(xì)胞顯示了與正常細(xì)胞相比不同的miRNA譜，相比在正常細(xì)胞中，在癌細(xì)胞中一些miRNA基因過(guò)表達(dá),而其他miRNA下調(diào)。層次聚類分析顯示,該miRNA印記能夠使得腫瘤樣品以它們的組織來(lái)源為基礎(chǔ)進(jìn)行分組。全基因組分析(Genome-wideprofiling)研究已經(jīng)在多種癌癥類型上進(jìn)行，包括CLL、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和內(nèi)分泌胰腺腫瘤。在對(duì)104匹配對(duì)的原發(fā)癌和非癌卵巢組織的研究中，觀察到了 43種差異表達(dá)的miRNA ;在腫瘤中28種下調(diào)，15種過(guò)表達(dá)。
[0048]以兩種不同方法獲得的微陣列數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、來(lái)自六種實(shí)體瘤(卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌和內(nèi)分泌胰腺腫瘤)的微陣列的顯著性分析(SAM)和微陣列的預(yù)測(cè)分析(PAM)證明了一種由在至少三個(gè)腫瘤類型中差異表達(dá)的miRNA組成的共同印記。處于該列表頂部的是miR-21以及miR-17-5p和miR-191，前一種在六種類型的癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，后兩種在五種中過(guò)表達(dá)。由于所分析腫瘤的胚胎源是不同的，這些發(fā)現(xiàn)的重要意義可能在于這些常見的miRNA參與許多腫瘤類型中改變的基礎(chǔ)信號(hào)傳遞通路。以下的發(fā)現(xiàn)支持了這些基因在腫瘤發(fā)生中的功能，發(fā)現(xiàn)了對(duì)所述差異表達(dá)的miRNA的推定靶顯著地集中在那些靶向已知的腫瘤抑制基因和致癌基因的基因。此外，miR-21，唯一在分析的全部六種類型癌癥中都過(guò)表達(dá)的miRNA，顯示出直接靶向腫瘤抑制基因PTEN，該基因編碼一種抑制生長(zhǎng)和/或存活通路的磷酸酶。PTEN的功能在多種類型的晚期腫瘤(包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌)中有變化。
[0049]在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了用于表征個(gè)體的癌癥的方法。表征可以包括提供癌癥的診斷、預(yù)后和/或治療診斷(theragnosis)。在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了用于評(píng)價(jià)個(gè)體的癌癥的療效和/或進(jìn)展的方法。在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了用于評(píng)估癌癥的一種或多種微RNA存在(例如，miR印記或HliR表達(dá)譜)的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是頭頸癌。
[0050]在一些實(shí)施方案中，所述方法包括從個(gè)體提供生物樣品；從生物樣品分離包含miRNA的癌癥衍生的微囊泡；測(cè)定一種或多種miRNA的含量。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將一種或多種miRNA的含量與一個(gè)或多個(gè)miRNA對(duì)照水平相比較。如果與一個(gè)或多個(gè)對(duì)照水平相比，生物樣品中來(lái)自癌癥衍生的微囊泡的一種或多種miRNA的含量存在可測(cè)量差異，那么可以診斷個(gè)體患有癌癥。實(shí)施例2中提供了可以測(cè)量的示例性miRNA的非限制性列表，例如，let-7a、miR-133b、miR-122、miR-20b、miR-335、miR-196a、miR-125a-5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR_15a、miR_18b、miR-378、let_7b、miR-205、miR_181a、miR_130a、miR-199a_3p、miR-140_5p、miR_20a、miR-146b_5p、miR-132、miR_193b、miR-183、miR-34c_5p、miR_30c、miR_148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR-135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR-18 Id、miR_301a、miR_200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-1、miR-363、miR-150、let_71、miR_27b、miR_7、miR_127_5p、miR_29a、miR-191、let_7d、miR_9、let_7f、miR-10a、miR_181b、miR_15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR_34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR_19a、miR-193a_5p、miR-18a、miR_125b、miR-126、miR_27a、miR-372、miR-149、miR_23b、miR-203、miR-32 和miR-181c，和/或圖4和圖5中提供的。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量的miRNA選自圖4和圖5中所列的miRNA，并且在一些具體實(shí)施方案中，測(cè)量的miRNA選自miR-16、miR_181c、miR-25、miR_15b、miR-150、miR_148b、miR_92a、miR_92b、miR-222、miR-96、miR-125a_5p、miR-335和 miR-122。測(cè)量的 miRNA 也可以選自 let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR142_5p、miR96、miR222、miR148b、miR92a、miR214、miR130a、miR29a、miR212、miR124、miR21、miR200c、miRlOO、miR155、miR181b 和 miR210?？梢詼y(cè)量這些 miR來(lái)檢測(cè)癌癥，如本文中所述的那些，例如，頭頸癌和/或肺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥包括鱗狀上皮細(xì)胞癌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開主題的方法可以在體外進(jìn)行。
[0051]術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或腫瘤或惡性腫瘤，包括白血病、癌、腺瘤和肉瘤。癌癥的實(shí)例有腦癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤、間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌和子宮癌。
[0052]術(shù)語(yǔ)“白血病”包括造血器官的進(jìn)行性惡性疾病，其特征通常在于血液和骨髓中的白細(xì)胞及其前體異常的增殖及發(fā)育。白血病包括，例如急性非淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、成年T細(xì)胞性白血病、非白血性白血病(aleukemic leukemia)、非白血球性白血病(aleukocythemic leukemia)、嗜減性白血病(basophylic leukemia)、母細(xì)胞性白血病、牛白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚白血病、胚胎白血病(embryonal leukemia)、嗜酸性白血病(eosinophilic leukemia)、格羅斯白血病(Gross' leukemia)、毛細(xì)胞性白血病、成血性白血病(hemoblastic leukemia)、成血細(xì)胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、組織細(xì)胞性白血病、干細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、白細(xì)胞減少性白血病、淋巴白血病(lymphatic leukemia)、成淋巴細(xì)胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴細(xì)胞性白血病、成淋巴性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴樣白血病(lymphoidleukemia)、淋巴肉瘤細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞性白血病、巨核細(xì)胞性白血病、小成髓細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞性白血病、成髓性白血病(myeloblasts leukemia)、髓細(xì)胞性白血病、髓樣粒細(xì)胞性白血病(myeloid granulocytic leukemia)、髓單核細(xì)胞性白血病(myelomonocytic leukemia)、內(nèi)格利型(Naegeli)白血病、衆(zhòng)細(xì)胞性白血病(plasma cellleukemia)、衆(zhòng)細(xì)胞性白血病(plasmacytic leukemia)、早幼粒細(xì)胞性白血病、李德爾細(xì)胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling，s leukemia)、干細(xì)胞性白血病、亞白血性白血病和未分化細(xì)胞性白血病。[0053] 術(shù)語(yǔ)“癌”是指由傾向于浸潤(rùn)周圍組織并發(fā)生轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞組成的惡性新生物。示例性的癌包括，例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡狀癌(acinous carcinoma)、腺囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌(carcinoma adenomatosum)、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma)、基底細(xì)胞癌(carcinoma basocellulare)、基底細(xì)胞樣癌(basaloid carcinoma)、基底鱗狀細(xì)胞癌(basosquamous cell carcinoma)、細(xì)支氣管月市泡癌(bronchioalveolar carcinoma)、支氣管癌(bronchiolar carcinoma)、支氣管源性癌(bronchogenic carcinoma)、腦樣癌(cerebriform carcinoma)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(cholangiocellular carcinoma)、域毛膜癌(chorionic carcinoma)、膠樣癌(colloid carcinoma)、粉剌癌(comedo carcinoma)、子宮體癌(corpus carcinoma)、篩狀癌(cribriform carcinoma)、胸廓癌(carcinoma encuirasse)、皮膚癌(carcinomacutaneum)、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical carcinoma)、柱狀細(xì)胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、導(dǎo)管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、髓樣癌(encephaloid carcinoma)、epiennoid癌(epiennoid carcinoma)、腺樣上皮癌(carcinomaepitheliale adenoides)、外植癌(exophytic carcinoma)、潰痕性癌(carcinoma exulcere)、纖維性癌(carcinoma f ibrosum)、膠狀癌(gelatiniform carcinoma)、膠樣癌(gelatinous carcinoma)、巨大細(xì)胞癌(giant cell carcinoma)、巨細(xì)胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌(glandular carcinoma)、顆粒細(xì)胞癌、毛母質(zhì)癌(hair-matrixcarcinoma)、多血癌(hematoid carcinoma)、月干細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma)、大嗜酸細(xì)胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明質(zhì)癌(hyaline carcinoma)、類腎透明細(xì)胞癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌(infantile embryonal carcinoma)、原位癌、表皮內(nèi)癌(intraepidermal carcinoma)、上皮內(nèi)癌(intraepithelial carcinoma)、克龍派切爾癌(Krompecher’ s carcinoma)、Kulchitzky 細(xì)胞癌(Kulchitzky-cellcarcinoma)、大細(xì)胞癌(large-cell carcinoma)、豆?fàn)畎?lenticular carcinoma)、月旨瘤癌(lipomatous carcinoma)、淋巴上皮癌(lymphoepithelial carcinoma)、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(melanoticcarcinoma)、軟癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinomamuciparum)、粘液細(xì)胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮樣癌(mucoepidermoidcarcinoma)、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤樣癌(carcinoma myxomatodes)、鼻口因癌(naspharyngeal carcinoma)、燕麥細(xì)胞癌(oat cellcarcinoma)、骨化性癌(carcinoma ossificans)、類骨質(zhì)癌(osteoid carcinoma)、乳頭狀癌(papillary carcinoma)、門脈周癌(periportal carcinoma)、浸潤(rùn)前期癌(preinvasivecarcinoma)、棘細(xì)胞癌(prickle cell carcinoma)、軟糊狀癌(pultaceous carcinoma)、腎的腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma of kidney)、儲(chǔ)備細(xì)胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤樣癌(carcinoma sarcomatodes)、施奈德癌(Schneiderian carcinoma)、硬性癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌(carcinoma scroti)、印戒細(xì)胞癌(signet-ringcell carcinoma)、單純癌(carcinoma simplex)、小細(xì)胞癌(small-cell carcinoma)、馬鈴薯狀癌(solanoid carcinoma)、球狀細(xì)胞癌(spheroidal cell carcinoma)、梭形細(xì)胞癌(spindle cell carcinoma)、髓樣癌(carcinoma spongiosum)、鱗癌(squamouscarcinoma)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴(kuò)張性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管擴(kuò)張性癌(carcinoma telangiectodes)、移行細(xì)胞癌(transitional cell carcinoma)、結(jié)節(jié)性皮癌(carcinoma tuberosum)、結(jié)節(jié)性皮癌(tuberous carcinoma)、撫狀癌(verrucous carcinoma)和域毛狀癌(carcinomavillosum)o [0054]術(shù)語(yǔ)“肉瘤”通常是指由胚胎結(jié)締組織之類的物質(zhì)構(gòu)成的腫瘤，并且通常由鑲嵌于纖維物質(zhì)或同質(zhì)物質(zhì)中緊密壓實(shí)的細(xì)胞組成。肉瘤包括，例如，軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿伯內(nèi)西肉瘤(Abemethy' s sarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)、腺泡狀軟組織肉瘤(alveolar softpart sarcoma)、成釉細(xì)胞肉瘤、葡萄狀肉瘤(botryoid sarcoma)、綠色瘤肉瘤、域毛膜癌、胚胎性肉瘤(embryonal sarcoma)、維爾姆斯腫瘤肉瘤(Wilms' tumor sarcoma)、子宮內(nèi)膜肉瘤(endometrial sarcoma)、間質(zhì)肉瘤(stromal sarcoma)、尤因肉瘤(Ewing, ssarcoma)、筋膜肉瘤(fascial sarcoma)、纖維母細(xì)胞肉瘤(fibroblastic sarcoma)、巨細(xì)胞肉瘤(giant cell sarcoma)、粒細(xì)胞肉瘤(granulocytic sarcoma)、霍奇金肉瘤(Hodgkin ! s sarcoma)、特發(fā)性多發(fā)性色素沉著出血性肉瘤(idiopathic multiplepigmented hemorrhagic sarcoma)、B 細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(immunoblastic sarcoma ofB cells)、淋巴瘤、T細(xì)胞免疫母細(xì)胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of T-cells)、詹森肉瘤(Jensen' s sarcoma)、卡波西肉瘤(Kaposi ' s sarcoma)、肝巨嗷細(xì)胞肉瘤(Kupffercell sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、白血病性肉瘤(Ieukosarcoma)、惡性間葉肉瘤(malignant mesenchymoma sarcoma)、骨膜外肉瘤(parosteal sarcoma)、網(wǎng)織紅細(xì)胞肉瘤(reticulocytic sarcoma)、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)、衆(zhòng)液囊性肉瘤(serocysticsarcoma)、滑膜肉瘤和毛細(xì)血管擴(kuò)張性肉瘤(telangiectatic sarcoma) 0
[0055]術(shù)語(yǔ)“黑素瘤”用來(lái)表示起源于皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞體系的腫瘤。黑素瘤包括，例如，肢端雀斑樣癒黑色瘤(acral-lentiginous melanoma)、無(wú)黑色素性黑素瘤(amelanotic melanoma)、良性幼年黑素瘤(benign juvenile melanoma)、克勞德曼黑素瘤(Cloudman，s melanoma)、S91 黑素瘤、哈-帕二氏黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、幼年黑素瘤(juvenile melanoma)、惡性雀斑樣疲黑素瘤(lentigo maligna melanoma)、惡性黑素瘤(malignant melanoma)、結(jié)節(jié)性黑素瘤(nodular melanoma)、甲下黑素瘤(subungalmelanoma)和淺表擴(kuò)散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)。
[0056]術(shù)語(yǔ)“鱗狀上皮細(xì)胞”指的是身體大部分的表面細(xì)胞的上皮(組織層)。例如，皮膚和粘膜是鱗狀上皮細(xì)胞。鱗狀上皮細(xì)胞腫瘤包括但不限于乳頭狀癌、疣鱗狀上皮細(xì)胞癌、乳頭狀鱗狀上皮細(xì)胞癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、大細(xì)胞角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞癌、小細(xì)胞角質(zhì)化鱗狀上皮細(xì)胞癌、紡錘細(xì)胞鱗狀上皮細(xì)胞癌、腺樣/假腺鱗狀上皮癌、上皮內(nèi)鱗狀上皮細(xì)胞癌、淋巴上皮癌、基底細(xì)胞樣鱗狀上皮細(xì)胞癌、透明細(xì)胞鱗狀上皮細(xì)胞癌、角化棘皮瘤、印戒細(xì)胞鱗狀上皮癌和紡錘細(xì)胞鱗狀上皮細(xì)胞癌。鱗狀上皮細(xì)胞癌是人類最常見癌癥之一，并且通常由突變的襯在體內(nèi)的外胚層或內(nèi)胚層細(xì)胞引起。其可以在各種器官和組織中產(chǎn)生，包括皮膚、嘴唇、嘴、食道、膀胱、前列腺、肺、陰道、宮頸等。鱗狀上皮細(xì)胞癌最可能出現(xiàn)在40歲以上的具有嚴(yán)重酗酒和吸煙史的男性中。頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌(HNSCC)是最常見形式的喉癌，占了超過(guò)90%的咽喉癌。鱗狀上皮細(xì)胞肺癌是一種非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)并且與吸煙史密切相關(guān)。
[0057]在一些實(shí)施方案中，提供了一種用于表征個(gè)體的肺癌或頭頸癌的方法，并且包括從個(gè)體的生物樣品分離微囊泡；測(cè)定分離的微囊泡中的一種或多種微RNA的存在或含量；和將一種或多種微RNA的存在或含量與參照相比，其中基于分離的微囊泡中的一種或多種微RNA的存在和含量與參照相比的可測(cè)量差異來(lái)表征肺癌或頭頸癌。在一些實(shí)施方案中，表征包括提供癌癥的診斷、預(yù)后和/或治療診斷。
[0058]在一些實(shí)施方案中，提供了一種用于評(píng)價(jià)個(gè)體的肺癌或頭頸癌療效和/或進(jìn)展的方法，并且包括從個(gè)體的生物樣品分離微囊泡；測(cè)定分離的微囊泡中的一種或多種微RNA的存在或含量；和將一種或多種微RNA的存在或含量與參照相比，其中基于分離的微囊泡中的一種或多種微RNA的存在和含量與參照相比的可測(cè)量差異來(lái)評(píng)價(jià)肺癌或頭頸癌的療效和/或進(jìn)展。
[0059]在一些實(shí)施方案中，提供了一種用于評(píng)估肺癌miRNA印記或頭頸癌miRNA印記的一種或多種微RNA存在的方法，并且包括從生物樣品分離癌癥衍生的胞外微囊泡；和測(cè)定所述微囊泡中一種或多種微RNA的存在。在一些實(shí)施方案中，所述微囊泡從肺癌或頭頸癌細(xì)胞脫落。
[0060]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的主題的方法包括測(cè)定兩種或多種微RNA的表達(dá)譜或印記。在一些實(shí)施方案中，所述方法可以包括將表達(dá)譜與來(lái)自選定的參照樣品的譜相比較，以測(cè)定所述微囊泡中兩種或多種微RNA的存在或含量。
[0061]針對(duì)樣品的生物標(biāo)記物表達(dá)譜或生物標(biāo)記物印記可以包括關(guān)于樣品中所含的生物標(biāo)記物的特征、樣品中所含的生物標(biāo)記物的定量水平和/或相對(duì)于另一種樣品或?qū)φ盏纳飿?biāo)記物定量水平的變化的信息。例如，針對(duì)樣品的生物標(biāo)記物印記或譜可以包括關(guān)于來(lái)自特定個(gè)體的生物樣品的癌癥衍生的胞外微囊泡的生物標(biāo)記物的特征、定量水平和/或定量水平的變化的信息。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物印記或譜涉及關(guān)于樣品中兩種或多種生物標(biāo)記物的信息(例如，由2種生物標(biāo)記物組成的生物標(biāo)記物印記或譜)。在一些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記物印記或譜由 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85 種生物標(biāo)記物組成。
[0062]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自以下的微RNA:let_7a、miR_133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR_15a、miR_18b、miR-378、let-7b、miR-205、miR-181a、miR-130a、miR-199a-3p、miR-140-5p、miR-20a、miR-146b-5p、miR-132、miR-193b、miR-183、miR-34c-5p、miR-30c、miR-148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR_135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR_181d、miR_301a、miR_200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-1、miR-363、miR_150、let-71、miR-27b、miR-7、miR-127-5p、miR-29a、miR-191、let_7d、miR-9、let_7f，miR-10a、miR-181b、miR-15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR-34a，miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR-19a、miR-193a-5p、miR-18a、miR-125b、miR-126、miR-27a、miR-372、miR-149、miR_23b、miR-203、miR-32 和 miR_181c。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表不個(gè)體中存在癌癥。
[0063]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自以下的微RNA:miR-16、miR_181c、miR-25、miR_15b、miR-150、miR_148b、miR_92a、miR-222、miR-96、miR-125a-5p、miR-335和miR-122。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表不個(gè)體中存在頭頸癌。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示個(gè)體中存在頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。
[0064]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自以下的微RNA:let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25、miR181c、miR199a_3p、miR200c 和 miR16。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示個(gè)體中存在肺癌。
[0065]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自以下的微RNA:let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25和miR181c。在一些實(shí)施方案中，與參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示個(gè)體中存在肺腺癌。
[0066]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種微RNA包括一種或多種選自以下的微RNA:let7a、miR122、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25、miR181c、miR199a_3p、miR200c 和 miR16。在一些實(shí)施方案中，與參照相比
一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示個(gè)體中存在肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。
[0067]在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，包括基于測(cè)定的一種或多種微RNA的含量選擇癌癥的治療或改變癌癥的治療。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”或“治療(treating) ”涉及目標(biāo)癌癥的任何治療，包括但不限于預(yù)防性治療和治療性治療。因此，術(shù)語(yǔ)“治療(treatment) ”或“治療(treating) ”包括，但不限于:預(yù)防目標(biāo)癌癥或預(yù)防目標(biāo)癌癥的發(fā)展；抑制目標(biāo)癌癥的進(jìn)展；停止或預(yù)防目標(biāo)癌癥的發(fā)展；降低目標(biāo)癌癥的嚴(yán)重程度；改善或緩解與目標(biāo)癌癥相關(guān)的癥狀；和引起目標(biāo)癌癥或與目標(biāo)癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的逆轉(zhuǎn)(regression)。[0068]在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，一種方法包括與參照相比較。參照可以包括，例如，來(lái)自未患癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種微RNA的水平。在一些實(shí)施方案中，參照包括在一定時(shí)間段內(nèi)從個(gè)體獲取的樣品中一種或多種微RNA的水平。在一些實(shí)施方案中，參照包括在癌癥治療開始和/或癌癥發(fā)作之前從個(gè)體收集的樣品，并且在治療開始或癌癥發(fā)作后收集生物樣品。
[0069]在一些實(shí)施方案中，參照可以包括標(biāo)準(zhǔn)樣品。這樣的標(biāo)準(zhǔn)樣品可以是提供處于被認(rèn)為是對(duì)照水平的水平的一種或多種微RNA含量的參照。例如，可以制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，以模擬來(lái)自未患目標(biāo)癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種微RNA的含量或水平(例如，來(lái)自多個(gè)樣品的平均含量或水平)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)樣品可以是提供處于被認(rèn)為是與特定類型的癌癥和/或?qū)χ委熓菓?yīng)答者或無(wú)應(yīng)答者相關(guān)的水平的一種或多種微RNA的含量的參照。
[0070]在一些實(shí)施方案中，參照包括對(duì)照數(shù)據(jù)。對(duì)照數(shù)據(jù)，當(dāng)用作參照時(shí)，可以包括數(shù)據(jù)匯編，如此可以包含在表格、圖表、圖中，例如，標(biāo)準(zhǔn)曲線或數(shù)據(jù)庫(kù)，其提供被認(rèn)為是對(duì)照水平的一種或多種微RNA的含量或水平。例如，可以通過(guò)獲得來(lái)自未患目標(biāo)癌癥的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種miRNA的含量或水平(例如，來(lái)自多個(gè)樣品的平均含量或水平)來(lái)匯編這樣的數(shù)據(jù)。
[0071]本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物樣品”是指包含生物分子的樣品和/或源自個(gè)體的樣品。代表性的生物分子包括但不限于:總DNA、RNA、miRNA, mRNA和多肽。所述生物樣品可以用于檢測(cè)與癌癥衍生的微囊泡有關(guān)的目標(biāo)miRNA的存在和/或表達(dá)水平。任何細(xì)胞、細(xì)胞群、細(xì)胞碎片或細(xì)胞產(chǎn)物均可與本發(fā)明要求的主題的方法一塊使用，但最適宜的是預(yù)測(cè)含有與正常對(duì)照相比呈現(xiàn)miRNA差異表達(dá)的癌癥衍生的微囊泡的生物流體和器官。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品為相對(duì)容易獲得的生物樣品，如，例如血液或其成分。在一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液或其組合。
[0072]在一些實(shí)施方案中，尺寸排阻層析可用于分離所述癌癥衍生的微囊泡。參見，例如圖1和圖2。尺寸排阻層析技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的實(shí)施例中提供了示例性的非限制性技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，分離了空隙容積級(jí)分并且其包括目標(biāo)微囊泡。此外，在一些實(shí)施方案中，在通過(guò)(一個(gè)或多個(gè)層析級(jí)分的)離心技術(shù)層析分離后可以進(jìn)一步分離所述癌癥衍生的微囊泡，這通常是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，例如密度梯度離心可用于進(jìn)一步分離所述微囊泡。再進(jìn)一步，在一些實(shí)施方案中，需要進(jìn)一步從其他來(lái)源的微囊泡分離所述癌癥衍生的分離的微囊泡。
[0073]本文使用的術(shù)語(yǔ)“親和性選擇”指的是基于對(duì)特定分子的親和性選擇特定的配體、分子、物質(zhì)等。例如，在一些實(shí)施方案中，親和性選擇包括基于對(duì)特定結(jié)合劑的親和性，選擇并且由此分離特定微囊泡的方法。在這點(diǎn)上，本文使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”指的是具有已知結(jié)合親和性的任何試劑。例如，結(jié)合劑可以是抗體或適體。因此，基于它們與特定結(jié)合劑結(jié)合的程度，結(jié)合劑可以用于親和性選擇中，來(lái)選擇特定配體、分子、物質(zhì)等。在一些實(shí)施方案中，親和性選擇包括使用抗癌抗原抗體作為結(jié)合劑，通過(guò)免疫吸附捕獲，從非癌癥衍生的微囊泡分離癌癥衍生的微囊泡。參見，例如圖3。示例性抗癌抗原抗體包括，但不限于，抗上皮細(xì)胞粘附分子(抗-EpCAM)抗體，按照例如本發(fā)明實(shí)施例中所列的來(lái)使用。[0074]本文使用的術(shù)語(yǔ)“診斷(diagnosing) ”和“診斷(diagnosis) ”指的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用來(lái)估計(jì)乃至確定個(gè)體是否患有給定疾病或病癥的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)?；谝粋€(gè)或多個(gè)診斷指標(biāo)來(lái)進(jìn)行診斷，所述診斷指標(biāo)如，例如，含量(包括存在或不存在)表示病癥的存在、嚴(yán)重性或不存在的生物標(biāo)記物(例如，miRNA表達(dá)水平)。
[0075]與診斷一起，臨床癌癥的預(yù)后也是一個(gè)很受關(guān)注和注意的方面。為了制定最有效的治療計(jì)劃，重要的是知曉癌細(xì)胞的攻擊性和腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。例如，一些癌癥可以通過(guò)多種候選策略進(jìn)行管理。在一些情況下，使用局部和全身放療，而在其他情況下，應(yīng)用外科介入和/或化療。目前對(duì)單個(gè)癌癥個(gè)體的治療決策可以基于(I)與疾病有關(guān)的淋巴結(jié)的數(shù)目，(2) —種或多種癌癥標(biāo)記物的狀態(tài)，(3)原發(fā)性腫瘤的大小，和(4)診斷的疾病階段。然而，即使有這些要素，對(duì)所有癌癥個(gè)體的疾病過(guò)程進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)仍然是不可能的。如果可以進(jìn)行更加準(zhǔn)確的預(yù)后，那么就可以為患者選擇合適的治療，以及在某些情況下更緩和的治療。為了根據(jù)癌癥的進(jìn)展將受益于具體療法的個(gè)體分類并將他們與可能更適合其他或另外療法的其他個(gè)體相區(qū)分，本文公開的癌癥衍生的微囊泡miRNA水平的測(cè)量可能是有用的。與診斷相關(guān)的治療有時(shí)也稱為“治療診斷”。由此，在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，提供了用于表征個(gè)體的癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括:提供來(lái)自個(gè)體的生物樣品；從生物樣品分離包含微RNA(miRNA)的癌癥衍生的微囊泡；測(cè)定一種或多種miRNA的含量；以及將一種或多種miRNA的含量與一種或多種miRNA對(duì)照水平相比較。在這種實(shí)施方案中，基于癌癥衍生的微囊泡的一種或多種miRNA的含量與一種或多種miRNA對(duì)照水平相比的可測(cè)量差異，來(lái)表征癌癥。在一些實(shí)施方案中，表征癌癥包括，確定癌癥的類型、等級(jí)和/或階段。[0076]本文使用的“進(jìn)行診斷”或“診斷”進(jìn)一步包括，基于對(duì)癌癥衍生的微囊泡的診斷性miRNA水平的測(cè)量進(jìn)行預(yù)后(這可提供對(duì)(進(jìn)行或未進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的)臨床結(jié)果的預(yù)測(cè))、選擇合適療法(或療法是否有效)或者監(jiān)控現(xiàn)行療法并可能改變療法。涉及治療的診斷測(cè)試，如治療監(jiān)控或進(jìn)行決定可以稱為“治療診斷”。此外，在本發(fā)明公開的主題的一些實(shí)施方案中，可以隨時(shí)間多次測(cè)定一種或多種miRNA的含量以有利于癌癥的診斷(包括預(yù)后)、評(píng)估其療效和/或其進(jìn)展。一種或多種癌癥衍生的微囊泡的miRNA水平(即，生物樣品中的miRNA量)的時(shí)間性變化可以用于預(yù)測(cè)臨床結(jié)果、監(jiān)測(cè)癌癥的進(jìn)展和/或給予的癌癥治療的效果。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，例如，可能會(huì)觀察到生物樣品中特定miRNA的含量在治療的過(guò)程中會(huì)隨時(shí)間減少，從而表明治療的有效性。
[0077]本發(fā)明公開的主題在一些實(shí)施方案中還提供了一種用于治療診斷測(cè)試的方法，如評(píng)估個(gè)體的癌癥的療效和/或進(jìn)展的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括:提供來(lái)自個(gè)體在一段時(shí)間內(nèi)的一系列生物樣品；從該系列生物樣品分離包含miRNA的癌癥衍生的微囊泡；測(cè)定來(lái)自該系列的每個(gè)生物樣品中的一種或多種miRNA的含量；和測(cè)定來(lái)自該系列的每個(gè)生物樣品中的一種或多種miRNA含量的任何可測(cè)量變化，由此評(píng)估個(gè)體的癌癥療效和/或進(jìn)展。在所述時(shí)間段中測(cè)量的miRNA含量的任何變化可以用于預(yù)測(cè)臨床結(jié)果、測(cè)定是否啟動(dòng)或繼續(xù)癌癥的治療以及現(xiàn)行的療法是否能有效地治療所述癌癥。例如，可以在治療啟動(dòng)之前選擇第一時(shí)間點(diǎn)，并且在治療啟動(dòng)后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)選擇第二時(shí)間點(diǎn)?？梢詼y(cè)量取自不同時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)樣品中的miRNA水平，并記錄定性和/或定量差異。來(lái)自所述第一份和第二份樣品的一種或多種測(cè)量的miRNA水平的含量變化可以與個(gè)體疾病的預(yù)后、治療診斷、確定療效和/或進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。
[0078]本文使用的術(shù)語(yǔ)“相關(guān)的(correlated) ”和“相關(guān)聯(lián)(correlating) ”在言及癌癥相關(guān)的診斷性和預(yù)后性miRNA水平的用途時(shí)是指，將個(gè)體的miRNA水平的存在或含量與其在以下的個(gè)體中的存在或含量進(jìn)行比較:已知患有癌癥的個(gè)體，或者已知未患癌癥的個(gè)體，即“正常個(gè)體”或“對(duì)照個(gè)體”。例如，可以將生物樣品中的一種或多種miRNA的水平與已經(jīng)被測(cè)試并測(cè)定與癌癥相關(guān)的每種特定miRNA的miRNA水平進(jìn)行比較。所述樣品的一種或多種miRNA水平被認(rèn)為與診斷相關(guān)；即，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用miRNA水平來(lái)確定個(gè)體是否患有癌癥，并因此應(yīng)答。或者，可以將樣品的miRNA水平與已知與良好結(jié)果(例如，無(wú)癌癥)相關(guān)的對(duì)照miRNA水平(如正常個(gè)體群中存在的平均水平)進(jìn)行比較。
[0079]在某些實(shí)施方案中，診斷性或預(yù)后性miRNA水平僅通過(guò)其存在與否與癌癥相關(guān)聯(lián)。在其他實(shí)施方案中，可以確立診斷性或預(yù)后性miRNA水平的閾值水平，并且可以簡(jiǎn)單地將個(gè)體樣品中的miRNA水平與該閾值水平進(jìn)行比較。
[0080]如所述的，在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行一種或多種診斷性或預(yù)后性miRNA水平的多次測(cè)定，并且所述水平的時(shí)間性變化可以用于確定診斷或預(yù)后。例如，可以在初始時(shí)間測(cè)定特定的miRNA水平，并在第二時(shí)間再次測(cè)定。在這樣的實(shí)施方案中，miRNA水平從初始時(shí)間至第二時(shí)間內(nèi)的增加可以是癌癥的診斷，或是給定的預(yù)后。同樣，miRNA水平從初始時(shí)間至第二時(shí)間內(nèi)的降低可以表示癌癥，或是給定的預(yù)后。再者，可以將一種或多種miRNA水平的變化程度與所述癌癥的嚴(yán)重度和/或疾病進(jìn)展的時(shí)間線和未來(lái)的不良事件相關(guān)聯(lián)。
[0081]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然在某些實(shí)施方案中可以在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行相同的miRNA水平的比較測(cè)量，但也可以在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量給定的miRNA水平并在第二時(shí)間點(diǎn)測(cè)量第二 miRNA水平，并且這些水平的比較可以提供診斷信息。
[0082]本文使用的短語(yǔ)“確定預(yù)后”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)該方法可預(yù)測(cè)個(gè)體的病癥的過(guò)程或結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”可以指基于生物標(biāo)記物的存在、不存在或其水平，以高達(dá)100%的準(zhǔn)確性預(yù)測(cè)病癥的過(guò)程或結(jié)果的能力，或者預(yù)測(cè)給定的過(guò)程或結(jié)果更可能發(fā)生或更不可能發(fā)生的能力。術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”還可以指某一過(guò)程或結(jié)果出現(xiàn)的可能性增加；即，當(dāng)與沒(méi)有呈現(xiàn)病癥的那些個(gè)體相比時(shí)，在呈現(xiàn)給定病癥的個(gè)體中更可能出現(xiàn)該過(guò)程或結(jié)果。例如，在沒(méi)有呈現(xiàn)該病癥(例如，不表達(dá)或者以降低的水平表達(dá)miRNA水平)的個(gè)體中，給定結(jié)果(例如，患有癌癥)出現(xiàn)的可能性可以很低(如〈1%)，或甚至不存在。相反，在呈現(xiàn)該病癥(例如，表達(dá)或以大大高于對(duì)照的水平表達(dá)miRNA水平)的個(gè)體中，給定結(jié)果(例如患一種形式/階段的癌癥)出現(xiàn)的可能性可能較高。在某些實(shí)施方案中，預(yù)后有約5%的可能性、約7%的可能性、約10%的可能性、約12%的可能性、約15%的可能性、約20%的可能性、約25%的可能性、約30%的可能性、約40%的可能性、約50%的可能性、約60%的可能性、約75%的可能性、約90%的可能性或約95%的可能性出現(xiàn)給定的預(yù)期結(jié)果。
[0083]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行預(yù)后指標(biāo)與產(chǎn)生不良結(jié)果的傾向的關(guān)聯(lián)。例如，在一些實(shí)施方案中，高于或低于對(duì)照水平的miRNA水平(例如，樣品中的一種或多種miRNA的含量)可以預(yù)兆個(gè)體比具有低于或等于所述對(duì)照水平的個(gè)體更有可能患上癌癥，這由統(tǒng)計(jì)顯著性水平來(lái)確定。另外，miRNA水平相對(duì)于基線水平的變化可以反映出個(gè)體的預(yù)后，并且標(biāo)記物水平變化的程度可以與不良事件的嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計(jì)顯著性經(jīng)常通過(guò)以下方式來(lái)確定:比較兩個(gè)或多個(gè)群并確定置信區(qū)間和/或P值。例如，見Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New York, 1983,其全文按引用并入本文中。本發(fā)明主題的示例性置信區(qū)間為90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%,99.9%和 99.99%，而示例性 P 值為 0.1,0.05,0.025,0.02,0.01,0.005,0.001 和 0.0001。當(dāng)進(jìn)行多個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試時(shí)，例如，測(cè)定一組miRNA水平的差異表達(dá)，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)針對(duì)多次比較來(lái)矯正P值。
[0084]在其他實(shí)施方案中，可以確立預(yù)后性和診斷性miRNA水平的水平變化閾值度，并且可以簡(jiǎn)單地將生物樣品中的該指標(biāo)的水平變化度與該水平變化閾值度進(jìn)行比較。本發(fā)明公開的主題的miRNA水平的水平變化閾值優(yōu)選為約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約50%、約60%、約75%、約100%和約150%。在其他實(shí)施方案中，可以建立“諾模圖(nomogram)”，通過(guò)該圖可以將預(yù)后性和診斷性指標(biāo)水平與朝向給定結(jié)果相關(guān)的傾向進(jìn)行直接關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉使用這種諾模圖來(lái)關(guān)聯(lián)兩個(gè)數(shù)值，并同時(shí)理解由于所參照的是個(gè)體樣品的測(cè)量值而非群體的平均值，因此該測(cè)量的不確定性與該標(biāo)記物濃度的不確定性相同。
[0085]樣品中miRNA的特征和相對(duì)含量可以提供特定樣品的miRNA譜。樣品的miRNA譜可以包括關(guān)于樣品中所含miRNA的特征、樣品中所含miRNA的定量水平和/或相對(duì)于另一個(gè)樣品的miRNA定量水平的變化的信息。例如，樣品的miRNA譜可以包括關(guān)于與特定癌癥相關(guān)的miRNA的特征、定量水平及/或定量水平變化的信息。
[0086]進(jìn)一步，對(duì)于本發(fā)明公開主題的診斷方法，優(yōu)選的個(gè)體是脊椎動(dòng)物個(gè)體。優(yōu)選的脊椎動(dòng)物是溫血?jiǎng)游?；?yōu)選的溫血脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物最優(yōu)選人。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”包括人個(gè)體和動(dòng)物個(gè)體。因此，本發(fā)明公開的主題提供了獸醫(yī)的治療用途。
[0087]因此，本發(fā)明公開的主題提供了哺乳動(dòng)物的診斷，所述哺乳動(dòng)物例如人以及那些由于瀕臨滅絕而重要的哺乳動(dòng)物，例如東北虎(Siberian tiger);具有重要經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值的哺乳動(dòng)物，如在農(nóng)場(chǎng)中飼養(yǎng)用于人消費(fèi)的動(dòng)物；和/或在社會(huì)關(guān)系上對(duì)人重要的動(dòng)物，如作為寵物或動(dòng)物園中的動(dòng)物。這些動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于:食肉動(dòng)物，如貓和狗；豬類(swine),包括豬(pig)、閹豬(hog)和野豬(wild boar);反芻動(dòng)物和/或有蹄動(dòng)物例如牛(cattle)、公牛(oxen)、綿羊、長(zhǎng)頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝；以及馬。還提供了鳥類的治療，包括那些瀕臨滅絕和/或在動(dòng)物園中的鳥種類，以及家禽類的治療，更特別是家養(yǎng)禽，即家禽，如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞(guinea fowl)等，這是因?yàn)樗鼈儗?duì)人也有著重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。因此，還提供了家畜的治療，所述家畜包括但不限于家豬、反芻動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、馬(包括競(jìng)賽馬)、家禽等。
[0088]如上文所述，本發(fā)明公開的主題提供了個(gè)體的生物流體內(nèi)并且特別是來(lái)自個(gè)體的血清學(xué)樣品(例如，血液)內(nèi)與癌癥相關(guān)的癌癥衍生的微囊泡miRNA的含量測(cè)定。這提供了易于從個(gè)體獲取試驗(yàn)生物樣品的優(yōu)點(diǎn)。然后，可以利用本領(lǐng)域中公知的多種方法中的任一種來(lái)測(cè)定生物樣品中的一種或多種目標(biāo)miRNA的含量,并將該含量與miRNA對(duì)照水平相比較。
[0089]測(cè)定的一種或多種miRNA的“含量”是指所述一種或多種miRNA的定性測(cè)量值(例如，在所測(cè)量樣品中存在或不存在)和/或定量測(cè)量值(例如，存在多少)。“對(duì)照水平”是指未患癌癥個(gè)體中的可比較生物樣品中存在的一種或多種miRNA的含量(包括定性存在或不存在)或含量范圍。作為計(jì)算該對(duì)照水平的非限制性實(shí)例，可以計(jì)算正常生物樣品(例如血液)中存在的一種或多種目標(biāo)miRNA的含量并將其外推至全體個(gè)體。
[0090]用于測(cè)量生物樣品中來(lái)自微囊泡的miRNA水平的示例性方法是微陣列技術(shù)，該技術(shù)是基因表達(dá)研究中應(yīng)用的強(qiáng)大工具。該技術(shù)提供了大量具有已知序列信息的多核苷酸作為探針，以尋找樣品中的互補(bǔ)鏈并與其雜交，從而通過(guò)選擇性結(jié)合捕獲所述互補(bǔ)鏈。圖1和圖3提供的示例方案的流程圖可以用于通過(guò)微陣列分離并測(cè)量微囊泡衍生的miRNA。
[0091]本文使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”是指探針與靶多核苷酸特異性雜交的能力的測(cè)量值。因此，所述探針包括與至少部分的靶多核苷酸序列互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的多核苷酸序列?！盎パa(bǔ)的”核酸序列可以依照標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則進(jìn)行堿基配對(duì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)序列”是指基本互補(bǔ)的核酸序列，這可以通過(guò)與上文列出的相同的核苷酸比較進(jìn)行評(píng)估，或者被定義為在相對(duì)嚴(yán)格的條件(例如本文描述的那些條件)下能夠與論及的核酸區(qū)段雜交。被考慮的互補(bǔ)核酸區(qū)段的具體實(shí)例是反義寡核苷酸。關(guān)于本文公開的對(duì)miRNA具有結(jié)合親和性的探針，所述探針與靶多核苷酸序列可以100%互補(bǔ)。然而，所述探針不必與所述靶多核苷酸在所述靶多核苷酸的全長(zhǎng)上完全互補(bǔ)，只要所述探針可以與所述靶多核苷酸特異性結(jié)合，并將其從所述樣品中捕獲。
[0092]除了堿基組成、互補(bǔ)鏈的長(zhǎng)度和所述雜交核酸之間的核苷酸堿基錯(cuò)配的數(shù)目之外，核酸雜交還將受諸如鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑這些條件的影響，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。嚴(yán)格的溫度條件通常包括超過(guò)30°C的溫度，一般超過(guò)37°C，并優(yōu)選超過(guò)45°C。嚴(yán)格的鹽條件通常低于1，OOOmM, 一般低于500mM，并且優(yōu)選低于200mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個(gè)參數(shù)的測(cè)量值更重要。為了鑒定和/或分離包含高同源性水平的序列，確定合適的雜交條件是本領(lǐng)域中公知的。為了詳細(xì)說(shuō)明高嚴(yán)格性條件的目的，優(yōu)選的條件為約200mM的鹽濃度和約45 °C的溫度。
[0093]數(shù)據(jù)挖掘的工作通過(guò)生物信息學(xué)完成，包括掃描芯片、信號(hào)獲取、圖像處理、標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)計(jì)處理和數(shù)據(jù)比較以及通路分析。由此，微陣列可以以高通量的性能同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)種多核苷酸進(jìn)行作譜。在基礎(chǔ)研究中，mRNA表達(dá)的微陣列作譜分析已經(jīng)成功地為基因表達(dá)研究提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。并且，該技術(shù)還被應(yīng)用于制藥工業(yè)和臨床診斷中。隨著可獲得的miRNA數(shù)據(jù)量的增加并且隨著miRNA在基因調(diào)控中的重要性的證據(jù)的積累，微陣列已經(jīng)成為用于高通量miRNA研究中有用的技術(shù)。
[0094]與癌癥有關(guān)的miRNA的分析可以在一個(gè)測(cè)試樣品內(nèi)使用多個(gè)多核苷酸探針單獨(dú)進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。例如，可以將數(shù)種探針結(jié)合到一個(gè)測(cè)試中，用于多個(gè)樣品的有效處理，并且有可能用于提供更高的診斷和/或預(yù)后準(zhǔn)確性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到對(duì)來(lái)自同一個(gè)體的多個(gè)樣品(例如在連續(xù)的時(shí)間點(diǎn))進(jìn)行測(cè)試的價(jià)值。這種系列樣品的測(cè)試使得可以鑒定miRNA水平隨著時(shí)間的變化。miRNA水平的升高或降低以及不存在水平變化可以提供關(guān)于疾病狀態(tài)的有用信息。
[0095]在一些實(shí)施方案中，可以構(gòu)建由選擇性結(jié)合與一種或多種癌癥相關(guān)的癌癥衍生的微囊泡miRNA的多核苷酸探針組成的組，以提供與癌癥診斷或預(yù)后以及患有癌癥個(gè)體的管理有關(guān)的相關(guān)信息 。例如，可以使用 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500或1000個(gè)單獨(dú)的多核苷酸探針構(gòu)建這樣的組。在一些實(shí)施方案中，組包括1000個(gè)以上單獨(dú)的多核苷酸探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)構(gòu)成較大探針組的單個(gè)探針或探針子集進(jìn)行分析，以在多種臨床環(huán)境下優(yōu)化臨床敏感性或特異性。這些包括但不限于門診(ambulatory)、緊急護(hù)理、危重癥護(hù)理、重癥監(jiān)護(hù)、監(jiān)測(cè)室、住院個(gè)體、門診個(gè)體、醫(yī)生辦公室、醫(yī)療診所和健康篩查中心(screening settings)。再者,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用構(gòu)成較大探針組的單個(gè)探針或探針子集，并結(jié)合對(duì)每一前述的環(huán)境下的診斷閾值的調(diào)整，以優(yōu)化臨床敏感性和特異性。將試驗(yàn)的臨床敏感性定義為該試驗(yàn)正確預(yù)測(cè)的患所述疾病的個(gè)體的百分?jǐn)?shù)，而試驗(yàn)的特異性定義為該試驗(yàn)正確預(yù)測(cè)的無(wú)所述疾病的個(gè)體的百分?jǐn)?shù)。
[0096]在一些實(shí)施方案中,測(cè)定所述一種或多種miRNA的含量包括標(biāo)記所述一種或多種miRNA。然后，用各自選擇性結(jié)合一種或多種miRNA的一種或多種多核苷酸探針來(lái)捕獲標(biāo)記的 miRNA。
[0097]本文使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“標(biāo)記的”是指能夠通過(guò)光譜學(xué)方法、放射方法或其他方法檢測(cè)的部分與探針?lè)肿拥倪B接。因此，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”是指可探測(cè)標(biāo)記物任選共價(jià)地或非共價(jià)地結(jié)合或連接于分子(如多核苷酸)之中或之上。多種標(biāo)記多肽的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以被使用。用于多核苷酸的標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于以下:放射性同位素、熒光標(biāo)記、重原子、酶標(biāo)記或報(bào)告基因、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)、被第二報(bào)告物識(shí)別的預(yù)設(shè)的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合域、表位標(biāo)簽等)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記通過(guò)不同長(zhǎng)度的間隔臂(spacer arm)連接，以降低潛在的位阻。
[0098]使用多核苷酸探針?lè)治鰉iRNA水平也可以以多種物理形式進(jìn)行。例如，微量滴定板或自動(dòng)控制的使用可有助于大量測(cè)試樣品的處理?；蛘撸梢蚤_發(fā)單樣品形式，以有利于及時(shí)地進(jìn)行即刻治療和診斷。
[0099]在一些實(shí)施方案中，多種多核苷酸探針各自結(jié)合于基底。在一些實(shí)施方案中，所述基底包括多個(gè)地址。每個(gè)地址可以與所述陣列的至少一種多核苷酸探針相關(guān)聯(lián)。如果一個(gè)陣列具有不同部分的多個(gè)區(qū)域(如不同的多核苷酸序列)，使得位于所述陣列上一個(gè)特定的預(yù)設(shè)位置(即一個(gè)“地址”)的一個(gè)區(qū)域(即所述陣列的一個(gè)“要素”或“點(diǎn)”)可以檢測(cè)一種特定的靶或一類靶(雖然一個(gè)要素可能偶然地檢測(cè)非該要素的靶)，那么該陣列是“可尋址的”。陣列要素通常但不必須由插入空間(intervening spaces)分隔。對(duì)于陣列而言，所述“靶”miRNA可以被看作流動(dòng)相(一般是流體)中待被結(jié)合于所述基底不同區(qū)域的探針(“靶向探針”)檢測(cè)的部分。
[0100]可以通過(guò)將之前已經(jīng)獲得的生物聚合物(例如來(lái)自合成源或天然源)沉積于基底之上或者通過(guò)原位合成方法，來(lái)制造生物聚合物陣列(如多核苷酸微陣列)。沉積獲得的生物聚合物的方法包括但不限于:將針或毛細(xì)管加載，然后使其接觸表面，如美國(guó)專利5，807，522中所述的；通過(guò)從脈沖噴射口(如噴墨射頭)噴發(fā)進(jìn)行沉積，如PCT公開W095/25116和W098/41531中以及別處所述的。原位制造方法包括美國(guó)專利5，449，754中描述的用于合成肽陣列的那些方法，以及美國(guó)專利6，180，351和W098/41531和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的用于多核苷酸的那些方法，并且還可以將脈沖噴射用于沉積試劑。通過(guò)沉積之前已經(jīng)獲得的生物聚合物或者通過(guò)原位方法制造生物聚合物陣列的詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)一步公開于美國(guó)專利6，242，266,6, 232，072,6, 180，351和6，171，797中。在通過(guò)沉積之前獲得的生物聚合物或者通過(guò)原位方法制造陣列中，在其上將要形成或已經(jīng)形成陣列的基底表面上的每個(gè)區(qū)域(“陣列區(qū)域”)通常完全暴露于一種或多種試劑中。例如，在兩種方法之一中，所述陣列區(qū)經(jīng)常暴露于一種或多種試劑，以在所述表面形成一層合適的層，該層可以同時(shí)結(jié)合所述基底和生物聚合物或生物單體。在原位制造中，所述陣列區(qū)域還通常暴露于氧化劑、去封閉劑及任選的加帽劑中。同樣，特別是在通過(guò)沉積之前獲得的生物聚合物進(jìn)行制造中，可能需要將所述陣列區(qū)域暴露于合適的封閉劑，以阻斷所述表面上的無(wú)要素的位置與靶的非特異性結(jié)合。
[0101]可選地或除微陣列分析之外，測(cè)定癌癥衍生的微囊泡miRNA的含量可以包括使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，例如在本發(fā)明實(shí)施例中詳細(xì)公開的。實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)可以提供準(zhǔn)確且快速的有關(guān)樣品中miRNA的存在和含量的數(shù)據(jù)。圖2提供了可以用于通過(guò)RT-PCR分離并測(cè)定微囊泡衍生的miRNA的示例性方案的流程圖。示例性方法的其他詳細(xì)內(nèi)容在本發(fā)明的實(shí)施例中列出。
[0102]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括提供來(lái)自個(gè)體的生物樣品并且從所述生物樣品分離包含微-RNA (miRNA)的微囊泡。所述生物樣品可以是體液,如本文中所述的,例如血漿或血清。然后測(cè)定一種或多種miRNA的含量并將該含量與一種或多種miRNA對(duì)照水平相比較。然后如果來(lái)自微囊泡的一種或多種miRNA的含量與一種或多種miRNA對(duì)照水平相比存在可測(cè)量的差異，則可以診斷個(gè)體患有頭頸癌或處于頭頸癌風(fēng)險(xiǎn)中。所述一種或多種miRNA的水平還可以用于提供預(yù)后或治療診斷，如用于將個(gè)體歸類為對(duì)治療很可能是應(yīng)答者或無(wú)應(yīng)答者，或用于監(jiān)控隨著時(shí)間的療效。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法可以包括預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療的應(yīng)答，或預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療無(wú)應(yīng)答。所述對(duì)照水平可以是未患有頭頸癌或未處于頭頸癌風(fēng)險(xiǎn)中的對(duì)照樣品中的一種或多種miRNA水平，例如，對(duì)照樣品可以來(lái)自健康個(gè)體。當(dāng)監(jiān)控隨著時(shí)間的一種或多種miRNA水平時(shí)，對(duì)照還可以是不同時(shí)間點(diǎn)的一種或多種miRNA的水平。例如,個(gè)體中的一種或多種miRNA的水平隨著時(shí)間的降低可以表示對(duì)治療的應(yīng)答。[0103]所評(píng)估的一種或多種miRNA可以包括但不限于:let_7a、miR_133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR_15a、miR_18b、miR-378、let_7b、miR-205、miR_181a、miR_130a、miR-199a_3p、miR-140_5p、miR_20a、miR-146b_5p、miR-132、miR_193b、miR-183、miR-34c_5p、miR_30c、miR_148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR_135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR-18Id、miR_301a、miR_200c，miR-100, miR-10b，miR-155、miR-1、miR-363、miR-150、let_71、miR_27b、miR-7、miR-127_5p、miR_29a，miR-191，let_7d，miR-9，let_7f、miR-10a、miR-181b、miR-15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR-34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR-19a、miR-193a-5p、miR-18a、miR-125b、miR-126、miR-27a、miR-372、miR-149、miR_23b、miR-203、miR-32和miR_181c中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的 miRNA 包括 miR-16、miR_181c、miR-25、miR_15b、miR-150、miR_148b、miR_92a、miR-222、miR-96、miR-125a_5p、miR-335 和 miR-122 中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的 miRNA 包括 let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a，miR125a_5p、miR142_5p、miR96、miR222、miR148b、miR92a、miR214、miR130a、miR29a、miR212、miR124、miR21、miR200c、miR100、miR155、miR181b 和 miR210 中的一種或多種。
[0104]本發(fā)明公開的主題包括本文中所述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的試劑用于實(shí)施本文中公開的和權(quán)利要求中描述的方法的用途。本發(fā)明公開的主題還包括試劑盒，所述試劑盒包括本文中描述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的試劑，所述試劑用于實(shí)施本文中公開的和權(quán)利要求中描述的方法。
[0105]本發(fā)明公開的主題還包括系統(tǒng)和試劑盒，其可以用于實(shí)施本文中所述方法的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，提供了試劑盒，其可以用于測(cè)定一種或多種微RNA的存在或含量，其包括用于測(cè)定樣品中的一種或多種微RNA的每一種的存在或含量的探針。在一些實(shí)施方案中，所述探針是多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，引物對(duì)用于測(cè)定一種或多種微RNA的含量。在一些實(shí)施方案中，在基底上提供探針。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括用于至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、90、81、82、83、84或85種miRNA中的每一種的探針。
[0106]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開主題的試劑盒進(jìn)一步包括參照標(biāo)準(zhǔn)樣品，以獲得一種或多種微RNA的存在或含量，其用作樣品(例如，來(lái)自個(gè)體的樣品)可以與其比較的對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括一種或多種微RNA的存在或水平的對(duì)照數(shù)據(jù)，其用作樣品(例如，來(lái)自個(gè)體的樣品)可以與其比較的對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)臨床病理學(xué)特征的參照數(shù)據(jù)，以用于表征目標(biāo)癌癥。
[0107]在一些實(shí) 施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)可以選自:針對(duì)頭頸癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)肺癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)肺腺癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)肺鱗狀上皮細(xì)胞癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)非癌的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；針對(duì)應(yīng)答者的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)；和針對(duì)無(wú)應(yīng)答者的標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)。
[0108]除非另外指出，否則本發(fā)明公開主題的實(shí)施可以使用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual (實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(1989), 2nd Ed., ed.by Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring HarborLaboratory Press,Chaptersl6andl7;U.S.Pat.N0.4, 683, 195;DNA Cloning(DNA 克隆)，Volumes I and II, Glover, ed., 1985; Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，M.J.Gait, ed.，1984; Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)，D.Hames&S.J.Higgins, eds., 1984; Transcription and Translation (轉(zhuǎn)錄和番羽譯),B.D.Hames&S.J.Higgins, eds., 1984; Culture Of Animal Cells (動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng))，R.1.Freshney, AlanR.Liss, Inc., 1987;Immobilized Cells And Enzymes (固定化細(xì)胞和酶)，IRLPress, 1986;Perbal(1984), A Practical Guide To MolecularCloning (分子克隆的實(shí)用手冊(cè))；See Methods In Enzymology (參見酶學(xué)方法)(Academic Press, Inc., N.Y.) ;Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體)，J.H.Miller and Μ.P.Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1987;MethodsIn Enzymology (酶學(xué)方法)，Vols.154andl55, Wu et al., eds., Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (細(xì)胞中的免疫化學(xué)和分子生物學(xué))(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987;HandbookOf Experimental Immunology (免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Volumes 1-1V, D.M.Weir andC.C.Blackwell, eds.，1986。
[0109]在該文獻(xiàn)中列出了本發(fā)明公開主題的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容。在研究該文獻(xiàn)中提供的信息后，該文獻(xiàn)中描述的實(shí)施方案或其他實(shí)施方案的改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。該文獻(xiàn)中提供的信息，并且特別是所述示例性實(shí)施方案的特定詳細(xì)內(nèi)容，主要是為了清楚地理解而提供的，并且對(duì)其理解沒(méi)有不必要限制。在抵觸的情況中，將對(duì)該文獻(xiàn)的說(shuō)明書包括定義進(jìn)行約束。
[0110]在某些情況中，參照miRBase Registry規(guī)定的名稱(可在www.mirbase.0rg獲得)來(lái)鑒定本文中公開的微RNA(miRNA)。關(guān)于miRBase Registry中列出的已鑒定的miRNA的序列和其他信息通過(guò)引用明確并入本文，miRBase Registry或其他公共數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的等同的和相關(guān)的miRNA也是如此。還通過(guò)引用明確并入本文中的是miRBase Registry中存在的與本文中公開的miRNA相關(guān)的所有注釋。除非另外指出或顯而易見，對(duì)miRBaseRegistry的參照是按照本申請(qǐng)的提交日最新版本的數(shù)據(jù)庫(kù)的參照(即，mirBasel9, 2012年8月I日發(fā)布)。
[0111]盡管認(rèn)為本文中使用的術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠充分理解的，但列出了定義以幫助解釋本發(fā)明公開的主題。
[0112]除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明公開主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管在本發(fā)明公開主題的實(shí)施或試驗(yàn)中可以使用與本文中所述那些的相似或等同的任何方法、器件和材料，但現(xiàn)在將描述代表性的方法、器件備和材料。
[0113]遵循長(zhǎng)期存在的專利法慣例，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a) ”、“一個(gè)(an) ”和“該(the) ”在本申請(qǐng)(包括權(quán)利要求)中，指的是“一個(gè)或多個(gè)”。因此，例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)這樣的細(xì)胞，諸如此類。
[0114]除非另外指出，在說(shuō)明書和權(quán)利要求中使用的所有表示成分含量、特性(如，反應(yīng)條件)等的數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況中由術(shù)語(yǔ)“約”來(lái)修飾。因此，除非表明與此相反，否則本說(shuō)明書和權(quán)利要求中列出的數(shù)字參數(shù)是可以根據(jù)本發(fā)明公開主題設(shè)法獲得的所需特性而改變的近似值。
[0115]如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)“約”，當(dāng)涉及質(zhì)量、重量、時(shí)間、體積、濃度或百分比的值或量時(shí)，其表不包括從具體含量的變化，在一些實(shí)施方案中所述變化為±20%,在一些實(shí)施方案中為±10%,在一些實(shí)施方案中為±5%,在一些實(shí)施方案中為±1%,在一些實(shí)施方案中為±0.5%,并且在一些實(shí)施方案中為±0.1%,只要這樣的變化適于進(jìn)行公開的方法。
[0116]如本文中所用的，范圍可以表示為從“約” 一個(gè)特定值和/或至“約”另一個(gè)特定值。還理解存在多個(gè)本文中公開的值，并且每個(gè)值除了值本身，在本文中也公開為“約”該特定值。例如，如果公開了值“10”，則也公開了“約10”。還理解還公開了兩個(gè)特定單位之間的每個(gè)單位。例如,如果公開了 10和15，則還公開了 11、12、13和14。
實(shí)施例 [0117]已經(jīng)包括以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明公開主題的方式。根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容和本領(lǐng)域技術(shù)的一般水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到以下實(shí)施例只是示例性的，并且在不背離本發(fā)明公開主題的范圍內(nèi)可以使用各種改變、變化和替換。以下實(shí)施例可以包括在涉及本發(fā)明的研發(fā)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的不同時(shí)間采集的代表性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)匯編。
[0118]本發(fā)明公開的主題公開了可以從生物流體中的微囊泡發(fā)現(xiàn)并分離miRNA。分離的miRNA可以用作疾病(如癌癥)的診斷工具。本發(fā)明的實(shí)施例提供了這些應(yīng)用的依據(jù)。
[0119]實(shí)施例1:材料和方法
[0120]使用以下技術(shù)來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的方法
[0121]循環(huán)囊泡的分離
[0122]可以使用本領(lǐng)域已知的和/或本文中公開的方法來(lái)分離生物樣品如血清中的微囊泡，所述方法包括離心、PEG-沉淀或?qū)游龇蛛x。參見，例如美國(guó)專利公開US2010/0151480中描述的分離方法，其于2000年6月17日公開且發(fā)明名稱為“Exosome-associated MicroRNAas a Diagnostic Marker (用作診斷標(biāo)記物的外來(lái)體相關(guān)的微RNA) ” ；和Taylor etal., uChapter 15:Exosome Isolation for Proteomic Analyses and RNA Profiling(用于蛋白質(zhì)生物學(xué)分析和RNA作譜的外來(lái)體分離)，” in Richard J.Simpson and Davidff.Greening (eds.), Serum/Plasma Proteomics:Methodsand Protocols, Methods inMolecular Biology, vol.728, pp235-246, ? Springer Science+Business Media, LLC2011中所述的分離方法，將這些出版物通過(guò)引用全部并入本文中。
[0123]為了通過(guò)超離心分離微囊泡，將生物流體(2ml)在12，OOOXg下離心15分鐘。將該上清液在4°C 100，OOOXg下離心I小時(shí)。將含有囊泡的沉淀物(pellet)重懸浮于PBS中，然后在4°C下重新離心I小時(shí)。使用Trizol提取工藝來(lái)提取囊泡沉淀物，用于RNA和蛋白質(zhì)分析。
[0124]為了通過(guò)尺寸排阻層析來(lái)分離微囊泡，將2ml等份生物流體施加于瓊脂糖2B柱上(2.5 X 16cm)，用PBS洗脫，并收集2ml級(jí)分，在280nm下監(jiān)控洗脫。將含有囊泡的空隙容積級(jí)分合并(pooled)并且在100，OOOXg下離心Ih(小時(shí))。使用Trizol提取工藝來(lái)提取囊泡沉淀物，用于RNA和蛋白質(zhì)分析。可以使用層析系統(tǒng)，如Bio-Rad生物學(xué)層析系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)。
[0125]為了通過(guò)PEG沉淀分離囊泡，將生物流體(2ml)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，并且加入
0.5ml ExoQuick 沉淀溶液(System Biosciences (SBI)，MountainView, CA)并混合。將混合物在4°C下孵育過(guò)夜，然后將混合物在微量離心機(jī)(microfuge)中在12，OOOrpm下離心5分鐘。吸出上清液，并且使用Trizol提取工藝提取微囊泡沉淀，用于RNA和蛋白質(zhì)分析。
[0126]使用針對(duì)與癌癥相關(guān)的微囊泡表面蛋白的抗體，如抗-上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)，通過(guò)改進(jìn)的磁激活細(xì)胞分選(MACS)工藝來(lái)特異性地分離腫瘤衍生的微囊泡。其他微囊泡標(biāo)記物是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于捕獲微囊泡，例如四跨膜蛋白(tetraspanins),如⑶9和/或⑶63。用針對(duì)偶聯(lián)磁微珠(50 μ I)的微囊泡表面蛋白的抗體培養(yǎng)來(lái)自正常對(duì)照、患有良性疾病的患者和患有癌癥的患者的血清樣品(2.5ml)。將這些混合，并且在4°C下孵育2小時(shí)(hr)。將LD微量柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，并且用500 μ I Tris-緩沖鹽水(TBS)沖洗柱。將磁性免疫復(fù)合物施加至柱上，并且丟棄穿過(guò)的未結(jié)合(未標(biāo)記)材料。用500μ1 TBS將柱洗滌四次。通過(guò)從分離器中取出柱并將其放入收集管中來(lái)收集特異性選擇的微囊泡。將TBS(Iml)加入柱中，并且通過(guò)應(yīng)用柱配備的活塞來(lái)獲得磁標(biāo)記的微囊泡。將分離的微囊泡/微珠在IgG洗脫緩沖液(Pierce ChemicalCo, Rockford, II1.)中稀釋，并且將復(fù)合物在10，OOOrpm下離心，以分離微珠和微囊泡(上清液)。然后將上清液在4°C下在100，OOOg下離心I小時(shí)。將沉淀的微囊泡重懸浮于250 μ I磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，然后測(cè)試這些腫瘤衍生的微囊泡的總蛋白。使用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò) Bradford微試驗(yàn)方法(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量?？梢栽谌缟纤鲆呀?jīng)非特異性地從生物樣品中分離出囊泡后，使用該方法來(lái)分離微囊泡。
[0127]透射電子顯微鏡法
[0128]對(duì)于透射電子顯微鏡法，將沉淀的微囊泡固定在PBS中的2.5%(w/v)戊二醛中，脫水并且包埋在環(huán)氧樹脂(Epon)中。切出超薄切片(65nm)，并且用乙酸鈾酰和雷諾氏(Reynold’ s)檸檬酸鉛染色。用Jeoll210透射電子顯微鏡檢查切片。
[0129]miRNA的分離和作譜
[0130]根據(jù)制造商的說(shuō)明(Ambion, Austin, Tex.),使用mirVana miRNA分離試劑盒，從腫瘤細(xì)胞和微囊泡分離總RNA。使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies, Foster City, Calif.)分析 miRNA 級(jí)分的 RNA 質(zhì)量、產(chǎn)量和大小。使用mirVana miRNA陣列標(biāo)記試劑盒(Ambion)和后標(biāo)記活性染料(Post LabelingReactive Dye)試劑盒(Amersham Bioscience, Pittsburgh, Pa.),用 Cy3 將分離的miRNA3’端標(biāo)記。使用含有用于467種人成熟miRNA的探針的微陣列,通過(guò)Ocean RidgeBiosciences (Jupiter, Fla.),將微RNA作譜,一式兩份。該分析使用定制研發(fā)的miRNA陣列，其包括mirBASE V9.0中存在的467種miRNA，由35-44_mer寡核苷酸組成，由Invitrogen制造，并且重復(fù)兩份點(diǎn)樣。雜交后，使用GenePix4000A陣列掃描儀(AxonInstruments, Union City, Calif.)掃描 miRNA 陣列，并且使用 GeneSpring7.0 軟件(Silicon Genetics, Redwood City, Calif.)將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行分析。通過(guò)表達(dá)相對(duì)于加入每個(gè)樣品中的對(duì)照miRNA (Ambion)的每種miRNA復(fù)制品,來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,使得允許陣列之間進(jìn)行比較?；趤?lái)自陰性對(duì)照探針的雜交信號(hào)，計(jì)算陰性對(duì)照(TPT95)的閾值和第95個(gè)百分點(diǎn)，所述陰性對(duì)照探針包括:38個(gè)錯(cuò)配和改組(shuffled)對(duì)照探針以及87個(gè)非保守秀麗線蟲(C.elegans)探針。為了限定靈敏度，將NCode合成miRNA在1/500，000質(zhì)量比下添加至標(biāo)記反應(yīng)中，并且檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于特異性，使用了針對(duì)miR-93、miR-27a和miR-152的完全匹配探針以及針對(duì)每一種的2個(gè)錯(cuò)配。通常，2個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配探針證明了所有陣列上低于或處于TPT95的信號(hào)。
[0131]或者,根據(jù)制造商的說(shuō)明(Invitrogen),使用Trizol從微囊泡分離總RNA。使用GeneQuant II (Pharmacia)評(píng)估了 RNA質(zhì)量和產(chǎn)量。使用 Agilent2100 生物分析儀(AgilentTechnologies, Foster City, CA)分析小 RNA 的分布。
[0132]通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)免疫印跡分析微囊泡蛋白質(zhì)
[0133]按照制造商所述的，使用以上的Trizol分離工藝進(jìn)行微囊泡蛋白質(zhì)分離。使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)Bradford微陣列方法(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過(guò)Laemmli (1970)的方法進(jìn)行SDS-PAGE,并且使用Imperial Purple (PierceChemical)通過(guò)蛋白質(zhì)染色使分離的蛋白質(zhì)顯現(xiàn)。進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)分析特定蛋白質(zhì)的存在，例如微囊泡標(biāo)記物，如四跨膜蛋白CD63和EpCAM。將來(lái)自每個(gè)微囊泡分離物的蛋白質(zhì)(40 μ g)施加于4-20%SDS-PAGE凝膠的每個(gè)泳道。通過(guò)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，并且通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡分析，使用初級(jí)抗體在4°C下探測(cè)過(guò)夜。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL, Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL)來(lái)使結(jié)合的免疫復(fù)合物顯現(xiàn)，并且通過(guò)密度測(cè)定法(Un-Scan-1t Software, Silk Scientific Corp., Orem, UT)進(jìn)行定量。
[0134]一般統(tǒng)計(jì)學(xué)考慮
[0135]使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SAS9.1 (SAS Institute, Cary, N.C.)分析數(shù)據(jù)。將每組個(gè)體的循環(huán)微囊泡的水平限定為來(lái)自至少兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行三次的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)單向ANOVA進(jìn)行組之間的比較，接著進(jìn)行比較每個(gè)群體的圖基試驗(yàn)后的多重比較(Tukeyj s multiple comparisons post-test)。使用 2_ Δ Δ Ct 方法(Applied BiosystemsUser Bulletin N0.2)計(jì)算miRNA表達(dá)的相對(duì)量，并且以靶miRNA的1glO相對(duì)量(RQ)來(lái)分析數(shù)據(jù)，將其相對(duì)于加入每種樣品中的對(duì)照miRNA標(biāo)準(zhǔn)化，從而允許陣列之間進(jìn)行比較。計(jì)算每個(gè)子集的miRNA分布和相關(guān)系數(shù)以及置信區(qū)間。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為P ( 0.05。
[0136]實(shí)施例2:鱗狀上皮細(xì)胞癌和腺癌中的微囊泡-miRNA譜
[0137]預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)癌癥治療的應(yīng)答仍然是挑戰(zhàn)，并且相同癌癥期的不同臨床過(guò)程仍然是不清楚的。需要更好的限定癌癥的方法。在這個(gè)實(shí)施例中，已報(bào)道了血源性miRNA用于鑒定頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌(HNSCC)、肺SCC、肺腺瘤，并用于預(yù)測(cè)結(jié)果。
[0138]依據(jù)IRB批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案，在治療開始時(shí)，從診斷為HNSCC (n=32)的患者獲得肝素化血樣，并且在臨床追蹤過(guò)程中還獲得連續(xù)樣品。還從正常(即，非癌)患者以及診斷為肺SCC和肺腺癌的患者獲得樣品。將血樣在400Xg下離心10分鐘以除去細(xì)胞。然后將血衆(zhòng)在15，OOOxg下離心20分鐘，以除去細(xì)胞碎片。通過(guò)層析,接著通過(guò)ExoQuick?(SystemBiosciences, Mountain View, CA)沉淀,分離循環(huán)微囊泡。通過(guò)改進(jìn)的Trizol方案提取總RNA,并且使用小 RNA 分離試劑盒(SABiosciences, a Qiagen company, Frederick, MD)分離小 RNA。
[0139]使用癌癥特異性qRT-PCR 陣列(SABiosciences)與 Agilent M3002P(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA),來(lái)定量小RNA內(nèi)的八十八種特異性miRNA。通過(guò)使用TaqMan微RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems, life technologies, Carlsbad,CA),由15 μ I反應(yīng)體積中的5.5ng總RNA合成單鏈cDNA。首先將反應(yīng)在16°C下孵育30min (分鐘)，然后在42°C下孵育30min。通過(guò)在85°C下孵育5min來(lái)使反應(yīng)失活。通過(guò)使用來(lái)自TaqMan微RNA試驗(yàn)人面板的序列特異性引物，在Alilent M3005P上擴(kuò)增所合成的每個(gè)cDNA。20 μ IPCR混合物包括10 μ 12 X常規(guī)的PCR預(yù)混液，2 μ I每種10 X TaqMan微RNA試驗(yàn)混合物和
1.5μ1逆轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)物。將反應(yīng)在95°C下孵育IOmin (分鐘)，接著進(jìn)行95 °C下15s(秒)和60°C下Imin的40個(gè)循環(huán)。將閾值循環(huán)(CT)定義為熒光經(jīng)過(guò)固定閾值(0.2)時(shí)的分段(fractional)循環(huán)數(shù)。將所有CT ^ 37.9的信號(hào)人工設(shè)定為未測(cè)定。通過(guò)使用針對(duì)每個(gè)制劑的參照(外源性對(duì)照)，通過(guò)Λ CT研究，來(lái)估算靶miRNA的相對(duì)含量(RQ)。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行兩次，并且每個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)非模板對(duì)照孔。為了比較，通過(guò)與使用正常人AB血清獲得的那些比較來(lái)限定倍數(shù)變化。
[0140]對(duì)于miRNA水平，標(biāo)準(zhǔn)化用于準(zhǔn)確定量，并且已經(jīng)檢查了幾種方法來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)。使用 2-ΔΔα 方法(Applied Biosystems User Bulletin N。2)計(jì)算 miRNA 表達(dá)的相對(duì)含量，并且將數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于miR-92標(biāo)準(zhǔn)化的祀miRNA的1glO的相對(duì)含量(RQ)。第二種標(biāo)準(zhǔn)化方法顯示了以標(biāo)準(zhǔn)化至sn/snoRNA并且相對(duì)于對(duì)照樣品的靶miRNA的1glO的相對(duì)含量(RQ)的數(shù)據(jù)。最后，與微陣列數(shù)據(jù)相似，將原始數(shù)據(jù)CT標(biāo)準(zhǔn)化，并且使用 BRB ArrayTools 版本 3.3.2 來(lái)分析(BRB-ArrayTools 由 Dr.Richard Simon 和BRB-ArrayTools 研發(fā)團(tuán)隊(duì)研發(fā)，并且從 National Cancer Institute 在 linus.nc1.nih.gov/BRB-ArrayTools.html可獲得)。通用中值標(biāo)準(zhǔn)化后，將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于對(duì)照樣品的靶miRNA的1glO的相對(duì)含量(RQ)。進(jìn)行分類比較和微陣列的顯著性分析(SAM)來(lái)鑒定差異表達(dá)的 miRNA。使用 GENESIS 軟件(Sturn et al., Geneis: cluster analysis ofmicroarray data, Bioinformatics, 18:207-208),使用平均連接和 Euclidean 距離作為相似性測(cè)量，用不同標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果的觀察。
[0141]分析了八十四種 miR,包括 let-7a、miR_133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR-15a、miR-18b、miR-378、let-7b、miR-205、miR-181a、miR-130a、miR-199a-3p、miR-140_5p、miR_20a、miR-146b_5p、miR-132、miR_193b、miR-183、miR-34c_5p、miR_30c、miR_148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR-135b、miR_206、miR-124、miR-21、miR_181d、miR-301a、miR-200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-Ι、miR-363、miR-150、let_71、miR_27b、miR_7、miR-127_5p、miR_29a、miR-191、let_7d、miR_9、let_7f、miR-10a、miR_181b、miR_15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR-34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR_19a、miR-193a_5p、miR_18a、miR_125b、miR-126、miR_27a、miR-372、miR-149、miR-23b、miR-203、miR-32 和 miR_181c。在 HNSCC 患者樣品中觀察了 12 種 miR 的表達(dá)，包括 miR-16, miR-181c, miR-25, miR_15b、miR-150、miR_148b、miR_92a、miR-222、miR-96、miR-125a-5p、miR-335和miR-122?？梢詫iRNA表達(dá)與肺SCC和肺腺癌中表達(dá)的那些相比較。參見圖4A-C。圖4D包括對(duì)照數(shù)據(jù)。
[0142]三十名頭頸癌患者參與了研究?？紤]了十五名用于分析，因?yàn)樵谥委熀笫占酥辽僖粋€(gè)追蹤樣品。患有HNSCC的患者呈現(xiàn)出循環(huán)微囊泡內(nèi)與正常對(duì)照和患有肺鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCC)的患者截然不 同的miRNA譜。分析的84種miRNA和檢測(cè)的12種中，miR148b和miR222顯示出在HNSCC中唯一地表達(dá)，而miR16在HSCC和肺SCC患者的微囊泡中都有存在。在應(yīng)答最初治療的患者中，抑制了大部分微囊泡-miRNA的水平；然而，在未能應(yīng)答的患者中，觀察到微囊泡-miRNA沒(méi)有降低。參見圖5A-B。
[0143]參照?qǐng)D6A-K，在治療前和治療后，獲得了頭頸癌患者的miRNA譜。還獲得了對(duì)照患者(非-癌)的譜。在外科手術(shù)當(dāng)天但在外科手術(shù)前獲得了治療前樣品(“組1”)，并且在外科手術(shù)后3個(gè)月時(shí)獲得了治療后樣品(“組2”)。在外科手術(shù)后進(jìn)行治療，并且治療包括化療或化療和放療的組合。將患者鑒定為“應(yīng)答者”或“無(wú)應(yīng)答者”。認(rèn)為是應(yīng)答者的患者在最初外科手術(shù)后18個(gè)月時(shí)沒(méi)有疾病跡象，而無(wú)應(yīng)答者在最初外科手術(shù)的18個(gè)月內(nèi)診斷為疾病復(fù)發(fā)。應(yīng)答者呈現(xiàn)出循環(huán)微囊泡內(nèi)與無(wú)應(yīng)答者截然不同的miRNA譜，而應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者都呈現(xiàn)出循環(huán)微囊泡內(nèi)與正常對(duì)照截然不同的miRNA譜。
[0144]血源性微囊泡內(nèi)的miRNA譜在癌癥的鑒定中具有效用，所述癌癥包括HNSCC、肺SCC和肺腺癌。除了在診斷中的作用以外，微囊泡-miRNA譜可以用于疾病監(jiān)控。
[0145]在整個(gè)文件中，提及了各種參考文獻(xiàn)。所有這些參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文中，包括以下列表中所列的參考文獻(xiàn):
[0146]參考文獻(xiàn)[0147]1.Andre Fj Schartz N Ej Movassagh M，et al.Malignant effusions andtumour-derived exosomes (惡性滲出物和腫瘤衍生的外來(lái)體).Lancet2002; 360:295-305.[0148]2.Bard M P，Hegmans J P, Hemmes A，et al.Proteomic analysis of exosomesisolated from human malignant pleural effusions (從人惡性胸膜滲出物分離的外來(lái)體的蛋白質(zhì)組分析).Am J Respir Cell Mol Biol2004; 31:114-21.[0149]3.Bartel D P.MicroRNAs:Genomics, biogenesis, mechanism, and function (染色體組學(xué)，生源論，機(jī)制和功能).Cell2004; 116:281-97.[0150]4.Berek J S，Schultes B C，Nicodemus C F.Biologic and immunologictherapies for ovarian cancer (用于卵巢癌的生物學(xué)和免疫療法).J Clin0ncol2003;21 (slO):168-74.[0151]5.Calin G A,Croce C M.MicroRNA-cancer connection:the beginning of a newtale (微 RNA-癌關(guān)聯(lián):新故事的開始).Cancer Res2006a; 66:7390-94.[0152]6.Calin G A, Croce C M.MicroRNA signatures in human cancers (人癌癥中的微 RNA 印記).Nature Rev Cancer2006b; 6:857-66.[0153]7.Choi D S，Lee J Mj Park G W 等，Proteomic analysis of microvesiclesderived from human colorectal cancer cells (源自人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的微囊泡的蛋白質(zhì)組分析).J Proteome Res2007;6:4646-55.[0154]8.De Cecco L，Marchionni L，Gariboldi Mj Reid J F，Lagonigro M S，Caramuta Setal.Gene expression profiling of advanced ovarian cancer:Characteristizationof a molecular signature involving fibroblast growth factor2 (晚期卵巢癌的基因表達(dá)譜:涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2的分子印記的表征).0ncogene2004:23:8171-83.[0155]9.Esquela-Kerscher A, Slack F J.0ncomirs-microRNAs with a role incancer (在癌癥中有作用的 Oncomirs-微 RNA).Nature Rev Cancer2006; 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【權(quán)利要求】
1.一種用于表征個(gè)體的肺癌或頭頸癌的方法，包括: a)從所述個(gè)體的生物樣品分離微囊泡； b)測(cè)定來(lái)自分離的微囊泡的一種或多種微RNA的存在或含量；以及 c)將所述一種或多種微RNA的存在或含量與參照相比較，其中基于所述來(lái)自分離的微囊泡的一種或多種微RNA的存在或含量與所述參照相比的可測(cè)量差異來(lái)表征所述肺癌和頭頸癌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表征包括提供所述癌癥的診斷、預(yù)后和/或治療診斷。
3.一種用于評(píng)價(jià)個(gè)體的肺癌或頭頸癌的療效和/或進(jìn)展的方法，包括: a)從所述個(gè)體的生物樣品分離微囊泡； b)測(cè)定分離的微囊泡中一種或多種微RNA的存在或含量；以及 c)將所述一種或多種微RNA的存在或含量與參照相比較,其中基于所述一種或多種微RNA的存在或含量與所述參照相比的可測(cè)量差異來(lái)評(píng)價(jià)所述肺癌或頭頸癌的療效和/或進(jìn)展。
4.一種用于評(píng)估肺癌miRNA印記或頭頸癌miRNA印記的一種或多種微RNA的存在或含量的方法，包括: a)從生物樣品分離微囊泡； b)測(cè)定所述微囊泡中的一種或多種微RNA的存在或含量。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述微囊泡從肺癌或頭頸癌細(xì)胞脫落。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述生物樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。
7.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定兩種或多種微RNA的表達(dá)譜。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將所述表達(dá)譜與來(lái)自選定的參照樣品的譜進(jìn)行比較，以測(cè)定所述微囊泡中兩種或多種微RNA的存在或含量。
9.如權(quán)利要求1至3和7至8所述的方法，其中所述參照包括來(lái)自一個(gè)或多個(gè)未患所述癌癥個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)樣品中的一種或多種微RNA的水平。
10.如權(quán)利要求1至3和7至9所述的方法，其中所述參照包括在一定的時(shí)間過(guò)程中從所述個(gè)體獲取的樣品中的所述一種或多種微RNA的水平。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述參照包括在所述癌癥治療開始和/或所述癌癥發(fā)作之前從所述個(gè)體收集的樣品，并且在所述治療開始或所述癌癥發(fā)作之后收集所述生物樣品。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述參照包括標(biāo)準(zhǔn)樣品。
13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述參照包括對(duì)照數(shù)據(jù)。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物樣品包括乳汁、血液、血清、血漿、腹水、囊內(nèi)液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液或其組合。
15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中分離所述微囊泡包括使用尺寸排阻層析。
16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中分離所述微囊泡包括所述微囊泡的PEG-沉淀。
17.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中分離所述微囊泡包括離心含有所述微囊泡的層析級(jí)分。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述層析級(jí)分是空隙容積級(jí)分。
19.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中分離所述微囊泡包括使用微囊泡表面抗原的結(jié)合劑進(jìn)行親和性選擇。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述微囊泡表面抗原是已知的癌癥標(biāo)記物。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述結(jié)合劑是抗上皮細(xì)胞粘附分子(抗-EpCAM)抗體、抗-⑶9抗體或抗-⑶63抗體。
22.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定所述一種或多種微RNA的含量包括標(biāo)記所述一種或多種微RNA。
23.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定所述一種或多種微RNA的含量包括用各自選擇性地結(jié)合所述一種或多種微RNA的一種或多種多核苷酸探針捕獲所述一種或多種微RNA。
24.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定所述一種或多種微NRA的含量包括使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)定量所述一種或多種微RNA的含量。
25.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。
26.如權(quán)利要求1至 25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是鱗狀上皮細(xì)胞癌。
27.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是腺癌。
28.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是頭頸癌。
29.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。
30.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是肺癌。
31.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是非小細(xì)胞鱗狀上皮細(xì)胞癌。
32.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。
33.如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是肺腺癌。
34.如權(quán)利要求1至3和7至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述個(gè)體是人。
35.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述一種或多種微RNA包括let_7a、miR_133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR_15a、miR_18b、miR-378、let_7b、miR-205、miR-181a、miR-130a、miR-199a-3p、miR-140-5p、miR-20a、miR-146b-5p、miR-132、miR-193b、miR-183、miR-34c-5p、miR-30c、miR-148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR_135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR_181d、miR_301a、miR_200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-1、miR-363、miR-150、let-71、miR-27b、miR-7、miR-127-5p、miR-29a、miR-191、let_7d、miR-9、let_7f、miR-10a、miR-181b、miR-15b、miR-16、miR-210、miR-17、miR-98、miR-34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR-19a、miR-193a-5p、miR-18a、miR-125b、miR-126、miR-27a、miR-372、miR-149、miR-23b、miR-203、miR-32 和 miR_181c 中的一種或多種。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中與所述參照相比一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表不所述個(gè)體中存在所述癌癥。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述一種或多種微RNA包括miR-16、miR_181c、miR-25、miR-15b、miR-150、miR-148b、miR-92a、miR-222、miR-96、miR-125a-5p、miR-335 和miR-122中的一種或多種。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中與所述參照相比所述一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示所述個(gè)體中存在頭頸癌。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中與所述參照相比所述一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示所述個(gè)體中存在頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述一種或多種微RNA包括let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25、miR181c、miR199a-3p、miR200c 和 miR16 中的一種或多種。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中與所述參照相比所述一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示所述個(gè)體中存在肺癌。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述一種或多種微RNA包括let7a、miR133b、miR122、miR20b、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25和miR181c中的一種或多種。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中與所述參照相比所述一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示所述個(gè)體中存在肺腺癌。
44.如權(quán)利要求40 所述的方法，其中所述一種或多種微RNA包括let7a、miR122、miR335、miR196a、miR125a_5p、miR96、miR92a、let7b、miR21、miR150、miR15b、miR25、miR181c、miR199a-3p、miR200c 和 miR16 中的一種或多種。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中與所述參照相比所述一種或多種微RNA的過(guò)表達(dá)表示所述個(gè)體中存在肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。
46.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括基于測(cè)定的所述一種或多種微RNA的含量，選擇所述癌癥的治療或改變所述癌癥的治療。
47.如權(quán)利要求1至3和7至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療的應(yīng)答。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療無(wú)應(yīng)答。
49.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中使用了試劑。
50.試劑盒，其包含進(jìn)行權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)所述方法的試劑。
51.如權(quán)利要求50所述的試劑盒，其包含: 一個(gè)或多個(gè)用于測(cè)定一種或多種微RNA含量的引物對(duì)。
52.如權(quán)利要求51所述的試劑盒，其包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85 個(gè)用于測(cè)定所述一種或多種微RNA含量的引物對(duì)。
53.如權(quán)利要求51所述的試劑盒，其中所述一種或多種微RNA包括let-7a、miR-133b、miR-122、miR_20b、miR-335、miR_196a、miR-125a_5p、miR-142_5p、miR-96、miR-222、miR_148b、miR_92a、miR-184、miR-214、miR_15a、miR_18b、miR-378、let_7b、miR-205、miR_181a、miR_130a、miR-199a_3p、miR-140_5p、miR_20a、miR-146b_5p、miR-132、miR_193b、miR-183、miR-34c_5p、miR_30c、miR_148a、miR-134、let_7g、miR-138、miR-373、let_7c、let_7e、miR-218、miR_29b、miR_146a、miR-212、miR_135b、miR-206、miR-124、miR-21、miR_181d、miR_301a、miR_200c、miR-100、miR-10b、miR-155、miR-1、miR-363、miR-150、let-71、miR-27b、miR-7、miR-127-5p、miR-29a、miR-191、let_7d、miR-9、let_7f、miR-10a、miR-18 lb、miR-15b、miR-16、miR_210、miR-17、miR-98、miR-34a、miR-25、miR-144、miR-128、miR-143、miR-215、miR-19a、miR-193a-5p、miR-18a、miR-125b、miR-126、miR-27a、miR-372、miR-149、miR-23b、miR-203、miR-32 和 miR_181c 中的一種或多種。
54.如權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含參照標(biāo)準(zhǔn)樣品。
55.如權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中包括參照對(duì)照數(shù)據(jù)。
56.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)頭頸癌。
57.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。
58.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)肺癌。
59.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)肺腺癌。
60.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)肺鱗狀上皮細(xì)胞癌。
61.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)非癌癥。
62.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ帐轻槍?duì)應(yīng)答者。
63.如權(quán)利要求54或55所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諗?shù)據(jù)是針對(duì)非應(yīng)答者。
64.如權(quán)利要求50-63中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)臨床病理學(xué)特征的參照數(shù)據(jù)。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103842522SQ201280048933
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】道格拉斯·D·泰勒, 塞克·格賽爾·泰勒 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)