視網(wǎng)膜變性疾病的治療方法
【專利摘要】該方法包括施用具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞性能的細(xì)胞到視網(wǎng)膜，和所述細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞融合介導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞的重編，所述重編是通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活介導(dǎo)。
【專利說明】視網(wǎng)膜變性疾病的治療方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對(duì)于眼科疾病的細(xì)胞療法或者再生療法的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了將細(xì)胞(所述細(xì)胞具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的性能)施用到視網(wǎng)膜并介導(dǎo)所述細(xì)胞與所述視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞融合重編視網(wǎng)膜細(xì)胞以治療視網(wǎng)膜變性疾病的方法，所述視網(wǎng)膜細(xì)胞例如視網(wǎng)膜的神經(jīng)元或視網(wǎng)膜的膠質(zhì)細(xì)胞，所述重編由fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活來介導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]視網(wǎng)膜是在眼睛后部的專門化的光敏組織，其包含光感受器細(xì)胞(視柱細(xì)胞和視錐細(xì)胞)和連接到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的用于處理視覺信息的神經(jīng)元。視柱細(xì)胞在低照度的條件下發(fā)揮功能，而視錐細(xì)胞負(fù)責(zé)彩色視覺和所有那些需要高分辨率的視覺工作(例如閱讀)。視柱細(xì)胞主要位于遠(yuǎn)離視網(wǎng)膜周邊的眼睛中心的位置。發(fā)現(xiàn)的濃度最高的視錐細(xì)胞是視網(wǎng)膜中心黃斑，其是對(duì)于視敏度是必需的。為了支持它的代謝功能，視網(wǎng)膜依賴于鄰近的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)。
[0003]視網(wǎng)膜變性是由視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的進(jìn)行性的和最后的凋亡所引起的退化。視網(wǎng)膜變性有幾個(gè)原因，包括動(dòng)脈或靜脈阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、早熟性新生兒晶體后纖維組織形成/視網(wǎng)膜病變、或(通常遺傳的)疾病。這些可以以許多不同的方式存在，例如視力下降、夜盲、視網(wǎng)膜脫落、光敏感、管狀視野和外周視野受損甚至全部視野受損。在許多不同的視網(wǎng)膜疾病的形式中發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜變性，包括色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障和青光眼。
[0004]色素性視網(wǎng)膜炎(RP)是最常見的視網(wǎng)膜變性，個(gè)體的發(fā)病率為大約1/3000到1/5000，在全世界影響大約150萬的人口。RP是遺傳性視網(wǎng)膜疾病的異種家族，其特征在于感光體的進(jìn)行性退化以及隨后的RPE的退化。它是最常見的遺傳性視網(wǎng)膜變性，特征在于色素主要地沉積在視網(wǎng)膜周邊和相對(duì)少量在視網(wǎng)膜中心。典型的表現(xiàn)形式呈現(xiàn)在青年期和成年早期之間，很可能導(dǎo)致?lián)p壞性的視力喪失。在大多數(shù)的RP案例中，光感受器視柱細(xì)胞的原發(fā)性變性，伴隨視錐細(xì)胞的繼發(fā)性變性。RP是一種長(zhǎng)期的疾病，其通常經(jīng)過幾十年發(fā)展，最初呈現(xiàn)為夜盲，隨后在生活中呈現(xiàn)為在日常情況中的視覺損傷。目前，沒有治療能停止視網(wǎng)膜變性的發(fā)展或恢復(fù)視力。具有少數(shù)治療選擇例如避光和/或利用弱視力幫助減緩RP的發(fā)展。某些從業(yè)者也將維生素A作為一種可能的治療選擇來減緩RP的發(fā)展。
[0005]已經(jīng)廣泛地研究了對(duì)于視網(wǎng)膜變性的有效治療?；诟杉?xì)胞治療的領(lǐng)域?qū)τ谝暰W(wǎng)膜變性疾病的治療具有巨大的潛力，因?yàn)樵趧?dòng)物模型中的許多研究表明干細(xì)胞具有再生損失的光感受器和視網(wǎng)膜神經(jīng)元并改善視力的能力。迄今為止，這些細(xì)胞包括視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、 來自骨髓的干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0006]視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(RPC)衍生自胎兒的或新生兒的視網(wǎng)膜，包括未成熟的細(xì)胞群，其在胚胎發(fā)育期間負(fù)責(zé)產(chǎn)生所有視網(wǎng)膜細(xì)胞。在體外，RPC能夠增殖和生成新的神經(jīng)元并分化為視網(wǎng)膜支持細(xì)胞，并且在體內(nèi)可以移植進(jìn)所有的視網(wǎng)膜層和產(chǎn)生各種視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的形態(tài)特征(MacLaren等，2006, Nature444:203-7)。這些結(jié)果支持這樣一種假設(shè):RPC移植是一種對(duì)于視網(wǎng)膜變性疾病的潛在的治療。
[0007]胚胎干細(xì)胞(ESC)衍生自囊胚級(jí)胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有自我再生能力并能夠分化為所有成體細(xì)胞類型，包括小鼠和人類中的光感受器祖細(xì)胞、光感受器或RPE(Lamba等，2006，PNAS USA103:12769-74;Osakada 等，2008，Nat Biotechnol26:215 - 224)。Lamba等表明將衍生自人類ESC的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植進(jìn)入成年CrxfA)小鼠的視網(wǎng)膜下腔促進(jìn)了源自hESC的視網(wǎng)膜細(xì)胞分化成有功能的光感受器，該措施改善了這些動(dòng)物對(duì)光的反應(yīng)(Lamba等，2009, Cell Stem Cell4:73-9)。雖然在視網(wǎng)膜替代療法中ESC是有前景的，但仍要考慮倫理學(xué)問題和免疫排斥問題，且業(yè)已證明ESC與畸胎瘤形成有關(guān)。
[0008]骨髓含有至少兩種不同的干細(xì)胞群:間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和造血干細(xì)胞(HSC)。在體外使用激活素A、?；撬岷捅砥どL(zhǎng)因子，可以誘導(dǎo)MSC成為表達(dá)光感受器譜系-特異性標(biāo)記的細(xì)胞(Kicic等，2003，J Neurosci23:7742-9)。此外，體內(nèi)動(dòng)物模型證明在皇家外科醫(yī)學(xué)院(RCS)大鼠中，把MSC注射入視網(wǎng)膜下腔可以減緩視網(wǎng)膜細(xì)胞變性，整合入視網(wǎng)膜，并分化為光感受器(Kicic 等,2003, J Neurosci23:7742-9; Inoue 等,2007, Exp EyeRes85:234-41)。
[0009]Otani等報(bào)道稱在rdl和rdlO小鼠中玻璃體內(nèi)注入譜系_陰性的(LirT)造血干細(xì)胞(HSC)可以挽救視網(wǎng)膜變性(Otani 等，2004，J Clin Investll4:755-7;US2008/031772l;US2010/0303768)。然而，幾乎僅僅視錐細(xì)胞形成了移植的視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜電流圖響應(yīng)嚴(yán)重異常，與未治療的動(dòng)物相當(dāng)。限制在于:玻璃體內(nèi)注入LirT的HSC僅僅在早期、產(chǎn)后發(fā)育階段整合入視網(wǎng)膜，而不是在成年小鼠中，僅僅在新生的小鼠或在成年小鼠中的外傷誘導(dǎo)模型中觀察到了革巴向激活的 星形細(xì)胞(Otani等,2002, Nat Med8:1004-10; Otani等,2004, JClin Investll4:755-7; Sasahara 等，2004，Am J Pathol 172:1693-703)。
[0010]衍生自成體組織的誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(iPS)是多能性的ESC樣細(xì)胞，其是通過四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子:0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在體外重編自末端分化的體細(xì)胞。據(jù)報(bào)道人類iPS具有類似ESC的潛力來模仿正常視網(wǎng)膜發(fā)生(Meyer等，2009, PNAS USA106:16698-703)。然而，主要問題包括減少病毒整合的風(fēng)險(xiǎn)和為了產(chǎn)生多潛能干細(xì)胞使得致癌基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。這些限制可以使用可替代的方法獲得iPS來克月艮，例如信號(hào)通路的激活，包括Wnt/ β -連環(huán)蛋白、MAPK/ERK、TGF- β和ΡΙ3Κ/ΑΚΤ信號(hào)通路(W02009/101084; Sanges & Cosma, 2010，Int J Dev Biol54:1575-87)。
[0011]因此，需要提供一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的有效的方法。
[0012]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0013]發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過將細(xì)胞移植到受試者的視網(wǎng)膜而實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜再生，所述細(xì)胞具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的性能，所述細(xì)胞與視網(wǎng)膜細(xì)胞融合，例如視網(wǎng)膜神經(jīng)元，如視柱細(xì)胞等等，或視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，如MUller細(xì)胞，來形成雜交細(xì)胞，其重新激活神經(jīng)元的前體標(biāo)記，增殖，去分化并最終分化為目的末端分化后的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，如感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等等，其可以使損傷的視網(wǎng)膜組織再生。fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活對(duì)誘導(dǎo)所述雜交細(xì)胞的去分化并最終再分化為目的視網(wǎng)膜神經(jīng)元是至關(guān)重要的。在一個(gè)實(shí)施例中，Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活至少是部分地通過植入細(xì)胞來提供的(所述細(xì)胞用fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或用fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑，和/或使Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑過表達(dá)來處理),而在另一個(gè)實(shí)施例中,Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活僅僅由向待治療的受試者施用fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑來提供，或作為如例如視網(wǎng)膜變性疾病(例如色素性視網(wǎng)膜炎)中發(fā)生的視網(wǎng)膜損傷或傷害的結(jié)果來提供。在移植后的哺乳動(dòng)物中，新生的視網(wǎng)膜神經(jīng)元完全地再生視網(wǎng)膜，伴隨一些功能性視力的挽救。組織學(xué)分析表明在移植兩個(gè)月后，所述再生的視網(wǎng)膜與野生型哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜是無法區(qū)分的。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞融合介導(dǎo)的再生是一種在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中非常有效的方式，并且可以通過在所述移植細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活來觸發(fā)，而且體內(nèi)末端的分化視網(wǎng)膜神經(jīng)元的重編是一種可能的組織再生機(jī)制。因此，可以應(yīng)用這些教導(dǎo)來治療視網(wǎng)膜變性的疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.細(xì)胞融合對(duì)照。(a)實(shí)驗(yàn)方案示意圖。在HSPCsKFP/&e與LoxP-STOP-LoxP-YFP小鼠(R26Y)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間的體內(nèi)細(xì)胞融合導(dǎo)致在視網(wǎng)膜神經(jīng)元的終止密碼子的切除，隨后YFP的表達(dá)。所產(chǎn)生的雜交體表達(dá)RFP和YFP。(b)在視網(wǎng)膜下移植BIO-處理的HSPCs—24小時(shí)后，I^Ylrdl視網(wǎng)膜的代表性的熒光性顯微照片。YFP陽性的細(xì)胞表示衍生自HSPC與I^eYlrdl視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞融合的雜交體。(c)靶基因Axin2的RT-PCR分析顯示在BIO-處理的HSPC中β-連環(huán)蛋白信號(hào)激活。(d-e)在視網(wǎng)膜下移植BIO-處理的HSPCscee/efp24小時(shí)后，pl0野生型的R26Y視網(wǎng)膜的代表性的熒光性顯微照片。沒有檢測(cè)到Y(jié)FP-陽性的細(xì)胞(綠色)。在(e)中用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。虛線示出了視網(wǎng)膜組織的最終的部分。OS:外節(jié)；0NL:外核層；INL:內(nèi)核層。
[0015]圖2.在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活后，移植的HSPC融合并誘導(dǎo)的rdl小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的去分化。(a-d)在視網(wǎng)膜下移植HSPCgke/kfp24小時(shí)之后，R26fdl小鼠視網(wǎng)膜的代表性的熒光性顯微照片。隨著HSPC (紅色)與rdl視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞融合，在ONL中檢測(cè)到了雙-陽性的RFP/YFP (紅色/綠色)雜交體，也有少量在INL中。這些YFP-陽性的雜交體(YFP，綠色)對(duì)于視柱細(xì)胞(視紫質(zhì)；在13中為紅色)和MUller (谷氨酰胺合成酶；在c中為紅色)標(biāo)記物也是陽性的，但對(duì)于視錐細(xì)胞(d)的標(biāo)記物是非陽性的。(e_g)在P 10R26Yril眼睛中，移植未經(jīng)BIO-處理(無ΒΙ0)和BIO-處理(BIO)的HSPCs?24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡的感光體(e)和細(xì)胞凋亡的雜交體(f)和增殖的(g)雜交體的定量分析。用TUNEL陽性的感光體相對(duì)于總的感光體細(xì)胞核(e)的百分比或膜聯(lián)蛋白V (f)或Ki67 (g)陽性的細(xì)胞相對(duì)于YFP陽性的雜交體細(xì)胞的總的百分比來估算數(shù)量。(h)在HSPC細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞和雜交細(xì)胞(如所顯示的)中基因表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR (如所顯示的)。ONL:外核層；INL:內(nèi)核層。
[0016]圖3.去分化的雜交體的增殖和細(xì)胞凋亡分析。在PlO時(shí)，移植用BIO-處理的HSPCcee (BIO ；a, c)或未經(jīng) BIO-處理的 HSPCcee (無 BIO ；b, d)24 小時(shí)后，在所分析的 R26Yrdl小鼠的視網(wǎng)膜切片上膜聯(lián)蛋白V (&，13)和燈67((3，(1)的代表性的免疫熒光染色。在融合后獲得的YFP熒光(綠色)定位雜交體。細(xì)胞核用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染。黃色箭頭指示細(xì)胞凋亡的雜交體(b)或增殖的雜交體(c-d)。
[0017] 圖4.在去分化雜交體中，前體標(biāo)記的表達(dá)的免疫熒光分析。在PlO時(shí)，移植用BIO-處理的HSPCGKE(B10; a-c)或未經(jīng)BIO-處理的細(xì)胞(無BIO ；d-f)24小時(shí)后，來自R26Yril小鼠的視網(wǎng)膜切片中巢蛋白(a, d,紅色)、頭蛋白(Noggin) (b, e,紅色)和0tx2 (c, f,紅色)的代表性的免疫熒光染色。在融合后獲得的YFP雜交體(綠色)僅僅在BIO-處理(a-c，黃色箭頭)后對(duì)于這些標(biāo)記是陽性的。
[0018]圖5.在rdl小鼠中，視網(wǎng)膜再生的組織學(xué)分析時(shí)間進(jìn)程。(a-h)在plO時(shí)，移植未處理的 HSPCsefp7cee (a, c, e, g)或 BIO-處理的(b, d, f, h)HSPCsKFP/CKE5 天(pl5 ;a_d)、10 天(p20 ；e, f)和15天(p25 ；g, h)后，在I^Ylrdl小鼠的視網(wǎng)膜切片中代表性的H&E染色(a、b、e-h)和TUNEL染色(c、d;紅色)。(1-ρ)在plO (k-η)時(shí)，用未經(jīng)處理的HSPC (m，n)或BIO-處理(k-1) HSPC未移植(1、j、ο、P)或移植的野生型(i，j )小鼠和rdl小鼠(k-p)代表性的H&E染色，均在p60進(jìn)行分析。放大倍數(shù):20 X，a-h、j、1、η、P ;5 X，1、k、m、ο。ONL:外核層。
[0019]圖6.移植的R26rdl眼睛的組織學(xué)分析時(shí)間進(jìn)程。(a-h)在plO移植未經(jīng)處理的HSPCefp7cee (a, c，e, g)或 BIO-處理的(b, d, f,h) HSPCkf咖后，在 R26Yrdl 小鼠的視網(wǎng)膜切片中代表性的H&E染色(a, b, e-h)和TUNEL染色(c，d ;紅色)，在移植后第5天(pl5;a_d)，10天(p20;e, f)和 15 天(p25 ；g, h)分析。(i_p)在 plO (k_n),未移植(i, j, ο, ρ)或移植未經(jīng)處理的HSPC (m，η)或BIO-處理(k-1) HSPC的野生型(1、j )和rdl小鼠(k-p)的代表性的H&E染色，均在p60進(jìn)行分析。放大倍數(shù):20X，a-h、j、l、n、p ;5X，1、k、m、o。ONL:外核層；INL:內(nèi)核層。
[0020]圖7.在ρ60的雜交體分化分析。(a-f)沒有移植(e)和在plO移植用BIO-處理的HSPC (a-d, f)的R26Yril小鼠的視網(wǎng)膜切片的代表性的免疫熒光染色，在p60進(jìn)行分析。(a-d)YFP-陽性的雜交體(綠色)是對(duì)視紫質(zhì)(a，紅色)是陽性的，但是對(duì)于視錐細(xì)胞視蛋白(b，紅色)，谷氨酰胺合成酶(C，紅色)，和⑶31 (d，紅色)為陰性。底部圖像:紅色和綠色的融合，細(xì)胞核也用DAPI (藍(lán)色)進(jìn)行復(fù)染。(e-f)視紫質(zhì)(紅色)，Pde6b (洋紅)和用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染的細(xì)胞核。(g)野生型(wt)，以及移植未經(jīng)處理的HSPC (rdlNT)或者用BIO-處理的HSPC (rdlBIO)的R26Yr il小鼠的視網(wǎng)膜中的Pde6b蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡法，所有分析在P60進(jìn)行。用抗β_肌動(dòng)蛋白抗體來標(biāo)準(zhǔn)化總蛋白溶解產(chǎn)物。0NL:外核層；INL:內(nèi)核層；GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。
[0021]圖8.YFP陽性的雜交體表達(dá)H)E6B。(a)在plO移植未經(jīng)處理的HSPCsgke細(xì)胞后2個(gè)月，來自R26Yril小鼠的視網(wǎng)膜切片中的視紫質(zhì)(紅色)的代表性的免疫熒光染色。既沒有檢測(cè)到Y(jié)FP雜交體(綠色)，也沒有檢測(cè)到視紫質(zhì)(紅色)陽性的感光體。用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。(b)在plO移植用BIO-處理HSPCs?，并在p60進(jìn)行分析的R26Yril小鼠的代表性的視網(wǎng)膜切片。YFP陽性的雜交體(綠色)對(duì)于視紫質(zhì)(紅色)和Pde6b (洋紅)都是陽性的。在融合圖像中，用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。0NL:外核層；INL:內(nèi)核層；GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。
[0022]圖9.體內(nèi)的損傷-依賴性細(xì)胞融合。(A)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。在體內(nèi)，在紅色-標(biāo)記的SPCCre與LoxP-STOP-LoxP-YFP小鼠(R26Y)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間的細(xì)胞融合導(dǎo)致切除在視網(wǎng)膜神經(jīng)元中終止密碼子，并隨后表達(dá)YFP。所產(chǎn)生的雜交體表達(dá)YFP，并且也標(biāo)記為紅色。(B，C)用HSPCsKFP/&e移植的R26Y小鼠的NMDA-損傷(B)或健康的視網(wǎng)膜(C)的共聚焦的顯微照片。在組織損傷24小時(shí)之后處死小鼠。在NMDA損傷(B，NMDA)存在下檢測(cè)到了衍生自細(xì)胞融合的雙陽性RFP (紅色)和YFP (綠色)雜交體，而在沒有損傷的眼睛中(C，無NMDA)未檢測(cè)到。用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。Onl:外核層；inl:內(nèi)核層；gcl:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。比例尺:50μπι。(D)在細(xì)胞移植24小時(shí)后形成的雜交體的定量分析，用在光學(xué)區(qū)域中定位的YFP-陽性的細(xì)胞在總的紅色HSPCqwkfp的百分?jǐn)?shù)來表示。分析NMDA-損傷和未-損傷(無NMDA)的眼睛的切片。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=90 (每只眼睛10個(gè)不同的視網(wǎng)膜連續(xù)切片的三個(gè)不同的視網(wǎng)膜區(qū)域，分析三只不同的眼睛)。**撲〈0.0Ol0(E-G):視網(wǎng)膜融合細(xì)胞部分的免疫組織化學(xué)的分析。在NMDA-損傷眼睛中，移植HSPCs&e12小時(shí)后檢測(cè)，YFP雜交體對(duì)于神經(jīng)節(jié)(E, Thyl.1,紅色),無長(zhǎng)突細(xì)胞(F,突觸結(jié)合蛋白(sintaxin),紅色)也是陽性的,或者對(duì)于Miiller (G, GS,紅色)細(xì)胞標(biāo)記是陰性的。黃色箭頭表示細(xì)胞對(duì)于YFP和標(biāo)記染色都是陽性的。比例尺:10 μ m。
[0023]圖10.細(xì)胞融合現(xiàn)象的分析。(A)H&E染色(左)和視網(wǎng)膜組織的示意圖。(B)NMDA注射之后48小時(shí)被處死的R26Y小鼠眼睛的切片的TUNEL染色(綠色)。(C) NMDA處理在R26Y小鼠中沒有激活視網(wǎng)膜神經(jīng)元中YFP的表達(dá)(綠色)。(D)對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少在3只不同的眼睛中進(jìn)行細(xì)胞移植。然后，每只眼睛總共檢測(cè)10個(gè)連續(xù)切片，每個(gè)切片檢測(cè)3個(gè)不同的區(qū)域。統(tǒng)計(jì)單獨(dú)的切片上在視網(wǎng)膜的3個(gè)區(qū)域內(nèi)的YFP-陽性的或GFP-陽性的免疫活性標(biāo)記陽性的細(xì)胞的數(shù)目(40X光場(chǎng))。在相同的區(qū)域中，后者數(shù)目和總的紅色標(biāo)記(DiD)細(xì)胞或RFP陽性的細(xì)胞數(shù)量之間的比值得出陽性細(xì)胞的百分比。在包括視網(wǎng)膜組織的gel和ini區(qū)域選擇40X視野(紅色矩形)。(E)在從用B10_HSPC&e移植的NMDA-損傷的R26Y視網(wǎng)膜分離的總細(xì)胞中，進(jìn)行具有4C含量的DNA的四倍體細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析。當(dāng)開啟RFP陽性的細(xì)胞(雜交體)時(shí)，檢測(cè)到了在細(xì)胞周期的G2/M期的四倍體細(xì)胞的存在(右圖表)，而在對(duì)照的未融合的RFP HSPCcre (左圖表)中沒有檢測(cè)到。(F)視網(wǎng)膜融合部分的統(tǒng)計(jì)分析。在HSPCare移植到NMDA-損傷的R26Y眼睛12小時(shí)之后，表示YFP雜交體百分比的數(shù)量對(duì)于檢測(cè)的神經(jīng)節(jié)、無長(zhǎng)突細(xì)胞或者M(jìn)Uller視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記也是陽性的。
[0024]圖11.ESC 和 RSPC 融合事件分析。(A)將 DiD-ESCsare 和 DiD_RSPCs&e 注入用 NMDA預(yù)處理24小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的小鼠眼睛中，或注入到健康的眼睛(無NMDA)中的代表性樣本。在R26Y眼睛中細(xì)胞注入24小時(shí)后(DiD細(xì)胞，紅色)，在NMDA-損傷眼睛(NMDA沖檢測(cè)到了 YFP表達(dá)(YFP，綠色)，但是在未損傷眼睛(沒有NMDA)中沒有檢測(cè)到Y(jié)FP表達(dá)(YFP，綠色)。用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。比例尺:20μπι。(B) YFP-陽性的細(xì)胞用相對(duì)于在光學(xué)視野定位的移植DiD-ESCta和DiD-RSPCta的總數(shù)量的百分比來定量分析。在移植后24小時(shí)處死小鼠，分析NMDA-損傷和未-損傷眼睛的切片。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；η=30(對(duì)于每只眼睛，三個(gè)不同區(qū)域中的10個(gè)不同的視網(wǎng)膜連續(xù)切片)。P值〈0.001(#*)。(C)對(duì)R26Y小鼠注射NMDA (玻璃體內(nèi)的)和BrdU (腹膜內(nèi)的)；一天后，注射未標(biāo)記的ESC (玻璃體內(nèi)的)并且最后再過24小時(shí)后，在處死的小鼠的眼睛切片上進(jìn)行BrdU染色。在40Χ視野計(jì)算總的BrdU陽性的細(xì)胞(紅色箭頭)。YFP陽性的雜交體對(duì)于BrdU染色(綠燈箭頭)從不顯示陽性。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；η=30。
[0025]圖12.融合之后視網(wǎng)膜神經(jīng)元的重編分析。(A)在用NMDA，或者NMDA和DKKl處理的眼睛，或作為對(duì)照的未處理的眼睛的切片上，使用抗β-連環(huán)蛋白抗體(紅色)進(jìn)行免疫熒光染色。在用DKKl處理之后，在NMDA-損傷眼睛(紅色箭頭)中檢測(cè)到的在視網(wǎng)膜細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞核累積減少。比例尺:20μπι。(B)體內(nèi)重編實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。注射未經(jīng)處理(對(duì) 照)，或用BIO處理24小時(shí)的紅色-標(biāo)記SPC到Nanog-GFP-Puro受體小鼠的NMDA-損傷或未受損傷的眼睛中。注射一天后，在重編雜交體中分析GFP的表達(dá)。(C)NMDA處理沒有激活Nanog-GFP視網(wǎng)膜神經(jīng)元中GFP的表達(dá)(綠色)。(D-F)如圖所示，在未經(jīng)處理的(E)或者BIO-處理的(F)細(xì)胞中，通過靶基因Axin2的RT-PCR (D)或通過β-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)，HSPC的BIO處理激活的β -連環(huán)蛋白信號(hào)。(G)在健康的Nanog-GFP眼睛中，BIO-處理的HSPCkfp (紅色)的移植沒有誘導(dǎo)Nanog-GFP轉(zhuǎn)基因(綠色)的再激活。用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
[0026]圖13.在體內(nèi)細(xì)胞融合后，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活增強(qiáng)神經(jīng)元的重編。(A)體內(nèi)重編實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。在注射HSPCk26y—天前，巢蛋白-CRE小鼠接收玻璃體內(nèi)注入NMDA和DKKl、單獨(dú)NMDA或作為對(duì)照的PBS。在移植以前，用或不用Wnt3a，或BIO預(yù)處理HSPCsk26y,并用DiD紅色染料標(biāo)記。在細(xì)胞移植24小時(shí)之后分析樣品。Cre可以僅僅由于細(xì)胞融合和重編，由于巢蛋白促進(jìn)劑的激活，在成年小鼠中再表達(dá)，誘導(dǎo)在保持紅色膜的雜交體中YFP的表達(dá)。(B)僅僅存在NMDA而沒有DKKl，移植紅色HSPCsk26y的細(xì)胞開始表達(dá)YFP (綠色箭頭)。黃色箭頭表示雙-陽性的紅色和綠色細(xì)胞。在移植以前用fct3a預(yù)處理紅色HSPCk26y增加了雙-陽性的紅色/綠色雜交體的量。比例尺:50 μ m (C-D)在移植未經(jīng)處理的HSPC、或用Wnt3a或BIO-處理的HSPC24小時(shí)之后，在用NMDA、NMDA+DKK1處理的、或未經(jīng)處理的(無NMDA)的巢蛋白-CRE(C)或Nanog GFP (D)視網(wǎng)膜中檢測(cè)到的雙紅色/綠色(DiD/YFP)-陽性的雜交體的數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析。用在光學(xué)視野中檢測(cè)到的YFP-陽性的細(xì)胞相對(duì)于總紅色HSPC的數(shù)量來估算百分比。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=90。***P〈0.001。(E)在未受損傷的(無NMDA) Nanog-GFP視網(wǎng)膜和用Wnt3a (NMDA+Wnt3a)預(yù)處理的HSPC移植的NMDA Nanog-GFP視網(wǎng)膜的移植24小時(shí)后的共聚焦的顯微照片。
[0027]圖14.在體內(nèi)細(xì)胞融合之后，fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活增強(qiáng)神經(jīng)元的重編。(A)代表樣品，其中在Nanog-GFP-puro小鼠注射PBS (無NMDA)，或注射NMDA24小時(shí)之后注射DiD-ESC。在ESC注射24小時(shí)之后，在NMDA-損傷(NMDA)的ESC-神經(jīng)元雜交體(紅色和綠色)中檢測(cè)到了 Nanog - GFP的表達(dá)(綠色)，但是在未經(jīng)處理的眼睛(無NMDA)中沒有檢測(cè)到。用DKKl (NMDA+DKK1)預(yù)處理減少了 GFP-陽性雜交體的數(shù)量。相對(duì)于未經(jīng)處理的ESC (無B10)，經(jīng)BIO和Wnt3a預(yù) 處理的ESC增加GFP-陽性的重編神經(jīng)元(紅色/綠色)的數(shù)量。用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。比例尺:20μπι。(B)從用BIO-處理(BIO)或未經(jīng)處理的(無BIO) ESC移植的NMDA-損傷的Nanog-GFP眼睛中分離雜交體，其在嘌呤霉素篩選下體外培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)一個(gè)月后，其中檢測(cè)到平均23個(gè)GFP-陽性克隆。這些克隆也對(duì)于堿性磷酸酶染色是陽性的。(C)在存在或不存在BIO處理的情況下，移植RSPC (紅色)不重編NMDA-損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)元。用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。(D)用NMDA預(yù)處理(NMDA)或未經(jīng)NMDA預(yù)處理(無NMDA)的R26Y眼睛中，注射未經(jīng)處理的或經(jīng)BIO-處理的HSPCare (白條)，ESCare (灰色條)或者RSPCsare (黑色條)之后，YFP-雜交體的百分比的統(tǒng)計(jì)分析。
[0028]圖15.重編的雜交體的特性。(A)在BIO (黑色條)或未經(jīng)BIO-處理(灰色條)HSPC&e/RFP移植到R26Y NMDA-損傷的眼睛之后24小時(shí)，在根據(jù)FACS分選出的RFP陽性的雜交體中不同的基因表達(dá)的RT-PCR分析。(B)移植用BIO-處理的HSPCsto和隨后用抗-0ct4、抗-Nanog、抗-巢蛋白、抗cKit或者抗Tuj-1抗體染色24小時(shí)的NMDA-損傷R26Y視網(wǎng)膜共聚焦的顯微照片。YFP陽性的雜交體(綠色)對(duì)于0ct4、Nanog和巢蛋白(紅色,箭頭)表達(dá)也是陽性的，然而它們對(duì)于c-Kit或Tuj-1 (綠色，箭頭)不是陽性的。比例尺:50 μ m。(C-D)在BIO-處理和DiD標(biāo)記人類⑶34+HSPC移植到Nanog-GFP小鼠的NMDA-損傷眼睛24小時(shí)之后，使用在雜交體中FACS-分選的小鼠(C)或人類(D)特異的寡核苷酸通過RT-PCR評(píng)估種屬特異性的基因表達(dá)。(E-J)用BIO處理(BIO)或未經(jīng)處理的(無BIO) HSPCcre玻璃體內(nèi)注射到NMDA-損傷R26Y眼睛中，24小時(shí)之后分析。為了評(píng)估YFP陽性的雜交體(綠色)的增殖(E-G和I)和細(xì)胞死亡(F、H和J)，切片進(jìn)行染色或者用抗-Ki67 (G和I，紅色)或抗-膜聯(lián)蛋白V (H和J)抗體進(jìn)行染色。陽性的雜交體的量評(píng)價(jià)作用Ki67 (E)或膜聯(lián)蛋白V (F)陽性的細(xì)胞相對(duì)于總YFP雜交體的百分比來估算。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=30。P值〈0.001(***)。G和J中的黃色箭頭分別表示Ki67陽性的雜交體或膜聯(lián)蛋白V陽性的雜交體。比例尺:50μπι。(K-L)在BIO-處理(K)或者未經(jīng)處理(L)的HSPC&e注射到R26Y小鼠的NMDA-損傷眼睛之后，在形成的YFP雜交體中對(duì)于ESC (0ct4, Nanog),中胚層(Gata4)，內(nèi)胚層(Handl),神經(jīng)外胚層(巢蛋白,Noggin和0tx2), HSPC (c-Kit和Seal)或末端的分化神經(jīng)元(Tuj-1)的標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，所述小鼠在細(xì)胞移植之后24小時(shí)(白色條)、48小時(shí)(灰色條)和72小時(shí)(黑色條)處死。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=30。
[0029]圖16.在雜交體中的增殖和基因表達(dá)。(A-B)未移植NMDA-損傷R26Y視網(wǎng)膜(A)或未經(jīng)處理的(無ΒΙ0，灰色條)，或BIO-處理的(ΒΙ0，黑色條)HSPC細(xì)胞的RT-PCR分析。(C)用DiD-標(biāo)記和BIO-處理的人CD34+HSPC(紅色)移植的NMDA-損傷Nanog-GFP視網(wǎng)膜的共聚焦的顯微照片。檢測(cè)YFP陽性的雜交體(綠色/紅色細(xì)胞，黃色箭頭)。(D-E)在NMDA-損壞R26Y眼睛中注射BIO-處理或未經(jīng)處理的ESC之后獲得的YFP-陽性的重編雜交體上進(jìn)行Ki67 (D)和膜聯(lián)蛋白V (E)染色。陽性的雜交體用陽性細(xì)胞相對(duì)于總的YFP雜交體的數(shù)量的百分比來估算。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=30。P值〈0.001 (#*)。(F)在BIO處理HSPCare注射入R26Y小鼠的NMDA-損壞眼睛之后，在所形成的YFP雜交體中對(duì)于中胚層(Gata4),內(nèi)胚層(Handl),神經(jīng)外胚層(巢蛋白，Noggin和0tx2),末端的分化神經(jīng)元(Tuj-1)或ESCs (0ct4, Nanog)的標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，所述小鼠在細(xì)胞移植之后24小時(shí)(白色條)，48小時(shí)(灰色條)和72小時(shí)(黑色條)被處死。數(shù)據(jù)是n=30的平均值。
[0030]圖17.在移植的HSPC融合之后，NMDA-損傷視網(wǎng)膜可以再生。(A)在B10_HSPC&e移植之后I個(gè)月，在N MDA-損傷視網(wǎng)膜中，H&E染色顯示內(nèi)核層的厚度增加(ini，括號(hào))和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(gcl，箭頭)的再生增加。箭頭表明在NMDA-損傷視網(wǎng)膜中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失。比例尺:50mm。(B-C)在gcl (B)中的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核和在ini (C)中的細(xì)胞核行數(shù)的定量分析，移植用BIO-處理(BIO)或未經(jīng)處理的HSPC的損傷(NMDA)或未受損傷的視網(wǎng)膜縱向視網(wǎng)膜切片的統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=30)。*#P〈0.001.(D)沿著鼻顳(左)和背腹側(cè)的(右)軸計(jì)數(shù)在gcl中的神經(jīng)元并用每平方毫米的細(xì)胞數(shù)的曲線圖表示。對(duì)于每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)組成整個(gè)視網(wǎng)膜的總共80個(gè)不同的圖像。數(shù)據(jù)是3個(gè)視網(wǎng)膜的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P〈0.01。ON:視神經(jīng)。(E)沿著鼻顳(左)和背腹側(cè)的(右)軸計(jì)數(shù)在gcl中的除外內(nèi)皮細(xì)胞的總細(xì)胞，并用密度圖曲線來表示。如在色條中表明的，暗紅相應(yīng)于10，000細(xì)胞/平方毫米的細(xì)胞密度。
[0031]圖18.在細(xì)胞融合-介導(dǎo)的重編之后獲得的雜交體的長(zhǎng)期的分化潛力。(A)在BIO-處理或未經(jīng)處理的HSPCare移植到NMDA-損傷R26Y視網(wǎng)膜中一個(gè)月之后，鑒定YFP+雜交體的實(shí)驗(yàn)策略。(B)在B10-HSPC&e移植一個(gè)月之后，在NMDA-損傷R26Y視網(wǎng)膜平片中檢測(cè)YFP+神經(jīng)元。用DAPI (藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。比例尺:50μπι。在右側(cè)組中顯示了更高的放大倍數(shù)的YFP+神經(jīng)元。(C)YFP+分化雜交體(綠色)表達(dá)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記SM1-32 (左側(cè)，紅色)或者無長(zhǎng)突細(xì)胞標(biāo)記Chat (右側(cè)，紅色)。(D)在用BIO-HSPCto移植的眼睛的視神經(jīng)中檢測(cè)到Y(jié)FP+軸突(綠色)，然而在用未經(jīng)處理的-HSPCto移植的眼睛中沒有檢測(cè)到。在右側(cè)組中顯示了在更高的放大倍數(shù)的所述視神經(jīng)YFP+陽性軸突(綠色)。
[0032]圖19.在內(nèi)源BM松動(dòng)術(shù)和細(xì)胞融合之后，骨髓更換效率的分析和雜交體增殖和細(xì)胞凋亡的分析。(A)在骨髓更換一個(gè)月之后，代表性的小鼠血液色譜細(xì)胞計(jì)數(shù)(haemochromocytometric)分析。(B-C)在來自接受:BMEFP/Cre 更換的小鼠的 NMDA-損傷 R26Y眼睛中注射B1024小時(shí)之后，在所獲得的YFP-陽性重編的雜交體上進(jìn)行Ki67 (B)和膜聯(lián)蛋白V (C)染色。
[0033]圖20.損傷眼睛中回收(recruite)的內(nèi)源BM-衍生的細(xì)胞可以與視網(wǎng)膜神經(jīng)元融合。(A)實(shí)驗(yàn)方案。在亞-致死劑量照射后，R26Y小鼠通過尾靜脈注射接受BMKFP/&e移植。在BM重建之后(一個(gè)月)，右眼接受NMDA的玻璃體內(nèi)的注射，左眼不注射；小鼠在24小時(shí)后分析。僅僅在回收的-BM細(xì)胞(紅色)和神經(jīng)元的細(xì)胞融合的情況下，才檢測(cè)到Y(jié)FP/RFP雙陽性的雜交體。(B-F)在NMDA-損傷(B-C，NMDA)中檢測(cè)到雙陽性的YFP/RFP雜交體，但是在健康的眼睛中(D-E，無NMDA)沒有檢測(cè)到。(F)估算YFP/RFP雙陽性的雜交體相對(duì)于總的檢測(cè)的RF P細(xì)胞的百分比。(G-K)視網(wǎng)膜細(xì)胞-融合助手的免疫化學(xué)分析。在NMDA損傷24小時(shí)之后，YFP雜交體(綠色)對(duì)于Seal (G)和c-Kit (H) HSPC標(biāo)記，和對(duì)于神經(jīng)節(jié)(I，Thyl.1，紅色)，無長(zhǎng)突細(xì)胞(J，突觸融合蛋白，紅色)和MUller (K，GS，紅色)視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記也是陽性的。黃色箭頭表明雙陽性的細(xì)胞。比例尺:50μπι。
[0034]圖21.通過BIO誘導(dǎo)的內(nèi)源BM細(xì)胞融合-介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的重編。(A)實(shí)驗(yàn)方案。在亞-致死劑量照射后，巢蛋白-Cre小鼠通過尾靜脈注射接受BMk26y移植。在BM重建之后(一個(gè)月)，右眼接受B10+NMDA的玻璃體內(nèi)注射，而對(duì)側(cè)的眼睛單獨(dú)注射NMDA。僅僅在回收的-BMCk26y和神經(jīng)元之間的細(xì)胞融合-介導(dǎo)的雜交體重編的情況下，巢蛋白-介導(dǎo)的Cre表達(dá)才導(dǎo)致YFP的表達(dá)。(B-C)僅僅在BIO注射之后(C)，在招募的BM-細(xì)胞和損傷的神經(jīng)元的融合之后，才檢測(cè)到Y(jié)FP陽性的重編雜交體(綠色)。相反無BIO的NMDA-損傷的眼中沒有看到Y(jié)FP雜交體(B)。(D-E)增殖(Ki67陽性的，D)或死亡(膜聯(lián)蛋白V陽性的，E)雜交體的百分?jǐn)?shù)，用YFP雙陽性的細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)于總的YFP細(xì)胞的數(shù)量來估算。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=30。(F-1) NMDA+B10處理的視網(wǎng)膜共聚焦的顯微照片顯示0ct4(在F-G中紅色)和Nanog (紅色在H-1中紅色)蛋白質(zhì)在YFP-重編重編雜交體中的表達(dá)(綠色，看到并入融合至G和I)。0ct4和Nanog陽性的雜交體(E)的百分?jǐn)?shù)，用YFP雙陽性的細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)于總的YFP細(xì)胞的數(shù)量來估算。數(shù)據(jù)是平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差；n=30。
[0035]圖22.在HSPC移植之后，巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞分析。(A)未經(jīng)處理的HSPC移植一個(gè)月之后，平片式NMDA-損傷視網(wǎng)膜的代表性的共聚焦圖像。僅僅檢測(cè)到少數(shù)YFP+細(xì)胞(綠色)。比例尺:50 μ m。(B)在NMDA-損傷R26Y眼睛中移植HSPC&e24小時(shí)之后，采集視神經(jīng)。比例尺:200 μ m。(C-F)在NMDA-損傷R26Y眼睛中移植HSPCCre/RFP之后24小時(shí)(C，D)和2周(E，F(xiàn))之后，用RFP+/YFP+雜交體對(duì)于CD45 (C-E)和Macl (D-F)染色同樣是陽性的的百分比進(jìn)行FACS分析。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]通過植入一些類型的細(xì)胞到受試者的視網(wǎng)膜可以實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜再生，所述細(xì)胞具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的性質(zhì)，如造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或間質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞與視網(wǎng)膜細(xì)胞融合，如視網(wǎng)膜神經(jīng)元，例如視柱細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞等等，或與視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞融合，例如MUller細(xì)胞，來形成雜交細(xì)胞，其隨后去分化并最終分化為目的視網(wǎng)膜神經(jīng)元，例如光感受器細(xì)胞和/或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等等，其中在所述植入細(xì)胞或在雜交細(xì)胞中fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活對(duì)于誘導(dǎo)所述雜交細(xì)胞的去-分化和最終的再-分化為目的視網(wǎng)膜神經(jīng)元是必要的。在一個(gè)實(shí)施例中，fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活是至少部分地由植入細(xì)胞(其已經(jīng)用fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或用Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑來處理，和/或過表達(dá)fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑)來提供，而在另一個(gè)實(shí)施例中，Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活是僅僅由于對(duì)待治療的受試者施用Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑來提供，或由于視網(wǎng)膜損傷或傷害，出現(xiàn)在如視網(wǎng)膜變性疾病中。
[0038]具有干細(xì)胞或祖細(xì)胞的性能的細(xì)胞用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的用途，其通過Wnt/ 連環(huán)蛋白通路的激活的介導(dǎo)，重編融合到所述細(xì)胞的視網(wǎng)膜細(xì)胞
[0039]治療A
[0040]一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有的激活的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路，并選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞所組成的組。換言之，依據(jù)該方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞，其選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)所組成的組，其中所述細(xì)胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的，該細(xì)胞用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療。
[0041]因而，本發(fā)明提供一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞所組成的組，其中所述細(xì)胞是用fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理、或用Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理，和/或它是一種過表達(dá)fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活 劑的細(xì)胞。作為所述處理的結(jié)果，或操作細(xì)胞來過表達(dá)fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路，并可以用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療。因此，將這樣處理或操作的細(xì)胞植入到需要視網(wǎng)膜變性疾病治療的受試者的眼睛中。
[0042]換言之，本發(fā)明的這個(gè)方面涉及一種細(xì)胞在制備用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的藥物組合物中的應(yīng)用，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路，所述細(xì)胞選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞所組成的組；或可替代地，本發(fā)明的這個(gè)方面涉及一種選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞在制備用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的藥物組合物的用途，其中所述細(xì)胞用fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理，或用Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑來處理，和/或過表達(dá)fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑。
[0043]根據(jù)治療A，Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活是至少部分地通過植入具有激活的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的，并選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞所組成的組細(xì)胞來提供。待治療的受試者也可以在視網(wǎng)膜損傷或傷害之后激活fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路?？偟膩碚f，當(dāng)靶基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路被激活；舉例說明，可以通過常規(guī)技術(shù)來證實(shí)fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活，例如，通過分析靶基因(如Axin2)的表達(dá)，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式來分析基因的表達(dá)，諸如RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),或通過常規(guī)技術(shù)來檢測(cè)在所述細(xì)胞的細(xì)胞核中fct/ β -連環(huán)蛋白易位,諸如通過免疫染色，或通過檢測(cè)散亂蛋白(Dishevelled)的磷酸化作用或LRP尾部的磷酸化作用等。
[0044]激活Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的方式可以不同。舉例說明，如下文所述，在一種選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)所組成的組的細(xì)胞中，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活可以通過用fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理或或用Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理來實(shí)現(xiàn)，或通過操作所述細(xì)胞來過表達(dá)一種蛋白質(zhì)或肽，所述蛋白質(zhì)或肽是fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑來實(shí)現(xiàn)。如下文將論述的，可替代地，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活可以作為視網(wǎng)膜損傷或傷害的結(jié)果來完成，如出現(xiàn)在例如視網(wǎng)膜變性疾病中，或通過給予fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑至待治療的受試者，或給予一種fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑至待治療的受試者，以這種方式激活所述通路。
[0045]如本文使用的術(shù)語“造血干細(xì)胞”或“HSC”，復(fù)數(shù)形式“HSCs”涉及一種多能的干細(xì)胞，其產(chǎn)生所有的血細(xì)胞類型，從髓細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板和樹突細(xì)胞)，和淋巴細(xì)胞系(T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、NK-細(xì)胞)。HSC是一種異源群體。干細(xì)胞分三類，通過在血液中它們的淋巴與髓細(xì)胞樣的后代的比值來區(qū)分(L/M)。髓細(xì)胞樣的-偏向(My-bi)HSC具有低的L/M比值(>0，〈3)，而淋巴-偏向(Ly-bi)HSC顯示大的比值(>10)。第三類由均衡的(Bala)HSC組成，其3 ( L/
10。作為干細(xì)胞，HSC通過它們的重新補(bǔ)足所有的血細(xì)胞類型的能力(多能性)和它們的自我更新能力來定義。關(guān)于表型，HSC是通過它們的小型，缺少譜系(Iin)標(biāo)記，用活體染料著色低(側(cè)群)諸如若丹明123 (若丹明DULL，也稱為rholo)或Hoechst33342，和在它們的表面存在各種抗原的標(biāo)記來鑒定。在人類中，大多數(shù)HSC是⑶34+⑶38-⑶90+⑶45RA-。然而所述組合不覆蓋所有的HSC，盡管如此，所述組合很普遍。實(shí)際上，甚至在人類中，也有HSC是⑶34-⑶38-。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，HSC是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地人類細(xì)胞。
[0046]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，HSC是一種長(zhǎng)期的HSC (LT-HSC),即能夠促進(jìn)造血作用數(shù)月甚至一生的造血干細(xì)胞，其特征在于CD34-、CD38-、SCA-1+, Thyl.1+/低、C_kit+、Iin-,CD135-、Slamf1/CD150+。
[0047]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，HSC是一種短期的HSC (ST-HSC),即一種具有局限于幾周的再生能力的 HSC，它是 CD34+、CD38+、SCA-1+, Thyl.1+/ 低、C_kit+、Iin-, CD135-、Slamfl/CD150+、Mac-1 (CDllb)低。
[0048]如本文使用的術(shù)語“CD34”涉及在人體內(nèi)存在的某些細(xì)胞上的分化抗原。它是一種細(xì)胞表面糖蛋白并用作細(xì)胞-細(xì)胞粘著因子。它可以同時(shí)介導(dǎo)干細(xì)胞到骨髓細(xì)胞外基質(zhì)或直接地到基質(zhì)細(xì)胞的附著。表達(dá)CD34的細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)通常發(fā)現(xiàn)于臍帶和骨髓如造血細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞的亞型、內(nèi)皮的祖細(xì)胞、血管的內(nèi)皮細(xì)胞，但在淋巴管沒有發(fā)現(xiàn)。人類CD34的完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P28906(2012年7月26日)。
[0049]如本文使用的術(shù)語“CD38”涉及分化抗原簇38，又名環(huán)ADP核糖水解酶，是一種在許多免疫細(xì)胞(白細(xì)胞)表面發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，其包括CD4+、CD8+、B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。CD38同樣在細(xì)胞粘著、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣信號(hào)中起作用。CD38是一種II類跨膜蛋白質(zhì)，用作一種信號(hào)分子并介導(dǎo)淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘著。它同樣用作第二信使環(huán)ADP核糖的酶促形成和水解。在造血 系統(tǒng)中，⑶38在血漿細(xì)胞上最高表達(dá)。人類⑶38完整的蛋白質(zhì)序列具有 UniProt 登錄號(hào) P28907 (2012 年 7 月 26 日)。
[0050]如本文使用的術(shù)語“⑶90”或Thy-1涉及分化簇90，一種25 - 37kDa重N-糖基化的，具有單個(gè)V樣免疫球蛋白域(所述免疫球蛋白域是一類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其由設(shè)置在兩個(gè)β-折疊中7和9之間的反平行β折疊鏈的具有希臘鑰匙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的2-層三明治組成)的錨定糖磷脂酰肌醇(GPI)的保守細(xì)胞表面蛋白，最初發(fā)現(xiàn)作為一種胸腺細(xì)胞抗原。人類CD90的完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ04216 (2012年7月26日)。
[0051]如本文使用的術(shù)語“CD45”涉及由多個(gè)成員組成的家族，其是所有單個(gè)復(fù)雜基因的產(chǎn)物。該基因包含34個(gè)外顯子和初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的三個(gè)外顯子，可選擇地拼接生成最多八個(gè)不同的成熟mRNA，和在翻譯后生成八個(gè)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這三個(gè)外顯子產(chǎn)生RA、RB和RC亞型。CD45 存在各種亞型:CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R (ABC)。人類CD45完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P08575 (2012年7月26日)。
[0052]術(shù)語“SCA-1”涉及功能未知的脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)蛋白(ataxin) I。人類SCA-1完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P54253 (2012年7月26日)。
[0053]術(shù)語“c-kit”涉及一種肥大/干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(SCFR)，也稱為原癌基因C-Kit或酪氨酸-蛋白激酶Kit或⑶117，是一種在人類中由KIT基因編碼的蛋白質(zhì)。⑶117是一種受體酪氨酸激酶類型III，其連接到干細(xì)胞因子，又名“青灰因子”或“c-kit配體”。人類c - kit的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P10721 (2012年7月26日)。
[0054]如本文使用的術(shù)語“⑶135”涉及分化抗原簇135 (⑶135)，也稱作Fms樣酪氨酸激酶3 (FLT-3)，或受體型酪氨酸-蛋白質(zhì)激酶。⑶135是一種在造血的祖細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞因子受體。人類⑶135完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P36888 (2012年7月26 曰)。
[0055]如本文使用 的術(shù)語“SLAMF1”涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞的激活分子，是一種在人類中由SLAMFl基因編碼的蛋白質(zhì)。近來SLAMFl同樣被指定為⑶150 (分化抗原簇150)。人類SLAMFl完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Q13291 (2012年7月26日)。
[0056]如本文所使用的術(shù)語“Mac-Ι (⑶lib)”涉及整合蛋白a M (ITGAM)，是一種形成異質(zhì)二聚體的整合蛋白α-Μβ-2 ( αΜβ 2)分子的蛋白質(zhì)亞基，也稱為巨噬細(xì)胞-1抗原(Macl)或補(bǔ)體受體3(CR3)。ITGAM也稱為CR3A，分化抗原分子簇llB(CDllB)。人類Mac-1完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P11215 (2012年7月26日)。
[0057]所述術(shù)語“l(fā)in”涉及譜系標(biāo)志物，設(shè)計(jì)一種標(biāo)準(zhǔn)的雞尾酒式的抗體以從樣品中移出成熟的造血細(xì)胞。那些抗體靶向是在小鼠中的CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、TER-119、和Gr-Ι，以及在人類中的⑶3 (T淋巴細(xì)胞)、⑶14 (單核細(xì)胞)、⑶16 (NK細(xì)胞，粒細(xì)胞)、⑶19 (B淋巴細(xì)胞)、⑶20 (B淋巴細(xì)胞)和CD56 (NK細(xì)胞)。
[0058]“祖細(xì)胞”涉及一種通過分化衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞，并且能夠進(jìn)一步分化為更成熟細(xì)胞類型。相較于干細(xì)胞，祖細(xì)胞典型地具有更多受限制的增殖能力。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是一種衍生自HSC通過在從HSC到分化功能的細(xì)胞期間分化的造血祖細(xì)胞。所述造血祖細(xì)胞的特征在于標(biāo)記物⑶34+⑶38-⑶90-⑶45RA-。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，優(yōu)選地人類細(xì)胞。
[0059]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是早期多潛能祖細(xì)胞(早期MPP)，其特征在于 CD34+、SCA-1+, Thyl.1-、C-kit+, lin-、CD135+、Slamf 1/CD150-、Mac-1 (CDllb)低、CD4低。
[0060]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是晚期多潛能祖細(xì)胞(延遲MPP)，限定為CD34+、SCA-1+、Thy 1.1-、C-kit+, lin-、CD 135 高、Slamf 1/CD150-、Mac-1 (CDllb)低、CD4低。
[0061]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是譜系受限的祖細(xì)胞(LRP)細(xì)胞，其特征在于 CD150-CD48+CD244+。
[0062]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是普通骨髓祖細(xì)胞(CMP)，即產(chǎn)生骨髓細(xì)胞的群落形成單位，特征在于⑶34+⑶38+IL3Ra低⑶45RA-。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)，成單核細(xì)胞和原粒細(xì)胞的前體，特征在于CD34+CD38+IL3Ra-CD45Ra-。
[0063]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞(MEP)，特征在于 CD34+CD38+IL3RA+CD45RA-。
[0064]如本文所使用的術(shù)語“CD4”涉及分化抗原簇4。它是一種在免疫細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)的糖蛋白，例如T輔助細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。CD4是一種共-受體，其輔助T細(xì)胞受體(TCR )與抗原呈遞細(xì)胞。利用它的位于T細(xì)胞內(nèi)部的部分，CD4通過招募酶來放大通過TCR產(chǎn)生的信號(hào)，所述酶已知為酪氨酸激酶lck，其對(duì) 于激活包含在激活T細(xì)胞的信號(hào)級(jí)聯(lián)中的許多分子是必不可少的。CD4利用它的胞外域也直接地與在抗原呈遞細(xì)胞表面上的II類MHC分子相互作用。人類⑶4完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P01730 (2012年7月26日)。
[0065]如本文使用的術(shù)語“⑶244”涉及⑶244分子，天然殺傷細(xì)胞受體2B4。該基因編碼一種在天然殺傷(NK)細(xì)胞(和一些T細(xì)胞)上表達(dá)的細(xì)胞表面受體，其介導(dǎo)非-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制的殺傷。通過這個(gè)受體在NK-細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的相互作用被認(rèn)為是調(diào)節(jié)NK-細(xì)胞細(xì)胞溶解的活性。人類CD244的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Q9BZW8(2012 年 7 月 26 日)。
[0066]如本文使用的術(shù)語“IL3RA”涉及白細(xì)胞介素3受體，α (低親合力)(IL3RA)，也稱為⑶123 (分化抗原簇123)，是一種41.3Kda的I類跨膜蛋白，IL3RA已經(jīng)顯示出與白細(xì)胞介素3相互作用。人類的IL3RA完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P26951 (2012年7月26日)。
[0067]如本文使用的術(shù)語“間質(zhì)干細(xì)胞”或“MSC”，復(fù)數(shù)形式“MSCs”，涉及一種多能基質(zhì)細(xì)胞，其能夠分化為各種細(xì)胞類型，包括:成骨細(xì)胞(骨細(xì)胞)、軟骨細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)和脂肪細(xì)胞(脂肪細(xì)胞)。通過間質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記包括CD105(SH2)、CD73(SH3/4)、CD44、CD90 (Thy-1)、CD71和Stro-1,以及粘著分子CD106、CD166和CD29。MSC陰性的標(biāo)記(沒有表達(dá))是造血標(biāo)記⑶45、⑶34、⑶14，和共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40以及粘著分子⑶31。
[0068]如本文使用的術(shù)語“⑶105”涉及內(nèi)皮糖蛋白，一種位于細(xì)胞表面的I類糖蛋白，是TGFii受體復(fù)合體的一部分。人類⑶105的完整的蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P17813(2012 年 7 月 26 日)。
[0069]如本文使用的術(shù)語“⑶73”涉及5’ -核苷酸酶(5’ -NT),也稱為外_5’ -核苷酸酶或⑶73 (分化抗原簇73)，是一種在人類中由NT5E基因編碼的酶。人類⑶73的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P21589 (2012年7月26日)。
[0070]術(shù)語“CD44”涉及抗原，是在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞粘著和遷移中涉及的細(xì)胞表面糖蛋白。人類CD44的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P16070(2012年7月26日)。
[0071]如本文使用的術(shù)語“⑶71”涉及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白I (TfRl)，也稱為(分化抗原簇71) (CD71)，是鐵從鐵傳遞蛋白向細(xì)胞傳遞所需要的蛋白質(zhì)。人類CD71的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P02786 (2012年7月26日)。
[0072]如本文使用的術(shù)語“STR0-1 ”涉及由骨髓基質(zhì)細(xì)胞和紅細(xì)胞前體表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。
[0073]術(shù)語“⑶106”涉及血管的細(xì)胞粘連蛋白1，也稱為血管的細(xì)胞粘著分子I (VCAM-1)或分化抗原簇106 (CD106)，是一種在人類中由VCAMl基因編碼并用作細(xì)胞粘著分子的蛋白。人類CD106的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)P19320 (2012年7月26日)。
[0074]如本文使用的“⑶166”涉及一種100_105kD的I類跨膜糖蛋白，其是蛋白質(zhì)的免疫球蛋白超家族的成員。人類⑶166的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Q13740 (2012年7月26日)。
[0075]如本文使用的術(shù)語“⑶29”涉及一種整聯(lián)蛋白β-l，是一種與極晚期抗原受體相關(guān)的整聯(lián)單元。人類⑶29的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ05556 (2012年7月26日)。
[0076]如本文使用的術(shù)語“⑶14”涉及分化抗原簇14，其是先天的免疫系統(tǒng)的組分。人類CD14的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ08571 (2012年7月26日)。 [0077]如本文使用的術(shù)語“⑶80”分化抗原簇80 (同樣⑶80和B7_l)是在激活的B細(xì)胞和單核細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，其提供一種T細(xì)胞激活和存活所必需的共刺激信號(hào)。人類CD80的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ33681 (2012年7月26日)。
[0078]如本文使用的術(shù)語“⑶86”涉及分化抗原簇86 (也稱為⑶86和Β7_2)，是在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的蛋白，其提供T細(xì)胞激活和存活所必需的共刺激信號(hào)。人類CD86的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ42081 (2012年7月26日)。
[0079]如本文使用的術(shù)語“⑶40”，涉及一種在抗原遞呈細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的共刺激蛋白，并為抗原遞呈細(xì)胞的激活所需。人類⑶40的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ25942 (2012年7月26日)。
[0080]如本文使用的術(shù)語“⑶31”涉及一種血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘著分子(PECAM-1)，也稱為分化抗原簇31 (CD31)，是在從身體中移除老化嗜中性粒細(xì)胞起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。人類CD31的完整蛋白質(zhì)序列具有UniProt登錄號(hào)Ρ16284(2012年7月26日)。
[0081]可以測(cè)定在細(xì)胞中標(biāo)記的存在與否，舉例來說通過使用常規(guī)方法和設(shè)備的流式細(xì)胞儀。比如可以使用一種具有市場(chǎng)上可獲得的抗體和在本領(lǐng)域已知的實(shí)驗(yàn)方案的BD LSR IIF流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)公司，富蘭克林湖，新澤西州，美國(guó))。因而，可以選擇放射一種對(duì)于特定細(xì)胞表面標(biāo)記比背景噪音更強(qiáng)烈的信號(hào)的細(xì)胞。背景信號(hào)定義為與用來在常規(guī)的FACS分析中檢測(cè)每個(gè)表面標(biāo)記的特異性抗體的相同的同種型的非特異性的抗體給出的信號(hào)強(qiáng)度。為了使一種標(biāo)記被認(rèn)為是陽性的，觀察到的特異的信號(hào)必須是相較于使用常規(guī)方法和設(shè)備的背景信號(hào)(例如通過使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD生物科學(xué)公司，富蘭克林湖，新澤西州，美國(guó))和市場(chǎng)上可獲得的抗體)強(qiáng)20%、優(yōu)選地30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、500%、1000%、5000%、10000%或以上。否則，認(rèn)為細(xì)胞對(duì)于所述標(biāo)記是陰性的。
[0082]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，用于根據(jù)治療A來治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞是HSC，所述細(xì)胞具有激活的fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述細(xì)胞是LT-HSC 或 ST-HSC。
[0083]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，用于根據(jù)治療A來治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞是祖細(xì)胞，所述細(xì)胞具有激活的fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中,所述祖細(xì)胞是早期 MPP、晚期 MPP、LRP、CMP、GMP 或 MEP。
[0084]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，用于根據(jù)治療A來治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞是MSC，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。
[0085]根據(jù)本發(fā)明用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療的細(xì)胞可以形成所述細(xì)胞群的部分，所述細(xì)胞用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)額外的方面。
[0086]因而，在其它的方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種包括多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路，并且選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組，用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療。因此，根據(jù)這個(gè)方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞群，其包括多個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞細(xì)胞選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組，其中所述細(xì)胞的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的，用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療。
[0087]換言之，本發(fā)明涉及一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的包括多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞選自由HSC、祖細(xì)胞、MSC及其任何組合所組成的組，其中所述細(xì)胞用Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理，或用fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理，和/或所述細(xì)胞過表達(dá)Wnt/ β -連環(huán)蛋 白信號(hào)通路激活劑。由于所述治療,或操作細(xì)胞來過表達(dá)fct/β_連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑的蛋白質(zhì)或肽，所述細(xì)胞群的細(xì)胞具有激活的fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，可以用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療。為此將細(xì)胞群植入需要視網(wǎng)膜變性疾病治療的受試者的眼睛中。
[0088]可選擇地設(shè)計(jì)本發(fā)明的這個(gè)方面涉及包括多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群在制備用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療的藥物組合物中的用途，所述細(xì)胞具有它們的激活的fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路，并且選自由HSC、祖細(xì)胞、MSC及其任何組合所組成的組；或可選擇地，涉及包括多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群在制備用于視網(wǎng)膜變性疾病的治療的藥物組合物中的用途，所述細(xì)胞選自由HSC、祖細(xì)胞、MSC及其任何組合所組成的組，其中所述細(xì)胞用Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理，或用fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理，和/或所述細(xì)胞過表達(dá)Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，通過這種方式所述激活所述fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。
[0089]所述HSC、祖細(xì)胞和MSCs的詳情參見上文。上述的治療的具體目標(biāo)在于激活Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，這將在下文論述。
[0090]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群其包括多種(即超過兩種的HSs)，所述細(xì)胞具有激活的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述HSC選自LT-HSC、ST-HSC及其組合。
[0091]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群，其包括多種祖細(xì)胞，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞選自早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP及其組合。
[0092]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群，包括多種MSC，所述細(xì)胞具有激活的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。
[0093]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群包括至少一種HSC和至少一種祖細(xì)胞，所述細(xì)胞具有激活的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述HSC細(xì)胞是LT-HSC或ST-HSC ;在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是早期 ΜΡΡ、晚期 MPP、LRP、CMP、GMP、ΜΕΡ。
[0094]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群包括至少一種HSC和至少一種MSC，所述細(xì)胞具有激活的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述HSC細(xì)胞是LT-HSC或ST-HSC。
[0095]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群其包括至少一種祖細(xì)胞和至少一種MSC，所述細(xì)胞具有激活的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP。
[0096]在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，根據(jù)治療Α，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的所述細(xì)胞群包括至少一種HSC、至少一種祖細(xì)胞和至少一種MSC，所述細(xì)胞具有激活的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述HSC細(xì)胞是LT-HSC或ST-HSC ;在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述祖細(xì)胞是早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP。
[0097]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可從骨髓獲得的包括HSC、前體細(xì)胞和MSC的細(xì)胞群，本文有時(shí)定義為“HSPC”，即“造血的干細(xì)胞和祖細(xì)胞”。所述細(xì)胞群HSPC可以包括不同的比值或比例的HSC、祖細(xì)胞和MSC。所述HSPC細(xì)胞群可以舉例來說，從骨髓獲得，或可選擇地通過以所需比值或比例混合HSC、祖細(xì)胞和MSC，來獲得HSPC細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述細(xì)胞群通過傳 統(tǒng)方法可以富集以任何類型特定細(xì)胞，例如，通過任何合適的基于使用用于相應(yīng)表面標(biāo)記的結(jié)合對(duì)的技術(shù)分離特定類型的細(xì)胞。因而，在一個(gè)具體的實(shí)施例中，HSPC細(xì)胞群可以富集HSC，或祖細(xì)胞，或MSC。為了使所述定義為HSPC的細(xì)胞群合適用于根據(jù)治療A治療視網(wǎng)膜變性疾病，必要的是所述細(xì)胞群的細(xì)胞具有激活的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路。
[0098]為了在本領(lǐng)域的教導(dǎo)下使用，為了最小化最終排斥或不希望有的副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，所述細(xì)胞可以來自相同受試者，即自體的，所述細(xì)胞具有激活的fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路并選自由造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞所組成的組，用于根據(jù)本發(fā)明的視網(wǎng)膜變性疾病的治療，或所述細(xì)胞群用于根據(jù)本發(fā)明的視網(wǎng)膜變性疾病的治療；盡管如此，本發(fā)明同時(shí)預(yù)期異源的細(xì)胞的用途，即來自其他的與受體受試者同種的受試者的細(xì)胞，其中，雖然視網(wǎng)膜具有低的免疫反應(yīng)，但仍然推薦使用全身的或局部的免疫抑制劑，因此可以使用兼容來自不同的人類受試者的細(xì)胞，只要所述細(xì)胞選自HSC、祖細(xì)胞和MSC，并經(jīng)受一種治療或操作來使它們的fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路如上所述被激活。
[0099]表述“Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路”涉及一種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞極性產(chǎn)生中發(fā)揮多種作用。除非另有陳述，它涉及典型的fct通路和包括當(dāng)Wnt蛋白質(zhì)與Frizzled家族的細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí)發(fā)生的一系列作用，引起受體來激活散亂蛋白(Dishevelled)家族蛋白質(zhì)并最終導(dǎo)致到達(dá)細(xì)胞核的β-連環(huán)蛋白的量的變化。散亂蛋白(DSH)是膜-關(guān)聯(lián)Wnt受體復(fù)合體的關(guān)鍵組分，當(dāng)通過Wnt結(jié)合激活時(shí)其抑制包括axin、糖原合酶激酶3 (GSK-3),和結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)的第二蛋白質(zhì)的復(fù)合體。所述axin/GSK-3/APC復(fù)合體通常促進(jìn)β_連環(huán)蛋白胞內(nèi)的信號(hào)分子的蛋白降解。在抑制這個(gè)β_連環(huán)蛋白破壞復(fù)合體之后，細(xì)胞質(zhì)的β-連環(huán)蛋白池穩(wěn)定，一些β-連環(huán)蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞核并與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用來促進(jìn)特異基因表達(dá)。幾種蛋白質(zhì)激酶和蛋白質(zhì)磷酸酶已經(jīng)證明與細(xì)胞表面Wnt-激活的Wnt受體復(fù)合體結(jié)合到axin,和分解axin/GSK3復(fù)合體的能力有關(guān)。通過CKl和GSK3，LRP的胞質(zhì)域的磷酸化作用可以調(diào)節(jié)axin結(jié)合到LRP。GSK3的蛋白激酶活性似乎對(duì)于膜-相關(guān)Wnt/FRZ/LRP/DSH/Axin復(fù)合體的形成，以及Axin/APC/GSK3/P-連環(huán)蛋白復(fù)合體的功能都是重要的。通過GSK3的β-連環(huán)蛋白的磷酸化作用導(dǎo)致β_連環(huán)蛋白的破壞。
[0100]如本文使用的“Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑”是指能夠激活Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的分子。一般而言，當(dāng)所述靶基因轉(zhuǎn)錄時(shí)fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活；舉例說明，通過分析靶基因的表達(dá)可以證實(shí)fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活，例如Axin2，通過RT-PCR，或通過檢測(cè)在細(xì)胞的細(xì)胞核中的Wnt/ β -連環(huán)蛋白易位，通過例如免疫染色，或通過檢測(cè)散亂蛋白的磷酸化或LRP尾部的磷酸化等等。Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑可以作用在fct信號(hào)蛋白的膜受體上，和作用于包括信號(hào)級(jí)聯(lián)的蛋白質(zhì)上。說明性而非限制性的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑的例子包括肽或蛋白質(zhì)，以及除了肽或蛋白質(zhì)的化合物(即非肽藥物，如:
[0101]-肽或蛋白質(zhì)，例如Wnt 蛋白亞型，如 Wntl、Wnt2> Wnt2b/13> Wnt3> Wnt3a> Wnt4>Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntIOb> Wntll 或者Wntl6 ; β -連環(huán)蛋白；脊椎蛋白(spondin)，如R-spondin等；或者其功能化變體,例如與先前提及的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少40%，典型的至少50%，有利地至少60%，優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地至少80%,更加優(yōu)選地至少90%同一性的氨基酸序列的肽或蛋白質(zhì)，且其保持激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路能力；或
[0102]-非妝化合物，例如Gilbert等在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,第20卷，第一版，2010年I月I日，366-370中公開的2-(4-乙?；脚嫉?_2_ (3，3-二甲基-3,4-二氫-2H-異喹啉-1-基亞基)-乙酰胺(IQl)、(2S)-2-[2-(茚滿-5-基氧基)-9-(1，1'-聯(lián)苯-4-基)甲基)-9H-嘌呤-6-基氨基]-3-苯基-丙-1-醇(QS11)、脫氧膽酸(DCA)、2-氨基-4-[3，4-( 二甲叉氧基)芐基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶或(雜)芳基嘧啶。
[0103]屬于Wnt分泌蛋白質(zhì)家族,并用作Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活劑的Wnt蛋白質(zhì)亞型的例子，包括下列或其同源基因(Swiss-prot參考文獻(xiàn)):
[0104]人類:Wntl:P04628 ；Wnt2:P09544 ；Wnt2b/13:Q93097 ；Wnt3:P56703 ；Wnt3a:P56704 ；Wnt4:P56705 ；Wnt5a:P41221 ；Wnt5b:Q9H1J7 ；Wnt6:Q9Y6F9 ；Wnt7a:000755 ；Wnt7b:P56706 ；Wnt8a:Q9H1J5 ；Wnt9a:014904 ；Wnt9b:014905 ；Wntl0a:Q9GZT5 ；Wntl0b:000744 ；Wnt 11:096014 ；Wntl6:Q9UBV4;
[0105]小鼠:ffntl:P04426 ；Wnt2:P21552.1 ；Wnt2b/13:070283.2 ；Wnt3:P17553 ；Wnt3a:P27467 ；Wnt4:P22724；Wnt5a:P22725 ；Wnt5b:P22726 ；Wnt6:P22727.1 ；Wnt8a:Q64527 ；Wnt9a:Q8R5M2 ；Wnt9b:035468.2 ；Wntl0a:P70701 ；Wntl0b:P48614 ；ffntll:P48615 ；Wnt16:Q9QYS1.1 ；
[0106]以及其功能亞型、變型或片段，即具有激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的能力的功能亞型、變型或片段。[0107]β -連環(huán)蛋白的例子包括下列或它的同源基因(Swiss-prot參考文獻(xiàn)):
[0108]人類:P35222；
[0109]小鼠:Q02248;
[0110]以及其功能亞型、變型或片段，即具有激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的能力的功能亞型、變型或片段。
[0111]R-脊椎蛋白(RSpo)是典型的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的4種分泌的激動(dòng)劑，也稱為富含半胱氨酸和包含單血小板反應(yīng)蛋白域的蛋白質(zhì)(Cristins)，R-脊椎蛋白共享大概 40% 的氨基酸同一性(Lowther, W.等(2005) J.Virol.79:10093; Kim, K.-Α.等(2006)Cell Cycle5:23)。所有的R-脊椎蛋白都包含兩個(gè)鄰近的富含半胱氨酸弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域，隨后是血小板反應(yīng)蛋白(TSP-1)基序和堿性殘留物富集的區(qū)域。僅弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域是 β _ 連環(huán)蛋白穩(wěn)定所需要的(Kim, K.-A.等(2006) Cell Cycle5:23;Kazanskaya, 0.等(2004)Dev.Cell7:525)。在小鼠中注射重組R-脊椎蛋白I引起β _連環(huán)蛋白的激活和腸隱窩上皮細(xì)胞的增殖，并改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎(Kim，K.-A.等(2005) Science309:1256; Zhao，J.等(2007)Gastroenterologyl32:1331) ? R-脊椎蛋白 I (RSPOl)似乎通過與 Wnt 拮抗劑DKK-1競(jìng)爭(zhēng)，與Wnt共-受體的結(jié)合，Kremen來調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白。這個(gè)競(jìng)爭(zhēng)降低DKK-1/LRP-6/Kremen 復(fù)合體的內(nèi)化作用(Binnerts, M.E.et al.等(2007) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA104:147007)。R-Spondins脊椎蛋白的說明性而非限制性的例子包括下列或它的同源基因(Swiss-prot參考文獻(xiàn))，其充當(dāng)用作Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的激活劑:
[0112]人類:R-脊椎蛋白-1:Q2MKA7 ;R_ 脊椎蛋白 _2:Q6UXX9 ;R_ 脊椎蛋白 _3:Q9BXY4 ；R-脊椎蛋白-4:Q210M5，或它的功能型亞型、變型或片段，即具有激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的能力的它的功能 的亞型、變型或片段，例如維持它們的功能型區(qū)域的它們的亞型、變型或片段。
[0113]所述(雜)芳基嘧啶的說明性而非限制性的例子包括下列式(I)-(IV)的化合物。
[0114]在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述(雜)芳基嘧啶是式(I)、(II)、(III)或(IV)的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的(雜)芳基嘧啶激動(dòng)劑[表1]。
[0115]表1
[0116]Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路的(雜)芳基嘧啶激動(dòng)劑的說明性的例子
[0117]
[0118]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)所組成的組，其中所述細(xì)胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是一種用Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑處理，或用Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理的細(xì)胞，和/或是一種過表達(dá)fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白通路激活劑選自由fct亞型、β-連環(huán)蛋白、R-脊椎蛋白、2-(4-乙酰基苯偶氮基)-2- (3，3- 二甲基-3，4- 二氫-2H-異喹啉-1-基亞基)-乙酰胺(IQl)、{2S) ~2~ [2~ (茚滿-5-基氧基)-9- (1，I’ -聯(lián)苯-4-基)甲基)-W-嘌呤-6-基氨基]-3-苯基-丙-1-醇(QSll)、脫氧膽酸(DCA)、2_氨基_4_[3，4_(亞甲基二氧基)芐基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表1所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)(雜)芳基嘧啶，及其組合所組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞，其中所述Wnt/β -連環(huán)蛋白通路阻斷劑的抑制劑是選自GSK-3抑制劑、SFRPl抑制劑，及其組合所組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是選自由色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、斯特格病、視錐細(xì)胞-視柱細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良、先天性靜止性夜盲、利伯先天性黑朦、貝斯特卵黃狀黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、前部缺血性視神經(jīng)病變、無脈絡(luò)膜、年齡相關(guān)性黃斑變性、黃斑中心營(yíng)養(yǎng)不良、Bietti晶體角膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、尤塞氏綜合癥，和衍生自初級(jí)病變的視網(wǎng)膜變性情況所組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述視網(wǎng)膜變性衍生自白內(nèi)障、糖尿病或者青光眼。
7.用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其包含多種細(xì)胞，所述細(xì)胞是選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組，其中所述細(xì)胞的Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是用Wnt/β_連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或者fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑處理的細(xì)胞，和/或是過表達(dá)fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白通路激活劑是選自由fct亞型、β-連環(huán)蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QSlU DCA、2-氨基-4-[3，4-(亞甲基二氧基)芐基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表1中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(雜)芳基嘧啶，及其組合所組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑是選自由GSK-3抑制劑、SFRPl抑制劑，及其組合所組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是選自由色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、斯特格病、視錐細(xì)胞-視柱細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良、先天性靜止性夜盲、利伯先天性黑朦、貝斯特卵黃狀黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、前部缺血性視神經(jīng)病變、無脈絡(luò)膜、年齡相關(guān)性黃斑變性、黃斑中心營(yíng)養(yǎng)不良、Bietti晶體角膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、尤塞氏綜合癥，和衍生自初級(jí)病變的視網(wǎng)膜變性情況所組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜變性衍生自白內(nèi)障、糖尿病或者青光眼。
13.一種用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞，其選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)所組成的組，所述治療通過在受試者的眼睛中所述細(xì)胞與所述視網(wǎng)膜細(xì)胞在所述細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞接觸后的融合介導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞的重編進(jìn)行，所述重排由視網(wǎng)膜細(xì)胞的Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路介導(dǎo)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白通路激活劑是選自由fct亞型、β_連環(huán)蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QS11、DCA、2-氨基-4-[3，4-(亞甲基二氧基)芐基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表格I中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(雜)芳基嘧啶，及其組合所組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑選自由GSK-3抑制劑、SFRPl抑制劑，及其組合所組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是選自由色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、斯特格病、視錐細(xì)胞-視柱細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良、先天性靜止性夜盲、利伯先天性黑朦、貝斯特卵黃狀黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、前部缺血性視神經(jīng)病變、無脈絡(luò)膜、年齡相關(guān)性黃斑變性、黃斑中心營(yíng)養(yǎng)不良、Bietti晶體角膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、尤塞氏綜合癥，和衍生自主病癥的視網(wǎng)膜變性情況所組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利 要求17所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞，其中所述視網(wǎng)膜變性衍生自白內(nèi)障、糖尿病或者青光眼。
19.一種用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其包含多種細(xì)胞，所述細(xì)胞是選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組，所述治療通過在受試者的眼睛中所述細(xì)胞與所述視網(wǎng)膜細(xì)胞在所述細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞接觸后的融合介導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行，所述重編通過視網(wǎng)膜細(xì)胞的fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路介導(dǎo)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑，或fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞群，其中所述Wnt/β -連環(huán)蛋白通路激活劑是選自由fct亞型、β-連環(huán)蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QSlU DCA、2-氨基-4-[3，4-(亞甲基二氧基)芐基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表格I中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(雜)芳基嘧啶，及其組合所組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞群，其中所述Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑選自由GSK-3抑制劑、SFRPl抑制劑，及其組合所組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是選自由色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、斯特格病、視錐細(xì)胞-視柱細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良、先天性靜止性夜盲、利伯先天性黑朦、貝斯特卵黃狀黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、前部缺血性視神經(jīng)病變、無脈絡(luò)膜、年齡相關(guān)性黃斑變性、黃斑中心營(yíng)養(yǎng)不良、Bietti晶體角膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、尤塞氏綜合癥，和衍生自主病癥的視網(wǎng)膜變性情況所組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜變性衍生自白內(nèi)障、糖尿病或者青光眼。
25.—種細(xì)胞組合物，其中細(xì)胞組合物的至少50%的細(xì)胞選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)所組成的組的細(xì)胞，和其中所述細(xì)胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的。
26.—種藥物組合物，其選自下列的組: 1)一種藥物組合物，其包括至少一種選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，其中激活所述細(xì)胞的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，和 2)—種藥物組合物，其包括至少一種選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合所組成的組的細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，與Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑或fct/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷劑的抑制劑組合。
27.—種試劑盒，其選自下列的組: 1)一種試劑盒，其包括至少一種選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合物所組成的組的細(xì)胞，和使用試劑盒組分的說明書，其中所述細(xì)胞的fct/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路是激活的，和 2)—種試劑盒，其包括至少一種選自由造血干細(xì)胞(HSC)、祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其任意組合物所組成的組的細(xì)胞，其與fct/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活劑或Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路阻斷 劑的抑制劑組合，和使用試劑盒組分的說明書。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的試劑盒，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是選自由色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、斯特格病、視錐細(xì)胞-視柱細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良、先天性靜止性夜盲、利伯先天性黑朦、貝斯特卵黃狀黃斑營(yíng)養(yǎng)不良、前部缺血性視神經(jīng)病變、無脈絡(luò)膜、年齡相關(guān)性黃斑變性、黃斑中心營(yíng)養(yǎng)不良、Bietti晶體角膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、尤塞氏綜合癥，和衍生自初級(jí)病變的視網(wǎng)膜變性情況所組成的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用于治療視網(wǎng)膜變性疾病的試劑盒，其中所述視網(wǎng)膜變性衍生自白內(nèi)障、糖尿病或者青光眼。
【文檔編號(hào)】C12N5/0793GK104011203SQ201280049453
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】瑪麗亞·皮婭·卡斯馬, 丹妮拉·桑格斯 申請(qǐng)人:瑪麗亞·皮婭·卡斯馬, 丹妮拉·桑格斯