使用輔酶a轉(zhuǎn)移酶的有機酸的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機酸的制造方法，是通過以乙酰輔酶A作為底物生物化學(xué)地合成有機酸輔酶A，使用輔酶A轉(zhuǎn)移酶在乙酸的存在下進行所述有機酸輔酶A的輔酶A消除反應(yīng)，來制造有機酸的方法，其中，培養(yǎng)具有以乙酰輔酶A作為底物生成有機酸輔酶A的酶基因群和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)化微生物，得到有機酸。
【專利說明】使用輔酶A轉(zhuǎn)移酶的有機酸的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用輔酶A轉(zhuǎn)移酶的有機酸類的生物化學(xué)制造方法。更詳細地說，涉及使用了產(chǎn)生催化有機酸輔酶A的輔酶A消除反應(yīng)的輔酶A轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化微生物的、碳收率和能量效率優(yōu)異的有機酸類的生物化學(xué)制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]最近，從化石資源的枯竭和/或地球溫暖化對策的觀點出發(fā)，要求向由可再生資源的化學(xué)品制造工藝、所謂生物煉制的轉(zhuǎn)換。特別是對于可以從生物質(zhì)高效地生物化學(xué)獲得的各種有機酸類，廣泛地研究了作為新一代的化學(xué)阻塞(chemical block)的應(yīng)用。例如，羥基羧酸類除了是精密有機化學(xué)品的合成原料之外，還是作為已知由微生物蓄積生產(chǎn)的生物聚酯、聚羥基烷酸(PHA)的單體單元已知的有用化合物。特別是關(guān)于作為代表性的來源于微生物的PHA的聚-3-羥基丁酸，以其作為生物降解性聚合物的性質(zhì)受到關(guān)注的1980~1990年代為中心，努力地嘗試了其生物合成途徑的闡明和/或生產(chǎn)性提高。近年來，其構(gòu)成單元3-羥基丁酸作為化學(xué)阻塞(chemical block)的將來性再次受到關(guān)注，提出了各種3-羥基丁酸單體的生物化學(xué)制法。[0003]具體地，已知以下方法:提取在微生物菌體內(nèi)蓄積的聚-3-羥基丁酸，使具有其分解活性的酶或微生物作用，從而進行水解，得到作為單體單元的(R)-3-羥基丁酸的方法(非專利文獻I);在聚-3-羥基丁酸生產(chǎn)菌的活體內(nèi)，使聚-3-羥基丁酸解聚酶高表達，從而將生成的3-羥基丁酸低聚物依次分解，在培養(yǎng)中獲得(R)-3-羥基丁酸的方法(非專利文獻2);對活體內(nèi)的3-羥基丁酸前體3-羥基丁酰輔酶A，使共表達的磷酸轉(zhuǎn)丁?；?phosphotransbutyrylase, ptb)、丁酸激酶(buk)依次作用，從而通過與磷酸化反應(yīng)的共軛而消除輔酶，在培養(yǎng)中獲得(R)-3-羥基丁酸的方法(非專利文獻3);同樣地對3-羥基丁酰輔酶A，使共表達的硫解酶作用而消除輔酶A，在培養(yǎng)中得到3-羥基丁酸的方法(非專利文獻4)等。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0005]非專利文獻
[0006]非專利文獻1: Calabia, B.P.，Tokiwa, Y.，2004.Microbial degradationof poly (d-3-hydroxybutyrate)by a new thermophilic Streptomyces isolate.Biotechnol.Lett.26, 15-19.[0007]非專利文獻2:Lee, S.Y.，Lee, Y.，2003.Metabolic engineering of Escherichiacoli for production of enantiomerically pure (R)-(-)-hydroxycarboxylic acids.App1.Environ.Microbiol.69, 3421-3426.[0008]非專利文獻3:Gao, H.J.，Wu, Q.，Chen, G.Q.，2002.Enhanced production ofd-(-)-3-hydroxybutyric acid by recombinant Escherichia col1.FEMS microbiol.Lett.213, 59-65.[0009]非專利文獻4:Tseng et al., “Metabolic Engineering of E.coli forEnhanced Production of (R) -and (S) -3-Hydroxybu tyr ate，，，2009, App 1.Environ.Microbiol.，75，3137-3145.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明要解決的課題
[0011]然而，這些提案的制法的經(jīng)濟性不能說充分，要求生產(chǎn)性的進一步提高。例如，非專利文獻I的方法中，需要發(fā)酵、提取、分解這樣的復(fù)雜工序。在非專利文獻2的方法中，通過厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸然后水解，因而生產(chǎn)速度慢。在非專利文獻3和4的方法中，碳收率低、3-羥基丁酸的生產(chǎn)性不充分。
[0012]因此，本發(fā)明的課題是提供生成速度、碳收率和能量效率優(yōu)異的有機酸類、特別是3-羥基丁酸單體的生物化學(xué)制造方法。
[0013]用于解決課題的方法
[0014]本
【發(fā)明者】們仔細查看了上述非專利文獻I~4中記載的見解，以由與輔酶A的共軛而形成的有機酸生物合成途徑中的本質(zhì)的反應(yīng)效率的提高為目標進行了深入研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加于反應(yīng)體系內(nèi)的乙酸的存在下，至少以乙酰輔酶A作為底物生物化學(xué)地合成有機酸輔酶A，通過輔酶A轉(zhuǎn)移酶來進行所述有機酸輔酶A的輔酶A消除反應(yīng)，從而可以有效地提高有機酸類的生產(chǎn)性，從而完成了本發(fā)明。
[0015]即，本發(fā)明涉及以下[I]~[9]所示的有機酸的制造方法。
[0016][I]有機酸的制造方法，其特征在于，以乙酰輔酶A作為底物生物化學(xué)地合成有機酸輔酶A，使用輔酶A轉(zhuǎn)移酶在乙酸的存在下進行所述有機酸輔酶A的輔酶A消除反應(yīng)。
[0017][2]根據(jù)前項I所述的有機酸的制造方法，輔酶A轉(zhuǎn)移酶是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、或其同源物。
[0018][3]根據(jù)前項I或2所述的有機酸`的制造方法，有機酸是碳數(shù)3~6的羧酸。
[0019][4]根據(jù)前項3所述的有機酸的制造方法，有機酸是碳數(shù)3~6的羥基羧酸。
[0020][5]根據(jù)前項4所述的有機酸的制造方法，有機酸是3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、或3-羥基己酸。
[0021][6]根據(jù)前項I~5的任一項所述的有機酸的制造方法，將轉(zhuǎn)化微生物在乙酸的存在下進行培養(yǎng)，從而得到有機酸，所述轉(zhuǎn)化微生物具有以乙酰輔酶A作為底物而生成有機酸輔酶A的酶基因群和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。
[0022][7]根據(jù)前項6所述的有機酸的制造方法，將轉(zhuǎn)化微生物在乙酸的存在下進行培養(yǎng)，從而得到3-羥基丁酸，所述轉(zhuǎn)化微生物具有以乙酰輔酶A作為底物而生成3-羥基丁酰輔酶A的酶基因群和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。
[0023][8]根據(jù)前項7所述的有機酸的制造方法，以乙酰輔酶A作為底物而生成3-羥基丁酰輔酶A的酶基因群是β-酮硫解酶基因或其同源物、和乙酰乙酰輔酶A還原酶基因或其同源物，輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因或其同源物。
[0024][9]根據(jù)前項6~8的任一項所述的有機酸的制造方法，微生物是大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌、或梭菌。
[0025]發(fā)明的效果
[0026]本發(fā)明提供有機酸的制造方法，該方法是伴有至少以乙酰輔酶A作為底物生物化學(xué)地合成的有機酸輔酶A的輔酶A的消除的各種有機酸的制造方法，其中，在添加于反應(yīng)體系內(nèi)的乙酸的存在下，使用與有機酸的輔酶A消除反應(yīng)共軛的乙酸的輔酶A轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，在由與輔酶A的共軛而形成的有機酸生物合成途徑中，活性中間體有機酸輔酶A的自由能，在由與存在于體系內(nèi)的乙酸的共軛而形成的輔酶A轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，作為乙酰輔酶A而被回收。生成的乙酰輔酶A與有機酸生物合成的原料乙酰輔酶A等價，再次被攝入有機酸生物合成途徑中，其自由能在碳骨架延伸反應(yīng)中被再利用。另外，該過程中供給的乙酸自身也作為有機酸生物合成途徑的碳骨架源被利用，從而實現(xiàn)了不發(fā)生物質(zhì)的損失、在生成速度、能量效率和碳收率的任一方面均優(yōu)異的有機酸的生物化學(xué)合成。
[0028]在本發(fā)明的方法中，必須在添加于反應(yīng)體系內(nèi)的乙酸的存在下進行反應(yīng)。此外，通常已知在大多微生物中，在其利用糖質(zhì)等的增殖過程中作為副產(chǎn)物排出乙酸。在本發(fā)明中，利用這樣副產(chǎn)的乙酸作為目的的有機酸合成中的輔酶A轉(zhuǎn)移的供體，進而轉(zhuǎn)移反應(yīng)所生成的乙酰輔酶A作為有機酸合成的碳骨架被利用，也有助于培養(yǎng)基碳源向目的反應(yīng)的有效利用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是實施例1所構(gòu)建的質(zhì)粒pTV118NpctAB的基因圖譜。
[0030]圖2是比較例3所構(gòu)建的質(zhì)粒PTV118NAB的基因圖譜。
[0031 ] 圖3是實施例8的GC/MS色譜。
【具體實施方式】
[0032]本發(fā)明的方法中成為合成對象的有機酸，只要是可以通過至少以乙酰輔酶A為底物的反應(yīng)得到成為其前體的有機酸輔酶A、該有機酸輔酶A成為在乙酸共軛的輔酶A消除中使用的轉(zhuǎn)移酶的底物的有機酸即可，不特別限定。從通常所知的輔酶A轉(zhuǎn)移酶的底物特異性的觀點出發(fā)，優(yōu)選碳數(shù)3~6的 羧酸，更優(yōu)選碳數(shù)3~6的羥基羧酸。具體可列舉3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸等。
[0033]以乙酰輔酶A作為底物、且供給作為直到乙酸共軛的輔酶A消除的前體的有機酸輔酶A的反應(yīng)途徑和酶群，可以根據(jù)目的有機酸任意選擇。例如，在以3-羥基丁酸為目的的反應(yīng)工序中，得到作為其乙酸共軛的輔酶A消除的前體的3-羥基丁酰-輔酶A的反應(yīng)，通過以下組合來實現(xiàn):由2分子的乙酰輔酶A伴隨I分子的輔酶A消除而生成乙酰乙酰輔酶A的β-酮硫解酶(EC:2.3.1.9)或其同源物、以及將生成的乙酰乙酰輔酶A還原而得到3-羥基丁酰-輔酶A的乙酰乙酰輔酶A還原酶或其同源物的兩階段的酶反應(yīng)的組合。此外，在本申請說明書和權(quán)利要求書中，只要沒有特別記載，則該乙酰乙酰輔酶A還原酶除了名稱為乙酰乙酰輔酶A還原酶的酶(EC:1.1.1.36 ;生成(R)-3-羥基丁酰-輔酶A)之外，還包括已知催化同等的反應(yīng)的3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶(EC:1.1.1.35 ;生成(S)_3_羥基丁酰-輔酶A)、3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC:1.1.1.157 ;生成(S)-3-羥基丁酰-輔酶A)
坐寸ο
[0034]本發(fā)明中使用的用于乙酸共軛的輔酶A消除的轉(zhuǎn)移酶，也可以根據(jù)目的有機酸任意選擇。例如，在以3-羥基丁酸為目的的反應(yīng)工序中，可以使用丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC:2.8.3.1)或其同源物。[0035]本發(fā)明所得的有機酸的光學(xué)選擇性，依賴于如上所述得到的有機酸輔酶A的光學(xué)選擇性、或該有機酸輔酶A的生物合成途徑中任意選擇的酶反應(yīng)的光學(xué)選擇性，本發(fā)明的輔酶A轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的應(yīng)用不受機酸的光學(xué)選擇性影響。即，本發(fā)明可以通過適當選擇獲得作為前體的有機酸輔酶A的反應(yīng)途徑的手性，而應(yīng)用于任意所希望的光學(xué)活性體的制造。例如，在以3-羥基丁酸為目的的反應(yīng)工序中，作為一例而選擇的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)對(S)體、(R)體的任一種3-羥基丁酰輔酶A都可以進行以乙酸作為接受體的輔酶A轉(zhuǎn)移。為了獲得手性的3-羥基丁酸，適當選擇作為其前體的3-羥基丁酰輔酶A、或其生成途徑中應(yīng)用的酶的光學(xué)選擇性即可。例如，已知由乙酰乙酰輔酶A，如果利用來源于雷爾氏菌(Ralstonia)屬微生物的乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)，則得到(R)_3_羥基丁酰輔酶A，另外如果利用例如來源于梭菌(Clostridium)屬微生物的乙酰乙酰輔酶A還原酶(hbd),則得到(S)-3-羥基丁酰輔酶A。通過將這些工序與本發(fā)明的乙酸共軛的輔酶A轉(zhuǎn)移酶組合而分別得到(R)_3-羥基丁酸、(S)-3-羥基丁酸。
[0036]在實施本發(fā)明的優(yōu)選的一種方式中，如上所述，使根據(jù)所要求的有機酸選擇的一系列的酶群在通過基因重組而轉(zhuǎn)化的微生物體內(nèi)共表達。例如，在生產(chǎn)3-羥基丁酸時，將分別編碼前述的各酶、即酮硫解酶(EC:2.3.1.9)或其同源物、和乙酰乙酰輔酶A還原酶(EC:1.1.1.35、EC:1.1.1.36、EC:1.1.1.157)或其同源物、丙酰輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶(EC:
2.8.3.1)或其同源物的基因分別地或作為一系列的簇插入任意的載體，轉(zhuǎn)化宿主微生物。將這樣的轉(zhuǎn)化體通過以適當?shù)奶荚?、例如葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，使各基因表達。例如，在能夠在該宿主中構(gòu)成表達的基因的情況下，直接使各自的編碼基因表達，在配置于載體上的調(diào)節(jié)元件的控制下構(gòu)成各基因的情況下，通過添加誘導(dǎo)底物、移至誘導(dǎo)的環(huán)境等，而使各自的編碼基因表達。進而，通過使成為乙酸共軛的輔酶A轉(zhuǎn)移的底物的乙酸共存，從而以由宿主的糖酵解系統(tǒng)供給的乙酰輔酶A作為反應(yīng)原料的一系列反應(yīng)進行，高效率地實現(xiàn)作為本發(fā)明的目的之一的3-羥基丁酸的合成。
[0037]作為編碼本發(fā)明中使用的各酶的基因的例子，可列舉來源于雷爾氏菌(Ralstonia)屬微生物的β_酮硫解酶(PhaA`)基因、來源于雷爾氏菌(Ralstonia)屬微生物的乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)基因、和來源于巨型球菌(Megasphaera)屬或梭菌(Clostridium)屬微生物的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因。另外，作為本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)化宿主微生物，只要能夠應(yīng)用基因重組技術(shù)就不特別限定。作為適合產(chǎn)業(yè)上的利用的轉(zhuǎn)化宿主微生物，可列舉大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌型細菌、梭菌屬細菌等。作為酵母，可列舉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等。作為棒狀桿菌型細菌,可列舉谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒桿菌(Corynebacterium efficiens)、二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)、角軍糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum) > 7'' L-?' r 1J 々 Λ.ij 才 7 4 jl.Λ (Brevibacterium immariophilum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、./ > 匕' 八夕 f 々 Λ.f 才 y' 二夕丨J % (Brevibacteriumtiogenitalis)、嗜乙酸乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、帚石南棒桿菌(Corynebacterium callunae)、百合棒桿菌(Corynebacterium lilium)、棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)等。作為梭菌屬細菌，可列舉科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)等。其中，大腸桿菌、釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、谷氛酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)由于容易轉(zhuǎn)化，因而優(yōu)選使用，特別優(yōu)選大腸桿菌。此外，不需要構(gòu)成乙酰輔酶A以后的目的生物合成途徑的酶基因全部作為外來基因通過轉(zhuǎn)化而提供，也可以以其一部分利用宿主本來保有的酶基因的方式構(gòu)成生物合成途徑。進而，乙酰輔酶A的供給也不僅可以直接利用來源于宿主的代謝途徑，還可以利用基因擴增和/或外來基因的導(dǎo)入、分支途徑的敲除等代謝工程學(xué)的已知手法提高其供給能力而使用。
[0038]此外，本發(fā)明中所說的同源物包含直向同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog)。本說明書中，直向同源物是指在由共同祖先的基因通過種分化而產(chǎn)生的在種間對應(yīng)的基因、和由該基因得到的酶，旁系同源物(paralog)是指在同種內(nèi)不是通過種分化、而是通過基因重復(fù)而產(chǎn)生的基因、和由該基因得到的酶的組，同源物是指與是直向同源物(ortholog)還是旁系同源物(paralog)無關(guān)地在序列上有同一'I"生的基因、和由該基因得到的酶。此外，這樣的同源物，可以基于針對適當?shù)臄?shù)據(jù)庫的同源性檢索程序(BLAST、FASTA等)的應(yīng)用、或使用了包含上述鑒定基因的一部分或全部的探針的雜交、PCR等常規(guī)方法，作為基因，或作為通過由利用該基因的轉(zhuǎn)化等而得的酶而獲得。
[0039]在本發(fā)明中，成為有機酸輔酶A合成的底物的乙酰輔酶A，優(yōu)選在利用如上所述的重組體的生產(chǎn)中，通過宿主所具有的糖酵解系統(tǒng)，以培養(yǎng)中使用的任意的碳源、例如葡萄糖等糖質(zhì)作為來源而被供給。乙酰輔酶A另外還作為以作為有機酸合成途徑的乙酸共軛的輔酶A轉(zhuǎn)移的共軛底物而添加 的乙酸為來源、在該反應(yīng)的進行中生成的乙酰輔酶A而同時被供給。即，除了作為培養(yǎng)或反應(yīng)的主原料的糖質(zhì)等碳源之外，本反應(yīng)中補加的乙酸不僅作為有機酸輔酶A的輔酶A轉(zhuǎn)移反應(yīng)的共軛底物而被消耗，而且在反應(yīng)進行的同時被轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A，從而成為目的有機酸的合成底物、和有機酸合成的自由能源而被回收，有助于高效率。
[0040]對將乙酸供給至反應(yīng)體系內(nèi)的方法不特別限制，除了在微生物的耐性的范圍預(yù)先添加至培養(yǎng)基中之外，也可以根據(jù)反應(yīng)的進行而連續(xù)地添加。既可以根據(jù)培養(yǎng)的最適PH值，預(yù)先與堿混合而調(diào)整PH值然后添加，也可以以乙酸鹽的形式添加。作為乙酸鹽，優(yōu)選使用乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨等。另外不僅人為地在培養(yǎng)或反應(yīng)過程中添加的乙酸，連作為微生物的代謝副產(chǎn)物而在培養(yǎng)中生成的乙酸也被反應(yīng)所利用，有助于反應(yīng)體系整體的物質(zhì)收支的改善。因此，反應(yīng)整體中供給的乙酸量，還優(yōu)選計量地考慮來源于有機酸合成中被消耗的主原料的乙酰輔酶A量、和作為輔酶A轉(zhuǎn)移的共軛底物所要求、作為乙酰輔酶A被回收的乙酸量、以及培養(yǎng)過程中發(fā)酵副生成的乙酸量等，來適當調(diào)節(jié)。進而，還可以通過培養(yǎng)條件的調(diào)整、和/或宿主的代謝途徑改變等，連同乙酸的人為添加一起，從作為主原料的糖質(zhì)生成理論等量分量的乙酸，從而進行調(diào)整以供給乙酸共軛的輔酶A轉(zhuǎn)移反應(yīng)所需的量。此外，作為本發(fā)明的必要條件的“供給的乙酸的存在下”，不僅是指以通過通常已知的乙酸的分析方法能檢測到乙酸的狀態(tài)存在。即，還包含供給的乙酸作為依次在反應(yīng)中被消耗的反應(yīng)中間體而在反應(yīng)途徑上存在。這樣的乙酸的存在方式雖然難以直接作為乙酸檢測到，但作為乙酸被供給、且被攝入反應(yīng)途徑的事實，可以通過例如，使同位素標記化乙酸共存，利用質(zhì)譜儀依次追蹤反應(yīng)物、生成物的所謂代謝通量分析等常規(guī)方法來確認。
[0041]實施例
[0042]以下列舉實施例和比較例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下的記述限定。
[0043][3-羥基丁酸的生產(chǎn)(I)]
[0044]實施例1:
[0045]重組微生物的制作:
[0046]由埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii) ATCC25940株(由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)保藏)培養(yǎng)菌體，通過使用根據(jù)已知基因序列信息制成的引物的PCR法，制備約1.6kbp的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因片段。同樣地，由真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstonia eutropha)H16株(作為ATCC17699由美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏)培養(yǎng)菌體，將編碼酮硫解酶(PhaA)、和來源于同株的乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)的2種酶的約2.3kbp的一系列的基因區(qū)域，作為包含其上游的來源于同株的啟動子樣區(qū)域的片段獲得。此外，在引物的設(shè)計和克隆化時，關(guān)于PCT參照Taguchi等的文獻(PNAS, vol.105，N0.45，p.17323 (2008))，關(guān)于 PhaA,PhaB 參照 Peoples 等的文獻(J.Biol.Chem.Vol.264，N0.26，p.15293-(1989))。將它們通過常規(guī)方法插入載體質(zhì)粒pTV118N(夕力9生物社制)的多克隆位點，構(gòu)建能在大腸桿菌中表達的質(zhì)粒pTV118NpctAB。該質(zhì)粒的基因圖譜示于圖1。
[0047]使用所得的質(zhì)粒，通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，獲得被上述3種基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌株。
[0048]實施例2和比較例1:
[0049]培養(yǎng)試驗:
[0050]將所得的轉(zhuǎn)化體在包含氨芐青霉素50mg/L的LB瓊脂培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)一晝夜，然后在相同的液體培養(yǎng)基5mL中接菌I白金耳，培養(yǎng)12小時。
[0051]將所得的培養(yǎng)液100 μ L接種到包含氨芐青霉素50mg/L、葡萄糖20g/L、以及相對于葡萄糖為I摩爾等量(約6.7g/L)的乙酸的500mL燒瓶中的IOOmL的LB培養(yǎng)基中，以30°C振蕩培養(yǎng)48小時(實施例2)。
[0052]另外，除了不包含乙酸之外，接種到同一組成的培養(yǎng)基中，同樣地以30°C振蕩培養(yǎng)48小時(比較例I)。
[0053]使培養(yǎng)第48小時的各培養(yǎng)物的離心上清通過0.45 μ m的除菌過濾器，將其原液1(^1^共于下述條件的即^:。
[0054]作為標準品，將0.1質(zhì)量％濃度的試劑3-羥基丁酸('> V ^ K 'j 'y f社制)水溶液同樣地供試于HPLC。根據(jù)從培養(yǎng)物樣品在與該標準品相同的保留時間得到的峰面積的相對值，測定培養(yǎng)液中生成的3-羥基丁酸的濃度(g/L)。
[0055]HPLC 條件:
[0056]柱:ShodexSH-1011 (昭和電工制)、
[0057]柱溫度:60°C、
[0058]移動相:稀硫酸(5mM)、[0059]流速:0.6mL/ 分鐘、
[0060]檢出:差示折射率檢出器。
[0061]結(jié)果示于表1。確認了通過添加乙酸，在生成物量增大的同時，相應(yīng)于碳源加入量的收量也改善。
[0062]表1
【權(quán)利要求】
1.有機酸的制造方法，其特征在于，以乙酰輔酶A作為底物生物化學(xué)地合成有機酸輔酶A，使用輔酶A轉(zhuǎn)移酶在乙酸的存在下進行所述有機酸輔酶A的輔酶A消除反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機酸的制造方法，輔酶A轉(zhuǎn)移酶是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、或其同源物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的有機酸的制造方法，有機酸是碳數(shù)3~6的羧酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的有機酸的制造方法，有機酸是碳數(shù)3~6的羥基羧酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的有機酸的制造方法，有機酸是3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、或3-羥基己酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項所述的有機酸的制造方法，將轉(zhuǎn)化微生物在乙酸的存在下進行培養(yǎng)，從而得到有機酸，所述轉(zhuǎn)化微生物具有以乙酰輔酶A作為底物而生成有機酸輔酶A的酶基因群和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的有機酸的制造方法，將轉(zhuǎn)化微生物在乙酸的存在下進行培養(yǎng)，從而得到3-羥基丁酸，所述轉(zhuǎn)化微生物具有以乙酰輔酶A作為底物而生成3-羥基丁酰輔酶A的酶基因群和輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機酸的制造方法，以乙酰輔酶A作為底物而生成3-羥基丁酰輔酶A的酶基因群是β -酮硫解酶基因或其同源物、和乙酰乙酰輔酶A還原酶基因或其同源物，輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因是丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因或其同源物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6~8的任一項所述的有機酸的制造方法，微生物是大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌、或 梭菌。
【文檔編號】C12N15/09GK103890187SQ201280050964
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月18日
【發(fā)明者】松本謙一郎, 田口精一, 青木裕史 申請人:昭和電工株式會社, 國立大學(xué)法人 北海道大學(xué)