轉(zhuǎn)化微生物如巴斯德畢赤酵母中多亞基蛋白如抗體的高滴度和高純度生成的多拷貝方案的制作方法
【專利摘要】公開了在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)生成異源多亞基蛋白的方法。具體而言，本公開提供了生成可能或可能不被分泌的多亞基蛋白，包括抗體和其它多亞基蛋白的改進(jìn)方法，該方法產(chǎn)量更高而且不需要的副產(chǎn)物生成減少。在示例性實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為酵母，例如甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母如巴斯德畢赤酵母。
【專利說明】轉(zhuǎn)化微生物如巴斯德畢赤酵母中多亞基蛋白如抗體的高滴度和高純度生成的多拷貝方案
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的公開
[0002]本申請(qǐng)要求2011年8月19日提交的標(biāo)題為“MULT1-COPY STRATEGY FORHIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULT1-SUBUNIT PROTEINS SUCH ASANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PAST0RIS” 的美國序列N0.61/525，307 (代理人案號(hào)67858.730200)的權(quán)益，并且是標(biāo)題為“HIGH-PURITYPRODUCTION OF MULT1-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBESSUCH AS PICHIA PAST0RIS”并于2012年5月8日提交的美國序列N0.13 / 466，795 (代理人案號(hào)75820.711001)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其各自據(jù)此通過引用整體并入。
[0003]本申請(qǐng)包括于2012年8月16日創(chuàng)建的名稱為“67858o730201.txt”并且大小為43，651個(gè)字節(jié)的文件中，經(jīng)EFS-Web，以ASCII格式提交的序列表，其據(jù)此通過引用整體并入。
[0004]領(lǐng)域
[0005]本公開通常涉及在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中生成異源蛋白的方法。具體而言，本公開提供了生成可能或可能不被分泌的多亞基蛋白，包括抗體和其它多亞基蛋白例如激素和受體的改進(jìn)方法，產(chǎn)量更高而且不需要的副產(chǎn)物生成減少。在示例性實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞為酵母，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0006]背景
[0007]常規(guī)抗體是由兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構(gòu)成的四聚體蛋白。特定類型的純凈人抗體可能難以或不可能從天然來源純化足夠量用于許多目的。因此，生物技術(shù)和制藥公司已經(jīng)轉(zhuǎn)向基于重組DNA的方 法以大規(guī)模制備抗體。功能性抗體的生成通常不僅牽涉兩個(gè)多肽的合成，而且還牽涉許多翻譯后事件，包括N端分泌信號(hào)序列的蛋白水解加工；多肽恰當(dāng)折疊并組裝成四聚體；二硫鍵的形成；并且通常包括特異性N連接糖基化。所有這些事件均在真核細(xì)胞分泌途徑，真核細(xì)胞獨(dú)有的細(xì)胞器官復(fù)合體中發(fā)生。
[0008]此類復(fù)合蛋白的重組合成通常已依賴高等真核細(xì)胞的培養(yǎng)物以用培養(yǎng)的極常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成生物活性材料。然而，相對(duì)于微生物發(fā)酵方法，基于哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)的生產(chǎn)系統(tǒng)招致費(fèi)用和并發(fā)癥明顯增加。另外，源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物可能需要另外的安全測(cè)試以確保在培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物源產(chǎn)物，例如血清中沒有可能存在的哺乳動(dòng)物病原體(包括病毒)。
[0009]先前的工作已經(jīng)幫助建立了巴斯德畢赤酵母作為有成本效益的平臺(tái)，以生成可能適合研究、診斷和治療使用的功能性抗體。見共有美國專利7，935，340和7，927，863，其各自通過引用整體并入本文。在文獻(xiàn)中也已知設(shè)計(jì)并優(yōu)化巴斯德畢赤酵母發(fā)酵以表達(dá)重組蛋白的方法，包括優(yōu)化細(xì)胞密度、肉湯體積、底物給料速度和每個(gè)反應(yīng)期的長(zhǎng)度。見Cregg, J.M.編輯，2007, Pichia Protocols (第 2 版)中 Zhang 等，“Rational Design andOptimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations，，， Methods in MolecularBiology,第 389 卷，Humana Press, Totowa, N.J.,第 43-63 頁。[0010]雖然可由培養(yǎng)的細(xì)胞生成重組多亞基蛋白，但是也可能生成不需要的副產(chǎn)物。例如，培養(yǎng)的細(xì)胞可生成所需多亞基蛋白，連同游離單體、具有不正確化學(xué)計(jì)量的復(fù)合物或具有不需要或異常糖基化的蛋白。所需多亞基蛋白的純化可增加生產(chǎn)成本，并且純化中牽涉的步驟可降低活性復(fù)合物的總產(chǎn)量。而且，即使在純化之后，也可能存在引起關(guān)注的量的不需要副產(chǎn)物。例如，可能存在施用后增加免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的量的糖基化副產(chǎn)物，而異常復(fù)合物或聚集物可能降低比活性并且也可能具潛在免疫原性。
[0011]概述
[0012]本公開提供了為了以更高產(chǎn)量，重組生成多亞基蛋白(例如抗體、激素和受體)和其它多亞基復(fù)合物而提供的物質(zhì)的改進(jìn)方法和組成。這些多亞基多肽可包含可能相同或不同的2個(gè)或更多個(gè)亞基(即，均聚或雜聚多肽)。在示例性實(shí)施方案中，使用本文公開的方法可增加此類多亞基蛋白的分泌或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)量至少50%、至少100%或更高(相對(duì)于常規(guī)方法)。
[0013]本公開還提供了為了重組生成抗體和其它多亞基蛋白而提供的物質(zhì)的改進(jìn)方法和組成，不需要的副產(chǎn)物生成減少。在示例性實(shí)施方案中，不需要的副產(chǎn)物可為糖基化蛋白，例如糖基化抗體重鏈，其相對(duì)豐度與初始豐度水平(相對(duì)于常規(guī)方法)相比，使用本文公開的方法可降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或降到不可檢測(cè)的水平。其相對(duì)豐度可能如此降低的示例性不需要的副產(chǎn)物可包括表觀分子量與所需多亞基復(fù)合物不同的一個(gè)或多個(gè)種類。例如，表觀分子量可受化學(xué)計(jì)量法、折疊、復(fù)合物組裝和/或糖基化的差異影響。例如，此類不需要的副產(chǎn)物可使用尺寸排阻色譜法和/或凝膠電泳檢測(cè)，并且可具有比所需多亞基復(fù)合物更高或更低的表觀分子量。在示例性實(shí)施方案中，可在還原條件下檢測(cè)不需要的副產(chǎn)物。在其它示例性實(shí)施方案中，可在非還原條件下檢測(cè)不需要的副產(chǎn)物。
[0014]在示例性實(shí)施方案中，本公開還提供了為了以更高產(chǎn)量重組生成抗體和其它多亞基復(fù)合物而提供的物質(zhì)的改進(jìn)方法和組成。在示例性實(shí)施方案中，可使用本文公開的方法增加產(chǎn)量至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少100 %或更高(相對(duì)于常規(guī)方法)。`
[0015]在示例性實(shí)施方案中，在其中可生成多亞基蛋白的宿主細(xì)胞可為酵母，例如畢赤酵母物種如巴斯德畢赤酵母或另一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(methylotrophic yeast),或酵母物種例如釀酒酵母(S.cerevisiae),或另一種酵母例如裂殖酵母(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。在本發(fā)明中可利用的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的其它實(shí)例包括安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)(在本領(lǐng)域中也稱為多形漢遜酵母(Hansenulapo Iymorpha))、季也蒙畢赤酵母(pichia gui I Iermordii)、甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、Pichia inositovera>Ogataea nitratoaversa和博伊丁假絲酵母(Candidaboidnii)。
[0016]一方面，本公開提供了鑒定生成更高產(chǎn)量的所需抗體或其它所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的改進(jìn)方法，其可包括:(a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基(例如，所述所需抗體的輕鏈和重鏈)而提供的基因的至少兩種宿主細(xì)胞；(b)在允許多亞基復(fù)合物表達(dá)的條件下培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞，其中所述至少兩種宿主細(xì)胞中的基因是為了不同水平表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基而提供；(C)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量；和(d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的產(chǎn)量的宿主細(xì)胞為生成更高產(chǎn)量的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
[0017]另一方面，本公開提供了鑒定生成更高純度的所需抗體或其它所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的改進(jìn)方法，其可包括:(a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基(例如，所述所需抗體的輕鏈和重鏈)而提供的基因的至少兩種宿主細(xì)胞；(b)在允許多亞基復(fù)合物表達(dá)的條件下培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞，其中所述至少兩種宿主細(xì)胞中的基因是為了不同水平表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基而提供；(c)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的所述多亞基復(fù)合物的純度；和(d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的純度的宿主細(xì)胞為生成更高純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。 [0018]宿主細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞如甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母(例如畢赤酵母屬的酵母)。畢赤酵母屬的示例性甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括巴斯德畢赤酵母、安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和Pichia inositovera。可通過交配,例如通過使各自含編碼多亞基復(fù)合物的亞基的至少一個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝的兩個(gè)單倍體酵母細(xì)胞交配產(chǎn)生宿主細(xì)胞。例如，可產(chǎn)生含有已知不同拷貝數(shù)的所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的多個(gè)單倍體細(xì)胞，以致單倍體細(xì)胞不同組合之間的交配可迅速產(chǎn)生一組二倍體細(xì)胞，各自含有預(yù)選拷貝數(shù)的編碼多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的基因。另外，可產(chǎn)生含有已知不同拷貝數(shù)的所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的多個(gè)二倍體細(xì)胞，以致二倍體細(xì)胞不同組合之間的交配可迅速產(chǎn)生一組四倍體細(xì)胞，各自含有預(yù)選拷貝數(shù)的編碼多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的基因。
[0019]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，畢赤酵母屬的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為巴斯德畢赤酵母。宿主細(xì)胞可為二倍體或四倍體細(xì)胞。
[0020]編碼所需多亞基復(fù)合物的所述亞基，例如所述所需抗體輕鏈和/或重鏈的所述基因的至少一個(gè)，可在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，例如CUPl (受培養(yǎng)基中銅的水平誘導(dǎo)；見Koller等，Yeast2000 ；16:651-656.)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(見，例如，Staib等，Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 2008 年 I 月，第 146-156 頁)、硫胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、AOXU ICL1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、FLDU ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pvk啟動(dòng)子、源自其中的嵌合啟動(dòng)子、酵母啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、昆蟲啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、爬行動(dòng)物啟動(dòng)子、兩棲動(dòng)物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和禽類啟動(dòng)子。
[0021]編碼所需多亞基復(fù)合物的所述亞基，例如所述所需抗體輕鏈和/或重鏈的所述基因的至少一個(gè)，可在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，例如CUP1、AOXU ICL1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、硫胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、源自其中的嵌合啟動(dòng)子、酵母啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、昆蟲啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、爬行動(dòng)物啟動(dòng)子、兩棲動(dòng)物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和禽類啟動(dòng)子。
[0022]宿主細(xì)胞可將所述所需多亞基復(fù)合物分泌到培養(yǎng)基中?？蛇x地或另外，所述所需多亞基復(fù)合物可留在所述宿主細(xì)胞中并且可從中分離。
[0023]所述宿主細(xì)胞可為二倍體、四倍體細(xì)胞或多倍體。[0024]所述方法可進(jìn)一步包括從所述宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基中純化所述多亞基復(fù)合物。
[0025]可從所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)或膜純化所述多亞基復(fù)合物。
[0026]所需多亞基復(fù)合物可包含抗體，例如單特異性或雙特異性抗體。抗體可為特異性結(jié)合任何抗原的抗體。
[0027]所述多亞基復(fù)合物可包含人抗體或人源化抗體或其片段。
[0028]所述人源化抗體可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊或牛來源。
[0029]所述人源化抗體可為兔來源。
[0030]所述多亞基復(fù)合物可包含單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)抗體。
[0031]可通過蛋白A和/或蛋白G親和從所述培養(yǎng)物中純化所述抗體。
[0032]所述組中至少一種所述真核細(xì)胞中為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基而提供的至少一個(gè)基因可經(jīng)優(yōu)化在所述真核細(xì)胞中表達(dá)。
[0033]所述組中的至少兩種宿主細(xì)胞可包含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的基因，例如不同拷貝數(shù)的編碼所需抗體重鏈和/或所述所需抗體輕鏈的基因。
[0034]所述組中的至少一種宿主細(xì)胞可包含編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的基因的至少兩個(gè)拷貝，例如編碼所需抗體重鏈和/或所述所需抗體輕鏈的基因的至少兩個(gè)拷貝。
[0035]所述組中的至少一種宿主細(xì)胞可包含編碼所述所需多亞基復(fù)合物的亞基(例如所需抗體重鏈或所需抗體輕鏈)的基因，其表達(dá)受與驅(qū)動(dòng)所述組中不同宿主細(xì)胞中的相應(yīng)基因的表達(dá)的啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。`
[0036]所述組中的至少一種宿主細(xì)胞可包含含一個(gè)以上編碼所述所需多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的序列的多順反子基因。
[0037]所需多亞基復(fù)合物可包含可與任何抗原特異性結(jié)合的所需抗體。示例非限制性實(shí)例包括 IL-6、TNF- a、CGRP, PCSK9 或 NGF。
[0038]所需多亞基復(fù)合物可包含任何類型的抗體。示例性抗體類型包括任何哺乳動(dòng)物類的抗體，例如人、小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、牛等。優(yōu)選地，抗體為人抗體或可為兔來源的人源化抗體。所需抗體可為單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)抗體。
[0039]所述組中的至少一種所述宿主細(xì)胞中，為表達(dá)所需多亞基復(fù)合物的亞基(例如所需抗體的輕鏈和/或重鏈)而提供的至少一個(gè)所述基因可經(jīng)優(yōu)化在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)(例如，通過選擇優(yōu)選密碼子和/或通過密碼子選擇改變AT百分比)。
[0040]如工作實(shí)例所示，在一些實(shí)施方案中，通過使用重鏈相對(duì)于輕鏈的拷貝更多，輕鏈相對(duì)于重鏈的拷貝更多或輕鏈和重鏈的拷貝數(shù)相等的宿主細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)一步優(yōu)化抗體的產(chǎn)量和/或純度。
[0041]通過測(cè)量所述宿主細(xì)胞生成的非糖基化的、含在具有預(yù)計(jì)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑和/或表觀分子量(例如，通過尺寸排阻色譜法測(cè)得)的復(fù)合物中、具有預(yù)計(jì)電泳遷移率(例如，通過凝膠電泳如SDS-PAGE和任選Western印跡檢測(cè))的所需多亞基復(fù)合物的分?jǐn)?shù)，和/或測(cè)量多亞基復(fù)合物的比活性(例如，特異性結(jié)合所需抗體的靶標(biāo))，可評(píng)估所述所需多亞基復(fù)合物，例如所需抗體的純度。
[0042]所需多亞基復(fù)合物可為抗體，并且通過測(cè)定所述宿主細(xì)胞生成的扣除經(jīng)糖基化、含在除具有預(yù)計(jì)表觀分子量或流體動(dòng)力學(xué)半徑的復(fù)合物外的抗體復(fù)合物中和/或不能與所述所需抗體的靶標(biāo)特異性結(jié)合的任何產(chǎn)物相關(guān)變體的所需抗體的量，可評(píng)估所述抗體的產(chǎn)量。
[0043]另一方面，本公開提供了一種重組生成所需多亞基復(fù)合物，例如所需抗體的方法，包括:(a)提供包含編碼所述所需抗體輕鏈和重鏈的基因的宿主細(xì)胞，其中通過本文所述的任何方法鑒定所述宿主細(xì)胞為生成更高產(chǎn)量和/或純度的所需抗體的宿主細(xì)胞；和(b)在允許所述輕鏈和重鏈基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。所述方法可進(jìn)一步包括純化所述所需抗體。
[0044]另一方面，本公開提供了一種重組生成所需多亞基復(fù)合物，例如所需抗體的方法，包括:(a)提供包含編碼所述所需抗體輕鏈和重鏈的基因的多個(gè)拷貝的宿主細(xì)胞，相對(duì)于僅含編碼所述所需抗體輕鏈和重鏈的所述基因的單個(gè)拷貝的等基因宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞生成更高產(chǎn)量和/或純度的所需抗體；和(b)在允許所述輕鏈和重鏈基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。所述方法可進(jìn)一步包括純化所述所需抗體。
[0045]所述方法可進(jìn)一步包括使用如標(biāo)題為“HIGH-PURITY PRODUCTION OFMULT1-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH ASPICHIA PASTORIS”并于2012年5月8日提交的共有美國申請(qǐng)序列n0.13 / 466，795(代理人案號(hào)75820.711001)(其據(jù)此通過引用整體并入)中描述的方法和/或條件培養(yǎng)。例如，所述培養(yǎng)可包括向培養(yǎng)物中添加乙醇團(tuán)注(ethanol bolus),例如達(dá)最終濃度為約1 % w / W。
[0046]例如，本公開的一個(gè)方面提供了一種生成多亞基復(fù)合物的方法，包括:(a)提供包含真核細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述真核細(xì)胞包含為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基而提供的基因的多個(gè)拷貝；(b)向所述培養(yǎng)物中添加乙醇團(tuán)注；和(C)培養(yǎng)所述培養(yǎng)物以生成所述多亞基復(fù)合物。
[0047]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，乙醇團(tuán)注可增加穩(wěn)定二硫鍵的形成。
[0048]所述多亞基復(fù)合物可含有包含至少一個(gè)二硫鍵的一條或多條多肽。
[0049]所述多亞基復(fù)合物可包含抗體。
[0050]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低一種或多種產(chǎn)物相關(guān)變體的相對(duì)豐度。
[0051]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低通過尺寸排阻色譜法或凝膠電泳檢測(cè)的表觀分子量比所述所需多亞基復(fù)合物更高或更低的產(chǎn)物相關(guān)變體的相對(duì)豐度。
[0052]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低化學(xué)計(jì)量異常的復(fù)合物的相對(duì)豐度。
[0053]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低二硫鍵異常的復(fù)合物的相對(duì)豐度。
[0054]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低半胱氨酸還原的復(fù)合物的相對(duì)豐度。
[0055]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低糖基化異常的復(fù)合物的相對(duì)豐度。
[0056]所述方法可調(diào)節(jié)重鏈間二硫鍵的形成或穩(wěn)定性。
[0057]所述方法可調(diào)節(jié)連接輕鏈和重鏈的二硫鍵的形成或穩(wěn)定性。[0058]相對(duì)于在沒有乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法可降低一種或多種產(chǎn)物相關(guān)變體的相對(duì)豐度。
[0059]所述產(chǎn)物相關(guān)變體可包含H1L1、H2L1和H4L4產(chǎn)物相關(guān)變體的一種或多種。
[0060]相對(duì)于在沒有所述乙醇團(tuán)注時(shí)實(shí)現(xiàn)的相同方法，所述方法增加所述抗體的純度。
[0061]步驟(b)可在步驟(C)之前實(shí)現(xiàn)。
[0062]步驟(b)可在步驟(C)之后實(shí)現(xiàn)。
[0063]步驟(b)可與步驟(C)同時(shí)實(shí)現(xiàn)。
[0064]步驟(b)可導(dǎo)致所述培養(yǎng)物中的乙醇濃度介于約0.01%和約4% (w / V)之間。
[0065]步驟(b)可導(dǎo)致所述培養(yǎng)物中的乙醇濃度介于約0.01%和約4%之間，介于約0.02%和約3.75%之間，介于約0.04%和約3.5%之間，介于約0.08%和約3.25%之間，介于約0.1%和約3%之間，介于約0.2%和約2.75%之間，介于約0.3%和約2.5%之間，介于約0.4%和約2.25%之間，介于約0.5%和約1.5%之間，介于約0.5%和約2%之間，介于約0.6%和約1.75%之間，介于約0.7%和約1.5%之間或介于約0.8%和約1.25%之間。
[0066]步驟(b)可導(dǎo)致所述培養(yǎng)物中的乙醇濃度可為至少約0.01^^0.02^^0.03%、0.04 %,0.05 %,0.06 %,0.07 %,0.08 %,0.09 %,0.10 %,0.2 %,0.3 %,0.4 %,0.6
0.6%、0.7%、0.8%或 0.9% (w/v)。
[0067]步驟(b)可導(dǎo)致所述 培養(yǎng)物中的乙醇濃度可為至多約4^^3.5^^3^^2.5%、2%U.8%U.6%U.5%U.4%U.3%U.2%U.1%>1.0%,0.9%,0.8%,0.7%,0.6%,0.5%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2% 或 0.15% (w / V)。
[0068]步驟(b)可包括向所述培養(yǎng)物添加乙醇，向所述培養(yǎng)物添加包含乙醇的載體，向包含乙醇的培養(yǎng)基或載體添加所述細(xì)胞，或更換部分培養(yǎng)基。
[0069]在介于I至20min的時(shí)間段內(nèi)可向培養(yǎng)基添加所述乙醇團(tuán)注。
[0070]步驟(c)可包括向所述細(xì)胞供氧。
[0071]所述供氧可包括攪拌所述培養(yǎng)物。
[0072]所述供氧可包括使所述培養(yǎng)物與包含氧的氣體混合物接觸。
[0073]步驟(C)可包括向所述培養(yǎng)物添加包含碳源的給料。
[0074]所述給料可包含至少一種可發(fā)酵碳源。
[0075]所述給料可包含以下的一種或多種:葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山梨糖醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露糖醇和棉子糖。
[0076]所述方法可進(jìn)一步包括在步驟(C)期間將乙醇濃度維持在介于上設(shè)定值與下設(shè)定值之間。
[0077]所述下設(shè)定值可為約0.01%,0.02%,0.03%,0.04%,0.05%,0.06%,0.07%,
0.08%,0.09%,0.10%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%、0.6%、0.7%、0.8%或0.9% (w / v)。
[0078]所述上設(shè)定值可為約4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.8%、1.6%、1.5%、1.4%、
1.3 %,1.2 1.1 %,1.0 %,0.9 % ,0.8 %,0.7 %,0.6 %,0.5 %,0.4%,0.35 %、0.3 %、0.25%,0.2%或 0.15% (w / V)。
[0079]所述上設(shè)定值可至多為約1.5%、1.4%、1.3、1.2%或1.1 % (w/v)。[0080]所述方法可進(jìn)一步包括在步驟(C)期間將乙醇濃度維持在設(shè)定值。
[0081]所述設(shè)定值可為約0.1 %、0.2 %,0.3 %,0.4 %,0.5 %,0.6 %,0.7 %,0.80.m1.1%、1.2%、1.3%、1.4% 或 1.5% (w / V)。
[0082]步驟(c)可包括將所述培養(yǎng)物中的乙醇濃度維持在介于約0.01 %和約4%之間，介于約0.02%和約3.75%之間，介于約0.04%和約3.5%之間，介于約0.08%和約3.25%之間，介于約0.1%和約3%之間，介于約0.2%和約2.75%之間，介于約0.3%和約2.5%之間，介于約0.4%和約2.25%之間，介于約0.5%和約2%之間，介于約0.6%和約1.75%之間，介于約0.7%和約1.5%之間或介于約0.8%和約1.25%之間。
[0083]可通過由所述細(xì)胞控制乙醇的生成或通過向所述培養(yǎng)物添加乙醇維持所述培養(yǎng)物中的乙醇濃度。
[0084]控制乙醇生成的步驟可包括控制以下一項(xiàng)或多項(xiàng):葡萄糖濃度、氧可用性、攪拌強(qiáng)度、氣體壓力、供給的空氣或其它氣體混合物的流量、培養(yǎng)物粘度、培養(yǎng)物密度、供給的空氣或其它氣體混合物中的氧濃度和溫度。
[0085]步驟(a)和步驟(b)間隔的時(shí)間可小于約72h、小于約48h、小于約24h、小于約12h、小于約9h、小于約6h、小于約5h、小于約4h、小于約3h、小于約90min、小于約30min、小于約5min或小于約lmin。
[0086]步驟(b)和步驟(C)間隔的時(shí)間可小于約10h、小于約9h、小于約8h、小于約7h、小于約6h、小于約5h、小于約4h、小于約3h、小于約2h、小于約90min、小于約80min、小于約70min、小于約60min、小于約50min、小于約40min、小于約30min、小于約20min、小于約lOmin、小于約5min或小于約lmin。
`[0087]通過向所述培養(yǎng)物中添加碳源，并且培養(yǎng)所述培養(yǎng)物直至碳源可能耗盡，可生成步驟(a)的培養(yǎng)物。
[0088]所述碳源可包含以下的一種或多種:甘油、葡萄糖、乙醇、檸檬酸鹽、山梨糖醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、蜜二糖、乳糖、麥芽糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、甘露糖醇和棉子糖。
[0089]可通過檢測(cè)所述真核細(xì)胞代謝活性的降低測(cè)定碳源耗盡。
[0090]可通過檢測(cè)所述真核細(xì)胞氧消耗量的降低，通過檢測(cè)培養(yǎng)物中pH的增大，通過檢測(cè)濕細(xì)胞團(tuán)塊的穩(wěn)定，或通過檢測(cè)培養(yǎng)物中氨濃度的增大，鑒定所述真核細(xì)胞代謝活性的所述降低。
[0091]可通過檢測(cè)所述培養(yǎng)物中溶解氧的濃度增大鑒定所述真核細(xì)胞氧消耗量的所述降低。
[0092]所述真核細(xì)胞可包括酵母細(xì)胞。
[0093]所述酵母細(xì)胞可包括甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母。
[0094]所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母可為畢赤酵母屬。
[0095]畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母可為巴斯德畢赤酵母。
[0096]畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母可選自:安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和Pichia inositovera。
[0097]為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物而提供的基因可整合到一個(gè)或多個(gè)基因組座位(genomic loci)中。[0098]至少一個(gè)所述基因組座位可選自pGAP基因座、3’ AOX TT基因座、PpURA5、OCHUA0Xl、HIS4、GAP、pGAP、3’ AOX TT、ARG 和 HIS4TT 基因座。
[0099]編碼多亞基復(fù)合物的所述亞基的至少一個(gè)基因可在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
[0100]所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可選自A0XUCUP1、四環(huán)素誘導(dǎo)型、硫胺誘導(dǎo)型和FLDl啟動(dòng)子。
[0101]編碼多亞基復(fù)合物的所述亞基的至少一個(gè)基因可在選自以下的啟動(dòng)子的控制下表達(dá):CUP1、A0X1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、FLD1、ADH1、醇脫氫酶 I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、硫胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、源自其中的嵌合啟動(dòng)子、酵母啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、昆蟲啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、爬行動(dòng)物啟動(dòng)子、兩棲動(dòng)物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和禽類啟動(dòng)子。
[0102]所述真核細(xì)胞可為二倍體、四倍體細(xì)胞或多倍體。
[0103]所述方法可進(jìn)一步包括從所述真核細(xì)胞或從培養(yǎng)基純化所述多亞基復(fù)合物。
[0104]可從所述真核細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)或膜純化所述多亞基復(fù)合物。
[0105]所述真核細(xì)胞將所述多亞基復(fù)合物分泌到培養(yǎng)基中。
[0106]可從所述培養(yǎng)基純化所述多亞基復(fù)合物。
[0107]所述多亞基復(fù)合物可包含單特異性或雙特異性抗體。 [0108]所述多亞基復(fù)合物可包含人抗體或人源化抗體或其片段。
[0109]所述人源化抗體可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊或牛來源。
[0110]所述人源化抗體可為兔來源。
[0111]所述多亞基復(fù)合物可包含單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)抗體。
[0112]可通過蛋白A和/或蛋白G親和從所述培養(yǎng)物中純化所述抗體。
[0113]所述組中至少一種所述真核細(xì)胞中為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基而提供的至少一個(gè)基因可經(jīng)優(yōu)化在所述真核細(xì)胞中表達(dá)。
[0114]所述多亞基復(fù)合物可包含抗體并且通過測(cè)量所述真核細(xì)胞生成的可能含在具有預(yù)計(jì)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑的抗體復(fù)合物中、可能含在具有預(yù)計(jì)分子量的抗體復(fù)合物中和/或特異性結(jié)合所述抗體的靶標(biāo)的抗體的分?jǐn)?shù)，可評(píng)估所述抗體的純度。
[0115]所述多亞基復(fù)合物可包含抗體并且通過測(cè)定所述真核細(xì)胞生成的扣除可能經(jīng)異常糖基化、含在除具有預(yù)計(jì)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑的復(fù)合物外的抗體復(fù)合物中、含在具有預(yù)計(jì)分子量的抗體復(fù)合物中和/或不能與所述抗體的靶標(biāo)特異性結(jié)合的任何產(chǎn)物相關(guān)變體的抗體的量，可評(píng)估所述抗體的產(chǎn)量。
[0116]可通過非還原SDS-PAGE測(cè)定所述抗體復(fù)合物的分子量。
[0117]所述多亞基復(fù)合物可包含抗體，所述方法可進(jìn)一步包括純化所述抗體。
[0118]所述培養(yǎng)細(xì)胞可生成至少IOOmg / L、至少150mg / L、至少200mg / L、至少250mg / L、至少300mg / L、介于100和300mg / L之間、介于100和500mg / L之間、介于100和1000mg / L之間、至少1000mg / L、至少1250mg / L、至少1500mg / L、至少約1750mg / L、至少約2000mg / L、至少約1000Omg / L或更高的上清液抗體滴度。
[0119]可由一個(gè)以上的基因拷貝表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基。
[0120]所述多亞基復(fù)合物可包含可由編碼所述抗體輕鏈的基因的1-10個(gè)拷貝和編碼所述抗體重鏈的基因的1-10個(gè)拷貝表達(dá)的抗體。[0121]為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物而提供的基因可整合到所述細(xì)胞的基因組中。
[0122]染色體外元件、質(zhì)?；蛉斯と旧w上可含有為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物而提供的基因。
[0123]所述細(xì)胞可包含比為表達(dá)所述抗體重鏈而提供的基因的拷貝更多的為表達(dá)所述抗體輕鏈而提供的基因的拷貝。
[0124]所述細(xì)胞中編碼所述抗體重鏈的基因的拷貝數(shù)和編碼所述抗體輕鏈的基因的拷貝數(shù)各自可以為:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
[0125]所述細(xì)胞中編碼所述抗體重鏈的基因的拷貝數(shù)和編碼所述抗體輕鏈的基因的拷貝數(shù)各自可以為:2和1、3和1、4和1、5和1、6和1、7和1、8和1、9和1、10和1、1和2、2和2、3和2、4和2、5和2、6和2、7和2、8和2、9和2、10和2、1和3、2和3、3和3、4和3、5和3、6和3、7和3、8和3、9和3、10和3、I和4、2和4、3和4、4和4、5和4、6和4、7和4、8 和 4、9 和 4、10 和 4、1 和 5、2 和 5、3 和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10和 5、1 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6 和 6、7 和 6、8 和 6、9 和 6、10 和 6、1 和 7、2 和 7、3和 7、4 和 7、5 和 7、6 和 7、7 和 7、8 和 7、9 和 7、10 和 7、1 和 8、2 和 8、3 和 8、4 和 8、5 和 8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、1和9、2和9、3和9、4和9、5和9、6和9、7和9、8和9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4 和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10,10和10。
[0126]步驟(C)的培養(yǎng)物可在生產(chǎn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0127]所述生產(chǎn)培養(yǎng)基可為基本培養(yǎng)基。
[0128]所述基本培養(yǎng)基缺乏選擇劑。
[0129]所述基本培養(yǎng)基缺乏預(yù)先形成的氨基酸或其它復(fù)合生物分子。
[0130]生產(chǎn)培養(yǎng)基可為復(fù)合培養(yǎng)基。
[0131 ] 復(fù)合培養(yǎng)基可包含酵母提取物、大豆蛋白胨或其它植物蛋白胨的一種或多種。
[0132]步驟(C)的培養(yǎng)物可生長(zhǎng)至高細(xì)胞密度。
[0133]所述高細(xì)胞密度可為至少50g / L。
[0134]所述高細(xì)胞密度可為至少100g / L。
[0135]所述高細(xì)胞密度可為至少300g / L。
[0136]所述高細(xì)胞密度可為至少400g / L。
[0137]所述高細(xì)胞密度可為至少500g / L。
[0138]所述高細(xì)胞密度可為至少750g / L。
[0139]可培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后維持所述多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
[0140]可培養(yǎng)步驟(C)的細(xì)胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后維持所述多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
[0141]可培養(yǎng)步驟(C)的細(xì)胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后維持所述多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
[0142]所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基可包含分泌信號(hào)。
[0143]所述多亞基復(fù)合物可包含抗體。[0144]主題方法可產(chǎn)生至少IOOmg / L、至少150mg / L、至少200mg / L、至少250mg /L、至少300mg / L、介于100和300mg / L之間、介于100和500mg / L之間、介于100和1000mg / L之間或超過1000mg / L,例如高達(dá)1200mg / L、高達(dá)10, OOOmg / L或更高的上
清液抗體滴度。
[0145]另一方面，本公開提供了一種宿主細(xì)胞，其通過前述任何方法鑒定為生成更高產(chǎn)量和/純度的所需多亞基復(fù)合物，例如所需抗體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為畢赤酵母屬的二倍體或四倍體細(xì)胞，例如巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。另一方面，本公開提供了一種源自上述宿主細(xì)胞的二倍體或四倍體酵母培養(yǎng)物。為表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物的亞基例如所需抗體的輕鏈和重鏈而提供的基因，可整合到所述宿主細(xì)胞的基因組中。在染色體外元件、質(zhì)?；蛉斯と旧w上可含有為表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物的亞基例如所需抗體的輕鏈和重鏈而提供的基因。所需多亞基復(fù)合物為抗體時(shí)，宿主細(xì)胞可包含比為表達(dá)重鏈而提供的基因的拷貝更多的為表達(dá)輕鏈而提供的基因的拷貝。在示例性實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可包含編碼輕鏈的基因的1-10個(gè)拷貝和編碼重鏈的基因的1-10個(gè)拷貝。所述宿主細(xì)胞中編碼重鏈的基因的拷貝數(shù)和編碼輕鏈的基因的拷貝數(shù)各自可以為:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、 4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。圖37中列舉了重鏈和輕鏈基因拷貝數(shù)的另外的示例性組合，其列舉了具有多達(dá)10個(gè)拷貝的重鏈和/或輕鏈基因的組合，包括具有標(biāo)識(shí) H2xLl、H3xLl、H4xLl、H5xLl、H6xLl、H7xLl、H8xLl、H9xLl、HlOxLl、HlxL2、H2xL2、H3xL2、H4xL2、H5xL2、H6xL2、H7xL2、H8xL2、H9xL2、H10xL2、HlxL3、H2xL3、H3xL3、H4xL3、H5xL3、H6xL3、H7xL3、H8xL3、H9xL3、H10xL3、HlxL4、H2xL4、H3xL4、H4xL4、H5xL4、H6xL4、H7xL4、H8xL4、H9xL4、H10xL4、HlxL5、H2xL5、H3xL5、H4xL5、H5xL5、H6xL5、H7xL5、H8xL5、H9xL5、H10xL5、HlxL6、H2xL6、H3xL6、H4xL6、H5xL6、H6xL6、H7xL6、H8xL6、H9xL6、H10xL6、HlxL7、H2xL7、H3xL7、H4xL7、H5xL7、H6xL7、H7xL7、H8xL7、H9xL7、H10xL7、HlxL8、H2xL8、H3xL8、H4xL8、H5xL8、H6xL8、H7xL8、H8xL8、H9xL8、H10xL8、HlxL9、H2xL9、H3xL9、H4xL9、H5xL9、H6xL9、H7xL9、H8xL9、H9xL9、H10xL9、HlxLlO、H2xL10、H3xL10、H4xL10、H5xL10、H6xL10、H7xL10、H8xL10、H9xL10、HIOxLIO的菌株。例如,可將指定數(shù)量的重鏈和輕鏈基因拷貝串聯(lián)整合到單個(gè)基因座或多個(gè)基因座中(其中任一個(gè)或全部可能含有一個(gè)以上的拷貝)。任選地，每個(gè)基因組座位可含有不多于三個(gè)或四個(gè)串聯(lián)整合基因拷貝，從而提高增殖和/或抗體生成期間的拷貝數(shù)穩(wěn)定性。
[0146]培養(yǎng)最常牽涉為細(xì)胞提供能源、氧和營(yíng)養(yǎng)素。在文獻(xiàn)中也已知設(shè)計(jì)并優(yōu)化巴斯德畢赤酵母發(fā)酵以表達(dá)重組蛋白的方法，包括優(yōu)化細(xì)胞密度、肉湯體積、底物給料速度和每個(gè)反應(yīng)期的長(zhǎng)度。見Cregg, J.M.編輯,2007, Pichia Protocols (第2版)中Zhang等，“Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations，，，Methods in Molecular Biology,第 389 卷,Humana Press, Totowa, N.J.,第 43-63 頁?？蔀榕囵B(yǎng)物提供包含氧的氣體混合物，例如有或無氧補(bǔ)充的空氣。可在培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母培養(yǎng)物，培養(yǎng)基可為基本培養(yǎng)基，可能缺乏選擇劑和/或可能缺乏預(yù)先形成的氨基酸或其它復(fù)合生物分子。培養(yǎng)基也可為復(fù)合培養(yǎng)基(例如，含酵母提取物和/或植物蛋白胨)。培養(yǎng)基可包括氮源(例如，甲胺氯、NH4S04、酵母提取物、大豆蛋白胨、其它植物蛋白胨等)。示例性的基本培養(yǎng)基包括基本葡萄糖培養(yǎng)基(MD) (1.34%酵母氮源(YNB)(無氨基酸)、4X 10_5%生物素和2%葡萄糖)、緩沖型基本甘油復(fù)合培養(yǎng)基(BMGY) (I %酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、1.34% YNB(無氨基酸)、4X 10-5%生物素和IOOmM磷酸氫二鉀(pH6.0))。培養(yǎng)基可包括一種或多種鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如磷酸氫二鉀、Tris或HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如，添加以抑制污染物的生長(zhǎng)和/或維持選擇標(biāo)記)、微量元素和葡萄糖和另一能源。在將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的適當(dāng)濃度下，也可包括任何補(bǔ)充和代替。
[0147]培養(yǎng)物可生長(zhǎng)至高細(xì)胞密度，例如至少50g / L、至少100g/L、至少300g / L、至少400g / L、至少500g/L或至少700g / L。這些培養(yǎng)物密度為說明性而非限制性，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地測(cè)定適合的培養(yǎng)物密度。
[0148]可培養(yǎng)酵母細(xì)胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后維持所述抗體的高水平表達(dá)。
[0149]可培養(yǎng)酵母細(xì)胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后維持所述抗體的高水平表達(dá)。
[0150]可培養(yǎng)酵母細(xì)胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后維持所述抗體的高水平表達(dá)。
[0151]另一方面，本公開提供了一種培養(yǎng)基，其含有根據(jù)前述任何方法生成的穩(wěn)定二倍體畢赤酵母培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基可包含至少約50mg / LUOOmg / L、500mg / L、750mg / LUOOOmg / L、1250mg / L、1500mg / L、1750mg / L、2000mg/L 或更高表達(dá)水平的所述所需抗體。這些產(chǎn)量值為說明性而非限制性。任選地，例如使用上文Zhang等(2007)描述的方法和一般途徑可優(yōu)化產(chǎn)量。例如，可通過改變溫度、pH、培養(yǎng)基組成(例如，碳源、碳源濃度、兩種或更多種碳源的混合物、氮源和濃度、鹽濃度和營(yíng)養(yǎng)素，包括KH2P04、K2HPO4,MgSO4、硫酸鉀、檸檬酸鈉、硫酸鉀、檸檬酸鈉、微量金屬(例如氯化鈷)、硫酸銅、碘化鈉、硫酸錳、鑰酸鈉、硼酸、氯化鋅、硫酸亞鐵、維生素(例如生物素)、肌醇、硫胺、蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白氨基酸、尿素、磷酸銨或其它銨離子、L-精氨酸-鹽酸鹽)、時(shí)間、培養(yǎng)物密度、氧化和影響產(chǎn)量的其它因素優(yōu)化產(chǎn)量。例如，在某些情況下可通過將溫度維持在所需設(shè)定值，例如介于約15°C和約30°C之間，例如介于約17°C和約25°C之間的設(shè)定值，提高所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量、表達(dá)和/或純度。不期望受理論限制，假設(shè)控制溫度可通過折疊和翻譯后加工途徑幫助細(xì)胞內(nèi)移行，和/或可降低細(xì)胞蛋白酶的活性。同樣，在某些情況下可通過將培養(yǎng)基的pH維持在所需設(shè)定值，例如介于pH3至pH8，例如介于pH4和pH7之間的設(shè)定值，提高所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量、表達(dá)和/或純度。
[0152]另一方面，本公開提供了一種培養(yǎng)基，其含有源自根據(jù)前述任何方法產(chǎn)生的向培養(yǎng)基中表達(dá)所述所需抗體的細(xì)胞的穩(wěn)定二倍體巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中所述二倍體細(xì)胞的細(xì)胞密度可為至少約50g / LUOOg / L、300g / L、400g/L、500g / L、700g / L或更高。這些培養(yǎng)物密度為說明性而非限制性，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易地測(cè)定適合的培養(yǎng)物密度。
[0153]所述抗體 或其它多亞基蛋白的至少一個(gè)亞基可包含分泌信號(hào)，例如雞溶菌酶(CLY)信號(hào)肽、CLY-L8、釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)信號(hào)肽、MF-a (Prepro), MF- a (Pre)-apv,MF- a (Pre) -apv-SLEKR、MF- α (Prepro) - (EA) 3、α F 信號(hào)肽、KILMI 信號(hào)肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHOl)信號(hào)肽、黑曲霉(A, niger)G0X信號(hào)肽、西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號(hào)肽、無前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、ISN信號(hào)肽、IFN信號(hào)肽、HGH信號(hào)肽、植物血球凝集素(PHA)、蠶溶菌酶、人溶菌酶(LYZl)U型激活素受體、II型激活素受體、巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結(jié)合蛋白(PpBiP)、人抗體3D6輕鏈前導(dǎo)序列及其任何組合。
[0154]可通過使各自含編碼所述抗體或其它多亞基蛋白的一個(gè)或多個(gè)亞基的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝的兩個(gè)單倍體酵母細(xì)胞交配產(chǎn)生宿主細(xì)胞。
[0155]附圖簡(jiǎn)述
[0156]圖1提供了獲得含特別指定拷貝數(shù)的編碼所需抗體輕鏈和/或重鏈的基因的單倍體菌株，并且使單倍體菌株交配以獲得由特別指定拷貝數(shù)的輕鏈和重鏈基因表達(dá)所需抗體的一組二倍體菌株的示例性方法的概述。
[0157]圖2用圖表說明了與H3xL3菌株相比，來自含拷貝數(shù)增加的編碼Ab-A輕鏈和重鏈的基因的選定二倍體菌株的相對(duì)全抗體產(chǎn)量。將H3xL3產(chǎn)量設(shè)為100%，相對(duì)全肉湯抗體滴度通常隨抗體總拷貝數(shù)增加而增加，順序?yàn)镠3xL4、H3xL3、H4xL4、H4xL6、H5xL4、H5xL5和H5xL7。
[0158]圖3用圖表說明了與H3xL3菌株相比，來自含拷貝數(shù)增加的編碼Ab-B輕鏈和重鏈的基因的菌株的相對(duì)全肉湯抗體產(chǎn)量。將H3xL3產(chǎn)量設(shè)為100%，相對(duì)全肉湯抗體滴度通常隨抗體拷貝數(shù)增加而增加，順序?yàn)镠3xL3、H3xL4、H4xL3、H4xL5和H4xL6。
[0159]圖4用圖表說明了與H3xL3菌株相比，來自含拷貝數(shù)增加的編碼Ab-C輕鏈和重鏈的基因的菌株的相對(duì)全肉湯抗體產(chǎn)量。將H3xL3產(chǎn)量設(shè)為100%，相對(duì)全肉湯抗體滴度通常隨抗體拷貝數(shù)增加而增加，順序?yàn)锳b-C-H3xL4、Ab-C-H4xL3、Ab_C_H4xL4、Ab_C_H4xL5、Ab-C-H5xL5、Ab-C-H5xL4、Ab-C_H5xL6 和 Ab-C_H6xL5。
[0160]圖5A-E示出了通過HPLC測(cè)定，由H4xL4和H4xL6菌株生成的Ab-A的蛋白-A捕獲洗脫物的純度。在15.5min時(shí)遷移的產(chǎn)物相關(guān)變體的水平(通過整合總面積的百分比測(cè)量)，降低5倍以上(從H4xL4中的8.81`降低到H4xL6中的1.58% )。
[0161]圖6A-E示出了通過HPLC測(cè)定，由H4xL3和H4xL5菌株生成的Ab-B的蛋白-A捕獲洗脫物的純度。在15.5min時(shí)遷移的產(chǎn)物相關(guān)變體的水平(通過整合總面積的百分比測(cè)量)，降低約59% (從H4xL3中的6.26%降低到H4xL5中的2.54% )。
[0162]圖7A-E示出了通過HPLC測(cè)定，由HexL3和H5xL5菌株生成的Ab-C的蛋白-A捕獲洗脫物的純度。在15.2-16.1min時(shí)遷移的產(chǎn)物相關(guān)變體的水平(通過整合總面積的百分比測(cè)量)，降低約39% (從H3xL3中的6.55%降低到H5xL5中的4.00% )。
[0163]圖8示出了由H4xL4和H4xL6菌株生成的Ab-A的染色SDS-PAGE凝膠。觀察到的“低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體”(箭頭)在來自具有較高輕鏈拷貝數(shù)的菌株的制劑中豐度較低。
[0164]圖9示出了由H4xL5和H4xL6菌株生成的蛋白-A純化Ab-B的染色SDS-PAGE凝膠。如同Ab-A—樣，觀察到的“低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體”(箭頭)在來自具有較高輕鏈拷貝數(shù)的菌株的制劑中豐度較低。
[0165]圖10示出了由H3xL3和H5xL5菌株生成的蛋白-A純化Ab-C的染色SDS-PAGE凝膠。如同Ab-A和Ab-B —樣，觀察到的“低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體”(箭頭)在來自具有較高抗體鏈拷貝數(shù)的菌株的制劑中豐度較低。
[0166]圖11顯示鑒定低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體為與人Fe有關(guān)的糖基化蛋白(通過其被凝集素柱選擇性富集和受抗Fe抗體特異性識(shí)別證明)?？贵w制劑(“載料”)與凝集素樹脂結(jié)合并洗脫(“凝集素洗脫物”)。SDS-PAGE(圖11A)展示了低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體受凝集素柱的選擇性富集。用抗HuFc抗體進(jìn)行的Western印跡(圖11A)檢測(cè)了低遷移率產(chǎn)物相關(guān)變體，表明其含有至少部分人Fe序列。本文將這種產(chǎn)物相關(guān)變體稱為“糖基-重鏈變體”。另外，相對(duì)于菌株H4xL3，在來自菌株H4xL5的抗體制劑中這種產(chǎn)物相關(guān)變體的量明顯減少。
[0167]圖12A-D和13A-D展示，通過HPLC觀察到的產(chǎn)物相關(guān)變體(保留時(shí)間約15.5min)在凝集素柱洗脫物中選擇性富集，表明糖基-重鏈變體是這種產(chǎn)物相關(guān)變體的組成部分。由H4xL3和H4xL5菌株制備抗體Ab-B。
[0168]圖14示出了用于將Ab-A或Ab-B的抗體重鏈序列靶向整合到pGAP基因座(基因座#1)中的構(gòu)建體的圖譜。[0169]圖15示出了用于將Ab-A或Ab-B的抗體輕鏈序列靶向整合到pGAP基因座(基因座#1)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0170]圖16示出了用于將Ab-A或Ab-B的抗體重鏈序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0171]圖17示出了用于將Ab-A或Ab-B的抗體輕鏈序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0172]圖18示出了用于將Ab-C的抗體重鏈序列靶向整合到AOXlTT基因座(基因座#1)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0173]圖19示出了用于將Ab-C的抗體輕鏈序列靶向整合到AOXlTT基因座(基因座#1)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0174]圖20示出了用于將Ab-C的抗體重鏈序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0175]圖21示出了用于將Ab-C的抗體輕鏈序列靶向整合到HIS4TT基因座(基因座#2)中的構(gòu)建體的圖譜。
[0176]圖22說明了在單個(gè)基因座整合的抗體拷貝數(shù)與通過Southern印跡可檢測(cè)的預(yù)計(jì)片段大小之間的關(guān)系。
[0177]圖23和24示出了分別用于檢測(cè)經(jīng)編碼Ab-A鏈的基因轉(zhuǎn)化的多個(gè)分離株中，抗體重鏈基因和輕鏈基因的拷貝數(shù)的Southern印跡。
[0178]圖25-27示出了用于確認(rèn)通過使轉(zhuǎn)化單倍體菌株交配產(chǎn)生的一組二倍體菌株中，pGAP(圖25-26)和HIS4TT(圖27)基因座上存在的編碼Ab-A重鏈和輕鏈的基因的拷貝數(shù)的Southern印跡。
[0179]圖28A-B示出了分別用于檢測(cè)經(jīng)編碼Ab-B鏈的基因轉(zhuǎn)化的多個(gè)分離株中，抗體重鏈基因和輕鏈基因的拷貝數(shù)的Southern印跡。
[0180]圖29-31示出了確認(rèn)通過使轉(zhuǎn)化單倍體菌株交配產(chǎn)生的一組二倍體菌株中，pGAP(圖29-30)和HIS4TT(圖31)基因座上存在的編碼Ab-B重鏈和輕鏈的基因的拷貝數(shù)的Southern印跡。
[0181]圖32-33示出了分別用于檢測(cè)經(jīng)編碼Ab-C鏈的基因轉(zhuǎn)化的多個(gè)分離株中，抗體重鏈和輕鏈基因的拷貝數(shù)的Southern印跡。
[0182]圖34-36示出了確認(rèn)通過使轉(zhuǎn)化單倍體菌株交配產(chǎn)生的一組二倍體菌株中，3’A0XTT(圖34-35)和HIS4TT(圖36)基因座上存在的編碼Ab-C重鏈和輕鏈的基因的拷貝數(shù)的Southern 印跡。
[0183]圖37說明了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案可使用的輕鏈和重鏈基因拷貝數(shù)的示例性、非限制性組合。
[0184]圖38示出了編碼Ab-A輕鏈和重鏈的多核苷酸序列及其編碼的多肽，以及其中所含的⑶R序列。
[0185]圖39示出了編碼Ab-B輕鏈和重鏈的多核苷酸序列及其編碼的多肽，以及其中所含的⑶R序列。
[0186]圖40示出了編碼Ab-C輕鏈和重鏈的多核苷酸序列及其編碼的多肽。
[0187]詳述
[0188]本公開提供了產(chǎn)生并鑒定能夠生成增高產(chǎn)量的所需異源多亞基復(fù)合物和/或生成具有提高純度的所需異源多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，異源多亞基復(fù)合物是由兩個(gè)重鏈亞基和兩個(gè)輕鏈亞基構(gòu)成的抗體或抗體片段，例如人源化抗體。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括酵母，并且特別優(yōu)選的酵母包括甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株，例如巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、Pichiainositovera 等(見，例如，美國專利 4，812，405、4，818，700、4，929，555、5，736，383、5，955，349,5, 888，768和6，258，559，其各自通過引用整體并入)。可通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生宿主細(xì)胞。例如，可通過使含不同拷貝數(shù)的單獨(dú)亞基基因的細(xì)胞交配(優(yōu)選其拷貝數(shù)在交配之前已知)，產(chǎn)生含不同基因拷貝數(shù)組合的一組二倍體或四倍體酵母細(xì)胞。
[0189] 申請(qǐng)人:已經(jīng)意外發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)物可維持高穩(wěn)定拷貝數(shù)的編碼所需多亞基復(fù)合物的基因。工作實(shí)例證明細(xì)胞維持多達(dá)6或7個(gè)拷貝的抗體重鏈和輕鏈編碼基因。即使在長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，這些細(xì)胞也可穩(wěn)定地表達(dá)所需抗體。另外，即使在長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)間之后，細(xì)胞也可維持所需多亞基復(fù)合物的高產(chǎn)量和高表達(dá)。
[0190]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可包含編碼異源蛋白亞基的一個(gè)或多個(gè)基因的一個(gè)以上的拷貝。例如，亞基基因的多個(gè)拷貝可串聯(lián)整合到一個(gè)或多個(gè)染色體基因座中。優(yōu)選在培養(yǎng)期間將串聯(lián)整合的基因拷貝保持在穩(wěn)定拷貝數(shù)以生成多亞基復(fù)合物。例如，在下述實(shí)例中，對(duì)于含輕鏈和重鏈抗體基因的3-4個(gè)串聯(lián)整合拷貝的巴斯德畢赤酵母菌株而言，基因拷貝數(shù)通常穩(wěn)定。
[0191]優(yōu)選將編碼異源蛋白亞基的一個(gè)或多個(gè)基因整合到宿主細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)染色體基因座中。任何適合染色體基因座均可用于整合，包括基因間序列、啟動(dòng)子序列、編碼序列、終止序列、調(diào)控序列等。巴斯德畢赤酵母中可用的示例性染色體基因座包括PpURA5、0CH1、A0X1、HIS4和GAP。編碼基因也可整合到一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)染色體基因座中，而不能靶向。在優(yōu)選實(shí)施方案中，染色體基因座選自PGAP基因座、3’AOX TT基因座和HIS4TT基因座。在另外的示例性實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)染色體外元件，例如一個(gè)或多個(gè)質(zhì)?；蛉斯と旧w中可含有編碼異源蛋白亞基的基因。
[0192]在示例性實(shí)施方案中，多亞基蛋白可包含2、3、4、5、6或更多個(gè)不同亞基。另外，在每種多亞基蛋白中每個(gè)亞基可出現(xiàn)一次或多次。例如，多亞基蛋白可為多特異性抗體，例如包含兩條不同輕鏈和兩條不同重鏈的雙特異性抗體?？赏ㄟ^使含有不同拷貝數(shù)的單獨(dú)亞基基因的細(xì)胞交配快速產(chǎn)生含有不同基因拷貝數(shù)組合的一組二倍體或四倍體酵母細(xì)胞。然后可評(píng)估組內(nèi)每種菌株的抗體生成以基于特征，例如相對(duì)于所需副產(chǎn)物所需多亞基蛋白的產(chǎn)量或所需多亞基蛋白的純度鑒定菌株供將來使用。
[0193]亞基可由單順反子基因、多順反子基因或其任何組合表達(dá)。每個(gè)多順反子基因可包含相同亞基的多個(gè)拷貝，或可包含每個(gè)不同亞基的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
[0194]在公開申請(qǐng)，包括U.S.20080003643、U.S.20070298500 和 U.S.20060270045，以及在 Higgins, D.R.和 Cregg, J.Μ.編輯，1998.Pichia Protocols.Methods in MolecularBiology.Humana Press, Totowa, N.J.,和 Cregg, J.M.編輯，2007, Pichia Protocols (第 2版)，Methods in Molecular Biology.Humana Press,Totowa,N.J.中公開了可用于操縱巴斯德畢赤酵母的示例性方法(包括培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和交配的方法)，其各自通過引用整體并入。
[0195]可利用的示例性表達(dá)盒由甘油醛脫氫酶基因(GAP基因)啟動(dòng)子構(gòu)成，與編碼分泌信號(hào)的序列融合，后面是待表達(dá)的基因序列，后面是來自巴斯德畢赤酵母醇氧化酶I基因(A0X1)的編碼巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列。Zeocin抗性標(biāo)記基因可提供通過選擇對(duì)較高水平的Zeocin有抗性的轉(zhuǎn)化體，富集含有菌株中的表達(dá)載體的多個(gè)整合拷貝的菌株的方式。類似地，G418或卡那霉素(Kanamycin)抗性標(biāo)記基因可用于提供通過選擇對(duì)較高水平的遺傳霉素(Geneticin)或卡那霉素有抗性的轉(zhuǎn)化體，富集含有菌株中的表達(dá)載體的多個(gè)整合拷貝的菌株的方式。
[0196]可利用的宿主菌株包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母或其它畢赤酵母菌株，例如metl、lyS3、ura3和adel或其它營(yíng)養(yǎng)缺陷型相關(guān)基因中有突變的菌株。優(yōu)選的突變不能以任何可估量的頻率產(chǎn)生回復(fù)突變體并且優(yōu)選為部分或甚至更加優(yōu)選完全缺失突變體。優(yōu)選地，通過使?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株的互補(bǔ)組交配產(chǎn)生原養(yǎng)型二倍體或四倍體菌株。
[0197]單倍體巴斯德畢赤酵母菌株的轉(zhuǎn)化和巴斯德畢赤酵母生殖周期的遺傳操縱可如上文 Pichia Protocols (1998，2007)中所述進(jìn)行。
[0198]轉(zhuǎn)化之前，可通過 在與靶基因組座位同源的區(qū)域(例如，GAP啟動(dòng)子序列)中的限制酶裂解使每個(gè)表達(dá)載體線性化以指示載體整合到宿主細(xì)胞的靶基因座中。然后可通過電穿孔或其它方法，將每種載體的樣品單獨(dú)轉(zhuǎn)化到所需菌株的培養(yǎng)物中，并且可借助于選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型的抗生素抗性或互補(bǔ)作用選擇成功的轉(zhuǎn)化體。在選擇條件下挑取分離株，劃單一菌落，然后通過對(duì)從每個(gè)菌株提取的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡或PCR測(cè)定，檢查確認(rèn)編碼多亞基復(fù)合物(例如，所需抗體)亞基的基因的拷貝數(shù)。任選地，例如可通過FACS、Western印跡、菌落轉(zhuǎn)移和免疫印跡及本領(lǐng)域已知的其它方法確認(rèn)預(yù)計(jì)亞基基因產(chǎn)物的表達(dá)。任選地，可再次轉(zhuǎn)化單倍體分離株以引入附加的異源基因，例如在不同基因座整合的相同亞基的附加拷貝和/或不同亞基的拷貝。然后使單倍體菌株交配以產(chǎn)生能夠合成多蛋白復(fù)合物的二倍體菌株(或更高倍數(shù)性的菌株)。可通過Southern印跡、PCR和本領(lǐng)域已知的其它檢測(cè)方式確認(rèn)每個(gè)預(yù)計(jì)亞基基因的存在。所需多蛋白復(fù)合物為抗體時(shí)，也可通過菌落轉(zhuǎn)移/免疫印跡法(Wung等Biotechniques21808_812 (1996)和/或通過FACS確認(rèn)其表達(dá)。
[0199]任選地重復(fù)該轉(zhuǎn)化方案以使異源基因靶向第二基因座，所述異源基因可為靶向第一基因座的相同基因或不同基因。當(dāng)待整合到第二基因座中的構(gòu)建體編碼與第一基因座編碼的序列相同或高度相似的蛋白時(shí) ，可改變其序列以降低不需要整合到第一基因座中的可能性。例如，相對(duì)于整合到第一基因座中的序列，待整合到第二基因座中的序列可能有啟動(dòng)子序列、終止序列、密碼子使用的差異和/或其它可容許的序列差異。
[0200]為使巴斯德畢赤酵母單倍體菌株交配，可將待雜交的每種菌株一起在交配板上成斑(patched)。例如，通過在適合其生長(zhǎng)的板上劃取待交配的每種菌株方便地同時(shí)進(jìn)行多次交配，并且可將配偶體劃在第二塊板上(優(yōu)選地，板為富集培養(yǎng)基例如YPD)。通常，在30°C下培育I或2天后，以十字形方式將來自兩塊板的細(xì)胞復(fù)制接種在交配板上，產(chǎn)生交叉陰影圖案，每對(duì)菌株共同接種并且有機(jī)會(huì)在一對(duì)原始劃線的交叉點(diǎn)交配。然后培育交配板(例如，在30°C下)以刺激菌株之間開始交配。約兩天之后，可劃取交配板上的細(xì)胞、成斑或復(fù)制接種到對(duì)所需二倍體菌株有選擇性的培養(yǎng)基上(例如，交配菌株具有互補(bǔ)自養(yǎng)作用時(shí)，可使用漏失或基本培養(yǎng)基板)。可培養(yǎng)這些板(例如，在30°C下)適合的時(shí)間(例如，約3天)以允許所需二倍體菌株的選擇性生長(zhǎng)。可挑取出現(xiàn)的菌落并且劃單一菌落以分離并純化每種二倍體菌株。
[0201 ] 用于本發(fā)明方法中的表達(dá)載體可進(jìn)一步包括酵母特定序列，包括用于鑒定轉(zhuǎn)化酵母菌株的可選營(yíng)養(yǎng)缺陷型或藥物標(biāo)記。藥物標(biāo)記可進(jìn)一步用于擴(kuò)增酵母宿主細(xì)胞中載體的拷貝數(shù)，例如通過在濃度升高的藥物中培養(yǎng)一群細(xì)胞，從而選擇表達(dá)抗性基因的水平升高的轉(zhuǎn)化體。
[0202]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，編碼異源蛋白亞基的一個(gè)或多個(gè)基因與誘導(dǎo)性啟動(dòng)子偶聯(lián)。適合的示例性啟動(dòng)子包括醇氧化酶I基因啟動(dòng)子、甲醛脫氫酶基因(FLD ;見美國出版物N0.2007/0298500)和本領(lǐng)域已知的其它誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。酵母在最常見的碳源，例如葡萄糖、甘油或乙醇上生長(zhǎng)期間，醇氧化酶I基因啟動(dòng)子受牢固阻抑，但是在甲醇上生長(zhǎng)期間受高度誘導(dǎo)(Tschopp等，1987 ;Stroman, D.W等的美國專利N0.4，855，231)。為生成外源蛋白，最初可使菌株在阻抑性碳源上生長(zhǎng)以生成生物質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到作為唯一(或主要)碳源和能源的甲醇上以誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可通過在阻抑條件下生長(zhǎng)，保存經(jīng)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒的外源基因轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母菌株。
[0203]在另一示例性實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)異源基因可與在適當(dāng)條件下表達(dá)水平可上調(diào)的受調(diào)控啟動(dòng)子偶聯(lián)。示例性的受調(diào)`控啟動(dòng)子包括CUPl啟動(dòng)子(受培養(yǎng)基中銅的水平誘導(dǎo))、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、硫胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子和FLDl啟動(dòng)子。
[0204]雖然本公開大量描述了抗體的生成，但是本文所述方法也易于適用于其它多亞基復(fù)合物。不期望受理論限制，據(jù)信多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量和純度可極大地受亞基濃度和化學(xué)計(jì)量的影響，其依次受負(fù)責(zé)生成每種亞基的基因的表達(dá)水平影響。本文公開的方法可容易地用于提高包含兩個(gè)或更多個(gè)不同亞基的任何重組多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量和/或純度。另外，本方法不限于生成多蛋白復(fù)合物，也可易于適用于核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物，包括端粒酶、hnRNP、核糖體、snRNP、信號(hào)識(shí)別粒子、原核和真核核糖核酸酶P復(fù)合物和含有多種不同蛋白和/或RNA亞基的任何其它復(fù)合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法生成表達(dá)多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。例如，可通過使含不同拷貝數(shù)的單獨(dú)亞基基因的細(xì)胞交配(優(yōu)選其拷貝數(shù)在交配之前已知)，產(chǎn)生含不同基因拷貝數(shù)組合的一組二倍體或四倍體酵母細(xì)胞。
[0205]定義
[0206]應(yīng)理解，本發(fā)明不限于描述的特定方法學(xué)、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種類或?qū)俸驮噭?，因?yàn)檫@些可改變。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實(shí)施方案，并非旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求的限制。[0207]如本文所使用，除非上下文另外明確規(guī)定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)所指物。因此，例如，提到“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)此類細(xì)胞并且提到“所述蛋白質(zhì)”包括提到一種或多種蛋白質(zhì)及其本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的等效物，等等。除非另外明確指出，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。
[0208]團(tuán)注添加(Bolus addition):在本公開中，“團(tuán)注添加”通常指接觸培養(yǎng)細(xì)胞(例如，在培養(yǎng)基中)的物質(zhì)(乙醇)濃度的急劇變化。例如，可向培養(yǎng)細(xì)胞中單次添加、連續(xù)一次以上添加和/或在一段時(shí)間內(nèi)(例如，約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、90或120min內(nèi))輸注所述物質(zhì)。也可通過部分或完全更換培養(yǎng)基添加所述物質(zhì)，例如通過濃縮細(xì)胞(使用離心、過濾、沉淀或其它方法)，去除部分或全部培養(yǎng)基并且添加所述物質(zhì)，或通過將細(xì)胞添加到含所述物質(zhì)的培養(yǎng)基中。所述物質(zhì)可與載體混合(例如，培養(yǎng)基、水、鹽水等)。例如，乙醇團(tuán)注添加可包括向培養(yǎng)基添加量足以產(chǎn)生所需濃度的純或濃乙醇(例如，100%、95%、70%、50%、60%、40%、30%、20%等)。再如，可將細(xì)胞添加到含乙醇的培養(yǎng)基中，例如通過向含乙醇的培養(yǎng)基中添加含細(xì)胞的接種物。
[0209]團(tuán)注濃度(Bolus concentration):在本發(fā)明中團(tuán)注濃度”通常指由于團(tuán)注添加物質(zhì)(例如，乙醇)產(chǎn)生的濃度。
[0210]能交配的酵母物種:在本發(fā)明中這是為了廣泛涵蓋可在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的任何二倍體或四倍體酵母。這些酵母物種可呈單倍體、二倍體或其它多倍體形式存在。給定倍數(shù)性的細(xì)胞可在適當(dāng)條件下呈該形式增殖無限代。二倍體細(xì)胞也可產(chǎn)生孢子以形成單倍體細(xì)胞。通過二倍體菌株的進(jìn)一步交配或融合，連續(xù)交配可產(chǎn)生四倍體菌株。本發(fā)明考慮到了單倍體酵母以及(例如)通過交配或融合(例如，球狀質(zhì)體融合)產(chǎn)生的二倍體或其它多倍體酵母細(xì)胞的用途。
[0211]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，能交配的酵母是酵母(Saccharomycetaceae)科的成員，其包括Arxiozyma屬、Ascobotryozyma屬、固囊酵母屬(Citeromyces)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、德克酵母屬(Dekkera)`、假囊酵母屬(Eremothecium)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、Kazachstania 屬、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、Kodamaea 屬、路德酵母屬(Lodderomyces)、管囊酵母屬(Pachysolen)、畢赤酵母屬(Pichia)、糖酵母屬(Saccharomyces)、Saturnispora 屬、Tetrapisispora 屬、有抱圓酵母屬(Torulaspora)、擬威爾氏酵母屬(Williopsis)和接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。在本發(fā)明中可能有用的其它酵母類型包括耶氏酵母屬(Yarrowia)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)Jg絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、黑粉酵母屬(Filobasium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、白冬孢酵母屬(Leucosporidium)和擬線黑粉酵母屬(Filobasidella)。
[0212]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，能交配的酵母是畢赤氏酵母屬的成員或是另一種甲基營(yíng)養(yǎng)生物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，畢赤氏酵母屬能交配的酵母是下列物種之一:巴斯德畢赤氏酵母、甲醇畢赤酵母和多形漢遜氏酵母(安格斯畢赤酵母)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，畢赤氏酵母屬能交配的酵母是物種巴斯德畢赤氏酵母。
[0213]單倍體酵母細(xì)胞:在其正?；蚪M(染色體組)中每個(gè)基因具有單個(gè)拷貝的細(xì)胞。
[0214]多倍體酵母細(xì)胞:具有其正?；蚪M(染色體組)一個(gè)以上拷貝的細(xì)胞。[0215]二倍體酵母細(xì)胞:在其正常基因組中基本上每個(gè)基因都有兩個(gè)拷貝(等位基因)的細(xì)胞，通常通過兩個(gè)單倍體細(xì)胞的融合(交配)過程形成。
[0216]四倍體酵母細(xì)胞:在其正?；蚪M中基本上每種基因都有四個(gè)拷貝(等位基因)的細(xì)胞，通常通過兩個(gè)二倍體細(xì)胞的融合(交配)過程形成。四倍體可以攜帶兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)不同的表達(dá)盒。在釀酒酵母中可通過將純合異宗配合的a / a與α / α 二倍體進(jìn)行選擇性交配，而在畢赤氏酵母中可通過將單倍體連續(xù)交配獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型二倍體，獲得這些四倍體。例如，可將[inet his]單倍體與[ade his]單倍體交配獲得二倍體[his];并且可將[met arg]單倍體與[ade arg]單倍體交配獲得二倍體[arg];然后可將二倍體[his]與二倍體[arg]交配獲得四倍體原養(yǎng)型。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，提到的二倍體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和用途也可適用于四倍體細(xì)胞。
[0217]酵母交配:兩個(gè)酵母細(xì)胞融合形成單個(gè)酵母細(xì)胞的過程。融合細(xì)胞可為單倍體細(xì)胞或具更高倍數(shù)性的細(xì)胞(例如，使兩個(gè)二倍體細(xì)胞交配產(chǎn)生四倍體細(xì)胞)。
[0218]減數(shù)分裂:二倍體酵母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂形成四個(gè)單倍體孢子產(chǎn)物的過程。然后每個(gè)孢子可發(fā)芽并形成單倍體無性生長(zhǎng)細(xì)胞系。
[0219]選擇標(biāo)記:選擇標(biāo)記是賦予接受(例如通過轉(zhuǎn)化事件)該基因的細(xì)胞以生長(zhǎng)表型(物理生長(zhǎng)特征)的基因或基因片段。選擇標(biāo)記允許該細(xì)胞在未接受該選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下，在選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存活并生長(zhǎng)。選擇標(biāo)記基因通常分成幾類，包括:正選擇標(biāo)記基因，例如賦予 細(xì)胞對(duì)抗生素或其它藥物，將兩種溫度敏感性(“ts”)突變體雜交或轉(zhuǎn)化ts突變體時(shí)的溫度的抗性的基因；負(fù)選擇標(biāo)記基因，例如賦予細(xì)胞在不含沒有該生物合成基因的所有細(xì)胞需要的特殊營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力的生物合成基因，或使細(xì)胞不能像不含野生型基因的細(xì)胞般生長(zhǎng)的誘變生物合成基因等等。適合的標(biāo)記包括但不限于 ZE0、NE0(G418)、LYS3、METl、MET3a、ADEl、ADE3、URA3 等。
[0220]整合:遺傳元件(通常為異源遺傳元件)共價(jià)連接到生物染色體中。
[0221]串聯(lián)整合:遺傳元件的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝整合到染色體中的相鄰位置。所述兩個(gè)或更多個(gè)拷貝不一定有取向；例如，對(duì)于轉(zhuǎn)錄基因而言，一些拷貝可從沃森鏈(Watsonstrand)轉(zhuǎn)錄而其它拷貝從克里克鏈(Crick strand)轉(zhuǎn)錄。
[0222]宿主細(xì)胞:在本公開的上下文中，術(shù)語宿主細(xì)胞指含有異源基因的細(xì)胞(例如，真核細(xì)胞如畢赤酵母細(xì)胞)。例如，異源基因可以是為了表達(dá)所需多亞基復(fù)合物的亞基而提供，是蛋白質(zhì)折疊(例如，伴侶蛋白)、表達(dá)或分泌中牽涉的基因和/或另一所需基因。異源基因可整合到真核細(xì)胞的基因組中或含在染色體外元件例如質(zhì)?；蛉斯と旧w中。
[0223]表達(dá)載體:這些DNA載體含有利于操縱靶宿主細(xì)胞中的外源蛋白表達(dá)的元件。為了方便，首先在細(xì)菌宿主(例如大腸桿菌(E.coli))中進(jìn)行對(duì)序列的操縱和用于轉(zhuǎn)化的DNA的生成，并且載體通常將包括利于此類操縱的序列，包括細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和適當(dāng)?shù)募?xì)菌選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記編碼在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。未用含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中將不能存活。典型選擇基因編碼如下性質(zhì)的蛋白質(zhì):(I)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，(2)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷，或
(3)供給不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的重要營(yíng)養(yǎng)素。例如,在Burke,D.>Dawson7D.和Stearns,T.(2000).Methods in yeast genetics:a Cold Spring Harbor Laboratory courseinanual.Plainview,N.y:Cold Spring Harbor Laboratory Press 中描述了用于酵母轉(zhuǎn)化的示例性載體和方法，其通過引用整體并入本文。
[0224]用于本發(fā)明方法的表達(dá)載體還可包括酵母特定序列，包括用于鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母菌株的可選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷型或藥物標(biāo)記。藥物標(biāo)記還可用于選擇擴(kuò)增酵母宿主細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)。
[0225]目標(biāo)多肽編碼序列通常與為了在酵母細(xì)胞中表達(dá)多肽而提供的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可操作地連接。這些載體組分可包括但不限于下列一項(xiàng)或多項(xiàng):增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。還可包括用于分泌多肽的序列，例如信號(hào)序列等。因?yàn)楸磉_(dá)載體常常整合到酵母基因組中，所以酵母復(fù)制起點(diǎn)可任選。
[0226]雖然任選，但是在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基與為了將表達(dá)的多肽分泌到培養(yǎng)基中而提供的分泌序列可操作地連接或融合，這可利于收獲和純化異源多亞基復(fù)合物。甚至更加優(yōu)選，分泌序列是為了多肽從宿主細(xì)胞(例如，酵母二倍體細(xì)胞)的優(yōu)化地分泌而提供，例如通過選擇優(yōu)選密碼子和/或通過密碼子選擇改變AT百分比。在本領(lǐng)域中已知，分泌效率和/或穩(wěn)定性可受分泌序列的選擇影響并且最優(yōu)分泌序列在不同蛋白質(zhì)之間可以不同(見，例如，Koganesawa等，Protein Eng.2001年9月；14 (9):705_10，其通過引用整體并入本文)。在本領(lǐng)域中已知許多可能適合的分泌信號(hào)并且可容易地測(cè)試其對(duì)特定異源多亞基復(fù)合物產(chǎn)量和/或純度的影響。任何分泌序列均可能使用，包括酵母和其它物種的分泌蛋白中存在的分泌序列以及工程化分泌序列?？衫玫氖纠苑置谛蛄邪?雞溶菌酶(CLY)信號(hào)肽(MRSLLILVLCFLPLAALG(SEQ ID NO:31))、CLY-L8(MRLLLLLLLLPLAALG(SEQ ID NO:32))、釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)信號(hào)肽(MLLQAFLFLLAGFAAKISA(SEQ ID NO:33)), MF-a (Prepro)(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLE KR(SEQ ID NO:34))、MF-a (Pre)-apv(MRFPSIFTAVLFAASSALA-A PV(SEQ ID NO:35))、MF-a (Pre)-apv-SLEKR(MRFPSIFTAVLFAAS SALA-APVSLEKR(SEQ ID NO:36))、MF-a (Prepro) - (EA)3(MRFPSI FTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA(SEQ ID NO:37))、a F 信號(hào)肽(MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPA EAVIGYSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSL EKR (SEQID NO:38))、KILMl 信號(hào)肽( MTKPTQVLVRSVSILFFIT LLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR(SEQID NO:39)),阻抑性酸性磷酸酶(PHOl)信號(hào)肽(MFSPILSLEIILALATLQSVFA (SEQID NO:40)),黑曲霉 GOX 信號(hào)肽(MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR(SEQ ID NO:41))、西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號(hào)肽(MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA (SEQ ID NO:42))、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS RGVFRR(SEQ ID NO:43))、無前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO:44))、ISN 信號(hào)肽(MALWM RLLPLLALLALffGPDPAAA (SEQID NO:45)), IFN ff 號(hào)肽(MKYT SYILAFQLCIVLGSLGCDLP (SEQ ID NO:46))、HGH 信號(hào)肽(MAA DSQTPffLLTFSLLCLLffPQEPGA (SEQ ID NO:47))、植物血球凝集素(PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG(SEQ ID N 0:48))、蠶溶菌酶(MQKLIIFALVVLCVGSEA(SEQ IDNO:49))、人溶菌酶(LYZl) (MKALIVLGLVLLSVTVQG(SEQ ID NO:50))、I 型激活素受體(MVDGVMILPVLIMIALPSPS(SEQ ID NO:51))、II 型激活素受體(MGAAAKLAFAVFLISCSSG(SEQID NO:52))、巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結(jié)合蛋白(PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA(SEQ ID NO:53))、 和人抗體 3D6 輕鏈前導(dǎo)序列(MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC(SEQID NO:54))。見 Hashimoto 等，Protein Engineering 第 11 卷 2 號(hào)，第 75-77 頁，1998 年；Oka 等，Biosci Biotechnol Biochem.1999 年 11 月；63(11):1977-83 ;Gellissen 等，F(xiàn)EMSYeast Research5(2005) 1079-1096 ；Ma 等，Hepatology.2005 年 12 月；42(6):1355-63 ；Raemaekers 等，Eur J Biochem.1999 年 10 月 I 日；265(1):394-403 ；Koganesawa 等，Protein Eng.(2001) 14(9):705-710 ;Daly 等，Protein Expr Purif.2006 年 4 月；46(2):456-67 ；Damasceno 等，APPl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389 ;和 Felgenhauer等，Nucleic Acids Res.1990年8月25日；18(16):4927，其各自通過引用整體并入本文。多亞基復(fù)合物也可分泌到培養(yǎng)基中而不與分泌信號(hào)可操作地連接或融合。例如，已經(jīng)證明，當(dāng)在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，即使不與分泌信號(hào)連接或融合，一些異源多肽也分泌到培養(yǎng)基中。另外，可使用本領(lǐng)域已知的方法從宿主細(xì)胞純化多亞基復(fù)合物(例如，如果復(fù)合物分泌較差，可優(yōu)選)。
[0227]可從培養(yǎng)物中回收包含所需多亞基復(fù)合物的培養(yǎng)基或細(xì)胞。任選地，分泌的蛋白質(zhì)可純化。例如，可使用機(jī)械、化學(xué)、酶和/或滲透方法(例如，用液氮冷凍、使用均化器、球狀質(zhì)體化、超聲處理、在玻璃珠的存在下攪拌、使用洗滌劑等)溶解包含所需多亞基復(fù)合物的細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法濃縮、過濾、透析所需多亞基復(fù)合物等。例如，可基于其分子質(zhì)量(例如，尺寸排阻色譜法)、等電點(diǎn)(例如，等電聚焦)、電泳遷移率(例如，凝膠電泳)、疏水作用色譜(例如，HPLC)、電荷(例如，離子交換色譜法)、親和力(例如，在為抗體的情況下，與蛋白A、蛋白G和/或所需抗體結(jié)合的表位的結(jié)合)和/或糖基化狀態(tài)(例如，通過凝集素結(jié)合親和力檢測(cè))純化所需多亞基復(fù)合物?？蛇M(jìn)行多個(gè)純化步驟以獲得所需水平的純度。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所需多亞基復(fù)合物可包含免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域并且可使用蛋白A或蛋白G親和、尺寸排阻色譜法純化，并且沒有與凝集素結(jié)合(以去除糖基化形式)。任選地，可添加A蛋白酶抑制劑，例如苯甲基磺酰氟以抑制純化期間的蛋白水解降解。
[0228]當(dāng)置于和另一核 酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，核酸“可操作地連接”。例如，如果信號(hào)序列的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白，與多肽的DNA可操作地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，與編碼序列可操作地連接。通常，“可操作地連接”指相連DNA序列鄰近，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下鄰近且位于閱讀框中。然而，增強(qiáng)子不一定鄰近。相連是通過便利限制性位點(diǎn)處的連接或經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的PCR /重組法實(shí)現(xiàn)(Gateway⑩Technology ；Invitrogen, Carlsbad, California)。如果不存在此類位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐可使用合成的寡核苷酸適配子或連接子。所需核酸(包括含可操作連接序列的核酸)也可通過化學(xué)合成生成。
[0229]啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(5')(通常在約IOO-1OOObp內(nèi))的非翻譯序列，它控制與之可操作地連接的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類啟動(dòng)子分為幾類:誘導(dǎo)型、組成型和阻抑型啟動(dòng)子(其響應(yīng)于阻抑物的缺乏提高轉(zhuǎn)錄水平)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可響應(yīng)于培養(yǎng)條件的某些變化(例如營(yíng)養(yǎng)素的存在或缺乏或溫度的變化)而提高受它控制的DNA的轉(zhuǎn)錄水平。
[0230]酵母啟動(dòng)子片段也可用作將表達(dá)載體同源重組和整合到酵母基因組相同位點(diǎn)的位點(diǎn)；可選地，使用選擇標(biāo)記作為同源重組的位點(diǎn)。在Cregg等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385中描述了畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化，其通過引用整體并入本文。[0231]來自畢赤氏酵母的適合啟動(dòng)子的實(shí)例包括CUPl (受培養(yǎng)基中銅的水平誘導(dǎo))、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、硫胺誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子(Cregg等，(1989)Mol.Cell.Biol.9:1316-1323)、ICLl 啟動(dòng)子(Menendez 等，(2003) Yeast20 (13): 1097-108)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GAP) (Waterham 等，(1997) Genel86 (I):37-44)和 FLDl 啟動(dòng)子(Shen 等，(1998)Gene216 (I):93-102)。GAP啟動(dòng)子是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子而CUPl、Α0Χ和FLDl啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型。每個(gè)前述參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。
[0232]其它酵母啟動(dòng)子包括ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05、Pyk和源自其中的嵌合啟動(dòng)子。另外，在本發(fā)明中可使用非酵母啟動(dòng)子，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、病毒和禽類啟動(dòng)子。最通常的情況下，啟動(dòng)子將包括哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(對(duì)表達(dá)基因可能為內(nèi)源性)或?qū)樵诮湍赶到y(tǒng)中有效轉(zhuǎn)錄而提供的酵母或病毒啟動(dòng)子。
[0233]不但可直接重組生成目標(biāo)多肽，而且可作為與異源多肽(例如信號(hào)序列或在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端具有特異性裂解位點(diǎn)的其它多肽)的融合多肽。一般而言，信號(hào)序列可為載體的組分，或者它可為插入載體的多肽編碼序列的一部分。優(yōu)先選擇的異源信號(hào)序列是受到宿主細(xì)胞內(nèi)可用的標(biāo)準(zhǔn)途徑之一識(shí)別和加工的信號(hào)序列。釀酒酵母α因子前原信號(hào)(pre-pro signal)已經(jīng)證明在多種重組蛋白從巴斯德畢赤氏酵母的分泌中有效。其它酵母信號(hào)序列包括α交配因子信號(hào)序列、轉(zhuǎn)化酶信號(hào)序列和源自分泌的其它酵母多肽的信號(hào)序列。另外，這些信號(hào)肽序列可經(jīng)工程化以在二倍體酵母表達(dá)系統(tǒng)中增強(qiáng)分泌而提供。其它目標(biāo)分泌信號(hào)還包括哺乳動(dòng)物信號(hào)序列，其可能對(duì)于所分泌的蛋白質(zhì)異源，或者可能對(duì)于所分泌的蛋白質(zhì)而言是天然序列。信號(hào)序列包括前肽(pre-p印tide)序列，而且在有些情況下可包括原肽(prop印tide)序列。本領(lǐng)域已知許多此類信號(hào)序列，包括在免疫球蛋白鏈中發(fā)現(xiàn)的信號(hào)序列，例如K28前毒素原(pr印rotoxin)序列、PHA-E, FACE、人MCP-1、人血清白蛋白信號(hào)序列、人Ig重鏈、人Ig輕鏈等等。例如,見Hashimoto等,ProteinEngll (2) 75 (1998);和 Kobayashi 等 Therapeutic Apheresis2 (4) 257 (1998)，其各自通過引用整體并入本文。
[0234]可通過在載體中插入轉(zhuǎn)錄激活子序列來提高轉(zhuǎn)錄。這些激活子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，其作用于啟動(dòng)子以提高其轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子相對(duì)不依賴于取向和位置，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)位于轉(zhuǎn)錄單位的5'端和3'端，內(nèi)含子以及自身編碼序列中?？蓪⒃鰪?qiáng)子剪接到表達(dá)載體中，位于編碼序列的5'端或3'端,但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。
[0235]用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體還可含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢杂烧婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)中翻譯終止密碼子的3'端獲得。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄成mRNA非翻譯部分中的多聚腺苷酸片段的核苷酸區(qū)段。
[0236]采用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)或PCR /重組方法來構(gòu)建含一種或多種以上所列組分的適合載體。以期望的形式將分離的質(zhì)?；駾NA片段裂解、剪裁并重新連接或者通過重組方法生成所需質(zhì)粒。為了分析確認(rèn)所構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列，使用連接混合物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且在適當(dāng)?shù)那闆r下通過抗生素抗性(例如氨節(jié)青霉素或Zeocin)選擇成功的轉(zhuǎn)化體。由轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，通過限制性核酸內(nèi)切酶消化進(jìn)行分析和/或測(cè)序。
[0237]作為限制性切割和連接片段的替代方法，可使用基于an位點(diǎn)和重組酶的重組方法將DNA序列插入載體中。例如，Landy (1989) Ann.Rev.Biochem.58:913-949描述了此類方法；并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。此類方法利用由λ噬菌體和大腸桿菌編碼的重組蛋白的混合物介導(dǎo)的分子間DNA重組。重組發(fā)生在相互作用的DNA分子上的特異性附著(att)位點(diǎn)之間。關(guān)于 att 位點(diǎn)的描述，見 Weisberg 和 Landy (1983) Site-Specific Recombinationin Phage Lambda, in Lanbda II, Weisberg 編輯(Cod Spring Hatbor，N.y: Co Id SpringHarbor Press)，第211-250頁。轉(zhuǎn)換重組位點(diǎn)兩側(cè)的DNA區(qū)段，以致重組后，att位點(diǎn)是由每種親本載體提供的序列構(gòu)成的雜交序列。重組可發(fā)生在具有任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的DNA之間。每個(gè)前述參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。
[0238]可通過將目標(biāo)序列連接到適當(dāng)載體中；通過使用特異性引物生成含att B位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物；生成克隆到含有att位點(diǎn)的適當(dāng)載體中的cDNA文庫等等將an位點(diǎn)引入目標(biāo)序列。
[0239]單順反子和多順反子基因。單順反子基因編碼含僅翻譯一種蛋白質(zhì)的遺傳信息的RNA。多順反子基因編碼含翻譯一種以上蛋白質(zhì)的遺傳信息的mRNA。多順反子基因中編碼的蛋白質(zhì)可具有相同或不同序列或其組合。雙順反子或二順反子指編碼兩種蛋白質(zhì)的多順反子基因。多順反子基因任選包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件以利于非帽子依賴性翻譯開始，所述元件可位于可以獨(dú)立于和nRNA分子5'末端結(jié)合的5'-帽子結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)下游蛋白質(zhì)編碼區(qū)域翻譯的位置?？墒褂萌魏我阎狪RES序列(例如，病毒、真核或人工來源)。例如，如Thompson等(2001)PNAS98:12972-12977中所述，可使用基因間區(qū)域中的蟋蟀麻痹病毒IRES序列。任選地，IRES功能可通過遺傳改變加強(qiáng)，例如通過引起eIF2激酶GCN2的組成型表達(dá)或破壞兩個(gè)破壞(相同)的起始tRNA(met)基因。
[0240]如本文所使用，折疊指多肽和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其中氨基酸殘基之間的相互作用起到了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。雖然非共價(jià)相互作用在決定結(jié)構(gòu)時(shí)很重要，但是目標(biāo)蛋白通常具有由兩個(gè)半胱氨酸殘基形成的分子內(nèi)和/或分子間共價(jià)二硫鍵。對(duì)于天然存在的蛋白質(zhì)和多肽或其衍生物和變體而言，正確折疊通常是產(chǎn)生最佳生物學(xué)活性的排列，而且可以通過測(cè)定法方便監(jiān)測(cè)活性，例如配體結(jié)合、酶促活性等。
[0241]在一些情況下，例如當(dāng)所需產(chǎn)物源自合成時(shí)，基于生物學(xué)活性的測(cè)定法的意義將降低?？筛鶕?jù)物理性質(zhì)、能量因素、建`模研究等來確定此類分子的正確折疊。
[0242]可通過引入編碼增強(qiáng)折疊和二硫鍵形成的一種或多種酶(即折疊酶、伴侶蛋白等)的序列進(jìn)一步修飾表達(dá)宿主?？墒褂萌绫绢I(lǐng)域已知的載體、標(biāo)記等在酵母宿主細(xì)胞中組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)此類序列。優(yōu)選地，通過靶向方法學(xué)將包括足以實(shí)現(xiàn)所需表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在內(nèi)的序列穩(wěn)定整合到酵母基因組中。
[0243]例如，真核PDI不但是蛋白質(zhì)半胱氨酸氧化和二硫鍵異構(gòu)化的有效催化劑，而且還展示出伴侶蛋白活性。PDI的共表達(dá)可利于具有多個(gè)二硫鍵的活性蛋白的生成。同樣感興趣的是BIP(免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白)、親環(huán)素等的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可由通過交配產(chǎn)生的酵母菌株表達(dá)多亞基復(fù)合物,其中每一種單倍體親本菌株表達(dá)一種不同的折疊酶，例如一種菌株可能表達(dá)BIP，而另一種菌株可能表達(dá)PDI或其組合。
[0244]術(shù)語“所需蛋白”或“靶蛋白”可以互換使用，通常指異源多亞基蛋白，例如本文所述的人源化抗體或其結(jié)合部分。
[0245]術(shù)語“抗體”包括任何含多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，所述分子結(jié)構(gòu)具有適合且識(shí)別表位的特定形狀，其中一種或多種非共價(jià)結(jié)合相互作用穩(wěn)定了分子結(jié)構(gòu)與表位之間的復(fù)合物。原型抗體分子為免疫球蛋白，而且認(rèn)為來自所有來源例如人、嚙齒類動(dòng)物、兔、牛、綿羊、豬、犬、其它哺乳動(dòng)物、雞、其它禽類等的所有類型的免疫球蛋白、IgG、IgM、IgA、IgE、TgD等都是“抗體”。根據(jù)本發(fā)明用作原材料生成抗體的優(yōu)選來源為兔。已經(jīng)描述了許多抗體編碼序列；并且通過本領(lǐng)域眾所周知的方法可產(chǎn)生其它抗體編碼序列。其實(shí)例包括嵌合抗體、人抗體和其它非人哺乳動(dòng)物抗體、人源化抗體、單鏈抗體(例如scFv)、駱駝抗體、納米抗體、IgNAR(源自鯊魚的單鏈抗體)、小模塊免疫藥物(SMIP)和抗體片段例如Fab、Fab1、F(ab1 )2 等。見 Streltsov V A 等，Structure of a shark IgNAR antibody variabledomain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sc1.2005 年 11月；14(11):2901-9.Epub2005 年 9 月 30 日；Greenberg A S 等，A new antigen receptorgene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversificationin sharks, Nature.1995 年 3 月 9 日；374(6518):168-73 ；Nuttall S D 等，Isolationof the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold forthe display of protein loop libraries, Mol Immunol.2001 年 8 月；38(4):313-26;Hamers-Castennan C 等，Naturally occurring antibodies devoid of light chains,Nature.1993 年 6 月 3 日；363(6428):446-8 ;Gill D S 等，Biopharmaceutical drugdiscovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol.2006 年 12 月；17(6):653-8.Epub2006年10月19日。前述每個(gè)參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。
[0246]例如，可以通過基因工程生成抗體或抗原結(jié)合片段。在這種技術(shù)中，正如其它方法一樣，使抗體生成細(xì)胞對(duì)所需抗原或免疫原敏化。使用由抗體生成細(xì)胞分離的信使RNA作為模板以使用PCR擴(kuò)增制備cDNA。通過將擴(kuò)增得到的免疫球蛋白cDNA的適合區(qū)段插入表達(dá)載體中，生成每個(gè)都含有保留了最初抗原特異性的一個(gè)重鏈基因和一個(gè)輕鏈基因的載體文庫。通過合并重鏈基因文庫和輕鏈基因文庫構(gòu)建組合文庫。這導(dǎo)致了共表達(dá)重鏈和輕鏈(組裝抗體分子的Fab片段或抗原結(jié)合片段)的克隆文庫。將攜帶這些基因的載體共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主中誘導(dǎo)抗體基因合成時(shí)，重鏈和輕鏈蛋白自我組裝，生成可以通過抗原或免疫原篩選檢測(cè)的活性抗體。
[0247]目標(biāo)抗體編碼序列包括由天然序列編碼的序列，以及因遺傳密碼簡(jiǎn)并性，由與公開的核酸及其變體的序列不同的核酸編碼的序列。變體多肽可包括氨基酸(aa)取代、添加或缺失。氨基酸取代可為保守性氨基酸取代或是為了消除非必需氨基酸的取代，例如為了改變糖基化位點(diǎn)或?yàn)榱送ㄟ^取代或缺失一個(gè)或多個(gè)并非功能所必需的半胱氨酸殘基而將錯(cuò)誤折疊降至最低。變體可設(shè)計(jì)成保留或具有提高的蛋白質(zhì)特定區(qū)域(例如功能結(jié)構(gòu)域、催化氨基酸殘基等)的生物學(xué)活性。變體還包括本文公開的多肽的片段，特別是生物學(xué)活性片段和/或與功能結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的片段。已知用于對(duì)克隆基因進(jìn)行體外誘變的技術(shù)。本發(fā)明還包括已經(jīng)使用普通分子生物學(xué)技術(shù)修飾而提高其對(duì)蛋白水解降解作用的抗性或優(yōu)化了溶解性質(zhì)或使之更適于作為治療劑的多肽。
[0248]可通過將從一個(gè)物種的抗體生成細(xì)胞獲得的輕鏈和重鏈可變區(qū)和Vh)與從另一個(gè)物種得到的輕鏈和重鏈恒定區(qū)合并在一起，通過重組方法生成嵌合抗體。通常，嵌合抗體利用嚙齒類或兔可變區(qū)和人恒定區(qū)，以便生成人結(jié)構(gòu)域?yàn)橹鞯目贵w。此類嵌合抗體的生成在本領(lǐng)域是眾所周知，而且可 通過標(biāo)準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)(例如美國專利N0.5，624，659中所述，其通過引用整體并入本文)。進(jìn)一步考慮到，本發(fā)明嵌合抗體的人恒定區(qū)可選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgGlO、IgGll、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18 或 IgG19 恒定區(qū)。
[0249]人源化抗體經(jīng)工程化含有甚至更多人樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而且只并入了動(dòng)物源性抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。這是通過仔細(xì)檢查單克隆抗體可變區(qū)超變環(huán)的序列并使之適合人抗體鏈的結(jié)構(gòu)而完成的。雖然表面上復(fù)雜，但是實(shí)際上該過程簡(jiǎn)單直接。見，例如美國專利N0.6，187，287，其通過引用全部并入本文。先前在出版的美國專利N0.7935340中已經(jīng)描述了使抗體人源化的方法，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。在一些情況下，必須確定是否需要另外的兔骨架殘基來維持活性。在一些情況下，人源化抗體仍需保留一些關(guān)鍵的兔骨架殘基以使親和力或活性喪失最小化。在這些情況下，必須將來自人生殖系序列的單個(gè)或多個(gè)骨架氨基酸變回到原始兔氨基酸，以便具有所需活性。用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定這些變化以鑒定哪些兔殘基是保持親和力和活性所必須的。
[0250]除完整免疫球蛋白(或其重組對(duì)應(yīng)物)外，還可合成包含表位結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白片段(例如Fab'、F(ab' )2或其它片段)?？衫弥亟M免疫球蛋白技術(shù)設(shè)計(jì)“片段”或最小免疫球蛋白。例如，可通過合成融合的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)來生成用于本發(fā)明的“Fv”免疫球蛋白。對(duì)抗體的組合同樣感興趣，例如包含兩種不同F(xiàn)v特異性的雙鏈抗體。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，SMIP (小分子免疫藥物)、駱駝抗體、納米抗體和IgNAR為免疫球蛋白片段所涵蓋。
[0251]可在翻譯后修飾免疫球蛋白及其片段，例如添加效應(yīng)部分例如(化學(xué)連接子)、可檢測(cè)部分(例如熒光染料、酶、毒素、底物、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光部分等)或特異性結(jié)合部分(例如鏈霉親和素、親和素或生物素)等，它們可用于本發(fā)明的方法和組合物。下文提供了另外的效應(yīng)分子的實(shí)例。
[0252]產(chǎn)物相關(guān)變體:除所需產(chǎn)物(例如，所需多亞基復(fù)合物)外，存在于所需產(chǎn)物的制劑中并且與所需產(chǎn)物有關(guān)的產(chǎn)物。示例性產(chǎn)物相關(guān)變體包括截短或延長(zhǎng)的肽，糖基化與所需糖基化不同的產(chǎn)物(例如，如果需要非糖基化產(chǎn)物，則將任何糖基化產(chǎn)物視為產(chǎn)物相關(guān)變體)，有化學(xué)計(jì)量異常、組裝不正確、二硫鍵異常、折疊異?；虿煌耆?、聚集、蛋白酶裂解或其它異常的復(fù)合物。示例性的產(chǎn)物相關(guān)變體可表現(xiàn)出以下一項(xiàng)或多項(xiàng)的改變:分子質(zhì)量(例如，通過尺寸排阻色譜法檢測(cè))、等電點(diǎn)(例如，通過等電聚焦檢測(cè))、電泳遷移率(例如，通過凝膠電泳檢測(cè))、磷酸化狀態(tài)(例如，通過質(zhì)譜法檢測(cè))、電荷質(zhì)量比(例如，通過質(zhì)譜法檢測(cè))、蛋白水解片段的質(zhì)量或同一性(例如，通過質(zhì)譜法或凝膠電泳檢測(cè))、疏水性(例如，通過HPLC檢測(cè))、電荷(例如，通過離子交換色譜法檢測(cè))、親和力(例如，在為抗體的情況下，通過與蛋白A、蛋白G和/或所需抗體結(jié)合的表位的結(jié)合檢測(cè))和糖基化狀態(tài)(例如，通過凝集素結(jié)合親和力檢測(cè))。當(dāng)所需蛋白為抗體時(shí)，術(shù)語產(chǎn)物相關(guān)變體可包括糖基-重鏈變體和/或半抗體種類(描述如下)。
[0253] 示例性的產(chǎn)物相關(guān)變體包括含異常二硫鍵的變體形式。例如，大多數(shù)IgGl抗體分子被總計(jì)16個(gè)鏈內(nèi)和鏈間二硫橋鍵穩(wěn)定，二硫橋鍵穩(wěn)定了重鏈和輕鏈中IgG結(jié)構(gòu)域的折疊，而鏈間二硫橋鍵穩(wěn)定了重鏈和輕鏈之間的締合。其它抗體類型同樣含穩(wěn)定鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的特征。進(jìn)一步地，一些抗體(包括本文公開的Ab-A和Ab-B)含有稱為不規(guī)范二硫鍵的附加二硫鍵。因此，由于缺乏對(duì)附加亞基的穩(wěn)定共價(jià)鍵和/或二硫鍵，所以異常的鏈間二硫鍵可導(dǎo)致異常的復(fù)合物化學(xué)計(jì)量。另外，異常的二硫鍵(無論鏈間還是鏈內(nèi))可降低抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這可導(dǎo)致活性降低、穩(wěn)定性降低、形成聚集物的傾向增加和/或免疫原性增加。可用多種方法檢測(cè)含異常二硫鍵的產(chǎn)物相關(guān)變體，包括非還原變性SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳、cIEX、質(zhì)譜法(任選經(jīng)化學(xué)修飾在游離半胱氨酸中產(chǎn)生質(zhì)量偏移)、尺寸排阻色譜法、HPLC、光散射變化和本領(lǐng)域已知的任何其它適合方法。見，例如，The Protein ProtocolsHandbook2002 年，第五部分，581-583，DO1:10.1385 / 1-59259-169-8:581。
[0254]半抗體、半抗體種類或HlLl指包括單條重鏈和單條抗體輕鏈，但是缺乏對(duì)第二抗體重鏈和輕鏈的共價(jià)鍵的蛋白復(fù)合物。兩個(gè)半抗體可在相同條件下保持非共價(jià)締合(這可產(chǎn)生與全抗體類似的特性，例如通過尺寸排阻色譜法測(cè)定的表觀分子量)。類似地，H2L1指包括兩條抗體重鏈和單條抗體輕鏈，但是缺乏對(duì)第二抗體輕鏈的共價(jià)鍵的蛋白復(fù)合物；這些復(fù)合物也可與另一條抗體輕鏈非共價(jià)締合(并且同樣產(chǎn)生與全抗體類似的特性)。與全抗體一樣，半抗體種類和H2L1種類可在還原條件下離解成單條重鏈和輕鏈。可在非還原SDS-PAGE凝膠上檢測(cè)半抗體種類和H2L1種類為以低于全抗體的表觀分子量遷移的種類，例如HlLl在全抗體約一半的表觀分子量(例如，約75kDa)下遷移。
[0255]糖基-重鏈變體指有時(shí)存在于抗體制劑中并且至少含有部分Fe序列的糖基化產(chǎn)物相關(guān)變體。糖基-重鏈變體的特征在于，通過SDS-PAGE (相對(duì)于正常重鏈)可觀察到的電泳遷移率降低，凝集素結(jié)合親和力降低，與抗Fe抗體的結(jié)合降低和通過尺寸排阻色譜法測(cè)定，含糖基-重鏈變體的抗體復(fù)合物的表觀分子量更高。見2011年8月31日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列N0.61/525，307 (代理人案號(hào)67858.730200)，其通過引用整體并入本文。[0256]術(shù)語“穩(wěn)定表達(dá)或長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)所需分泌型異源多肽的多倍體酵母”指在閾值表達(dá)水平下，通常為至少50-500mg / L(培養(yǎng)約90h后)并且優(yōu)選本質(zhì)上更高，分泌所述多肽至少幾天到一周，更優(yōu)選至少一個(gè)月，還更優(yōu)選至少1-6個(gè)月并且甚至更加優(yōu)選一年以上的酵母培養(yǎng)物。
[0257]術(shù)語“分泌所需量的重組多肽的多倍體酵母培養(yǎng)物”指穩(wěn)定或長(zhǎng)時(shí)間地分泌至少50-500mg/L并且更加優(yōu)選500-1000mg / L或更多的培養(yǎng)物。
[0258]如果根據(jù)遺傳密碼翻譯多核苷酸序列產(chǎn)生多肽序列(即，多核苷酸序列“編碼”多肽序列)，則多核苷酸序列與多肽序列“對(duì)應(yīng)”，如果兩個(gè)序列編碼同一多肽序列，則一個(gè)多核苷酸序列與另一核苷酸序列“對(duì)應(yīng)”。
[0259]DNA構(gòu)建體的“異源”區(qū)域或結(jié)構(gòu)域是在較大DNA分子中，發(fā)現(xiàn)在自然界中不與較大分子締合的DNA可識(shí)別區(qū)段。因此，當(dāng)異源區(qū)域編碼哺乳動(dòng)物基因時(shí)，基因兩側(cè)通常是在源生物基因組中不在哺乳動(dòng)物基因組DNA兩側(cè)的DNA。異源區(qū)域的另一實(shí)例是編碼序列本身在自然界中不存在的構(gòu)建體(例如，基因組編碼序列含有內(nèi)含子的eDNA或密碼子與天然基因不同的合成序列)。等位變異或天然存在的突變事件不會(huì)產(chǎn)生如本文所定義的DNA的異源區(qū)域。
[0260]“編碼序列”是對(duì)應(yīng)或編碼蛋白質(zhì)或肽序列的密碼子框內(nèi)序列(由遺傳密碼來看)。如果序列或其互補(bǔ)序列編碼相同氨基酸序列，則兩個(gè)編碼序列相互對(duì)應(yīng)。與適當(dāng)調(diào)控序列締合的編碼序列可經(jīng)轉(zhuǎn)錄并翻譯為多肽。多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于編碼序列的3'端。“啟動(dòng)子序列”是能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并且引發(fā)下游(3'方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。啟動(dòng)子序列通常含有用于結(jié)合影響編碼序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控分子(例如，轉(zhuǎn)錄因子)的附加位點(diǎn)。當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合細(xì)胞中的啟動(dòng)子序列并將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,然后mRNA依次翻譯為編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)時(shí),編碼序列受啟動(dòng)子序列的“控制”或與啟動(dòng)子序列“可操作地連接”。
[0261]使用載體向生物體或宿主細(xì)胞中引入外源物質(zhì)，例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)。典型載體包括重組病毒(對(duì)于多核苷酸而言)和脂質(zhì)體(對(duì)多肽而言)?！癉NA載體”為復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一多核苷酸區(qū)段可附于其上以致引起所附區(qū)段的復(fù)制?！氨磉_(dá)載體”是DNA載體，其含有將指導(dǎo)適當(dāng)宿主細(xì)胞的多肽合成的調(diào)控序列。這通常意味著結(jié)合RNA聚合酶并引發(fā)mRNA的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和指導(dǎo)mRNA翻譯為多肽的起始信號(hào)。向表達(dá)載體的恰當(dāng)位點(diǎn)和正確閱讀框內(nèi)并入多核苷酸序列，接著用載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞，使得能夠生成所述多核苷酸序列編碼的多肽。
[0262]多核苷酸序列的“擴(kuò)增”是在體外生成特定核酸序列的多個(gè)拷貝。擴(kuò)增的序列通常呈DNA形式。在下列綜述文章中描述了進(jìn)行此類擴(kuò)增的多種技術(shù)，其各自通過引用整體并入本文:Van Brunt 1990, Bio / Technol., 8 (4):291-294 ;和 Gill 和 Ghaemi, NucleosidesNucleotides Nucleic Acids.2008 年 3 月；27(3):224_43。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或 PCR 是核酸擴(kuò)增的原型，并且本文PCR的使用應(yīng)視為其它適合擴(kuò)增技術(shù)的示例。
[0263]現(xiàn)很好理解大多數(shù)脊椎動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物)中抗體的一般結(jié)構(gòu)(Edelnan，G Μ.，Ann.N.Y.Acad.Sc1.，190:5(1971))。常規(guī)抗體由分子量約23，000道爾頓的兩條相同多肽輕鏈(“輕鏈”)和分子量53，000-70，000的兩條相同重鏈(“重鏈”)組成。4條鏈呈“Y”構(gòu)型通過二硫鍵連接，其中輕鏈托住從“Y”構(gòu)型開口處開始的重鏈。將“Y”構(gòu)型的“分支”部分指定為Fab區(qū)；將“￥”構(gòu)型的莖干部分指定為F。區(qū)。氨基酸序列取向?yàn)閺摹癥”構(gòu)型頂部的N末端到每條鏈底部的C末端。N末端具有對(duì)誘導(dǎo)它的抗原有特異性的可變區(qū)，并且長(zhǎng)度為約100個(gè)氨基酸，在輕鏈和重鏈及抗體之間稍有不同。
[0264]每條鏈中可變區(qū)與恒定區(qū)連接，恒定區(qū)延伸鏈的剩余長(zhǎng)度并且在特定類別的抗體中不會(huì)隨抗體的特異性(即，誘導(dǎo)它的抗原)而變化。已知5大類決定免疫球蛋白分子類別的恒定區(qū)(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE對(duì)應(yīng)于Υ、μ、α、δ和ε重鏈恒定區(qū))。恒定區(qū)或類別決定抗體的后續(xù)效應(yīng)功能，包括激活補(bǔ)體(Kabat, E.A., StructuralConcepts inTmmunology and Immunochemistry,第 2 版，第 413-436 頁，Holt, Rinehart,Winston (1976))和其它細(xì)胞反應(yīng)(Andrews,D.W.等，Clinical Immunobiology,第 1-18 頁，W.B.Sanders (1980) ；Kohl, S.等，Immunology, 48:187(1983));而可變區(qū)決定將與之反應(yīng)的抗原。輕鏈分為K或λ。每個(gè)重鏈類別可與K或λ輕鏈配對(duì)。輕鏈和重鏈相互共價(jià)鍵合，并且當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤或B細(xì)胞生成時(shí)，兩條重鏈的“尾”部通過共價(jià)二硫鍵相互鍵合。
[0265]表述“可變區(qū)”或“VR”指抗體每對(duì)輕鏈和重鏈中直接牽涉于使抗體與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，后面是許多恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域并且在其另一端有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。
[0266]表述“互補(bǔ)決定區(qū)”、“超變區(qū)”或“⑶R”指在抗體輕鏈或重鏈的可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)超變或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(見Kabat, Ε.Α.等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987))。這些表述包括如Kabat等定義的超變區(qū)("Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, " Kabat E.等，US D ept, of Health and Human Services, 1983)或抗體三維結(jié)構(gòu)中的超變環(huán)(Chothia 和 Lesk，J Mol.Biol.196901-917 (1987))。每條鏈中的 CDR 保持緊密靠近骨架區(qū)并且，和來自另一條鏈的CDR —起，有助于形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。在CDR中有已經(jīng)作為選擇性決定區(qū)(SDR)描述的選擇氨基酸，其表示抗體-抗原相互作用中CDR使用的關(guān)鍵接觸殘基(Kashmiri, S.，Methods, 36:25-34 (2005))。
[0267]表述“骨架區(qū)或“FR”指抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)骨架區(qū)(見Kabat，Ε.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth, Bethesda, Md., (1987))。這些表述包括置于抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)中的CDR之間的那些氨基酸序列區(qū)域。
[0268]表述“穩(wěn)定拷貝數(shù)”指宿主細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(例如至少一天、至少一周或至少一個(gè)月或更長(zhǎng))或在更多增殖代數(shù)(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多)大體上維持基因(例如抗體鏈基因)的拷貝數(shù)。例如，在給定時(shí)間點(diǎn)或世代數(shù)，培養(yǎng)物中至少50%，并且優(yōu)選至少70%、75%、85%、90%、95%或更多的細(xì)胞可維持與原始細(xì)胞相同的基因拷貝數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞含有所需多亞基復(fù)合物(例如，抗體)的每個(gè)亞基的穩(wěn)定拷貝數(shù)。
[0269]表述“穩(wěn)定表達(dá)”指宿主細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(例如至少一天、至少一周或至少一個(gè)月或更長(zhǎng))或在更多增殖代數(shù)(例如，至少30、40、50、75、100、200、500或1000代或更多)維持基因或蛋白質(zhì)(例如抗體)的相似表達(dá)水平。例如，在給定時(shí)間點(diǎn)或世代數(shù)，基因或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率或產(chǎn)量可為初始生產(chǎn)率的至少50%，并且優(yōu)選至少70%、75%、85%、90%、95%或更高。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)所需多亞基復(fù)合物(例如，抗體)。
實(shí)施例
[0270]提出下列實(shí)施例以便為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的全面公開和描述，并非旨在限制視為本發(fā)明的內(nèi)容的范圍。已經(jīng)做出努力確保關(guān)于所用數(shù)字(例如，量、溫度、濃度等)的精確性，但是應(yīng)容許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指出，份為重量份，分子量為平均分子量，溫度按攝氏度計(jì)；并且壓力為大氣壓或接近大氣壓。
`[0271]實(shí)施例1
[0272]通過改變重鏈和輕鏈基因拷貝數(shù)增加抗體產(chǎn)量
[0273]該實(shí)施例證明，通過改變重鏈和輕鏈基因的拷貝數(shù)可大大增加巴斯德畢赤酵母中生成的重組抗體的產(chǎn)量。具體而言，該實(shí)施例證明，本方法允許產(chǎn)生此類菌株的靶向交配。生成各自由不同拷貝數(shù)的重鏈和輕鏈基因表達(dá)人源化抗體的一組二倍體巴斯德畢赤酵母菌株，并測(cè)試所述菌株以鑒定產(chǎn)生更高抗體產(chǎn)量的基因拷貝數(shù)組合。圖1提供了用于有效生成一組二倍體菌株的方法的概述(下面實(shí)施例4中提供了詳細(xì)方法)。簡(jiǎn)言之，用在與分泌信號(hào)融合的啟動(dòng)子控制下編碼重鏈或輕鏈基因的基因轉(zhuǎn)化單倍體菌株。為指導(dǎo)整合到巴斯德畢赤酵母基因組內(nèi)的特定遺傳基因座中，使質(zhì)粒線性化于靶基因座的同源序列中。在該實(shí)施例中，雖然也可使用其它基因座，但是將構(gòu)建體整合到pGAP、3’ AOX TT和HIS4TT基因座中。通過Southern印跡鑒定含抗體鏈基因的多個(gè)串聯(lián)整合拷貝的轉(zhuǎn)化體，并且選擇含規(guī)定拷貝數(shù)的輕鏈或重鏈基因的單倍體菌株供將來使用。任選地，將相同抗體鏈基因的附加拷貝整合到單倍體菌株的第二基因座中。這些單倍體菌株的交配有效產(chǎn)生含規(guī)定數(shù)量的呈不同組合的輕鏈和重鏈基因的二倍體菌株。交配后，通過Southern印跡檢驗(yàn)二倍體菌株中的基因拷貝數(shù)。
[0274]使用這些方法，生成含編碼3種人源化抗體Ab-A和Ab-B和Ab-C的重鏈和輕鏈基因的二倍體巴斯德畢赤酵母菌株。圖38 (Ab-A)、圖39 (Ab-B)和圖40 (Ab-C)中示出了抗體多肽和多核苷酸序列。Ab-A、Ab-B和Ab-C是源自3種不同兔抗體的人源化抗體。Ab-C對(duì)不同于Ab-A和Ab-B的抗原有特異性。
[0275]下面表1、2和3中總結(jié)了二倍體菌株。每個(gè)菌株標(biāo)識(shí)的前綴表示生成的抗體，并且H和L后面的數(shù)字分別指整合的重鏈和輕鏈基因拷貝數(shù)。例如，菌株代號(hào)Ab-A-H3xL4標(biāo)示表達(dá)Ab-A并且含有重鏈基因的3個(gè)拷貝和輕鏈基因的4個(gè)拷貝的菌株?？v列標(biāo)出的pGAP、3’A0X TT和HIS4TT表示在各個(gè)基因座整合的基因拷貝數(shù)。每個(gè)基因座兩次列出以反映整合到同源染色體中(一個(gè)源于每個(gè)親本單倍體菌株)。
[0276]如實(shí)施例5中所述，在引起抗體生成和分泌的條件下在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所選二倍體菌株。每條抗體鏈均受GAP啟動(dòng)子的控制，在將一些葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的條件下(低氧利用率)，通過將甘油碳源轉(zhuǎn)變成葡萄糖碳源上調(diào)其表達(dá)。每個(gè)抗體鏈基因與分泌序列的框內(nèi)融合引起表達(dá)的抗體分泌到培養(yǎng)基中。在生長(zhǎng)約90h(T90)時(shí)收獲培養(yǎng)基并且如實(shí)施例6所述，通過高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定抗體產(chǎn)量。
[0277]在下表1最右邊列中不出了 T90時(shí)所選Ab-A表達(dá)菌株的相對(duì)抗體產(chǎn)量,并且在圖2中用圖表說明。H3xL3菌株用作參考并將其表達(dá)產(chǎn)量設(shè)為100%。全肉湯抗體滴度通常隨抗體拷貝數(shù)增加，順序?yàn)?Ab-A-H3xL4、Ab_A_H3xL3、Ab_A_H4xL4、Ab-A_H4xL6、Ab_A_H5xL4、Ab-A-H5xL5和Ab_A_H5xL7。所有這3種Ab_A_H5菌株的產(chǎn)量均超過兩種Ab_A_H4菌株的產(chǎn)量，所述Ab-A-H4菌株的產(chǎn)量超過兩種Ab-A-H3菌株的產(chǎn)量。對(duì)于給定重鏈拷貝數(shù)而言，總產(chǎn)量也隨輕鏈拷貝數(shù)增加而增加，除H3xL4的產(chǎn)量比H3xL3的產(chǎn)量低約13%外。
[0278]從表達(dá)Ab-B的菌株獲得相似產(chǎn)量結(jié)果，將其示于下面表2最右邊列中并且在圖3中用圖表說明。H3xL3菌株用作參考并將其表達(dá)產(chǎn)量設(shè)為100%。如同Ab-A—樣，Ab-B的產(chǎn)量通常隨抗體拷貝數(shù)增加,順序?yàn)锳b-B-H3xL3、Ab-B-H3xL4、Ab-B-H4xL3、Ab-B-H4xL5和Ab-B-H4xL6。所有這3種Ab_B_H4菌株的產(chǎn)量均超過兩種Ab_B_H3菌株的產(chǎn)量。
[0279]如下面表3最右邊列中所示和圖4中用圖表所說明那樣，增加抗體拷貝數(shù)也通常使抗體Ab-C的產(chǎn)量增加?？贵w產(chǎn)量通常隨抗體拷貝數(shù)增加，順序?yàn)锳b-C-H3xL4、Ab-C-H4xL3、Ab_C_H4xL4、Ab_C_H4xL5、Ab_C_H5xL5、Ab_C_H5xL4、Ab-C_H5xL6 和Ab-C-H6xL5。在具有5個(gè)重鏈拷貝或更多的菌株間，產(chǎn)量增加相對(duì)適度。另外，相對(duì)于Ab-C-H6xL5和Ab-C-H5xL6菌株，Ab_C_H6xL6菌株在產(chǎn)量上展現(xiàn)出大幅降低，以致該菌株的產(chǎn)量與Ab-C-H4xL4菌株相當(dāng)。
[0280]表1.表達(dá)Ab-A的二倍體巴斯德畢赤酵母菌株的匯總。將規(guī)定拷貝數(shù)的編碼Ab-A重鏈(He)和輕鏈(Lc)的基因整合到標(biāo)示的染色體基因座中。標(biāo)示相同基因組座位的列標(biāo)題指同源染色體。培養(yǎng)并測(cè)定所選菌株以確定分泌到培養(yǎng)基中的抗體的產(chǎn)量(最右邊列)。在圖2中用圖表說明了這些結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定生成更高產(chǎn)量的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的方法，其包括: (a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的基因的至少兩種宿主細(xì)胞； 其中所述至少兩種宿主細(xì)胞各自通過兩種親本細(xì)胞的交配或融合而生成，其中每種親本細(xì)胞包含編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的至少一個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝； (b)培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞以表達(dá)多亞基復(fù)合物，其中所述至少兩種宿主細(xì)胞中的基因是為不同水平表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基而提供； (c)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量；和 (d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的產(chǎn)量的宿主細(xì)胞為生成更高產(chǎn)量的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體，并且為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因包含編碼所述所需抗體的輕鏈和重鏈的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述篩選的細(xì)胞組包括表達(dá)編碼包含多亞基復(fù)合物的亞基的基因的不同拷貝數(shù)組合的宿主細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)15個(gè)拷貝的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)12個(gè)拷貝的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于另一亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)10個(gè)拷貝的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表 每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)8個(gè)拷貝的細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)6個(gè)拷貝的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼為抗體的多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)10個(gè)拷貝的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為二倍體酵母細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述二倍體酵母為畢赤酵母細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述二倍體酵母細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母、畢赤酵母屬的酵母、巴斯德畢赤酵母、安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母或Pichia inositovera。
14.一種鑒定生成更高純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的方法，其包括:(a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的基因的至少兩種宿主細(xì)胞； 其中所述至少兩種宿主細(xì)胞各自通過兩種親本細(xì)胞的交配或融合而生成，其中每種親本細(xì)胞包含編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的至少一個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝； (b)培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞以表達(dá)多亞基復(fù)合物，其中所述至少兩種宿主細(xì)胞中的基因是為不同水平表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基而提供； (c)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的多亞基復(fù)合物的純度；和 (d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的純度的宿主細(xì)胞為生成更高純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體，并且為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因包含編碼所述所需抗體的輕鏈和重鏈的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中通過測(cè)量一條或多條糖基化抗體鏈的相對(duì)比例測(cè)定所述純度。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述一條或多條糖基化抗體鏈包括糖基重鏈變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述篩選的細(xì)胞組包括表達(dá)編碼包含多亞基復(fù)合物的亞基的基因的不同拷貝數(shù)組合的宿主細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)15個(gè)拷貝的細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)12個(gè)拷貝的細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)10個(gè)拷貝的細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)8個(gè)拷貝的細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)6個(gè)拷貝的細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組包括表達(dá)編碼為抗體的多亞基復(fù)合物并且代表每個(gè)亞基相對(duì)于其它亞基的大體上所有可能的拷貝數(shù)組合的每個(gè)基因的多達(dá)10個(gè)拷貝的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求14-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為二倍體酵母細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述二倍體酵母為畢赤酵母屬細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述畢赤酵母屬為巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
28.一種鑒定生成更高產(chǎn)量的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的方法，其包括:(a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含不同拷貝數(shù)的為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的一個(gè)或多個(gè)基因的至少兩種宿主細(xì)胞: (b)培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞以表達(dá)多亞基復(fù)合物； (C)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量；和 (d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的產(chǎn)量的宿主細(xì)胞為生成更高產(chǎn)量的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體，并且為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因包含編碼所述所需抗體的輕鏈和重鏈的基因。
30.一種鑒定生成更高純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞的方法，其包括: (a)提供一組宿主細(xì)胞，所述組包含各自包含不同拷貝數(shù)的為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的一個(gè)或多個(gè)基因的至少兩種宿主細(xì)胞: (b)培養(yǎng)每種所述宿主細(xì)胞以表達(dá)多亞基復(fù)合物； (C)測(cè)量每種所述宿主細(xì)胞生成的多亞基復(fù)合物的純度；和 (d)鑒定所述宿主細(xì)胞組中生成比另一種宿主細(xì)胞更高的純度的宿主細(xì)胞為生成更高純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體，并且為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因包含編碼所述所需抗體的輕鏈和重鏈的基因。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中通過測(cè)量一條或多條糖基化抗體鏈的相對(duì)比例測(cè)定所述純度。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述一條或多條糖基化抗體鏈包括糖基重鏈變體。
34.根據(jù)權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為二倍體酵母細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述二倍體酵母細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母、畢赤酵母屬的酵母、巴斯德畢赤酵母、安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母或Pichia inositovera。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組通過含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的基因的單倍體細(xì)胞交配或融合而生成，從而所述交配生成含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的基因的二倍體細(xì)胞。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因整合至所述單倍體細(xì)胞的基因組中。
38.根據(jù)權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為多倍體酵母細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為四倍體酵母細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述二倍體酵母細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母、畢赤酵母屬的酵母、巴斯德畢赤酵母、安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母或Pichia inositovera。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞組通過含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的基因的二倍體細(xì)胞交配或融合而生成，從而所述交配生成含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的基因的四倍體細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因整合至所述二倍體細(xì)胞的基因組中。
43.根據(jù)前述任何權(quán)利要求所述的方法，其中所述經(jīng)鑒定的宿主細(xì)胞用于研發(fā)生產(chǎn)培養(yǎng)物。
44.根據(jù)前述任何權(quán)利要求所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述親本細(xì)胞各自為單倍體、二倍體或多倍體酵母細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述酵母細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為畢赤酵母屬。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為巴斯德畢赤酵母。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母選自:安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和Pichia inositovera。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中為表達(dá)多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因整合到選自 pGAP、3’ AOX TT、PpURA5、0CHl、A0Xl、HIS4、GAP、ARG和HIS4TT基因座的一個(gè)或多個(gè)基因組座位中。
52.根據(jù)前 述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼多亞基復(fù)合物的所述亞基的所述基因中的至少一個(gè)在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自GAP、CUP1、A0X1和FLDl啟動(dòng)子。
54.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼多亞基復(fù)合物的所述亞基的所述基因中的至少一個(gè)在選自以下的啟動(dòng)子的控制下表達(dá):A0X1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、FLDU ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk啟動(dòng)子、源自其中的嵌合啟動(dòng)子、酵母啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、昆蟲啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、爬行動(dòng)物啟動(dòng)子、兩棲動(dòng)物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和禽類啟動(dòng)子。
55.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為二倍體或四倍體細(xì)胞。
56.根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的方法，其中從所述細(xì)胞或從培養(yǎng)基中純化所述所需多亞基復(fù)合物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中從所述細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)或膜純化所述所需多亞基復(fù)合物。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞將所述所需多亞基復(fù)合物分泌至培養(yǎng)基中。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中從所述培養(yǎng)基中純化所述所需多亞基復(fù)合物。
60.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物為單特異性或雙特異性抗體。
61.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少兩種宿主細(xì)胞包含不同拷貝數(shù)的編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的基因。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述組中至少一種宿主細(xì)胞包含編碼多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的所述基因的至少2個(gè)拷貝。
63.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組中至少一種宿主細(xì)胞包含編碼多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的基因，所述基因的表達(dá)受與驅(qū)動(dòng)所述組中不同宿主細(xì)胞中的相應(yīng)基因的表達(dá)的啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
64.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組中至少一種宿主細(xì)胞包含含一個(gè)以上編碼多亞基復(fù)合物的亞基的序列的多順反子基因。
65.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含與IL-6、TNF- a、CGRP, PCSK9或NGF特異性結(jié)合的抗體。
66.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含人抗體或人源化抗體或其片段。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述人源化抗體為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊或牛來源。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述人源化抗體為兔來源。
69.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)抗體。
70.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組中的至少一種所述宿主細(xì)胞中為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基而提供的至少一個(gè)所述基因經(jīng)優(yōu)化在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
71.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體并且通過測(cè)量所述宿主細(xì)胞生成的非糖基化、含在具有預(yù)計(jì)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑的抗體復(fù)合物中和/或特異性結(jié)合所述所需抗`體的靶標(biāo)的所需抗體的分?jǐn)?shù)來評(píng)估所述所需抗體的純度。
72.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體并且通過測(cè)定所述宿主細(xì)胞生成的扣除經(jīng)糖基化、含在除具有預(yù)計(jì)表觀流體動(dòng)力學(xué)半徑的復(fù)合物外的抗體復(fù)合物中和/或不能與所述所需抗體的靶標(biāo)特異性結(jié)合的任何產(chǎn)物相關(guān)變體的所需抗體的量來評(píng)估所述所需抗體的產(chǎn)量。
73.—種重組生成所需多亞基復(fù)合物的方法，其包括: (a)提供包含編碼多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的一個(gè)或多個(gè)基因的宿主細(xì)胞，通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法鑒定所述宿主細(xì)胞為生成更高產(chǎn)量和/或純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)所述多亞基復(fù)合物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，進(jìn)一步包括純化所述所需抗體。
76.根據(jù)權(quán)利要求74或75所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生至少IOOmg/ L、至少150mg / L、至少 200mg / L、至少 250mg / L、至少 300mg / L、介于 100 和 300mg / L 之間、介于100和500mg / L之間、介于100和1000mg / L之間、至少1000mg / L、至少1250mg /L、至少1500mg / L、1750mg / L、2000mg/L或更高的抗體滴度。
77.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定20代。
78.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定50代。
79.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定100代。
80.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定500代。
81.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定1000代。
82.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的基因拷貝整合到兩個(gè)或更多個(gè)基因座中。
83.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的基因拷貝整合到三個(gè)或更多個(gè)基因座中。
84.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的方法，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過5個(gè)拷貝。
85.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的方法，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過4個(gè)拷貝。
86.根據(jù)權(quán)利要求82或83所述的方法，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過3個(gè)拷 貝。
87.—種宿主細(xì)胞，其根據(jù)權(quán)利要求1-86中任一項(xiàng)所述的方法鑒定為生成更高產(chǎn)量和/或純度的所需多亞基復(fù)合物的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞通過兩種親本細(xì)胞的交配或融合而生成，其中每種親本細(xì)胞包含編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的至少一個(gè)基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
88.根據(jù)權(quán)利要求77所述的宿主細(xì)胞，其中各自編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的兩個(gè)不同基因的每一個(gè)的至少一個(gè)拷貝整合到所述宿主細(xì)胞兩條同源染色體的同一基因座中。
89.根據(jù)權(quán)利要求87或88所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母屬的二倍體或四倍體細(xì)胞。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的宿主細(xì)胞，其為巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。
91.一種二倍體或四倍體酵母培養(yǎng)物，其源自根據(jù)權(quán)利要求87-90中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。
92.根據(jù)權(quán)利要求87-91中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中為表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物而提供的基因中的至少一個(gè)整合到所述宿主細(xì)胞的基因組中。
93.根據(jù)權(quán)利要求87-92中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中為表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物而提供的基因中的至少一個(gè)含在一個(gè)或多個(gè)染色體外元件、質(zhì)?；蛉斯と旧w中。
94.根據(jù)權(quán)利要求87-93中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含比為表達(dá)所述所需抗體的重鏈而提供的基因的拷貝更多的為表達(dá)所述所需抗體的輕鏈而提供的基因的拷貝。
96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含比為表達(dá)所述所需抗體的輕鏈而提供的基因的拷貝更多的為表達(dá)所述所需抗體的重鏈而提供的基因的拷貝。
97.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含與為表達(dá)所述所需抗體的重鏈而提供的基因的拷貝數(shù)相等的為表達(dá)所述所需抗體的輕鏈而提供的基因的拷貝數(shù)。
98.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其包含編碼所述所需抗體的輕鏈的基因的1-10個(gè)拷貝和編碼所述所需抗體的重鏈的基因的ι-?ο個(gè)拷貝。
99.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中編碼所述所需抗體的重鏈的基因的拷貝數(shù)和編碼所述所需抗體的輕鏈的基因的拷貝數(shù)各自為:2和2、2和3、3和3、3和4、3和5、4和3、4和4、4和5、4和6、5和4、5和5、5和6或5和7。
100.根據(jù)權(quán)利要求94所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中編碼所述所需抗體的重鏈的基因的拷貝數(shù)和編碼所述所需抗體的輕鏈的基因的拷貝數(shù)各自為:2和1、3和1、4和1、5和 1、6 和 1、7 和 1、8 和 1、9 和 1、10 和 1、I 和 2、2 和 2、3 和 2、4 和 2、5 和 2、6 和 2、7 和2、8和 2、9 和 2、10 和 2、1 和 3、2 和 3、3 和 3、4 和 3、5 和 3、6 和 3、7 和 3、8 和 3、9 和 3、10和 3、I 和 4、2 和 4、3 和 4、4 和 4、5 和 4、6 和 4、7 和 4、8 和 4、9 和 4、10 和 4、I 和 5、2 和 5、3和 5、4 和 5、5 和 5、6 和 5、7 和 5、8 和 5、9 和 5、10 和 5、I 和 6、2 和 6、3 和 6、4 和 6、5 和 6、6和6、7和6、8和6、9和6、10和6、1和7、2和7、3和7、4和7、5和7、6和7、7和7、8和7、9和7、10和7、I和8、2和8、3和8、4和8、5和8、6和8、7和8、8和8、9和8、10和8、I和9、2 和 9、3 和 9、4 和 9、5 和 9、6 和 9、7 和 9、8 和 9、9 和 9、10 和 9、1 和 10、2 和 10、3 和 10、4 和 10、5 和 10、6 和 10、7 和 10、8 和 10、9 和 10、10 和 10。
101.根據(jù)權(quán)利要求87-100中`任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定20代。
102.根據(jù)權(quán)利要求87-100中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定50代。
103.根據(jù)權(quán)利要求87-100中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定100代。
104.根據(jù)權(quán)利要求87-100中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定500代。
105.根據(jù)權(quán)利要求87-100中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所需多亞基復(fù)合物的基因的拷貝數(shù)和/或所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量穩(wěn)定1000代。
106.根據(jù)權(quán)利要求87-105中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的基因拷貝整合到兩個(gè)或更多個(gè)基因座中。
107.根據(jù)權(quán)利要求87-105中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中編碼所述多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基的基因拷貝整合到三個(gè)或更多個(gè)基因座中。
108.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的宿主細(xì)胞，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過5個(gè)拷貝。
109.根據(jù)權(quán)利要求104或105所述的宿主細(xì)胞，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過4個(gè)拷貝。
110.根據(jù)權(quán)利要求106或107所述的宿主細(xì)胞，其中每個(gè)基因座含有給定亞基的不超過3個(gè)拷貝。
111.根據(jù)權(quán)利要求91所述的酵母培養(yǎng)物，其在生產(chǎn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
112.根據(jù)權(quán)利要求111所述的培養(yǎng)物，其中所述生產(chǎn)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。
113.根據(jù)權(quán)利要求112所述的培養(yǎng)物，其中所述基本培養(yǎng)基缺乏選擇劑。
114.根據(jù)權(quán)利要求112所述的培養(yǎng)物，其中所述基本培養(yǎng)基缺乏預(yù)先形成的氨基酸或其它復(fù)合生物分子。
115.根據(jù)權(quán)利要求91所述的培養(yǎng)物，其生長(zhǎng)至高細(xì)胞密度。
116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高細(xì)胞密度為至少50g/ L0
117.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高細(xì)胞密度為至少100g/ L0
118.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高細(xì)胞密度為至少300g/ L0
119.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高田包密度為至少400g/ L0
120.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高細(xì)胞密度為至少500g/ L0
121.根據(jù)權(quán)利要求115所述的培養(yǎng)物，其中所述高細(xì)胞密度為至少750g/ L0
122.根據(jù)權(quán)利要求91所述的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞至少20次倍增并且在所述至少20次倍增后維持所述所需多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
123.根據(jù)權(quán)利要求91所述的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞至少50次倍增并且在所述至少50次倍增后維持所述所需多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
124.根據(jù)權(quán)利要求91所述的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)所述酵母細(xì)胞至少100次倍增并且在所述至少100次倍增后維持所述所需多亞基復(fù)合物的高水平表達(dá)。
125.根據(jù)權(quán)利要求122-124中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)物，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
126.—種培養(yǎng)基，其含有源自根據(jù)權(quán)利要求1-86中任一項(xiàng)所述的方法生成的細(xì)胞的穩(wěn)定二倍體畢赤酵母培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含至少約50mg / L、100mg / L、500mg / L或1000mg / L、1500mg / L或更高表達(dá)水平的所述所需多亞基復(fù)合物。
127.—種培養(yǎng)基，其含有源自根據(jù)權(quán)利要求1-86中任一項(xiàng)所述的方法生成的向培養(yǎng)基中表達(dá)所述所需多亞基復(fù)合物的細(xì)胞的穩(wěn)定二倍體巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物中所述二倍體細(xì)胞的細(xì)胞密度為至少約50g / LUOOg / L、300g / L、400g / L、500g / L、700g / L 或更高。
128.根據(jù)權(quán)利要求126或127所述的培養(yǎng)基，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
129.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其中所述所需多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基包含分泌信號(hào)。
130.根據(jù)權(quán)利要求129所述的方法或組合物，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
131.根據(jù)權(quán)利要求129或130所述的方法或組合物，其中所述分泌信號(hào)包含選自以下的多肽:雞溶菌酶(CLY)信號(hào)肽、CLY-L8、釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)信號(hào)肽、MF-a (Prepro),MF-a (Pre)-apV、MF-a (Pre)-apv-SLEKR、MF-a (Prepro) - (EA) 3、a F 信號(hào)肽、KILMl 信號(hào)肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHOl)信號(hào)肽、黑曲霉GOX信號(hào)肽、西方許旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號(hào)肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、無前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、ISN信號(hào)肽、IFN信號(hào)肽、HGH信號(hào)肽、植物血球凝集素(PHA)、蠶溶菌酶、人溶菌酶(LYZl)、I型激活素受體、II型激活素受體、巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結(jié)合蛋白(PpBiP)、人抗體3D6輕鏈前導(dǎo)序列及其任何組合。
132.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法或組合物，其中所述親本細(xì)胞各自為單倍體、二倍體或多倍體酵母細(xì)胞。
133.—種重組生成所需多亞基復(fù)合物的方法，其包括: (a)提供包含編碼所述所需多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的基因的2-10個(gè)拷貝的宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)編碼所述所需多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的所述基因， 其中所述宿主細(xì)胞通過兩種親本細(xì)胞的交配或融合而生成，其中每種親本細(xì)胞包含編碼所述多亞基復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)亞基的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝。
134.一種重組生成所需多亞基復(fù)合物的方法，其包括: (a)提供包含編碼所述所需多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的基因的2-10個(gè)拷貝的宿主細(xì)胞；和 (b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)編碼所述所需多亞基復(fù)合物的每個(gè)亞基的所述基因。
135.根據(jù)權(quán)利要求133或134所述的方法，其中各自編碼所述多亞基復(fù)合物的亞基的兩個(gè)不同基因的每一個(gè)的至少一個(gè)拷貝整合到所述宿主細(xì)胞兩條同源染色體的同一基因座中。
136.根據(jù)權(quán)利要求133-135中任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體。
137.根據(jù)權(quán)利要求133-136中任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
138.根據(jù)權(quán)利要求137所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞。`
139.根據(jù)權(quán)利要求138所述的方法，其中所述酵母細(xì)胞為甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母。
140.根據(jù)權(quán)利要求139所述的方法，其中所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為畢赤酵母屬。
141.根據(jù)權(quán)利要求140所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為巴斯德畢赤酵母。
142.根據(jù)權(quán)利要求140所述的方法，其中畢赤酵母屬的所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母選自安格斯畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、甲醇畢赤酵母和Pichia inositovera。
143.根據(jù)權(quán)利要求140所述的方法，其中為表達(dá)所述多亞基復(fù)合物的亞基而提供的所述基因的至少一個(gè)整合到選自PGAP基因座和HIS4TT基因座的一個(gè)或多個(gè)基因組座位中。
144.根據(jù)權(quán)利要求133-143中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述所需多亞基復(fù)合物的所述基因中的至少一個(gè)在誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
145.根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自GAP、AOXUCUPl和FLDl啟動(dòng)子。
146.根據(jù)權(quán)利要求133-145中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述所需抗體輕鏈和/或重鏈的所述基因中的至少一個(gè)在選自以下的啟動(dòng)子的控制下表達(dá):A0X1、ICL1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、FLDU ADH1、醇脫氫酶I1、GAL4、PH03、PH05和Pyk啟動(dòng)子、源自其中的嵌合啟動(dòng)子、酵母啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、昆蟲啟動(dòng)子、植物啟動(dòng)子、爬行動(dòng)物啟動(dòng)子、兩棲動(dòng)物啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和禽類啟動(dòng)子。
147.根據(jù)權(quán)利要求133-146中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為二倍體或四倍體細(xì)胞。
148.根據(jù)權(quán)利要求133-147中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌所述所需抗體。
149.根據(jù)權(quán)利要求133-148中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需抗體為單特異性或雙特異性抗體。
150.根據(jù)權(quán)利要求133-149中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需抗體與IL_6、TNF_a、CGRP、PCSK9或NGF特異性結(jié)合。
151.根據(jù)權(quán)利要求133-150中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需抗體為人抗體或人源化抗體或其片段。
152.根據(jù)權(quán)利要求151所述的方法，其中所述人源化抗體為兔來源。
153.根據(jù)權(quán)利要求133-152中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)抗體。
154.根據(jù)權(quán)利要求133-153中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼所述所需多亞基復(fù)合物的亞基的基因的至少一個(gè)所述拷貝經(jīng)優(yōu)化在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)。
155.根據(jù)權(quán)利要求133-154中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體并且編碼所述所需抗體的輕鏈的基因的拷貝數(shù)大于或等于編碼所述所需抗體的重鏈的基因的所述拷貝數(shù)。
156.根據(jù)權(quán)利要求133-155中任一項(xiàng)所述的方法，其生成所述所需多亞基復(fù)合物的產(chǎn)量比含有編碼所述所需多亞基復(fù)合物的亞基的每個(gè)基因的單個(gè)拷貝的菌株更高。
157.根據(jù)權(quán)利要求133-156中任一項(xiàng)所述的方法，其生成所述所需多亞基復(fù)合物的純度比含有編碼所述所需多亞基復(fù)合物的亞基的每個(gè)基因的單個(gè)拷貝的菌株更高。
158.根據(jù)權(quán) 利要求157所述的方法，其中所需多亞基復(fù)合物包含所需抗體并且通過測(cè)量糖基化重和/或輕鏈多肽的質(zhì)量占重和/或輕鏈多肽總質(zhì)量的百分比測(cè)定所述純度。
159.根據(jù)權(quán)利要求133-158中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述所需多亞基復(fù)合物的至少一個(gè)亞基包含分泌信號(hào)。
160.根據(jù)權(quán)利要求159所述的方法，其中所述分泌信號(hào)包含選自以下的多肽:雞溶菌酶(CLY)信號(hào)肽、CLY-L8、釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)信號(hào)肽、MF- a (Prepro)、MF-a (Pre)-apv、MF-a (Pre) -apv-SLEKR, MF- a (Prepro) - (EA) 3, a F 信號(hào)肽、KILMl 信號(hào)肽、阻抑性酸性磷酸酶(PHOl)信號(hào)肽、黑曲霉GOX信號(hào)肽、西方許旺酵母葡糖淀粉酶基因(GAMl)信號(hào)肽、具有前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、無前序列的人血清白蛋白(HSA)信號(hào)肽、ISN信號(hào)肽、IFN信號(hào)肽、HGH信號(hào)肽、植物血球凝集素(PHA)、蠶溶菌酶、人溶菌酶(LYZl)、I型激活素受體、II型激活素受體、巴斯德畢赤酵母免疫球蛋白結(jié)合蛋白(PpBiP)、人抗體3D6輕鏈前導(dǎo)序列及其任何組合。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103890178SQ201280051222
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】D·M·米切爾, L·F·加西亞-馬提尼茲, P·D·麥克尼爾, E·W·歐扎拉, M·以南, J·萊瑟姆 申請(qǐng)人:奧爾德生物控股有限責(zé)任公司