用于生產(chǎn)2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇和相關(guān)醇的微生物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供含有2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇途徑的非天然存在的微生物，該微生物包含至少一種外源核酸，該外源核酸編碼以足以產(chǎn)生2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇的量表達(dá)的丁二烯途徑酶。本發(fā)明另外還提供使用這樣的微生物生產(chǎn)2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇的方法，包括將如本文描述的含有2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇途徑的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生2,4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1,3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
【專利說明】用于生產(chǎn)2, 4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1, 3-丁二醇和相關(guān)
醇的微生物和方法
[0001]本申請要求2012年5月10曰申請的美國臨時(shí)申請順序號61/645，509,2011年9月15日申請的美國臨時(shí)申請順序號61/535，264,2011年9月2日申請的美國臨時(shí)申請順序號61/530，885和2011年8月19日申請的美國臨時(shí)申請順序號61/525，659的優(yōu)先權(quán)，這些美國臨時(shí)申請的全部內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。
[0002]發(fā)明背景
[0003]本發(fā)明總的來講涉及生物合成過程，更準(zhǔn)確地講涉及具有2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇生物合成能力的生物體。
[0004]每年有超過250億磅的丁二烯(1，3-丁二烯，BD)生產(chǎn)出來并用于制造合成橡膠和ABS樹脂等聚合物及六亞甲基二胺和1，4-丁二醇等化學(xué)品。丁二烯通常作為用于將石腦油(naphtha)、液化石油氣、乙燒或天然氣等石油原料(feedstocks)轉(zhuǎn)變成乙烯和其它烯烴的蒸汽裂化過程的副產(chǎn)物而生產(chǎn)出來。從替代和/或可再生的原料(renewablefeedstocks)制造丁二烯的能力將代表探索更可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)工藝的重大進(jìn)步。
[0005]可再生性地生產(chǎn)丁二烯的一種可能的方式包括糖或其它原料發(fā)酵生產(chǎn)二醇，例如1，4- 丁二醇或1，3- 丁二醇，然后將它們分離、提純后脫水得到丁二烯，在第二個(gè)步驟中包括基于基于金屬的催化作用。從可再生原料直接發(fā)酵生產(chǎn)丁二烯將不需要脫水步驟，而丁二烯氣體(bp-4.4°C )將連續(xù)不斷地從發(fā)酵罐中逸出并且很容易冷凝和收集。相對于石化來源的丁二烯，開發(fā)一種發(fā)酵生產(chǎn)工藝將消除對基于化石的丁二烯的需求并將使得成本、能耗大大節(jié)約，而有害廢物和排放物大大減小。
[0006]2，4-戊二烯酸以其自身的權(quán)利是一種有用的取代丁二烯衍生物，并且在生成其它取代的1，3_ 丁二烯衍生物的`途中是一種有價(jià)值的中間體，包括例如1-氨基甲?；?1，3-丁二烯類,它們可經(jīng)由庫爾提斯重排(Curtius rearrangement)獲得。所得的N-保護(hù)的-1，3-丁二烯衍生物可用于第爾斯一阿爾德(Diels alder)反應(yīng)以制備取代苯胺類。2，4-戊二烯酸可用于制備各種聚合物和共聚物。
[0007]I, 3- 丁二醇(1，3-BD0)是一種四碳二醇化合物，傳統(tǒng)上由乙炔通過其水合生產(chǎn)。然后將所得的乙醛轉(zhuǎn)變成3-羥基丁醛，隨后3-羥基丁醛還原成1，3-BD0。在最近幾年，乙炔已被更廉價(jià)的乙烯代替作為乙醛的來源。
[0008]I, 3-BD0通常被用作食品調(diào)味劑的有機(jī)溶劑。它也被用作聚氨酯和聚酯類樹脂的共單體(co-monomer)并廣泛用作降血糖藥(hypoglycaemic agent)。光學(xué)活性1,3-BDO是用于合成生物活性化合物和液晶的一種有用的起始料料。1，3-丁二醇的商業(yè)用途是隨后脫水得到 1，3_ 丁二烯(Ichikawa 等人，J.0f Molecular Catalysis A-Chemical, 256:106-112 (2006) ; Ichikawa等人，J.0f Molecular Catalysis A-Chemical, 231:181-189 (2005)),一種250億lb/年石油化學(xué)品，用于制造合成橡膠(例如輪胎)、膠乳和樹脂。用于乙炔或乙烯的對基于石油的原料的依賴性造成了對開發(fā)基于可再生原料的途徑來生產(chǎn)1，3- 丁二醇和丁二烯的需求。
[0009]3- 丁烯-1-醇是用于藥品、農(nóng)用化學(xué)品(agrochemicals)、香料和樹脂的一種原材料。3- 丁烯-1-醇與芳基鹵化物的鈀催化的偶聯(lián)是用于制備芳基-取代的醛類例如抗葉酸化合物培美曲塞二鈉(Pemetrexed disodium)的一種有價(jià)值的工藝(R.C.Larock等人，Tetrahedron Letters, 30，6629(1989)和美國專利第 6，262，262 號)。3_ 丁烯-1-醇通常在催化劑存在下在高溫和高壓下由丙烯和甲醛制得?；蛘撸?，4-環(huán)氧-1-丁烯制得。從可再生原料制備3- 丁烯-1-醇至今尚未得到證明。
[0010]丙烯主要通過烴類貯存物的蒸汽裂化作為石油精煉和乙烯生產(chǎn)的副產(chǎn)物生產(chǎn)出來。丙烯從裂化和其它精煉過程獲得的烴類混合物通過分餾分離得到。典型的烴類貯存物是來自不可再生的化石燃料，例如石油、天然氣和在較小程度上來自煤。每年生產(chǎn)丙烯超過750億磅，使其成為僅次于乙烯生產(chǎn)出來的第二大基于化石的化工產(chǎn)品。丙烯是一種基礎(chǔ)化工產(chǎn)品，可將其轉(zhuǎn)變成各種各樣的聚合物、聚合物中間體和化學(xué)品?；瘜W(xué)級和聚合級丙烯的最常用的一些衍生物是聚丙烯、丙烯酸、丁醇、丁二醇、丙烯腈、環(huán)氧丙烷、異丙醇和枯烯。丙烯衍生物一聚丙烯在生產(chǎn)塑料(例如注塑成型塑料)和纖維(例如氈毯)中的應(yīng)用占到美國消耗這種衍生物超過三分之一。丙烯也用于生產(chǎn)合成橡膠和作為拋射劑或氣霧劑的成分。
[0011]由替代和/或可再生的原料生產(chǎn)丙烯的能力將代表探索更可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)工藝的重大進(jìn)步。可再生地生產(chǎn)丙烯的一種可能的方式包括使糖類或其它原料發(fā)酵生產(chǎn)2-丙醇(異丙醇)或1-丙醇等醇，再將其分離、提純后脫水得到丙烯，在第二個(gè)步驟中包括基于金屬的催化作用。從可再生原料直接發(fā)酵生產(chǎn)丙烯將不需要脫水步驟。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，丙烯氣體將連續(xù)不斷地從發(fā)酵罐中逸出，很容易將其收集后冷凝。開發(fā)出一種發(fā)酵生產(chǎn)工藝也將消除對基于化石的丙烯的需求并使得相對于石化來源的丙烯，成本、能耗大大節(jié)約，而有害廢物和排放物大大減小。
[0012]巴豆醇(crotyl alcohol)，也稱為2_ 丁烯_1_醇，是一種有價(jià)值的化學(xué)中間體。它用作生產(chǎn)巴豆基鹵化物、酯類和醚類的前體，進(jìn)而是生產(chǎn)單體、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)業(yè)化學(xué)品(agricultural chemicals)和藥品的化學(xué)中間體。示例性的精細(xì)化學(xué)產(chǎn)品包括山梨酸、三甲基氫醌、巴豆酸和3-甲氧基丁醇。巴豆醇也是1，3-丁二烯的前體。巴豆醇目前僅僅由石油原料生產(chǎn)。例如，日本專利47-013009和美國專`利第3，090，815,3, 090，816和3，542，883號描述了一種通過1，2-環(huán)氧丁烷異構(gòu)化生產(chǎn)巴豆醇的方法。由替代和/或可再生的原料生產(chǎn)巴豆醇的能力將代表探索更可`持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)工藝的重大進(jìn)步。
[0013]因此，存在對有效生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的化合物例如2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的替代方法的需求。本發(fā)明滿足了這種需求，也提供了有關(guān)優(yōu)勢。
[0014]發(fā)明概沭
[0015]本發(fā)明提供含有2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇途徑的非天然存在的微生物(non-naturally occurring microbial organisms),該微生物具有至少一種編碼以足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的量表達(dá)的丁二烯途徑酶的外源核酸。本發(fā)明另外還提供使用這樣的微生物生產(chǎn)2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的方法，包括將如本文描述的含有2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇途徑的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
[0016]附圖簡沭
[0017]圖1顯示由2-氧代己二酸、2-氨基己二酸、5-氨基戊酸和戊二酰-Cok生成3_ 丁烯-1-醇、2，4-戊二烯酸和丁二烯的示例性途徑。酶是:A.2-氨基己二酸脫羧酶，B.5-氨基戊酸還原酶，C.5-氨基戊-2-烯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、脫氫酶或胺氧化酶，D.2-氧代己二酸脫羧酶，E.戊二酸半醛還原酶，F(xiàn).5-羥基戊酸脫氫酶，G.5-羥基戊-2-烯酸脫水酶，H.2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、脫氫酶或胺氧化酶，1.5-氨基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶、脫氫酶或胺氧化酶，J.5-氨基戊-2-烯酸脫氨酶，K.5-羥基戊-2-烯酸還原酶，L.5-羥基戊酰-CoA轉(zhuǎn)移酶和/或合成酶，M.5-羥基戊酰-CoA脫氫酶，N.5-羥基戊-2-烯酰-CoA脫水酶，0.2，4-戊二烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、合成酶或水解酶，P.5-羥基戊-2-烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或合成酶，Q.5-羥基戊酰-CoA脫水酶/脫氫酶，R.2-氧代己二酸脫氫酶、2-氧代己二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或2-氧代己二酸甲酸裂合酶，S.戊二酰-Cok還原酶，T.2，4-戊二烯酸脫羧酶，U.5-羥基戊-2-烯酸脫羧酶，V.3- 丁烯-1-醇脫水酶或化學(xué)轉(zhuǎn)化，W.5-羥基戊酸脫羧酶。
[0018]圖2顯示由乙酰-CoA生成2，4-戊二烯酸前體戊二酰-CoA的示例性碳-有效的途徑。酶是:A.乙酰乙酰-CoA硫解酶或合酶,B.乙酰乙酰-CoA還原酶,C.3-羥基丁酰-CoA脫水酶，D.戊二酰-CoA脫氫酶。
[0019]圖3顯示用于丙酰-CoA轉(zhuǎn)變成2，4-戊二烯酸的示例性途徑。酶是:A.3_氧代戊酸-CoA硫解酶或合酶,B.3_氧代戍酸-CoA還原酶,C.3_羥基戍酸-CoA脫水酶,D.戍-2-稀酰-CoA異構(gòu)酶，E.戊-3-烯酰-CoA脫氫酶，F(xiàn).2，4-戊二烯酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，G.戍-2-稀酸-CoA脫氧酶。
[0020]圖4顯示由3-羥基 丙酰-CoA和乙酰-CoA生成1，3_ 丁二醇的示例性途徑。酶是:A.3-氧代-5-羥基戊酰-CoA硫解酶或合酶，B.3-氧代-5-羥基戊酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，C.3-氧代-5-羥基戊酸脫羧酶和D.3-氧代丁醇還原酶。
[0021]圖5顯示由丙酮酸和乙醛生成1，3-丁二醇(13-BD0)、3_丁烯-1-醇和丁二烯的示例性途徑。酶是:A.4-羥基-2-氧代戊酸醛縮酶，B.4-羥基-2-氧代戊酸脫水酶，C.2-氧代戊烯酸脫羧酶，D.3- 丁烯-1-醛還原酶，E.3- 丁烯-1-醇脫水酶，F(xiàn).4-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶，G.3-羥基丁醛還原酶，H.4-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶、4-羥基-2-氧代戊酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或4-羥基-2-氧代戊酸甲酸裂合酶，1.3-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成)，J.3-羥基丁酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，K.3-羥基丁酸還原酶，L.3-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)。步驟E也可以通過化學(xué)脫水進(jìn)行催化。
[0022]圖6顯示由2，4-戊二烯酸和2，4_戊二烯酰-CoA生成丁二烯的示例性途徑。酶是:A.2, 4-戍二烯酸還原酶(酸還原)，B.戍-2，4- 二烯醒脫擬基酶，C.2, 4-戍二烯酸-CoA還原酶(酸還原)，D.2，4-戊二烯酰-Cok磷酸轉(zhuǎn)移酶，E.2，4-戊二烯酰-磷酸還原酶，F(xiàn).2，4-戊二烯酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，G.2，4-戊二烯酸脫羧酶，H.2，4-戊二烯酸激酶。
[0023]圖7顯示由丙二酰-ACP生成1，3- 丁二醇、巴豆醇和丙烯的示例性途徑。酶是:A.3-麗酸基-ACP 合酶(3-ketoacyl-ACP synthase), B.乙酸乙酸-ACP 還原酶，C.3_ 羥基丁酰-ACP脫水酶，D.乙酰乙酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，E.乙酰乙酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，F(xiàn).乙酰乙酸還原酶(酸還原)，G.3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，H.乙酰乙酰-ACP硫酯酶，1.乙酰乙酰-CoA還原酶(依賴CoA的，醛形成)，J.乙酰乙酰-ACP還原酶(醛形成)，K.乙酰乙酰-Cok還原酶(醇形成)，L.3-羥基丁酰-ACP硫酯酶，M.3-羥基丁酰-ACP還原酶(醛形成)，N.3-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成)，0.3-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，P.乙酰乙酰-CoA還原酶(酮還原)，Q.乙酰乙酸還原酶(酮還原)，R.3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，S.4-羥基-2- 丁酮還原酶，T.巴豆酰-ACP硫酯酶，U.巴豆酰-ACP還原酶(醛形成)，V.巴豆酰-Cok還原酶(醛形成)，W.巴豆酰-Cok (醇形成)，X.3-羥基丁酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，Y.3-羥基丁酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶，Z.3-羥基丁酸還原酶，AA.3-羥基丁醛還原酶，AB.3-羥基丁酰-Cok脫水酶，AC.3-羥基丁酸脫水酶，AD.3-羥基丁醒脫水酶，AE.巴豆酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)移酶,AF.巴豆酰-CoA水解酶、轉(zhuǎn)移酶或合成酶,AG.巴豆酸還原酶，AH.巴豆醛還原酶，Al.丁酰(Butryl)-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，AJ.丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、水解酶或合成酶，AK.丁酸脫羧酶,AL.巴豆酰-ACP還原酶，AM.巴豆酰-CoA還原酶，AN.巴豆酸還原酶，A0.巴豆醛脫羰基酶，AP.丁酰-ACP硫酯酶，AQ.巴豆酸脫羧酶，AR.3-羥基丁酸脫羧酶，AS.乙酰乙酰-CoA合酶。ACP是酰基載體蛋白。
[0024]圖8顯示用于在作為底物的碳水化合物上固定CO2的反向TCA循環(huán)。酶促轉(zhuǎn)化通過所示的酶實(shí)現(xiàn)。
[0025]圖9顯示用于將合成氣轉(zhuǎn)變成乙酰-Cok的與一氧化碳脫氫酶和加氫酶偶聯(lián)的反向TCA循環(huán)的途徑。
[0026]圖10顯示10微克ACS90(第I泳道)、ACS91(第2泳道)、Mta98/99 (第3和4泳道)細(xì)胞提取物與大小標(biāo)準(zhǔn)品(第5泳道)和熱醋穆爾氏菌(M.thermoacetica)C0DH(Moth_1202/1203)或 Mtr(Moth_1197)蛋白質(zhì)的對照(50，150，250，350，450，500，750，900，和 1000ng)的蛋白質(zhì)印跡(Western blots)。
[0027]圖11顯示CO氧化測定(assay)結(jié)果。細(xì)胞(熱醋穆爾氏菌或大腸桿菌，帶有C0DH/ACS操縱子；ACS90或ACS91或空載體:pZA33S)生長后制備提取物。在55°C在制備提取物的當(dāng)天的各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測定。歷經(jīng)120秒的時(shí)程，在578nm下跟蹤甲基紫精(methylviologen)的還原情況。`
[0028]圖12顯示巴豆醇轉(zhuǎn)變成丁二烯的途徑。酶是:A.巴豆醇激酶，B.2-丁烯基-4-磷酸激酶，C.丁二烯合酶，和D.巴豆醇二磷酸激酶。步驟E是非酶促催化的。
[0029]發(fā)明詳沭
[0030]本發(fā)明涉及具有2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇的生物合成生產(chǎn)能力的細(xì)胞和生物體的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。本發(fā)明具體涉及能夠產(chǎn)生2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的微生物的設(shè)計(jì)，即引入編碼2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇途徑酶的一種或多種核酸。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明利用大腸桿菌(Escherichia coli)代謝的計(jì)算機(jī)模似化學(xué)計(jì)量模型(in silico stoichiometric models)鑒定用于生物合成性生產(chǎn)2，4-戍二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的代謝設(shè)計(jì)。本文所述結(jié)果表明代謝途徑代謝途徑可以進(jìn)行設(shè)計(jì)和重組工程以實(shí)現(xiàn)2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇在大腸桿菌及其它細(xì)胞或生物體中的生物合成。例如，對于計(jì)算機(jī)模似設(shè)計(jì)，2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的生物合成性生產(chǎn)可以通過構(gòu)建具有設(shè)計(jì)的代謝基因型的菌株來證實(shí)。這些代謝工程改造的細(xì)胞或生物體也可以經(jīng)受適應(yīng)性進(jìn)化以進(jìn)一步增強(qiáng)丁二烯生物合成，包括在接近理論最大生長的條件下。
[0032]在某些實(shí)施方案中，所設(shè)計(jì)菌株的2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇生物合成特征使它們在遺傳上穩(wěn)定并在連續(xù)生物過程中特別有用。獨(dú)立的菌株設(shè)計(jì)策略用將不同的非天然或異源反應(yīng)能力摻入到大腸桿菌或其它宿主生物中導(dǎo)致由2-氨基己二酸、5-氨基戊酸、2-氧代己二酸、戊二酰-CoA、乙酰-CoA、丙酰-CoA、3-羥基丙酰-CoA或丙酮酸產(chǎn)生2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇進(jìn)行鑒定。對導(dǎo)致在微生物中由這些底物或代謝中間體中的每一種生物合成2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇的計(jì)算機(jī)模似代謝設(shè)計(jì)進(jìn)行了鑒定。
[0033]可以將通過該平臺的計(jì)算組分鑒定的菌株投入到實(shí)際生產(chǎn)中，即對任何預(yù)測的代謝改變進(jìn)行遺傳工程改造，它將導(dǎo)致生物合成性生產(chǎn)2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇或其它中間體和/或下游產(chǎn)物。在再一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以對表現(xiàn)出生物合成性生產(chǎn)這些化合物的菌株進(jìn)一步實(shí)施適應(yīng)性進(jìn)化以進(jìn)一步增強(qiáng)產(chǎn)物的生物合成。在適應(yīng)性進(jìn)化后產(chǎn)物生物合成產(chǎn)量的水平也可通過系統(tǒng)的計(jì)算組分來預(yù)測。
[0034]自葡萄糖的最大理論2，4-戍二烯酸產(chǎn)量是1.09mol/mol (0.59g/g)。
[0035]11C6H12O6= 12C5H602+6C02+30H20
[0036]圖1給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到0.85摩爾2，4_戊二烯酸的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量是可能的。經(jīng)過工程改造以具備圖1所示的途徑的生物體也能夠達(dá)到接近2，4-戊二烯酸的理論最大產(chǎn)量。
[0037]自葡萄糖的最大理論丁二烯產(chǎn)量是1.09mol/mol (0.327g/g)。
[0038]11C6H1206=12C4H6+18C02+30H20
[0039]圖1給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到0.85摩爾丁二烯的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量到接近理論最大值是可能的。經(jīng)過工程改造以具備圖5、圖6或圖1所示的途徑與圖12所示的途徑的組合的生物體也能夠達(dá)到接近丁二烯的理論最大產(chǎn)量。
[0040]自葡萄糖的最大理論1，3- 丁二醇產(chǎn)量是1.09mol/mol (0.54g/g)。
[0041 ] 11C6H1206=12C4H1002+18C02+6H20
[0042]圖5給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到I摩爾1，3-丁二醇的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量到理論最大值是可能的。經(jīng)過工程改造以具備圖7所示的途徑的生物體也能夠達(dá)到1，3- 丁二醇的理論最大產(chǎn)量。
[0043]自葡萄糖的最大理論3- 丁烯-1-醇產(chǎn)量是1.09mol/mol (0.437g/g)。
[0044]11C6H1206=12C4H80+18C02+18H20
[0045]圖1給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到0.85摩爾3- 丁烯_1_醇的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量到接近理論最大值是可能的。經(jīng)過工程改造以具備圖5所示的途徑的生物體也能夠達(dá)到接近丁二烯的理論最大產(chǎn)量。
[0046]自葡萄糖的最大理論巴豆醇產(chǎn)量是1.09mol/mol (0.436g/g)。
[0047]11C6H1206=12C4H80+18C02+18H20
[0048]圖7給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到1.08摩爾巴豆醇的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量到理論最大值是可能的。
[0049]自葡萄糖的最大理論丙烯產(chǎn)量是1.33mol/mol (0.31g/g)。
[0050]3C6H1206=4C4H80+6C02+6H20
[0051]圖7給出的途徑達(dá)到了每利用I摩爾葡萄糖得到1.2摩爾丙烯的產(chǎn)量。如果細(xì)胞能夠通過例如還原性(或反向)TCA循環(huán)或Wood-Ljungdahl途徑等途徑固定CO2,則提高產(chǎn)物產(chǎn)量到接近理論最大值是可能的。
[0052]如本文所用的，術(shù)語“非天然存在的”當(dāng)用于涉及本發(fā)明的微生物時(shí)，意指該微生物具有至少一個(gè)遺傳改變，該遺傳改變在正常情況下在參考菌種的天然存在的菌株(包括參考菌種的野生型菌株)中不存在。遺傳改變包括例如微生物遺傳材料的修飾，該修飾引入編碼代謝多肽的可表達(dá)核酸、其它核酸添加、核酸缺失和/或其它功能破壞。這樣的修飾包括例如參考菌種的異源多肽、同源多肽或者異源多肽和同源多肽二者的編碼區(qū)及其功能片段。另外的修飾包括例如非編碼調(diào)節(jié)區(qū)，其中該修飾改變了基因或操縱子的表達(dá)。示例性的代謝多肽包括2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3-丁二醇、巴豆醇或3-丁烯-1-醇生物合成途徑內(nèi)的酶或蛋白質(zhì)。`
[0053]代謝修飾是指自其天然存在的狀態(tài)被改變的生物化學(xué)反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可具有代謝多肽編碼核酸或其功能片段的遺傳修飾。在本文中公開了示例性的代謝修飾。
[0054]如本文所用的，術(shù)語“分離的”當(dāng)用于涉及微生物時(shí)，意指基本上不含隨該參考微生物在自然界中發(fā)現(xiàn)的至少一種組分的生物體。該術(shù)語包括去除了隨該微生物在其天然環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)的某些或所有組分的微生物。該術(shù)語也包括去除了隨該微生物在非天然存在的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)的某些或所有組分的微生物。因此，分離的微生物與隨其在自然界中被發(fā)現(xiàn)或者隨其在非天然存在的環(huán)境中生長、貯存或生存時(shí)被發(fā)現(xiàn)的其它物質(zhì)部分或完全分離開。分離的微生物的具體實(shí)例包括部分純的微生物、相當(dāng)純的微生物和在培養(yǎng)基即非天然存在的環(huán)境中培養(yǎng)的微生物。
[0055]如本文所用的，術(shù)語“微生物”意指作為用顯微鏡可看見的細(xì)胞存在的任何生物體，它被包括在古細(xì)菌(archaea)、細(xì)菌(bacteria)或真核微生物(eukarya)的范圍內(nèi)。因此，該術(shù)語預(yù)計(jì)包括具有用顯微鏡可看見的大小的原核或真核細(xì)胞或者原核或真核生物體，并且包括所有菌種的細(xì)菌、古細(xì)菌和真細(xì)菌以及真核微生物(例如酵母和真菌)。該術(shù)語也包括可以進(jìn)行培養(yǎng)以用于生物化學(xué)品生產(chǎn)的任何菌種的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0056]如本文所用的，術(shù)語“CoA”或“輔酶A”意指形成有活性的酶系統(tǒng)的有機(jī)輔因子或輔基(prosthetic group)(酶的非蛋白質(zhì)部分)，其存在對于許多酶(脫輔基酶)的活性是需的。輔酶A在某些縮合酶中發(fā)揮功能，在乙?；蚱渌；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移中和在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化中和在其它乙?；衅鹱饔?。[0057]如本文所用的,術(shù)語“ACP”或“?；d體蛋白(acyl carrier protein) ”是指與從細(xì)菌到植物的許多生物體的脂肪酸合酶系統(tǒng)締合的任何相對較小的酸性蛋白質(zhì)。ACPs可以含有一個(gè)4'-磷酸泛酰巰基乙胺(4' -phosphopantetheine)輔基,其通過磷酸酯鍵與絲氨酸殘基的羥基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。4'-磷酸泛酰巰基乙胺部分的巰基基團(tuán)充當(dāng)錨，在脂肪酸合成期間，?；虚g體與其(硫)酯化。ACP的一個(gè)實(shí)例是大腸桿菌ACP，一種單獨(dú)的單一蛋白質(zhì)，含有77個(gè)氨基酸殘基(8.85kDa)，其中磷酸泛酰巰基乙胺基團(tuán)與絲氨酸36相連。
[0058]如本文所用的，術(shù)語“丁二烯(butadiene) ”，具有分子式C4H6和分子質(zhì)量為
54.09g/mol(參見圖1、5、6和12) (IUPAC命名為丁-1，3-二烯)，在本文中可與1，3-丁二烯(1，3-butadiene)、雙乙烯(biethylene)、刺桐烯(erythrene)、二乙烯基(divinyl)、乙烯基乙烯(vinylethylene)互換使用。丁二烯是一種無色、非腐蝕性液化氣體，有輕微芳香氣味或汽油樣氣味。丁二烯是易爆易燃的，因?yàn)樗牡腿键c(diǎn)(low flash point)。
[0059]如本文所用的，術(shù)語“基本上厭氧的”當(dāng)用于涉及培養(yǎng)或生長條件時(shí)，意指氧的量低于液體培養(yǎng)基中溶解氧飽和度的約10%。該術(shù)語也預(yù)計(jì)包括用小于約1%氧的氣氛維持的液體或固體培養(yǎng)基的密閉室。
[0060]“外源的”當(dāng)它被用在本文中時(shí)意指參考分子或參考活性被引入到宿主微生物中。該分子可以例如通過將編碼核酸引入到宿主遺傳材料中，例如通過整合到宿主染色體或作為非染色體遺傳材料例如質(zhì)粒而引入。因此，該術(shù)語當(dāng)用于涉及編碼核酸的表達(dá)時(shí)，是指將編碼核酸以可表達(dá)形式引入到微生物中。當(dāng)用于涉及生物合成活性時(shí)，該術(shù)語是指被引入到宿主參比生物體中的活性?；钚詠碓纯梢允抢缭谝氲剿拗魑⑸镏蟊磉_(dá)參考活性的同源或異源編碼核酸。因此，術(shù)語“內(nèi)源的”是指宿主體內(nèi)存在的參考分子或活性。同樣地，該術(shù)語當(dāng)用于涉及編碼核酸的表達(dá)時(shí)，是指微生物內(nèi)含有的編碼核酸的表達(dá)。術(shù)語“異源的”是指從不是參考物種的來源獲得的分子或活性，而“同源的”是指來源于宿主微生物的分子或活性。因此，本發(fā) 明的編碼核酸的外源表達(dá)可以利用異源或同源編碼核酸中的任何一個(gè)或二者。
[0061]應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在微生物中包括超過一種外源核酸時(shí)，超過一種外源核酸是指如上所論述的參考編碼核酸或生物合成活性。還應(yīng)當(dāng)理解，正如本文所公開的，這樣的超過一種外源核酸可以在獨(dú)立的核酸分子上、在多順反子核酸分子或其組合上引入到宿主微生物中，并且仍然被視為超過一種外源核酸。例如，本文所公開的微生物可以經(jīng)過工程改造以表達(dá)兩種或更多種編碼所需途徑酶或蛋白質(zhì)的外源核酸。在將編碼所需活性的兩種外源核酸引入到宿主微生物的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，這兩種外源核酸可以作為一種核酸(例如在單個(gè)質(zhì)粒上、在獨(dú)立的質(zhì)粒上)被引入，可以整合到宿主染色體的單個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)上，并且仍然被視為兩種外源核酸。同樣地，應(yīng)當(dāng)理解，超過兩種外源核酸可以以任何所需組合(例如在單個(gè)質(zhì)粒上、在獨(dú)立的質(zhì)粒上)引入到宿主生物中，可以整合到宿主染色體的單個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)上，并且仍然被視為兩種或更多種外源核酸，例如三種外源核酸。因此，參考外源核酸或生物合成活性的數(shù)目是指編碼核酸的數(shù)目或生物合成活性的數(shù)目，而不是被引入到宿主生物中的獨(dú)立核酸的數(shù)目。
[0062]本發(fā)明的非天然存在的微生物可含有穩(wěn)定的遺傳改變，它是指可培養(yǎng)5代以上而沒有遺傳改變損失的微生物。一般而言，穩(wěn)定的遺傳改變包括持續(xù)10代以上的修飾，具體地說，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)約25代以上，和更具體地說，穩(wěn)定的遺傳修飾將是多于50代，包括無限期地。
[0063]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，遺傳改變，包括本文例舉的代謝修飾，可參照合適的宿主生物(例如大腸桿菌)和它們的相應(yīng)代謝反應(yīng)或者所需遺傳材料的合適來源生物體(例如所需代謝途徑的基因)進(jìn)行描述。然而，考慮到各種生物體的完全基因組測序和基因組學(xué)領(lǐng)域中技巧的高水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用到基本所有的其它生物體。例如，本文例舉的大腸桿菌代謝改變可以容易地應(yīng)用到其它物種，即通過摻入來自參考物種以外的其它物種的相同或類似編碼核酸。這樣的遺傳改變一般包括例如物種同源物(species homologs)的遺傳改變，和具體包括例如直系同源物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)或非直系同源基因置換(nonorthologous genedisplacements)的遺傳改變。
[0064]直系同源物是有垂直親緣(vertical descent)關(guān)系的并且在不同生物體中負(fù)責(zé)基本相同功能或相同功能的一個(gè)或多個(gè)基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人環(huán)氧化物水解酶可以因?yàn)榄h(huán)氧化物水解的生物功能而被視為直系同源物。當(dāng)某些基因共享足夠數(shù)量的序列相似性以表明它們是同源的，或者是從共同的祖先進(jìn)化而有親緣關(guān)系時(shí)，它們有垂直親緣關(guān)系。如果某些基因共享三維結(jié)構(gòu)但不一定共享足夠數(shù)量的序列相似性以表明它們是從共同的祖先進(jìn)化到一級序列相似性是不可辨識的程度，那么它們也可被視為直系同源物。作為直系同源的基因可以編碼具有約25%至100%氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白質(zhì)。編碼共享氨基酸相似性小于(less that) 25%的蛋白質(zhì)的基因也可被視為因有垂直親緣關(guān)系而提升，如果它們的三維結(jié)構(gòu)也顯示很高相似性的話。酶的絲氨酸蛋白酶家族成員，包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，都被視為因來自共同的祖先而有垂直親緣關(guān)系而提升。
[0065]直系同源物包括通過例如進(jìn)化而在結(jié)構(gòu)或總體活性上趨異的基因或它們的編碼基因產(chǎn)物。例如，當(dāng)一個(gè)物種編碼表現(xiàn)出兩種功能的基因產(chǎn)物并且當(dāng)這樣的功能已在第二個(gè)物種中分離到截然不同的基因上時(shí)，這三個(gè)基因及其相應(yīng)的產(chǎn)物被視為直系同源物。為了生物化學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為了構(gòu)建非天然存在的微生物，必須對帶有代謝活性的要被引入或破壞的直系同源`基因進(jìn)行選擇。表現(xiàn)出可分離活性的直系同源物的一個(gè)實(shí)例是當(dāng)截然不同的活性已在兩個(gè)或更多個(gè)物種之間或者在單一物種內(nèi)分離到截然不同的基因產(chǎn)物上。一個(gè)具體的例子是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(絲氨酸蛋白酶活性的兩種類型)已經(jīng)作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分離成為兩個(gè)截然不同的分子。第二個(gè)例子是支原體5’ -3’外切核酸酶和果蠅(Dr0Sophila)DNA聚合酶III活性的分離。來自第一個(gè)物種的DNA聚合酶可被視為來自第二個(gè)物種的外切核酸酶或聚合酶中任一個(gè)或二者的直系同源物，反之亦然。
[0066]相比之下，旁系同源物是因?yàn)槔邕M(jìn)化趨異后再復(fù)制而有親緣關(guān)系的同源物并且具有相似或共同的但不相同的功能。旁系同源物可起源于或來源于例如相同的物種或來自不同的物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可被視為旁系同源物，因?yàn)樗鼈兇砹藘煞N獨(dú)特的酶，從共同的祖先共進(jìn)化而來，它們催化不同的反應(yīng)且在相同的物種中具有不同的功能。旁系同源物是來自相同的物種并且彼此具有顯著序列相似性的蛋白質(zhì)，提示它們是同源的，或者通過從共同的祖先共進(jìn)化而有親緣關(guān)系。旁系同源蛋白質(zhì)家族的組包括HipA同源物、螢光素酶基因、妝酶等。
[0067]非直系同源基因置換是來自一個(gè)物種的非直系同源基因，它可以在不同的物種中取代參考基因功能。取代包括例如，與在不同的物種中的參考功能相比，能夠在原始的物種中執(zhí)行基本上相同或相似的功能。雖然一般而言，非直系同源基因置換將根據(jù)與編碼參考功能的已知基因在結(jié)構(gòu)上相關(guān)性進(jìn)行鑒別，但是盡管如此，結(jié)構(gòu)上相關(guān)性較少但功能上相似的基因及其相應(yīng)基因產(chǎn)物將仍然落入該術(shù)語的含義之內(nèi)，正如本文中使用的。與編碼待取代的功能的基因相比，在非直系同源基因產(chǎn)物的活性位點(diǎn)或結(jié)合區(qū)中，功能相似性需要例如至少某些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物(paralog)或無親緣關(guān)系的基因(unrelated gene)。
[0068]因此，在鑒定和構(gòu)建本發(fā)明的具有2，4-戊二烯酸、丁二烯、丙烯、1，3- 丁二醇、巴豆醇或3- 丁烯-1-醇生物合成能力的非天然存在的微生物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用到某個(gè)具體的物種時(shí)，代謝修飾的鑒定可包括直系同源物的鑒定和納入(inclusion)或失活。達(dá)到這種程度以致在編碼催化相似或基本上相似代謝反應(yīng)的酶的參考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置換，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。
[0069]直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行測定。例如，對于兩種多肽，核酸或氨基酸序列的檢查將揭示出比較序列之間的序列同一性和相似性?；谶@樣的相似性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定相似性是否足夠高以表明蛋白質(zhì)是來自共同的祖先通過進(jìn)化相關(guān)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的算法，例如Align、BLASTXlustalff等算法比較并測定原序列的相似性或同一性，并且也測定可比對權(quán)重或評分的序列中空位(gaps)的存在或顯著性。這樣的算法也是本領(lǐng)域已知的并且可同樣用于測定核苷酸序列相似性或同一性。具有足夠的相似性以確定親緣關(guān)系(relatedness)的參數(shù)可基于熟知的方法輸入計(jì)算機(jī)以計(jì)算統(tǒng)計(jì)相似性，或者在隨機(jī)多肽中找到相似匹配的機(jī)會，并且測定匹配的顯著性 。兩個(gè)或更多個(gè)序列的計(jì)算機(jī)比較也可以(如果需要)由本領(lǐng)域技術(shù)人員用肉眼最優(yōu)化。預(yù)期有親緣關(guān)系的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)可具有高度相似性，例如25%至100%序列同一性。無親緣關(guān)系的蛋白質(zhì)可具有與預(yù)期偶然發(fā)生基本上相同的同一性，如果對足夠大小的數(shù)據(jù)庫掃描(約5%)的話。占5%和24%之間的序列可以代表或不代表足夠的同源性以得出結(jié)論是被比較序列是相關(guān)的。可以進(jìn)行另外的統(tǒng)計(jì)分析以確定給出數(shù)據(jù)集大小的這類匹配的顯著性，從而確定這些序列的關(guān)系。
[0070]運(yùn)用BLAST算法來測定兩個(gè)或更多個(gè)序列的親緣關(guān)系(relatedness)的示例性參數(shù)例如可以是如下所示的。簡而言之，氨基酸序列比對可以使用BLASTP2.0.8版本(1999年I月5日)和以下參數(shù)進(jìn)行:矩陣(matrix):0BL0SUM62 ;空位開放(gap open):11 ;空位延伸(gap extension):1 ；x_dropoff:50 ;期望值(expect):10.0 ;字大小(wordsize):3 ;過濾器(filter):開(on)。核酸序列比對可以使用BLASTN2.0.6版本(1998年9月16日)和以下參數(shù)進(jìn)行:匹配(match):1 ;錯(cuò)配(mismatch):-2 ;空位開放(gapopen):5 ;空位延伸(gap extension):2 ；x_dropoff:50 ;期望值(expect): 10.0 ;字大小(wordsize):11 ;過濾器(filter):關(guān)(off)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會知道對以上參數(shù)可以做出什么修改以或者增加或者減少例如比較的嚴(yán)格性和測定兩個(gè)或更多個(gè)序列的親緣關(guān)系。
[0071]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供非天然存在的微生物，包括一種具有2，4-戊二烯酸途徑的微生物，該微生物具有至少一種編碼以足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸的量表達(dá)的2，4-戊二烯酸途徑酶的外源核酸，其中所述2，4-戊二烯酸途徑包括圖1和/或圖3中所示的途徑，選自:(I) 1D, II，IB, 1C, IK 和 1G; (2) ID, IE, IF 和 1G; (3) ID, IE, 1L, 1M, IP和 1G; (4) 1D, II，IB 和 1J; (5) 1D, II，IB, 1C, IK, 1P, IN 和 10; (6) ID, IE, IF, 1P, IN和 10; (7) ID, IE, 1L, 1M, IN 和 10; (8) ID, IE, 1L, IQ 和 10; (9) 1S, II，IB, 1C, IK 和1G; (10) IS, IE, IF 和 1G; (11) 1S, II，IB 和 1J; (12) 1S, II，IB, 1C, IK, 1P, IN 和10; (13) IS, IE, IF, 1P, IN 和 10; (14) IS, IE, 1L, 1M, IN 和 10; (15) IS, IE, 1L, IQ 和10; (16) IB, 1C, IK 和 1G; (17) II，IE, IF 和 1G; (18) II，IE, 1L, 1M, IP 和 1G; (19) IB和 1J; (20) II，IE, IF, 1P, IN 和 10; (21) II，IE, 1L, 1M, IN 和 10; (22) II，IE, 1L, IQ 和10; (23) 3A, 3B, 3C, 3D, 3E 和 3F;和(24) 3A, 3B, 3C, 3G 和 3F，其中 IB 是 5-氨基戊酸還原酶，其中IC是5-氨基戊-2-烯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊-2-烯酸脫氫酶或胺氧化酶，其中ID是2-氧代己二酸脫羧酶，其中IE是戊二酸半醛還原酶，其中IF是5-羥基戊酸脫氫酶，其中IG是5-羥基戊-2-烯酸脫水酶，其中II是5-氨基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊酸脫氫酶或胺氧化酶，其中IJ是5-氨基戊-2-烯酸脫氨酶，其中IK是5-羥基戊-2-烯酸還原酶，其中IL是5-羥基戊酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊酰-CoA合成酶，其中IM是5-羥基戊酰-CoA脫氫酶，其中IN是5-羥基戍-2-烯酸-CoA脫水酶，其中10是2，4-戍二烯酸-CoA轉(zhuǎn)移酶、2，4-戊二烯酰-Cok合成酶或2，4-戊二烯酰-Cok水解酶，其中IP是5-羥基戊-2-烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊-2-烯酰-CoA合成酶，其中IQ是5-羥基戊酰-CoA脫水酶/脫氫酶，其中IS是戍二酸-CoA還原酶,其中3A是3-氧代戍酸-CoA硫解酶或3-氧代戍酰-Cok合酶，其中3B是3-氧代戊酰-Cok還原酶，其中3C是3-羥基戊酰-Cok脫水酶，其中3D是戊-2-烯酰-Cok異構(gòu)酶，其中3E是戊-3-烯酰-Cok脫氫酶，其中3F是2，4-戊二烯酰-CoA水解酶、2，4-戊二烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或2，4-戊二烯酰-CoA合成酶，其中3G是戍-2-稀酸-CoA脫氧酶。
[0072]在本發(fā)明的有些方面，所述微生物可包括二、三、四、五、六、七、八、九或十種外源核酸，各自編碼2，4-戊二烯酸途徑酶。在本發(fā)明的有些方面，所述微生物可包括編碼選自如上所述的(1)-(24)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。在有些方面，所述至少一種外源核酸是異源核酸。在有些方面`，所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
[0073]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中所述具有選自如上所述的(9)-(15)的2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的(occuring)微生物還包括戊二酰-CoA途徑，其具有至少一種編碼以足以產(chǎn)生戊二酰-CoA的量表達(dá)的戊二酰-Cok途徑酶的外源核酸，所述戊二酰-Cok途徑具有選自以下的途徑:乙酰乙酰-Cok硫解酶或乙酰乙酰-Cok合酶；乙酰乙酰-Cok還原酶；3_羥基丁酰-Cok脫水酶；和戊二酰-Cok脫氫酶；或2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶；和2-氧代己二酸脫氫酶、2-氧代己二酸:鐵氧還蛋白(ferridoxin)氧化還原酶或
2-氧代己二酸甲酸裂合酶。
[0074]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中所述具有選自如上所述的(16)-(22)的2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的(occuring)微生物還包括5-氨基戊酸途徑，其具有至少一種編碼5-氨基戊酸途徑酶以足以產(chǎn)生的量表達(dá)的5-氨基戊酸的外源核酸，所述5-氨基戊酸途徑具有2-氨基己二酸脫羧酶；或2-氨基己二酸脫羧酶和2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶。
[0075]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中所述具有選自如上所述的(1)-(8)的2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的微生物還包括2-氧代己二酸途徑，其具有編碼以足以產(chǎn)生2-氧代己二酸的量表達(dá)的2-氧代己二酸途徑酶的外源核酸，所述2-氧代己二酸途徑具有2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或
2-氨基己二酸胺氧化酶。
[0076]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的微生物，該微生物具有至少一種編碼以足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸的量表達(dá)的2，4-戊二烯酸途徑酶的外源核酸，其中所述2，4-戊二烯酸途徑包括如上所述的途徑，還具有:(i)具有至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α -酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；(ii)具有至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或(iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
[0077]在有些方面，所述具有如上所述的(i)的微生物還包括編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-Cok合成酶、NAD(P)H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。在有些方面，所述具有(ii)的微生物還包括編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。在有些方面，所述具有如上所述的(i)的微生物包括編碼ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的四種外源核酸；其中所述具有如上所述的(ii)的微生物包括編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶的五種外源核酸；或其中所述具有如上所述的(iii)的微生物包括編碼CO脫氫酶和H2加氫酶的兩種外源核酸。
[0078]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)2，4-戊二烯酸的方法，包括將如本文描述的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
[0079]在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供非天然存在的微生物，包括一種具有丁二烯途徑的微生物，該微生物具有至少一種編碼以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的丁二烯途徑酶的外源核酸，其中所述丁二烯途徑包括圖1、3、5、6和/或12中所示的途徑，選自:(I) 1D, II，IB, 1C, IK, IG 和 IT; (2) ID, IE, IF, IG 和 IT; (3) ID, IE, 1L, 1M, IP, IG 和IT; (4) 1D, II，IB, IJ 和 IT; (5) 1D, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 10 和 IT; (6) ID, IE, IF, IP, IN, 10 和IT; (7) ID, IE, 1L, 1M, IN, 10 和 IT; (8) ID, IE, 1L, 1Q, 10 和 IT; (9) ID, IE, IF, IU 和IV; (10) 1D, II，IB, 1C, IK, IU 和 IV; (11) ID, IE, 1L, 1M, IP, IU 和 IV; (12) ID, IE, Iff 和I V; (13) 1D, II，I B, 1C, I K, IG, 6A 和 6B; (14) I D, IE，IF，IG, 6A 和6B; (15) ID, IE, 1L, 1M, IP, IG, 6A和 6B; (16) 1D, II，IB, 1J, 6A和 6B; (17) 1D, II，IB, 1C, IK, IP，IN, 10，6A 和 6B; (18) ID, IE, IF, 1P, IN, 10，6A 和 6B; (19) ID, IE, 1L, 1M, IN, 10，6A 和
【權(quán)利要求】
1.非天然存在的微生物，包括一種具有1，3-丁二醇途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生1，3-丁二醇的量表達(dá)的1，3-丁二醇途徑酶的外源核酸，其中所述1，3- 丁二醇途徑包含選自以下的途徑:
2.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四或五種外源核酸，各自編碼1，3- 丁二醇途徑酶。
3.權(quán)利要求2的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(37)的途徑中的至少一種途徑的各種酶的外源核酸。
4.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
5.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
6.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、朽1檬酰-CoA合成酶、朽1檬酰-CoA裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
7.權(quán)利要求6的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
8.權(quán)利要求6的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-Cok合成酶、琥珀酰-Cok轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
9.權(quán)利要求6的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
10.用于生產(chǎn)1，3-丁二醇的方法，該方法包括將權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生1，3- 丁二醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
11.非天然存在的微生物，包括一種具有2，4-戊二烯酸途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸的量表達(dá)的2，4-戊二烯酸途徑酶的外源核酸，其中所述2，4-戊二烯酸途徑包含選自以下的途徑:
(1)1D, II，IB, 1C, IK 和 1G;
(2)10，瓜卟和16;
(3)ID, IE, 1L, 1M, IP 和 1G;
(4)1D，1I，1B 和 1J;
(5)1D, II，IB, 1C, IK, 1P, IN 和 10;
(6)ID, IE, IF, 1P, IN 和 10;
(7)ID, IE, 1L, 1M, IN 和 10;
(8)ID, IE, 1L, IQ 和 10;
(9)1S, II，IB, 1C, IK 和 1G; (10)15，瓜卟和16;
(11)1S, II，IB 和 1J;
(12)1S, II，IB, 1C, IK, 1P, IN 和 10;
(13)IS, IE, IF, 1P, IN 和 10;
(14)IS, IE, 1L, 1M, IN 和 10;
(15)IS, IE, 1L, IQ 和 10;
(16)1B，1C，1K 和 1G; (17)11，瓜卟和16;
(18)II，IE, 1L, 1M, IP 和 1G;
(19)IB 和 1J;
(20)II，IE, IF, 1P, IN 和 10;
(21)II，IE, 1L, 1M, IN 和 10;
(22)II，IE, 1L, IQ 和 10;
(23)3A, 3B, 3C, 3D, 3E 和 3F;和
(24)3A, 3B, 3C, 3G 和 3F,其中IB是5-氨基戊酸還原酶，其中IC是5-氨基戊-2-烯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊-2-烯酸脫氫酶或胺氧化酶，其中ID是2-氧代己二酸脫羧酶，其中IE是戊二酸半醛還原酶，其中IF是5-羥基戊酸脫氫酶，其中IG是5-羥基戊-2-烯酸脫水酶，其中II是5-氨基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊酸脫氫酶或5-氨基戊酸胺氧化酶，其中IJ是5-氨基戊-2-烯酸脫氨酶，其中IK是5-羥基戊-2-烯酸還原酶，其中IL是5-羥基戊酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊酰-CoA合成酶，其中IM是5-羥基戊酰-CoA脫氫酶，其中IN是5-羥基戊-2-烯酰-CoA脫水酶，其中10是2，4-戊二烯酰-Cok轉(zhuǎn)移酶、2，4-戊二烯酰-Cok合成酶或2，4-戊二烯酰-CoA水解酶，其中IP是5-羥基戊-2-烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊-2-烯酰-CoA合成酶，其中IQ是5-羥基戊酰-CoA脫水酶/脫氫酶，其中IS是戊二酰-CoA還原酶，其中3A是3-氧代戊酰-Cok硫解酶或3-氧代戊酰-Cok合酶，其中3B是3-氧代戊酰-Cok還原酶，其中3C是3-羥基戊酰-CoA脫水酶，其中3D是戊-2-烯酰-CoA異構(gòu)酶，其中3E是戍-3-烯酰-CoA脫氫酶，其中3F是2，4-戍二烯酰-CoA水解酶、2，4-戍二烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或2，4-戍二烯酸-CoA合成酶，其中3G是戍-2-烯酸-CoA脫氫酶。
12.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五、六、七、八、九或十種外源核酸，各自編碼2，4-戊二烯酸途徑酶。
13.權(quán)利要求12的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(24)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。
14.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
15.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
16.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(9)-(15)的2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的微生物還包含戊二酰-CoA途徑，其包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生戊二酰-CoA的量表達(dá)的戊二酰-CoA途徑酶的外源核酸，所述戊二酰-CoA途徑包含選自以下的途徑: 乙酰乙酰-CoA硫解酶或乙酰乙酰-CoA合酶；乙酰乙酰-CoA還原酶；3_羥基丁酰-CoA脫水酶；和戊二酰-CoA脫氫酶；或 2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶；和2-氧代己二酸脫氫酶、2-氧代己二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或2-氧代己二酸甲酸裂合酶。
17.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(16)-(22)的2，4-戊二烯酸途徑的非天然存在的微生物還包含5-氨基戊酸途徑，其包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生5-氨基戊酸的量表達(dá)的5-氨基戊酸途徑酶的外源核酸，所述5-氨基戊酸途徑包含2-氨基己二酸脫羧酶；或2-氨基己二酸脫羧酶和2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶。
18.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(1)-(8)的2，4-戊二烯酸途徑的非 天然存在的微生物還包含2-氧代己二酸途徑，其包含編碼以足以產(chǎn)生2-氧代己二酸的量表達(dá)的2-氧代己二酸途徑酶的外源核酸，所述2-氧代己二酸途徑包含2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶。
19.權(quán)利要求11的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、朽1檬酰-CoA合成酶、朽1檬酰-CoA裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
20.權(quán)利要求19的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
21.權(quán)利要求19的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
22.權(quán)利要求19的非天然存在的微生物，其中所述包含⑴的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
23.用于生產(chǎn)2，4-戊二烯酸的方法，包括將權(quán)利要求11-22中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生2，4-戊二烯酸的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。`
24.非天然存在的微生物，包括一種具有丁二烯途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生丁二烯的量表達(dá)的丁二烯途徑酶的外源核酸，其中所述丁二烯途徑包含選自以下的途徑:
(1)1D, II，IB, 1C, IK, IG 和 1T;
(2)ID, IE, IF, IG 和 1T;
(3)ID, IE, 1L, 1M, IP, IG 和 1T;
(4)1D, II，IB, IJ 和 1T;
(5)1D, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 10 和 IT;
(6)ID, IE, IF, IP, IN, 10 和 1T;
(7)ID, IE, 1L, 1M, IN, 10 和 1T;
(8)ID, IE, 1L, 1Q, 10 和 1T;
(9)ID, IE, IF, IU 和 IV;
(10)1D, II，IB, 1C, IK, IU 和 IV;
(11)ID, IE, 1L, 1M, IP, IU 和 IV;
(12)1D，1E，1W 和 IV;
(13)1D, II，IB, 1C, IK, 1G，6A 和 6B;
(14)ID, IE, IF, 1G，6A 和 6B;
(15)ID, IE, 1L, 1M, IP, 1G，6A 和 6B;(16)ID, II，IB, 1J，6A 和 6B;(17)ID, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 10，6A 和 6B;(18)ID, IE, IF, IP, IN, 10，6A 和 6B;(19)ID, IE, 1L, 1M, IN, 10，6A 和 6B;(20)ID, IE, 1L, IQ, 10，6A 和 6B;(21)ID, II，IB, 1C, IK, 1G, 6H, 6E 和 6B;(22)ID, IE, IF, 1G, 6H, 6E 和 6B;(23)ID, IE, 1L, 1M, IP, 1G, 6H, 6E 和 6B;(24)ID, II，IB, 1J, 6H, 6E 和 6B;(25)ID, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 10，6H, 6E 和 6B;(26)ID, IE, IF, IP, IN, 10，6H, 6E 和 6B;(27)ID, IE, 1L, 1M, IN, 10，6H, 6E 和 6B;(28)ID, IE, 1L, IQ, 10，6H, 6E 和 6B;(29)ID, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 6C 和 6B;`(30)ID, IE, IF, IP, 1N，6C 和 6B;(31)ID, IE, 1L, 1M, 1N，6C 和 6B;(32)ID, IE, 1L, 1Q，6C 和 6B;(33)ID, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 6D, 6E 和 6B;(34)ID, IE, IF, IP, IN, 6D, 6E 和 6B;(35)ID, IE, 1L, 1M, IN, 6D, 6E 和 6B;(36)ID, IE, 1L, IQ, 6D, 6E 和 6B;(37)ID, II，IB, 1C, IK, 1G, 6F, 6C 和 6B;(38)ID, IE, IF, 1G，6F，6C 和 6B;(39)ID, IE, 1L, 1M, IP, 1G, 6F, 6C 和 6B;(40)ID, II，IB, 1C, IK, 1G, 6F, 6D, 6E 和 6B;(41)ID, IE, IF, 1G, 6F, 6D, 6E 和 6B;(42)ID, IE, 1L, 1M, IP, 1G, 6F, 6D, 6E 和 6B;(43)IS, II，IB, 1C, IK, IG 和 IT;(44)IS, IE, IF, IG 和 IT;(45)1S，II，1B，IJ 和 IT;(46)IS, II，IB, 1C, IK, IP, IN, 10 和 IT;(47)IS, IE, IF, IP, IN, 10 和 IT;(48)IS, IE, 1L, 1M, IN, 10 和 IT;(49)IS, IE, 1L, IQ, 10 和 IT;(50)IS, IE, IF, IU 和 IV;(51)IS, II，IB, 1C, IK, IU 和 IV;(52)IS, IE, 1L, 1M, IP, IU 和 IV;(53)IS, IE, IW 和 IV;(54)IS, II，IB, 1C, IK, 1G，6A 和 6B;
25.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一種外源核酸，各自編碼丁二烯途徑酶。
26.權(quán)利要求25的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(221)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。
27.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
28.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
29.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(43)-(79)的丁二烯途徑的非天然存在的微生物還包含戊二酰-CoA途徑，其包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生戊二酰-CoA的量表達(dá)的戊二酰-CoA途徑酶的外源核酸，所述戊二酰-CoA途徑包含選自以下的途徑: 乙酰乙酰-CoA硫解酶或乙酰乙酰-CoA合酶；乙酰乙酰-CoA還原酶；3-羥基丁酰-CoA脫水酶；和戊二酰-CoA脫氫酶；或 2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶；和2-氧代己二酸脫氫酶、2-氧代己二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或2-氧代己二酸甲酸裂合酶。
30.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(80)-(116)的丁二烯途徑的非天然存在的微生物還包含5-氨基戊酸途徑，其包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生5-氨基戊酸的量表達(dá)的5-氨基戊酸途徑酶的外源核酸，所述5-氨基戊酸途徑包含2-氨基己二酸脫羧酶；或2-氨基己二酸脫羧酶和2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶。
31.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，其中所述包含選自(1)-(42)的丁二烯途徑的非天然存在 的微生物還包含2-氧代己二酸途徑，其包含編碼以足以產(chǎn)生2-氧代己二酸的量表達(dá)的2-氧代己二酸途徑酶的外源核酸，所述2-氧代己二酸途徑包含2-氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、2-氨基己二酸脫氫酶或2-氨基己二酸胺氧化酶。
32.權(quán)利要求24的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、朽1檬酰-CoA合成酶、朽1檬酰-CoA裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
33.權(quán)利要求32的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
34.權(quán)利要求32的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
35.權(quán)利要求32的非天然存在的微生物，其中所述包含⑴的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
36.用于生產(chǎn)丁二烯的方法，包括將權(quán)利要求24-35中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生丁二烯的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
37.非天然存在的微生物，包括一種具有3-丁烯-1-醇途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生3- 丁烯 -1-醇的量表達(dá)的3- 丁烯-1-醇途徑酶的外源核酸，其中所述3- 丁烯-1-醇途徑包含選自以下的途徑: (1)瓜瓜卟和川；
(2)1D, II，IB, 1C, IK 和 1U;
(3)ID, IE, 1L, 1M, IP 和 1U;
(4)1D，1E 和 1W; (5)以瓜卟和川；
(6)1S, II，IB, 1C, IK 和 1U;
(7)IS, IE, 1L, 1M, IP 和 1U;
(8)1S，1E 和 1W;
(9)1B，1C，1K 和 1U; (10)11，瓜卟和川；
(11)II，IE, 1L, 1M, IP 和 1U;
(12)II，IE 和 Iff;和
(13)5A, 5B, 5C 和 5D, 其中IB是5-氨基戊酸還原酶，其中IC是5-氨基戊-2-烯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊-2-烯酸脫氫酶或胺氧化酶，其中ID是2-氧代己二酸脫羧酶，其中IE是戊二酸半醛還原酶，其中IF是5-羥基戊酸脫氫酶，其中II是5-氨基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-氨基戊酸脫氫酶或5-氨基戊酸胺氧化酶，其中IK是5-羥基戊-2-烯酸還原酶，其中IL是5-羥基戊酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊酰-CoA合成酶，其中IM是5-羥基戊酰-CoA脫氫酶，其中IP是5-羥基戊-2-烯酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或5-羥基戊-2-烯酰-CoA合成酶，其中IS是戊二酰-CoA還原酶，其中IU是5-羥基戊-2-烯酸脫羧酶，其中IW是5-羥基戊酸脫羧酶，其中5A是4-羥基-2-氧代戊酸醛縮酶，其中5B是4-羥基-2-氧代戊酸脫水酶，其中5C是2-氧代戊烯酸脫羧酶，其中是3- 丁烯-1-醛還原酶。
38.權(quán)利要求37的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五或六種外源核酸，各自編碼3- 丁烯-1-醇途徑酶。
39.權(quán)利要求38的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(13)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。
40.權(quán)利要求37的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
41.權(quán)利要求37的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
42.權(quán)利要求37的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α -酮戍二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自 CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
43.權(quán)利要求42的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
44.權(quán)利要求42的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
45.權(quán)利要求42的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
46.用于生產(chǎn)3-丁烯-1-醇的方法，包括將權(quán)利要求37-45中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生3- 丁烯-1-醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
47.用于生產(chǎn)丁二烯的方法，包括將權(quán)利要求37-45中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生3- 丁烯-1-醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期，并將所述3- 丁烯-1-醇進(jìn)行化學(xué)脫水得到丁二烯。
48.非天然存在的微生物，包括一種具有巴豆醇途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生巴豆醇的量表達(dá)的巴豆醇途徑酶的外源核酸，其中所述巴豆醇途徑包含選自以下的途徑:(13)7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG?7AH;(14)7>7B, 7M, 7AD-^HP7AH;(15)7>7B, 7L, 7Z, 7AD-^HP7AH;(Is 7>7B, 7L, 7AC, 7AG?7AH;(17)7>7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD-^HP7AH;(18)7>7B, 7X, 7Y, 7AC, 7AG?7AH;(19)7>7B, 7X, 7AB, 7V?7AH;(20)7>7B, 7X, 7AB, 7AF, 7AG?7AH;(21)7>7B, 7C, 7υ4ρ7ΑΗ;(22)7>7B, 7C, 7T, 7AG?7AH;(23)7>7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG?7AH;(24)7>7D, 7P, 7AB4P7W;(25)7>7B, 7X, 7AB4P7W; (26)7>7B, 7C, 7AE4P7W;(27)7>7B, 7C, 7AE, 7V?7AH;(28)71, 7R, 7AD-^HP7AH;(2S 7E, 7F, 7R, 7AS7AH;(30)7E, 7Q, 7Z, 7AS7AH;(31)7E, 7Q, 7AC, 7AG-^HP7AH;(32)7P, 7N, 7AD-^HP7AH;(33)7P, 7Y, 7Z, 7AS7AH;(34)7P, 7Y, 7AC, 7AG-^HP7AH;(35)7P, 7AB, 7ν4ρ7ΑΗ;(3S 7P, 7AB, 7AF, 7AG?7AH;(37)7P, 7AS7W;(38)7AS, 71, 7R, 7AD-^HP7AH;(3S 7AS, 7E, 7F, 7R, 7AS7AH;



16(40)7AS, 7E, 7Q, 7Z, 7AD 和 7AH;
(41)7AS, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 和 7AH;
(42)7AS, 7P, 7N, 7AD 和 7AH;
(43)7AS, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 和 7AH;
(44)7AS, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 和 7ΑΗ;
(45)7AS, 7Ρ, 7ΑΒ, 7V 和 7ΑΗ;
(46)7AS, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 和 7AH;和
(47)7AS, 7P, 7AB 和 7W, 其中7A是3-酮?；?ACP合酶，其中7B是乙酰乙酰-ACP還原酶，其中7C是3-羥基丁酰-ACP脫水酶，其中7D是乙酰乙酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7E是乙酰乙酰-CoA水解酶、乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，其中7F是乙酰乙酸還原酶(酸還原)，其中7H是乙酰乙酰-ACP硫酯酶，其中71是乙酰乙酰-Cok還原酶(依賴CoA的，醛形成)，其中7J是乙酰乙酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7K是乙酰乙酰-CoA還原酶(醇形成)，其中7L是3-羥基丁酰-ACP硫酯酶，其中7M是3-羥基丁酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7N是3-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成)，其中70是3-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，其中7P是乙酰乙酰-CoA還原酶(酮還原)，其中7Q是乙酰乙酸還原酶(酮還原)，其中7R是3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，其中7T是巴豆酰-ACP硫酯酶，其中7U是巴豆酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7V是巴豆酰-Cok還原酶(醛形成)，其中7W是巴豆酰-Cok (醇形成)，其中7X是3-羥基丁酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7Y是3-羥基丁酰-Cok水解酶、3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丁`酰-CoA合成酶，其中7Z是3-羥基丁酸還原酶，其中7AB是3-羥基丁酰-CoA脫水酶，其中7AC是3-羥基丁酸脫水酶，其中7AD是3-羥基丁醛脫水酶，其中7AE是巴豆酰-CoA: ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7AF是巴豆酰-CoA水解酶、巴豆酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或巴豆酰-CoA合成酶，其中7AG是巴豆酸還原酶，其中7AH是巴豆醛還原酶和其中7AS是乙酰乙酰-CoA合酶。
49.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五、六或七種外源核酸，各自編碼巴豆醇途徑酶。
50.權(quán)利要求1A的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(47)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。
51.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
52.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
53.權(quán)利要求48的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、朽1檬酰-CoA合成酶、朽1檬酰-CoA裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
54.權(quán)利要求53的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
55.權(quán)利要求53的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
56.權(quán)利要求53的非天然存在的微生物，其中所述包含⑴的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
57.用于生產(chǎn)巴豆醇的方法，包括將權(quán)利要求48-56中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生巴豆醇的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
58.非天然存在的微生物，包括一種具有丙烯途徑的微生物，該微生物包含至少一種編碼以足以產(chǎn)生丙烯的量表達(dá)的丙烯途徑酶的外源核酸，其中所述丙烯途徑包含選自以下的途徑:
(1)7A, 7J, 7R, 7AD 和 7A0;
(2)7A, 7H, 7F, 7R, 7AD 和 7A0;
(3)7A, 7D, 71，7R, 7AD 和 7A0;
(4)7A, 7D, 7E, 7F, 7R, 7AD 和 7A0;
(5)7A, 7H, 7Q, 7Z, 7AD 和 7A0;
(6)7A, 7D, 7E, 7Q, 7AD 和 7A0;
(7)7A, 7D, 7P, 7Y, 7Z, 7AD 和 7A0;
(8)7A, 7D, 7P, 7N, 7AD 和 7A0;
(9)7A, 7B, 7X, 7N, 7AD 和 7A0;
(10)7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD 和 7A0;
(11)7A, 7H, 7Q, 7V, 7AG 和 7A0;
(12)7A, 7D, 7E, 7Q, 7AC, 7AG 和 7A0;
(13)7A, 7D, 7P, 7Y, 7AC, 7AG 和 7A0;
(14)7A, 7D, 7P, 7AB, 7AF, 7AG 和 7A0;
(15)7A, 7P, 7AB, 7V 和 7A0;
(16)7A, 7B, 7M, 7AD 和 7A0;
(17)7A, 7B, 7L, 7Z, 7AD 和 7A0;
(18)7A, 7B, 7X, 7N, 7AD 和 7A0;
(19)7A, 7B, 7X, 7Y, 7Z, 7AD 和 7A0;
(20)7A, 7B, 7C, 7U 和 7A0;
(21)7A, 7B, 7C, 7T, 7AG 和 7A0;(22)7A, 7B, 7C, 7AE, 7V 和 7A0;(23)7A, 7B, 7C, 7AE, 7AF, 7AG 和 7A0;(24)7A, 7H, 7Q 和 7AR;(25)7A, 7D, 7E, 7Q 和 7AR;(26)7A, 7D, 7P, 7Y 和 7AR;(27)7Α, 7Β, 7Χ, 7Υ 和 7AR;(28)7Α, 7Β, 7L 和 7AR;(29)7Α, 7Η, 7Q, 7AC 和 7AQ;(30)7Α, 7D, 7Ε, 7Q, 7AC 和 7AQ;(31)7Α, 7D, 7Ρ, 7Υ, 7AC 和 7AQ;(32)7Α, 7D, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AF 和 7AQ;(33)7Α, 7Β, 7L, 7AC 和 7AQ;(34)7Α, 7Β, 7Χ, 7Υ, 7AC 和 7AQ; (35)7Α, 7Β, 7Χ, 7ΑΒ, 7AF 和 7AQ;(36)7Α, 7Β, 7C, 7ΑΕ, 7AF 和 7AQ;(37)7Α, 7Β, 7C, 7Τ 和 7AQ;(38)7Α, 7Η, 7Q, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ(39)7Α, 7D, 7Ε, 7Q, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(40)7Α, 7D, 7Ρ, 7Υ, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(41)7Α, 7D, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AF, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(42)7Α, 7D, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AM, 7AJ 和 7ΑΚ;(43)7Α, 7Β, 7L, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(44)7Α, 7Β, 7Χ, 7Υ, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(45)7Α, 7Β, 7Χ, 7ΑΒ, 7AF, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(46)7Α, 7Β, 7Χ, 7ΑΒ, 7AM, 7AJ 和 7ΑΚ;(47)7Α, 7Β, 7C, 7Τ, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(48)7Α, 7Β, 7C, 7ΑΕ, 7AF, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;(49)7Α, 7Β, 7C, 7ΑΕ, 7AM, 7AJ 和 7ΑΚ;(50)7Α, 7Β, 7C, 7AL, 7ΑΡ 和 7ΑΚ;(51)7Α, 7Β, 7C, 7AL, 7ΑΙ, 7AJ 和 7ΑΚ;(52)7Α, 7Β, 7Χ, 7ΑΒ, 7V 和 7ΑΟ;(53)7Α7Β, 7L, 7AC, 7AG 和 7ΑΟ;(54)7Α, 7Β, 7Χ, 7Υ, 7AC, 7AC, 7AG 和 7ΑΟ;(55)7Α, 7Β, 7Χ, 7ΑΒ, 7AF, 7AG 和 7ΑΟ;(56)7Α, 7Η, 7Q, 7AC, 7AG 和 7ΑΟ;(57)71，7R, 7AD 和 7ΑΟ;(58)7Ε, 7F, 7R, 7AD 和 7ΑΟ;(59)7Ε, 7Q, 7Ζ, 7AD 和 7ΑΟ;(60)7Ρ, 7Υ, 7Ζ, 7AD 和 7ΑΟ;(61)7P, 7N, 7AD 和 7A0;
(62)7E, 7Q, 7AC, 7AG 和 7A0;
(63)7P, 7Y, 7AC, 7AG 和 7A0;
(64)7Ρ, 7ΑΒ, 7AF, 7AG 和 7Α0;
(65)7Ρ,7ΑΒ, 7V 和 7Α0;
(66)7E，7Q 和 7AR;
(67)7P，7Y 和 7AR;
(68)7Ε, 7Q, 7AC 和 7AQ;
(69)7Ρ, 7Υ, 7AC 和 7AQ;
(70)7Ρ, 7ΑΒ, 7AF 和 7AQ;
(71)7Ε, 7Q, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;
(72)7Ρ, 7Υ, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;
(73)7Ρ, 7ΑΒ, 7AF, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;
(74)7Ρ, 7ΑΒ, 7AM, 7AJ 和 7ΑΚ;
(75)7AS, 71，7R, 7AD 和 7ΑΟ;
(76)7AS, 7Ε, 7F, 7R, 7AD 和 7ΑΟ;
(77)7AS, 7Ε, 7Q, 7AD 和 7ΑΟ;
(78)7AS, 7Ρ, 7Υ, 7Ζ, 7AD 和 7ΑΟ;
(79)7AS, 7Ρ, 7Ν, 7AD 和 7ΑΟ;
(80)7AS, 7Ε, 7Q, 7AC, 7AG 和 7ΑΟ;
(81)7AS, 7Ρ, 7Υ, 7AC, 7AG 和 7ΑΟ;
(82)7AS, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AF, 7AG 和 7ΑΟ;
(83)7AS, 7Ε, 7Q 和 7AR;
(84)7AS, 7Ρ, 7Υ 和 7AR;
(85)7AS, 7Ε, 7Q, 7AC 和 7AQ;
(86)7AS, 7Ρ, 7Υ, 7AC 和 7AQ;
(87)7AS, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AF 和 7AQ;
(88)7AS, 7Ε, 7Q, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;
(89)7AS, 7Ρ, 7Υ, 7AC, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;
(90)7AS, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AF, 7ΑΝ 和 7ΑΚ;和
(91)7AS, 7Ρ, 7ΑΒ, 7AM, 7AJ 和 7ΑΚ, 其中7Α是3-酮?；?ACP合酶，其中7Β是乙酰乙酰-ACP還原酶，其中7C是3-羥基丁酰-ACP脫水酶，其中7D是乙酰乙酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7Ε是乙酰乙酰-CoA水解酶、乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙 酰-CoA合成酶，其中7F是乙酰乙酸還原酶(酸還原)，其中7Η是乙酰乙酰-ACP硫酯酶，其中71是乙酰乙酰-Cok還原酶(依賴CoA的，醛形成)，其中7J是乙酰乙酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7L是3-羥基丁酰-ACP硫酯酶，其中7Μ是3-羥基丁酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7Ν是3-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成)，其中7Ρ是乙酰乙酰-Cok還原酶(酮還原)，其中7Q是乙酰乙酸還原酶(酮還原)，其中7R是3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，其中7S是4-羥基-2- 丁酮還原酶，其中7Τ是巴豆酰-ACP硫酯酶，其中7U是巴豆酰-ACP還原酶(醛形成)，其中7V是巴豆酰-CoA還原酶(醛形成)，其中7X是3-羥基丁酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7Y是3-羥基丁酰-Cok水解酶、3-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或3-羥基丁酰-CoA合成酶，其中7Z是3-羥基丁酸還原酶，其中7AB是3-羥基丁酰-CoA脫水酶，其中7AC是3-羥基丁酸脫水酶，其中7AD是3-羥基丁醛脫水酶，其中7AE是巴豆酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7AF是巴豆酰-CoA水解酶、巴豆酰-CoA轉(zhuǎn)移酶或巴豆酰-CoA合成酶，其中7AG是巴豆酸還原酶，其中7AI是丁酰-CoA:ACP轉(zhuǎn)移酶，其中7AJ是丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、丁酰-CoA水解酶或丁酰-CoA合成酶，其中7AK是丁酸脫羧酶，其中7AL是巴豆酰-ACP還原酶，其中7AM是巴豆酰-CoA還原酶，其中7AN是巴豆酸還原酶，其中7A0是巴豆醛脫羰基酶，其中7AP是丁酰-ACP硫酯酶，其中7AQ是巴豆酸脫羧酶，其中7AR是3-羥基丁酸脫羧酶和其中7AS是乙酰乙酰-Cok合酶。
59.權(quán)利要求58的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五、六、七或八種外源核酸，各自編碼丙烯途徑酶。
60.權(quán)利要求59的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含編碼選自(1)-(91)的途徑中的至少一種的各種酶的外源核酸。
61.權(quán)利要求58的非天然存在的微生物，其中所述至少一種外源核酸是異源核酸。
62.權(quán)利要求58的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厭氧的培養(yǎng)基中。
63.權(quán)利要求58的非天然存在的微生物，還包含: (i)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自ATP-檸檬酸裂合酶、檸檬酸裂合酶、朽1檬酰-CoA合成酶、朽1檬酰-CoA裂合酶、延胡索酸還 原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； (ii)包含至少一種編碼還原性TCA途徑酶的外源核酸的還原性TCA途徑，其中所述至少一種外源核酸選自丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、CO脫氫酶和H2加氫酶；或 (iii)至少一種編碼選自CO脫氫酶、H2加氫酶和其組合的酶的外源核酸。
64.權(quán)利要求63的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酰-CoA合成酶、NAD (P) H:鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白和其組合。
65.權(quán)利要求63的非天然存在的微生物，其中所述包含(ii)的微生物還包含編碼選自以下的酶的外源核酸:烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、延胡索酸酶、蘋果酸脫氫酶和其組合。
66.權(quán)利要求63的非天然存在的微生物，其中所述包含(i)的微生物包含三種外源核酸，編碼ATP-檸檬酸裂合酶或檸檬酸裂合酶、延胡索酸還原酶和α-酮戊二酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶； 其中所述包含(ii)的微生物包含四種外源核酸，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；C0脫氫酶；和H2加氫酶；或 其中所述包含(iii)的微生物包含兩種外源核酸，編碼CO脫氫酶和H2加氫酶。
67.用于生產(chǎn)丙烯的方法,包括將權(quán)利要求58-66中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足以產(chǎn)生丙烯的條件下培養(yǎng)足夠的時(shí)間周期。
68.用于生產(chǎn)丁二烯的工藝，包括: (a)將權(quán)利要求48-56中任一項(xiàng)的非天然存在的微生物在足夠量的營養(yǎng)物和培養(yǎng)基中通過發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生巴豆醇；和 (b)將通過培養(yǎng)所述非天然存在的微生物產(chǎn)生的巴豆醇轉(zhuǎn)變成丁二烯。
69.權(quán)利要求68的工藝，其中在催`化劑的存在下，通過化學(xué)脫水進(jìn)行步驟(b)。
【文檔編號】C12P7/18GK103890185SQ201280051472
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】羅賓·E·奧斯特豪特, A·P·博加德, M·J·伯克 申請人:基因組股份公司