煙曲霉纖維素分解酶組合物及其用途【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生煙曲霉纖維素分解酶組合物的重組木霉屬宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述組合物的方法?！緦＠f明】煙曲霉纖維素分解酶組合物及其用途[0001]對于在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下完成的發(fā)明的權利的聲明[0002]該發(fā)明是在由能源部授予的合作協(xié)議(CooperativeAgreement)DE-FC36-08G018080下以政府支持完成的。政府在該發(fā)明中具有一定權利。[0003]涉及序列表[0004]本申請包含計算機可讀形式的序列表，其通過提述并入本文。[0005]發(fā)明背景【
技術領域：
】[0006]本發(fā)明涉及產(chǎn)生煙曲霉纖維素分解酶組合物的木霉屬宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述組合物的方法。[0007]相關技術的描述[0008]纖維素是葡萄糖通過β-1,4-鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β_1，4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0009]將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉化為乙醇具有以下優(yōu)勢:大量原料現(xiàn)成可用，可以理想地避免燃燒或填埋材料，以及乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。一旦將纖維素轉化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。[0010]一種最常商業(yè)上使用的纖維素分解酶系統(tǒng)來自里氏木霉(有性型紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)),其分泌在內(nèi)部切割纖維素鏈的內(nèi)切葡聚糖酶,持續(xù)從末端降解纖維素鏈釋放纖維二糖的外切纖維二糖酶，和將纖維二糖水解為葡萄糖的葡糖苷酶。作為纖維素分解產(chǎn)生系統(tǒng)，里氏木霉具有數(shù)種優(yōu)點，如分泌蛋白的高產(chǎn)率，在大規(guī)模發(fā)酵下具生產(chǎn)性，非常具活性且理解良好的基礎纖維素分解酶系統(tǒng)，和經(jīng)測序且充分注釋的基因組。然而，里氏木霉纖維素分解酶系統(tǒng)的缺點是:其它生物產(chǎn)生個體而言更優(yōu)越的纖維素分解酶；對于富含半纖維素的底物而言，半纖維素降解酶不足；和在高固形物水解下，β-葡糖苷酶是限制性的。[0011]據(jù)報道，煙曲霉產(chǎn)生數(shù)種纖維素酶(Nierman等，2005，Nature438:1151-1156)。W02011/057140公開了一種煙曲霉纖維二糖水解酶I及其基因。W02011/057140公開了一種煙曲霉纖維二糖水解酶II及其基因。W02005/047499公開了一種煙曲霉β-葡糖苷酶及其基因。2010/138754公開了一種具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽及其基因。W02011/057140公開了一種煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II及其基因。W02006/078256公開了煙曲霉GHlO木聚糖酶。W02011/057140公開了一種煙曲霉β-木糖苷酶及其基因。[0012]在本領域中，需要新的纖維素分解酶系統(tǒng)，其可以商業(yè)量生產(chǎn)，且可更有效地分解纖維素材料。[0013]本發(fā)明提供了編碼煙曲霉纖維素分解酶組合物的木霉屬宿主細胞，和產(chǎn)生和使用所述組合物的方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]本發(fā)明涉及重組木霉屬宿主細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼(i)煙曲霉纖維二糖水解酶I;(ii)煙曲霉纖維二糖水解酶II;(iii)煙曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽；或其同源物。[0015]本發(fā)明亦涉及產(chǎn)生酶組合物的方法，其包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述酶組合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的木霉屬宿主細胞；和任選地(b)回收所述酶組合物。[0016]本發(fā)明亦涉及酶組合物，其包含本發(fā)明的重組木霉屬宿主細胞的回收的發(fā)酵液。[0017]本發(fā)明亦涉及用于降解纖維素材料的工藝，其包括用酶組合物處理所述纖維素材料，所述酶組合物包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液。[0018]本發(fā)明亦涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用酶組合物糖化纖維素材料，所述酶組合物包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液；(b)用一種或多種(例如幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0019]本發(fā)明進一步涉及發(fā)酵纖維素材料的工藝，其包括用一種或多種(例如幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是用酶組合物糖化的，所述酶組合物包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液?！緦＠綀D】【附圖說明】[0020]圖1顯示質粒pJfyS139的限制性酶切圖。[0021]圖2顯示質粒pJfyS142的限制性酶切圖。[0022]圖3顯示質粒pJfyS144的限制性酶切圖。[0023]圖4顯示質粒pAG43的限制性酶切圖。[0024]圖5顯示質粒pSMai214的限制性酶切圖。[0025]圖6顯示質粒pDM287的限制性酶切圖。[0026]圖7顯示表達煙曲霉纖維二糖水解酶1、煙曲霉纖維二糖水解酶I1、煙曲霉β-葡糖苷酶和煙曲霉GH61B多肽的里氏木霉菌株的酶組合物與基于里氏木霉的纖維素酶組合物或煙曲霉酶組合物在水解經(jīng)預處理的玉米秸桿方面的比較。[0027]圖8顯示煙曲霉野生型酶組合物與基于里氏木霉的纖維素酶組合物在水解經(jīng)預處理的玉米秸桿方面的比較。[0028]定義[0029]乙酰木聚糖酯酶:術語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎?、乙?；咸烟?、乙酸Ct-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN?20(聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯)的50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。[0030]等位變體(allelicvariant):術語“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種(例如幾種)可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0031]a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術語“a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μI中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,C0.Wicklow,Ireland)在4CTC進行30分鐘，接著通過A1VIINEX?HPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。[0032]α-葡糖醛酸糖苷酶:術語“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指a_D_葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個單位的α_葡糖醒酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。[0033]天冬氨酸蛋白酶:術語“天冬氨酸蛋白酶”意指使用天冬氨酸殘基催化肽和蛋白中肽鍵的水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是一個蛋白酶家族，其使用天冬氨酸殘基來催化水解其肽底物。一般而言，其在活性位點具有兩個高度保守的天冬氨酸，并在酸性PH具有最適活性(Szecsi,1992,Scand.J.Clin.Lab.1nvest.Supp1.210:5-22)。就本發(fā)明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根據(jù)由Aikawa等，2001,J.Biochem.129:791-794描述的方法確定。[0034]β-葡糖苷酶:術語“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，葡糖苷酶根據(jù)Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66的方法使用對硝基苯基-β_D_葡糖吡喃糖苷作為底物確定。一個單位的β-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01%TWEEN?20(聚氧乙烯山梨坦單月桂酸酯)的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。[0035]β-木糖苷酶:術語“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(I—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的β_木糖苷酶定義為在40°C，ρΗ5在含有0.01%TWEEN?20的IOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。[0036]cDNA:術語“cDNA”意指能夠通過反轉錄從得自真核或原核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體,其通過一系列的步驟包括剪接進行加工，然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。[0037]纖維二糖水解酶:術語“纖維二糖水解酶”意指1，4_β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纖維素、纖維寡糖，或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnologyl5:160-167;Teeri等，1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根據(jù)Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985，F(xiàn)EBSLettersl87:283-288;以及Tomme等，1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，[0038]Tomme等的方法可用于確定纖維二糖水解酶活性。[0039]纖維素分解酶或纖維素酶:術語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(例如幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，β_葡糖苷酶，或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β_葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatmanl號濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatmanl號濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987，Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。[0040]就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解相比于未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解的增加來確定:l-50mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素(或其它經(jīng)預處理的纖維素材料)在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C進行3-7日。通常條件為:Iml反應液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，lmMMnSO4,50°C、55°C或60°C，72小時，通過AMINEX?HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)進行糖分析。[0041]纖維素材料:術語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質的初生細胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細胞壁(secondarycellwall)在細胞停止生長后產(chǎn)生,其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，因此是直鏈β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，形成具有多種多樣的取代基的復雜分支結構。盡管纖維素通常是多形的，但存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質。[0042]纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，農(nóng)業(yè)殘余物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿與造紙廠殘余物、廢紙和木材(包括林業(yè)殘余物)(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編)，pp.105-118，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosicsj于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65，pp.23-40，Springer-VerlagjNewYork)。在本文中應理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，木素纖維素是一種在混合基質中包含木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是任何生物質材料。在另一個優(yōu)選的方面，所述纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質素。[0043]在一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是木材(包括林業(yè)殘余物)。[0044]在另一個方面，纖維素材料是蘆竹(arundo)。在另一個方面，纖維素材料是蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是竹子。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。[0045]在另一個方面，纖維素材料是白楊。在另一個方面，纖維素材料是桉樹。在另一個方面，纖維素材料是揪樹。在另一個方面，纖維素材料是松樹。在另一個方面，纖維素材料是楊樹。在另一個方面，纖維素材料是云杉。在另一個方面，纖維素材料是柳樹。[0046]在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是磷酸處理的纖維素。[0047]在另一個方面，纖維素材料是水生生物質。如用于本文中，“水生生物質”意指在水生環(huán)境中由光合作用過程產(chǎn)生的生物質。水生生物質可為藻類、挺水植物(emergentplant)、浮葉植物(floating-leafplant)或沉水植物(submergedplant)。[0048]纖維素材料可以按原樣(asis)使用或進行預處理，預處理使用本領域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預處理纖維素材料。[0049]編碼序列:術語“編碼序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框以起始密碼子如ATG、GTG或TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG或TGA結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。[0050]調控序列(controlsequence):術語“調控序列”意指對編碼多肽的多核苷酸表達是必需的核酸序列。各個調控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，來自同一基因)或外來的(即，來自不同基因)，或各個調控序列對于彼此可以是天然的或外來的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況下，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以配備用于引入特異性限制位點的接頭，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。[0051]內(nèi)切葡聚糖酶:術語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切_1，4-(1，3;l，4)-13_D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-Ι,4_β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandApp1.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0052]表達:術語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0053]表達載體:術語“表達載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的調控序列可操作地連接。[0054]家族61糖苷水解酶:術語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。該家族中的酶原先基于在一個家族成員測量到的非常弱的內(nèi)切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而歸類為糖苷水解酶家族。這些酶的結構和作用模式是非經(jīng)典的，且它們無法視為真正的(bonafide)糖苷酶。然而，基于當與纖維素酶或纖維素酶的混合物一同使用時，其增強木素纖維素分解的能力，它們被保留在CAZy分類中。[0055]阿魏酸酯酶:術語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_羥基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團從酯化的糖(其在天然生物質底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羥基肉桂?；ッ?、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-1或FAE-1I。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。[0056]側翼:術語“側翼”意指在特定DNA序列、基因座或基因任一側延伸的DNA序列。側翼DNA緊密鄰接著另一個DNA序列、基因座或基因，其即將整合入絲狀真菌細胞的基因組。[0057]片段:術語“片段”意指從成熟多肽主體的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性。在一個方面，片段含有酶的成熟多肽的至少85%，例如至少90%或至少95%的氨基酸殘基。[0058]半纖維素分解酶或半纖維素酶:術語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(例如幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003，6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質降解中的關鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡。半纖維素亦共價地附于木質素，與纖維素一同形成高度復雜的結構。半纖維素的多變的結構和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側基的酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級結構的同源性，可指派為GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進一步歸類為宗族(clan)，以字母標記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C，或合適的pH，例如5.0或5.5進行測量。[0059]高嚴格條件:術語“高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在65°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0060]同源3’或5’區(qū):術語“同源3’區(qū)”意指DNA片段，其與基因組中的區(qū)具有相同序列或具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性，且當與同源5’區(qū)組合時，可通過同源重組靶向整合一片DNA至基因組中的特定位點。術語“同源5’區(qū)”指DNA片段，其與基因組中的區(qū)具有相同序列，且當與同源3’區(qū)組合時，可通過同源重組靶向整合一片DNA至基因組中的特定位點。同源5’和3’區(qū)必須在基因組中相連，這意味著它們在同一染色體上，并彼此相距在200kb以內(nèi)(withinatleast200kbofoneanother)。[0061]同源側翼區(qū):術語“同源側翼區(qū)”意指DNA片段，其與基因組中的區(qū)相同或具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性，且位于緊接著胞外DNA靶向整合入的基因組中特定位點的上游或下游。[0062]同源重復:術語“同源重復”意指在引入宿主細胞的重組DNA中重復至少兩次的DNA片段，且其可通過同源重組協(xié)助DNA的喪失，即，將選擇標志物插入兩個同源重復之間。同源重復亦稱為直接重復。[0063]宿主細胞:術語“宿主細胞”意指任何適合于使用包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構建體或表達載體進行轉化、轉染、轉導等的細胞類型。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的由于在復制中發(fā)生的突變而不同于親本細胞的任何后代。[0064]分離的:術語“分離的”意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質。分離的物質的非限定性實例包括(I)任何非天然存在的物質，(2)任何至少部分地與一種或多種或全部與其天然伴隨的天然存在的成分脫離的物質，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質、肽或輔因子；(3)任何相對于自然界中所見的該物質而言經(jīng)過了人工修飾的物質；或(4)任何通過相對于與其天然伴隨的其他組分增加該物質的量(例如，在宿主細胞中重組產(chǎn)生；編碼該物質的基因的多拷貝；使用比與編碼該物質的基因天然伴隨的啟動子更強的啟動子)而修飾的物質。[0065]低嚴格條件:術語“低嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS,200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和25%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在50°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0066]成熟多肽:術語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:2的氨基酸I至26是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6)，煙曲霉纖維二糖水解酶I的成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸27至532。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:4的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，煙曲霉纖維二糖水解酶II的成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸20至454。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:6的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，煙曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:6的氨基酸20至863。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:8的氨基酸I至21是信號肽的SignalP程序，煙曲霉GH61多肽的成熟多肽是SEQIDNO:8的氨基酸22至250。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:10的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:10的氨基酸19至407。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:12的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:12的氨基酸19至329。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:14的氨基酸I至17是信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:14的氨基酸18至364。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:16的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:16的氨基酸20至323。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:18的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQIDNO:18的氨基酸20至397。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:20的氨基酸I至20是信號肽的SignalP程序，煙曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:20的氨基酸21至792。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:22的氨基酸I至17是信號肽的SignalP程序，煙曲霉膨脹素的成熟多肽是SEQIDNO:22的氨基酸18至470。[0067]在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:24的氨基酸I至17是信號肽的SignalP程序，里氏木霉纖維二糖水解酶I的成熟多肽是SEQIDNO:24的氨基酸18至514。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:26的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序，里氏木霉纖維二糖水解酶II的成熟多肽是SEQIDNO:26的氨基酸19至471。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:28的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:28的氨基酸20至744。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDN0:30的氨基酸I至22是信號肽的SignalP程序，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:30的氨基酸23至459。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:32的氨基酸I至21是信號肽的SignalP程序，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:32的氨基酸22至418。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:34的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQIDNO:34的氨基酸20至229。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:36的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQIDNO:36的氨基酸20至223。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:38的氨基酸I至16是信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQIDNO:38的氨基酸17至347。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:40的氨基酸I至20是信號肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQIDNO:40的氨基酸21至797。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDΝΟ:42的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序，里氏木霉膨脹素的成熟多肽是SEQIDNO:42的氨基酸19至493。在本領域中已知宿主細胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或更多種成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。[0068]成熟多肽編碼序列:術語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:1的核苷酸I至78編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，煙曲霉纖維二糖水解酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸79至1956或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:3的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉纖維二糖水解酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:3的核苷酸58至1700或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:5的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:5的核苷酸58至2580或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:7的核苷酸I至63編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉GH61多肽的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:7的核苷酸64至859或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:9的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:9的核苷酸55至1221或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:11的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:11的核苷酸55至1248或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:13的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:13的核苷酸52至1145或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:15的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:15的核苷酸58至1400或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:17的核苷酸I至106編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉木聚糖酶III的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:17的核苷酸107至1415或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:19的核苷酸I至60編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:19的核苷酸61至2373或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:21的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序，煙曲霉膨脹素的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:21的核苷酸52至1657或其cDNA序列。[0069]在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:23的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉纖維二糖水解酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:23的核苷酸52至1545或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:25的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉纖維二糖水解酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:25的核苷酸55至1608或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:27的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽編碼序列是SEQIDΝ0:27的核苷酸58至2612或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:29的核苷酸I至66編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:29的核苷酸67至1374或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDN0:31的核苷酸I至63編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:31的核苷酸64至1254或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDN0:33的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:33的核苷酸58至749或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:35的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:35的核苷酸58至778或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:37的核苷酸I至48編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:37的核苷酸49至1349或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:39的核苷酸I至60編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:39的核苷酸61至2391或其cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDN0:41的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序，里氏木霉膨脹素的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:41的核苷酸55至2776或其cDNA序列。[0070]中等嚴格條件:術語“中等嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在55°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0071]中等-高嚴格條件:術語“中等-高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3`%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在60°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0072]核酸構建體:術語“核酸構建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其經(jīng)修飾以本來不會存在于自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其包含一個或多個(例如幾個)調控序列。[0073]可操作地連接:術語“可操作地連接”意指這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導編碼序列的表達。[0074]具有纖維素分解增強活性的多肽:術語“具有纖維素分解增強的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測量來自由纖維素分解酶在下述條件下與對照水解相比較水解纖維素材料的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性:l-50mg總蛋白/gPCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的蛋白質，在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C，和pH，例如5.0或5.5歷時1-7天，所述對照水解用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中纖維素)進行。在一個優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質量的2_3%的煙曲霉葡糖苷酶(如W02002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST?1.5L(NovozymesA/S,BagSVaerd5Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。[0075]具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。[0076]預處理的玉米秸桿:術語“PCS”或“預處理的玉米秸桿”意指通過用熱和稀硫酸處理、堿預處理或中性預處理的源自玉米秸桿的纖維素材料。[0077]序列同一性:參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。[0078]就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),優(yōu)選5.0.0版或更新版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下:[0079](同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))[0080]就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)，優(yōu)選5.0.0版或更新版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測定。使用的參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下:[0081](同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))[0082]亞序列:術語“亞序列(subsequence)”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(例如幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有酶活性的片段。在一個方面，亞序列含有酶的成熟多肽編碼序列的至少85%，例如至少90%，或至少95%的核苷酸。[0083]枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶:術語“枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶”意指與枯草桿菌蛋白酶具有類似的底物特異性的蛋白酶，其使用絲氨酸殘基催化肽和蛋白中的肽鍵水解?？莶輻U菌蛋白酶樣蛋白酶(枯草蛋白酶)是絲氨酸蛋白酶，其表征為三個氨基酸天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯(lián)體(triad)。這些催化性殘基的排列與來自地衣芽孢桿菌的原型枯草桿菌蛋白酶相同(Siezen和Leunissen,1997,ProteinScience6:501-523)?？莶輻U菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性可使用IOOmMNaCl-1OOmMMOPSpH7.0中的合成底物N-玻拍酸-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基苯胺(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide,AAPF)(BachemAG,Bubendorf,Switzerland)在5CTC進行3小時然后測量405nm處的吸光度來確定。[0084]靶向整合:術語“靶向整合”意指胞外DNA在限定的基因組基因座的穩(wěn)定整合。[0085]轉化體:術語“轉化體”意指攝取胞外DNA(外源、人工或修飾的)并表達其中含有的基因的細胞。[0086]轉化:術語“轉化”意指將胞外DNA引入細胞，即，由通過細胞膜攝取并從其周圍直接攝取，組入和表達外源遺傳材料(外源DNA)導致的細胞的遺傳改變。[0087]轉化效率:術語“轉化效率”意指細胞可攝取胞外DNA并表達其中含有的基因的效率，其計算如下:將表達基因的陽性轉化體的數(shù)量除以在轉化步驟中使用的DNA的量。[0088]胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶:術語“胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶”意指具有與胰蛋白酶類似的底物特異性的蛋白酶，其使用絲氨酸殘基催化肽和蛋白中的肽鍵水解。就本發(fā)明而言，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性根據(jù)Dienes等，2007，EnzymeandMicrobialTechnology40:1087-1094所述的步驟來確定。[0089]變體:術語“變體”意指在一個或多個(例如幾個)位置包含改變，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指將占據(jù)某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在鄰接并緊接著占據(jù)某位置的氨基酸之后添加氨基酸。[0090]非常高嚴格條件:術語“`非常高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在70°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0091]非常低嚴格條件:術語“非常低嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和25%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在45°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0092]含木聚糖材料:術語“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)連接的木糖殘基骨架的植物細胞壁多糖的材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的雜聚物，其由短的糖鏈分支。它們包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多種包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖類型的多糖可分為均木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan),后者包括葡糖醒酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復合雜木聚糖。參見，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sc1.186:1-67。[0093]在本發(fā)明的工藝中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一個優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。[0094]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎方法包括:(I)測定總木聚糖分解活性，和(2)測定單獨的木聚糖分解活性(例如內(nèi)切木聚糖酶、β_木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結于幾個公開文獻中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFood和Agriculture86(11):1636-1647;Spanikova和Biely,2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophylIumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601;Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta—D—xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381。[0095]總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.0I%TRITON?X-100(4-(I,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸鈉緩沖液pH6中來確定。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青精。[0096]就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalC0.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的:Iml反應,5mg/ml底物(總固形物),5mg木聚糖分解蛋白質/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對羥基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定法進行糖分析。[0097]木聚糖酶:術語“木聚糖酶”意指1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(I,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中I,4_β-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0.01%TRIRON?x-100和200mM磷酸鈉pH6緩沖液中在37°C確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青精。[0098]發(fā)明詳述[0099]本發(fā)明涉及重組木霉屬宿主細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼(i)煙曲霉纖維二糖水解酶I;(ii)煙曲霉纖維二糖水解酶II;(iii)煙曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽；或其同源物。在一個方面，所述重組木霉屬宿主細胞進一步包含一種或多種(例如幾種)多核苷酸，所述多核苷酸編碼一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I;(ii)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II；(iii)煙曲霉木聚糖酶；(iv)煙曲霉木糖苷酶；和(V)煙曲霉膨脹素；或其同源物。[0100]本發(fā)明的重組木霉屬宿主細胞產(chǎn)生的煙曲霉纖維素分解酶的酶組合物令人意想不到地在分解纖維素材料方面比由里氏木霉或煙曲霉產(chǎn)生的天然纖維素分解酶組合物更加有效。[0101]煙曲霉纖維素酶和半纖維素酶[0102]在本發(fā)明中可使用任何煙曲霉纖維二糖水解酶I，煙曲霉纖維二糖水解酶II，煙曲霉β-葡糖苷酶；具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I，煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II，煙曲霉木聚糖酶，煙曲霉木糖苷酶，和煙曲霉膨脹素，或其同源物。[0103]在一個方面，所述煙曲霉纖維二糖水解酶I或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0104]在另一個方面，所述煙曲霉纖維二糖水解酶II或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為SEQIDNO:4的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:4的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜父。[0105]在另一個方面，所述煙曲霉葡糖苷酶或其同源物選自下組:(i)葡糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:6的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0106]在另一個方面，所述具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽或其同源物選自下組:(i)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為SEQIDNO:8的成熟多肽；(?)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:8的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0107]在另一個方面，所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I或其同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為SEQIDNO:10的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:10的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:9的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0108]在另一個方面，所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II或其同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為SEQIDNO:12的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0109]在另一個方面，所述煙曲霉木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:14、SEQIDNO:16或SEQIDNO:18的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:14,SEQIDN0:16或SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0110]在另一個方面，所述煙曲霉β-木糖苷酶或其同源物選自下組:α)β-木糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:20的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0111]在另一個方面，所述煙曲霉膨脹素或其同源物選自下組:(i)膨脹素，其包含或組成為SEQIDN0:22的成熟多肽；(ii)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0112]可利用SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19或21的多核苷酸或其亞序列，以及SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的多肽或其片段設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼酶的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的細胞的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少15，例如至少25，至少35，或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸探針是至少100個核苷酸的長度，例如，至少200個核苷酸，至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，至少500個核苷酸，至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸的長度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。[0113]可從基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼酶的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDN0:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21或其亞序列雜交的克隆或DNA,將所述載體材料用在Sounthern印跡中。[0114]就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于:(i)SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19或21；(ii)SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19或21的成熟多肽編碼序列；(iii)其cDNA序列；(iv)它們的全長互補鏈；或(iv)它們的亞序列?？墒褂美鏧射線膠片(X-rayfilm)或其他任何本領域中已知的檢測手段檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。[0115]在一個方面，所述核酸探針是`SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19或21，或其成熟多肽編碼序列。在另一個方面，所述核酸探針是編碼SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的多肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。[0116]用于分離或克隆多核苷酸的技術在本領域中是已知的，并包括從基因組分離DNA或cDNA,或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的擴增(NASBA)。可以從煙曲霉的菌株克隆所述多核苷酸，因此，例如可為所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位變體或種變體(speciesvariant)。[0117]可使用上述煙曲霉酶(或蛋白)的化學修飾的或蛋白質工程改造的突變體。[0118]煙曲霉酶亦可為雜合多肽，其中煙曲霉酶的區(qū)域融合于另一個酶的區(qū)域的N端或C端。[0119]所述煙曲霉酶亦可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一個酶融合于煙曲霉酶的N端或C端。通過將編碼另一個酶的多核苷酸融合于編碼所述煙曲霉酶的多核苷酸來產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框(inframe)，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的調控下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術構建,其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583；Dawson等，1994，Science266:776-779)。[0120]融合多肽還可以在兩個多肽之間包含切割位點。融合多肽一旦分泌，所述位點就被切割開，釋放所述兩個多肽。切割位點的實例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen_Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；ffard等，1995，Biotechnologyl3:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381;Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等，1995,Biotechnologyl3:982-987;Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點。[0121]所述煙曲霉酶還可為一個或多個(例如幾個)選自下組的煙曲霉酶:乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。[0122]所述煙曲霉酶甚至還可為一個或多個(例如幾個)選自下組的煙曲霉酶:酯酶，棒曲霉素，漆酶，木質素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，和蛋白酶。[0123]木霉屬宿主細胞[0124]所述木霉屬宿主細胞可為任何可用于酶或蛋白的重組產(chǎn)生的木霉屬細胞。例如，所述木霉屬細胞可為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)細胞。在一個方面，所述木霉屬細胞是哈茨木霉細胞。在另一個方面，所述木霉屬細胞是康寧木霉細胞。在另一個方面，所述木霉屬細胞是長枝木霉細胞。在另一個方面，所述木霉屬細胞是里氏木霉細胞。在另一個方面，所述木霉屬細胞是綠色木霉細胞。[0125]在另一個方面,所述里氏木霉細胞是里氏木霉RutC30。在另一個方面，所述里氏木霉細胞是里氏木霉TV10。在另一個方面，所述綠色木霉細胞是里氏木霉RutC30的突變體。在另一個方面，所述里氏木霉細胞是里氏木霉TVlO的突變體。在另一個方面，所述綠色木霉細胞是里氏木霉的形態(tài)學突變體。參見例如W097/26330，其通過全文提述并入本文。[0126]可以將木霉屬細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的工藝以本身已知的方式轉化。用于轉化木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474以及Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422中描述。[0127]在木霉屬宿主細胞中，可通過破壞或缺失一個或多個(例如幾個)天然纖維素酶和/或半纖維素酶基因或其一部分來使所述基因失活，這導致突變細胞與親本細胞相比，當在相同條件下培養(yǎng)時，產(chǎn)生較少或不產(chǎn)生所述纖維素酶和/或半纖維素酶。在一個方面，所述一種或多種(例如幾種)纖維素酶基因編碼選自下組的酶:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II,β-葡糖苷酶，和膨脹素。在另一個方面，所述一種或多種(例如幾種)半纖維素酶基因編碼選自下組的酶:木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶。在另一個方面，所述一種或多種(例如幾種)半纖維素酶基因編碼選自下組的酶:乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。[0128]所述突變細胞可通過使用本領域公知的方法，例如插入、破壞、替代或缺失，來減少或消除編碼木霉屬纖維素酶或半纖維素酶的多核苷酸的表達。在一個優(yōu)選的方面，所述多核苷酸經(jīng)失活。待修飾或失活的多核苷酸可為，例如編碼區(qū)或其對于活性必需的部分，或編碼區(qū)表達所需的調節(jié)元件。此種調節(jié)或調控序列的實例可為啟動子序列或其功能部分，即，足以影響多核苷酸表達的部分。其它可供修飾的調控序列包括但不限于:前導序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，信號肽序列，轉錄終止子，和轉錄激活子。[0129]可以通過向親本細胞施以誘變，并且選擇其中已將多核苷酸的表達減少或消除的突變細胞來進行多核苷酸的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機的，可以通過例如使用合適的物理或化學誘變劑進行，通過使用合適的寡核苷酸進行，或通過將所述DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進行誘變。[0130]適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。[0131]當使用這些試劑時，通常通過如下方法來進行所述誘變:在合適條件下存在所述誘變劑時溫育待誘變的親本細胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達減少的或無基因表達的突變細胞。[0132]亦可通過插入、取代或缺失基因或其轉錄或翻譯所需的調控元件中的一個或多個(例如幾個)核苷酸實現(xiàn)多核苷酸的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開讀框。按照本領域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進行，即，直接在表達待修飾的多核苷酸的細胞上進行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進行所述修飾。[0133]消除或減少多核苷酸表達的便利方式的實例是基于基因替代，基因缺失，或基因破壞的技術。例如，在基因破壞方法中，將對應于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉化入親本細胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸還編碼標志物，其可用于選擇其中多核苷酸被修飾或破壞的轉化子。在一個方面，用選擇性標志物(如本文所述的那些)來破壞所述多核苷酸。[0134]亦可通過在細胞中抑制由所述多核苷酸編碼的酶的表達來實現(xiàn)對于多核苷酸的修飾或失活，即向細胞施用或在細胞中表達雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含編碼所述酶的多核苷酸的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個雙鏈體核苷酸。[0135]所述dsRNA優(yōu)選為小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA是用于抑制轉錄的小干擾RNA。在另一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA。在另一個方面，所述雙鏈RNA(dsRNA)分子包含SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31,SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDN0:39，和/或SEQIDN0:41的成熟多肽編碼序列的一部分，以供在細胞中抑制所述多肽的表達。盡管本發(fā)明并不限于任何具體作用機制，但所述dsRNA可進入細胞并導致類似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)，包括內(nèi)源mRNA的降解。當細胞暴露于dsRNA時，來自同源基因的mRNA通過稱為RNA干擾(RNAi)的過程受選擇性降解。[0136]所述dsRNA可用于基因沉默以使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性降解RNA。該工藝可在體外、離體或體內(nèi)實踐。在一個方面，所述dsRNA分子可用于在細胞、器官或動物中生成功能喪失的突變。用于制備和使用dsRNA分子以選擇性降解RNA的方法是本領域中公知的，參見，例如美國專利號6，489，127;6，506，559;6，511，824;和6，515，109。[0137]在一個方面，所述木霉屬纖維二糖水解酶I或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為SEQIDN0:24的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:24的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0138]在另一個方面，所述木霉屬纖維二糖水解酶II或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為SEQID`N0:26的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:26的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0139]在另一個方面，所述木霉屬葡糖苷酶或其同源物選自下組:(i)葡糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:28的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0140]在另一個方面，所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I或其同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為SEQIDNO:30的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:30的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:29的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:29的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0141]在另一個方面，所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II或其同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為SEQIDNO:32的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:32的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:31的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:31的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0142]在另一個方面，所述木霉屬木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:34的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:34的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:33的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:33的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0143]在另一個方面，所述木霉屬木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:36的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:36的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:35的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:35的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0144]在另一個方面，所述木霉屬木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:38的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:38的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:37的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:37的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0145]在另一個方面，所述木霉屬β_木糖苷酶或其同源物選自下組:(i)β_木糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:40的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:40的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:39的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:39的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0146]在另一個方面，所述木霉屬膨脹素或其同源物選自下組:(i)膨脹素，其包含或組成為SEQIDN0:42的成熟多肽；(ii)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:42的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:41的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如非常高嚴格條件下，與SEQIDN0:41的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0147]在一個方面，木霉屬纖維二糖水解酶I基因失活。在另一個方面，木霉屬纖維二糖水解酶II基因失活。在另一個方面，木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因失活。在另一個方面，木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因失活。在另一個方面，木霉屬β-葡糖苷酶基因失活。在另一個方面，木霉屬木聚糖酶基因失活。在另一個方面，木霉屬β-木糖苷酶基因失活。在另一個方面，木霉屬膨脹素基因失活。[0148]在另一個方面，木霉屬纖維二糖水解酶I基因和木霉屬纖維二糖水解酶II基因失活。[0149]在另一個方面，兩個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨脹素基因。在另一個方面，三個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶,和膨脹素基因。在另一個方面，四個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨脹素基因。在另一個方面，五個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶,和膨脹素基因。在另一個方面，六個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨脹素基因。在另一個方面，七個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶,和膨脹素基因。在另一個方面，八個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨脹素基因。在另一個方面，九個或更多個(例如幾個)選自下組的基因失活:纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶,和膨脹素基因。[0150]在另一個方面，所述纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，和β-木糖苷酶基因失活。在另一個方面，所述纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶I，內(nèi)切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨脹素基因失活。[0151]在另一個方面，一個或多個(例如幾個)蛋白酶基因失活。在另一個方面，所述一個或多個(例如幾個)蛋白酶基因是如W02011/075677(其通過全文提述并入本文)中所述的枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。[0152]在上述每個方面中，所述木霉屬酶是哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)酶。在另一個方面，所述木霉屬酶是哈茨木霉酶。在另一個方面，所述木霉屬酶是康寧木霉酶。在另一個方面，所述木霉屬酶是長枝木霉酶。在另一個方面，所述木霉屬酶是里氏木霉酶。在另一個方面，所述木霉屬酶是綠色木霉酶。[0153]核酸構建體[0154]包含編碼煙曲霉酶或蛋白的核酸構建體可通過將一個或多個(例如幾個)調控序列可操作地連接于所述多核苷酸以在與所述調控序列相容的條件下指導所述編碼序列在木霉屬宿主細胞中表達。取決于于表達載體,在將多核苷酸插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術是本領域熟知的。[0155]調控序列可為啟動子，其由用于表達編碼酶或蛋白的多核苷酸的木霉屬宿主細胞所識別。啟動子含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在宿主細胞中顯示轉錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。[0156]用于指導核酸構建體在木霉屬宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子:構巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、壤片鍵抱Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻譯延伸因子，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其來自在曲霉屬中性α-淀粉酶基因，其中未翻譯的前導序列由曲霉屬丙糖磷酸異構酶的基因的未翻譯的前導序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其來自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導序列由構巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構酶的基因的未翻譯的前導序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。其它啟動子描述于美國專利號6，011，147，其通過全文提述并入本文。[0157]調控序列也可以是轉錄終止子，其由木霉屬宿主細胞識別以終止轉錄。所述終止子與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接。在本發(fā)明中可使用在宿主細胞中有功能的任何終止子。[0158]對于木霉屬宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻譯延伸因子。[0159]調控序列還可以是合適的前導序列，其為對于木霉屬宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒拗骷毎杏泄δ艿娜魏吻皩蛄小0160]對于木霉屬宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶。[0161]調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉錄時，木霉屬宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA的信號。可使用在宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0162]對于木霉屬宿主細胞優(yōu)選`的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得:構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶II和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V。[0163]調控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號肽，并且指導所述多肽進入細胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。當編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時，外源信號肽編碼序列可能是必需的?；蛘撸梢灾苯佑猛庠葱盘栯木幋a序列取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，可使用指導表達的多肽進入宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。[0164]對于里氏木霉宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質霉纖維素酶、特異腐質霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V。[0165]調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽的N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為活性多肽?？梢詮氖葻釟Ыz霉漆酶(W095/33836)和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因獲得前肽編碼序列。[0166]當信號肽和前肽序列二者均存在時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的N端。[0167]同樣理想的是添加調節(jié)序列，其相對于木霉屬宿主細胞的生長來調節(jié)多肽的表達。調節(jié)序列的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。調節(jié)序列包括黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子和里氏木霉纖維二糖水解酶II啟動子。調節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調節(jié)序列可操作地連接。[0168]表達載體[0169]重組表達載體可構建為包含編碼煙曲霉酶或蛋白的多核苷酸，啟動子，終止子，和轉錄和翻譯終止信號。多種核苷酸和調控序列可以結合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(例如幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼所述多肽多核苷酸?；蛘?，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述多核苷酸的核酸構建體或多核苷酸來表達所述多核苷酸。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)恼{控序列可操作地連接以供表達。[0170]重組表達載體可以是任何能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達的載體(例如，質?；虿《?。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質粒。[0171]載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自我復制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外,可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉座子(transposon)。[0172]所述載體優(yōu)選地含有一個或多個(例如幾個)選擇性標志物，以便于容易地選擇經(jīng)轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標志物是這樣的基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。[0173]用于木霉屬宿主細胞的選擇性標志物的實例包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑玻拍羧酉先胺合酶，phosphoribosylaminoimidazoIe-succinocarboxamidesynthase)、adeB(憐酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosy1-aminoimidazoIesynthase)、amdS(乙酸胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-憐酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酸轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。優(yōu)選用于木霉屬細胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。細菌選擇性標志物的實例是賦予抗生素抗性的標志物，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性。[0174]所述選擇性標志物可為W02010/039889A2(其通過全文提述并入本文)中所述的雙重選擇性標志物系統(tǒng)。在一個方面,所述選擇性標志物是hph-tk雙重選擇性標志物系統(tǒng)。[0175]所述載體優(yōu)選含有允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制的元件。[0176]為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置的額外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應含有足夠數(shù)量的與相應的目標序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10，000堿基對，400至10，000堿基對，和800至10，000堿基對，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細胞基因組中的目標序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。[0177]為了自主復制，載體可以還包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是在細胞中發(fā)揮功能的介導自主復制的任何質粒復制子(replicator)。術語“復制起點”或“質粒復制子”意指能夠使質粒或載體體內(nèi)復制的多核苷酸。`[0178]在木霉屬宿主細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質?；蜉d體能夠根據(jù)公開于W000/24883中的方法完成。[0179]可以將多于一個拷貝的多核苷酸插入木霉屬宿主細胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得:將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標志物基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標志物基因的擴增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。[0180]用于連接上述元件以構建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。[0181]產(chǎn)生方法[0182]本發(fā)明亦涉及產(chǎn)生包含煙曲霉纖維素酶和/或半纖維素酶的酶組合物的方法，其包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述酶組合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的木霉屬重組宿主細胞；和(b)回收所述酶組合物。[0183]使用本領域已知的方法在適合于產(chǎn)生所述酶組合物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)木霉屬宿主細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述酶的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，或實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。[0184]可以使用本領域已知的對于酶為特異性的方法來檢測所述煙曲霉纖維素酶和/或半纖維素酶。這些檢測方法包括但不限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法(enzymeassay)可用于確定活性。[0185]所述煙曲霉纖維素酶和/或半纖維素酶可以使用本領域已知的方法回收。例如，所述多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。在一個方面，回收了全部發(fā)酵液。[0186]多肽可以使用多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,Janson和Ryden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。[0187]酶組合物[0188]本發(fā)明亦涉及酶組合物，其包含本發(fā)明的重組木霉屬宿主細胞的回收的發(fā)酵液。在一個方面，所述酶組合物可具有移出的發(fā)酵液的一個或多個成分。在另一個方面，所述酶組合物可不具有移出的發(fā)酵液的任何成分。[0189]所述酶組合物包含:(i)煙曲霉纖維二糖水解酶I;(ii)煙曲霉纖維二糖水解酶II;(iii)煙曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽；或其同源物，如本文中所述。在一個方面，所述酶組合物進一步包含一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I;(ii)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II;(iii)煙曲霉木聚糖酶；(iv)煙曲霉木糖苷酶；和(V)煙曲霉膨脹素；或(vi)其組合；或其同源物，如本文中所述。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含煙曲霉木聚糖酶。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含煙曲霉木糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含煙曲霉膨脹素。[0190]在另一個方面，所述酶組合物進一步包含木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含了里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I(GENBANK?登錄號M15665)。在另一個方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I對于宿主細胞是天然的。在另一個方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I是SEQIDNO:30的成熟多肽。[0191]在另一個方面，所述酶組合物進一步包含木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II。在另一個方面，所述酶組合物進一步包含了里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II(GENBANK?登錄號M19373)。在另一個方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II對于宿主細胞是天然的。在另一個方面,所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II是SEQIDNO:32的成熟多肽。[0192]所述酶組合物可進一步包含一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:纖維素酶，具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，半纖維素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木質素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶，和膨脹素。在另一個方面，所述纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。在另一個方面，所述半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(例如幾種)選自下組的酶:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。所述酶對于所述木霉屬宿主細胞可為天然的或外來的。[0193]術語“發(fā)酵液”用于本文中指由細胞發(fā)酵產(chǎn)生、不經(jīng)歷或僅經(jīng)歷最低限的回收和/或純化的制備物。舉例而言，當將微生物培養(yǎng)物生長至飽和，在限制碳的條件下溫育以允許蛋白合成(例如由宿主細胞表達酶)，并分泌入細胞培養(yǎng)基時，產(chǎn)生發(fā)酵液。所述發(fā)酵液可含有在發(fā)酵終止時得到的發(fā)酵材料的未分級或分級的內(nèi)容物。通常而言，發(fā)酵液是未分級的，并包含去除(例如通過離心)微生物細胞(例如絲狀真菌細胞)之后存在的用過的培養(yǎng)基以及細胞碎片。在一些實施方案中，所述發(fā)酵液含有用過的細胞培養(yǎng)基，胞外酶，和能成活的和/或不能成活的(viableand/ornonviable)微生物細胞。[0194]在一個實施方案中，所述發(fā)酵液配制物和細胞組合物包含第一有機酸組分和第二有機酸組分，所述第一有機酸組分包含至少一種1-5碳的有機酸和/或其鹽，而所述第二有機酸組分包含至少一種6個或更多個碳的有機酸和/或其鹽。在一個具體實施方案中，所述第一有機酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、它們的鹽，或前述兩種或更多種的混合物，而所述第二有機酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、它們的鹽，或前述兩種或更多種的混合物。[0195]在一個方面，所述組合物含有有機酸，并任選地進一步含有已被殺滅的細胞和/或細胞碎片。在一個實施方案中，從已殺滅細胞的全培養(yǎng)液中移出所述已被殺滅的細胞和/或細胞碎片以提供不含這些組分的組合物。[0196]所述發(fā)酵液配制物或細胞組合物可進一步包含防腐劑和/或抗微生物(例如抑菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀和其它本領域中已知者。[0197]所述已殺滅細胞的全培養(yǎng)液或組合物可含有在發(fā)酵終止時得到的發(fā)酵材料的未分級內(nèi)容物。通常而言，所述已殺滅細胞的全培養(yǎng)液或組合物含有在將微生物細胞(例如絲狀真菌細胞)生長至飽和，并在限制碳的條件下溫育以允許蛋白合成之后存在的用過的培養(yǎng)基以及細胞碎片。在一些實施方案中，所述已殺滅細胞的全培養(yǎng)液或組合物含有用過的細胞培養(yǎng)基，胞外酶，和已被殺滅的絲狀真菌細胞。在一些實施方案中，在已殺滅細胞的全培養(yǎng)液或組合物中存在的微生物細胞可使用本領域中已知的方法滲透和/或裂解。[0198]如本文中所述的全培養(yǎng)液或細胞組合物通常為液體，但可含有不溶性組分，如已被殺滅的細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基組分和/或不溶性酶。在一些實施方案中，可去除不溶性組分以提供澄清的液體組合物。[0199]本發(fā)明的全培養(yǎng)液配制物和細胞組合物可通過W090/15861或W02010/096673中描述的方法來產(chǎn)生。[0200]用途[0201]本發(fā)明還涉及下述使用包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物的工藝。[0202]本發(fā)明還涉及降解或轉化纖維素材料的工藝，其包括:用包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，所述方法進一步包括回收已降解或轉化的纖維素材料。所述纖維素材料的降解或轉化的可溶性產(chǎn)物可從不溶性纖維素材料使用本領域已知的方法分離,如例如離心、過濾或重力沉降。[0203]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括:(a)用包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(例如幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0204]本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的工藝，其包括:用一種或多種(例如幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是用包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物糖化的。在一個方面，纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個方面，所述工藝進一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0205]本發(fā)明的工藝可以用于將纖維素材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將可發(fā)酵糖轉化成很多有用的發(fā)酵產(chǎn)物，例如燃料、飲用乙醇和/或平臺化學品(platformchemical)(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。[0206]根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的處理可使用本領域的常規(guī)方法完成。此外，本發(fā)明的工藝能使用經(jīng)配置以依照本發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質加工設備進行。[0207]水解(糖化)和發(fā)酵，分別的或同時的，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉化(DMC)，有時也稱為聯(lián)合生物加工(consolidatedbioprocessing,CBP)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖和戊糖單體，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵組合在一個步驟中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,Wyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.,和Himmel，M.，1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同時糖化和水解步驟之外，還包括單獨的水解步驟，所述各步驟可以在同一個反應器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度進行，即，高溫酶法糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個或多個(例如幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素轉化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉化成終產(chǎn)物的酶(Lynd,L.R.，Weimer,P.J.，vanZyl,W.H.,和Pretorius,1.S.，2002，Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本領域中已知的任何方法，包括預處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，均可用于實施本發(fā)明的工藝。[0208]常規(guī)設備可包括補料分批式攪拌反應器、分批式攪拌反應器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應器和/或連續(xù)活塞流柱式反應器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Techno1gy25:33-38;Gusakov，A.V.,和Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess，Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應器(Ryu，S.Κ.，和Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應器(Gusakov,A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkinj1.Y.，DavydkinjV.Y.，Protasj0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應器類型包括:流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機型的反應器。[0209]預處理。在本發(fā)明的工藝的實施中，可以使用本領域已知的任何預處理過程破壞植物細胞壁的纖維素材料組分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.0fMol.Sc1.9:1621-1651;Yang和Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。[0210]纖維素材料也可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行粒度減小、篩分、預浸泡、潤濕、洗漆和/或調理(conditioning)。[0211]常規(guī)的預處理包括但不限`于，蒸汽預處理(伴隨或不伴隨爆破)、稀酸預處理、熱水預處理、堿預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆破、氨纖維爆破、有機溶劑預處理和生物預處理。其它預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H20、臭氧、離子性液體和Y輻射預處理。[0212]可以在水解和/或發(fā)酵之前預處理纖維素材料。預處理優(yōu)選在水解前進行?；蛘撸A處理可以與酶水解同時進行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預處理步驟本身使一些生物質轉化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。[0213]蒸汽預處理。在蒸汽預處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁成分，包括木質素、半纖維素和纖維素，使纖維素和其它級分，例如，半纖維素能夠被酶觸及。將纖維素材料經(jīng)過或通過反應容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應時間。蒸汽預處理優(yōu)選在140-250°C，例如160-200°C，或170-190°C進行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優(yōu)選1-60分鐘，例如1-30分鐘，1-20分鐘，3-12分鐘，或4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和化學催化劑的添加。蒸汽預處理允許相對較高的固形物加載量，以致于纖維素材料在預處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預處理經(jīng)常與預處理后的物質的爆破放料(explosivedischarge)組合,這稱為蒸汽爆破，即，快速閃變至大氣壓和物質的瑞流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請N0.20020164730)。在蒸汽預處理過程中，半纖維素乙?；鶊F被切開，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成為單糖和寡糖。木質素僅以有限的程度被去除。[0214]化學預處理:術語“化學處理”指能促進纖維素、半纖維素和/或木質素分離和/或釋放的任何化學處理。此種預處理可將晶體纖維素轉化為無定形纖維素。合適的化學預處理工藝的實例包括例如稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆破(AFEX)、氨滲濾(APR)、離子性液體和有機溶劑預處理。[0215]經(jīng)常在蒸汽預處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至5%w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并改進酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等，2004，Appl.Biochem.BiotechnoI.113-116:509-523;Sassner等.,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。在稀酸預處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓。可以用很多反應器設計進行稀酸預處理，例如，活塞流反應器、逆流反應器或連續(xù)逆流收縮床反應器(Duff和Murray,1996,見上文；Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。[0216]還可以使用堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿預處理包括，但不限于，氫氧化鈉、石灰、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆破(AFEX)。[0217]用氧化鈣或氫氧化鈣，在85_150°C的溫度進行石灰預處理，停留時間從I小時到幾天(Wyman等，2005,BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005,BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/11089UW02006/110899,W02006/110900和W02006/110901公開了使用氨的預處理方法。[0218]濕氧化是一種熱預處理，通常在180-200V進行5_15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt和Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預處理優(yōu)選以1-40%干物質，例如2-30%干物質，或5-20%干物質進行，并且經(jīng)常通過加入堿如碳酸鈉來增加初始pH。[0219]濕氧化預處理方法的修改方法，稱為濕爆破(濕氧化和蒸汽爆破的組合)，能夠處理高達30%的干物質。在濕爆破中，在預處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結束預處理(W02006/032282)。[0220]氨纖維爆破(AFEX)涉及在溫和溫度如90-150°C和高壓如17_20bar，用液氨或氨氣將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質含量可以高達60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。在AFEX預處理過程中，纖維素和半纖維素保持相對完整。木質素-糖復合物被切開。[0221]有機溶劑預處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分半纖維素和木質素得以去除。[0222]合適的預處理方法的其他實例如Schell等，2003,Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686,和美國專利公開申請2002/0164730所述。[0223]在一個方面，化學預處理優(yōu)選作為稀酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸處理進行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范圍內(nèi)進行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范圍內(nèi)。將酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選140-200°C，例如165-190°C范圍內(nèi)的溫度保持I至60分鐘的時間。[0224]在另一個方面，預處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，例如20-70wt%*30-60wt%，如約40wt%的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。[0225]機械預處理或物理預處理:術語“機械預處理”或“物理預處理”指任何促進顆粒大小減少的預處理。舉例而言，此種預處理可涉及各種類型的研磨(grinding)或磨制(milling)(例如,干磨、濕磨或振動球磨)。[0226]纖維素材料可經(jīng)物理(機械)和化學預處理。機械或物理預處理可與下述結合:汽蒸/蒸汽爆破、水熱解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、福射(例如微波福射)，或其組合。在一個方面，高壓指優(yōu)選約100至約400psi,例如約150至約250psi的范圍的壓力。在另一個方面，高溫指約100至約300°C，例如約140至約200°C范圍的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機械或物理預處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、使用蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進行。所述物理和化學預處理可視需要順序進行或同時進行。[0227]因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進行物理(機械)或化學預處理，或者它們的任何組合，以促進纖維素、半纖維素和/或木質素的分離和/或釋放。[0228]生物預處理:術語“生物預處理”指可以促進纖維素、半纖維素和/或木質素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以包括應用溶解木質素的微生物和/或酶(參見，例如，Hsu,T.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMiIlan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.，編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0229]趣化。在水解步驟中，將纖維素材料，例如經(jīng)預處理的纖維素材料水解以將纖維素和半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解通過包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物酶促進行。[0230]酶水解優(yōu)選在易于由本領域技術人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進行。在一個方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最佳的條件下進行。水解可以以補料分批或連續(xù)的過程進行，在連續(xù)過程中將纖維素材料逐漸補入，例如，補入含酶的水解溶液中。[0231]糖化通常在攪拌釜反應器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的處理時間、溫度和pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達200小時，但是通常優(yōu)選進行約12至約120小時，例如約16至約72小時，或約24至約48小時。溫度為優(yōu)選約25°C至約70°C的范圍，例如約30°C至約65°C，約40°C至約60°C，或約50°C至約55°C。pH優(yōu)選約3至約8，例如約3.5至約7，約4至約6，或約5.0至約5.5的范圍。干固形物含量優(yōu)選約5至約50wt%,例如約10至約40wt%,或20至約30wt%。[0232]在本發(fā)明的工藝中，所述包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物可在發(fā)酵之前或之中添加，例如在糖化之中或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。[0233]包含本發(fā)明的回收的發(fā)酵液的酶組合物可為任何適用的形式，例如移除或不移除細胞的粗發(fā)酵液，含或不含細胞碎片的細胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或作為酶的來源的木霉屬宿主細胞。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機酸來穩(wěn)定化。[0234]煙曲霉纖維素酶或半纖維素酶的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶和/或半纖維素分解酶的混合物、纖維素材料、纖維素材料的濃度、纖維素材料的預處理、溫度、時間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同時糖化和發(fā)酵的酵母)。[0235]在一個方面，纖維素分解酶或半纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.0mg,例如約0.01至約40mg,約0.01至約30mg,約0.01至約20mg,約0.01至約IOmg,約0.01至約5mg,約0.025至約1.5mg,約0.05至約1.25mg,約0.075至約1.25mg,約0.1至約1.25mg,約0.15至約1.25mg,或約0.25至約1.0mg每g纖維素材料。[0236]在另一個方面，具有纖維素分解增強活性的GH61多肽在W02008/151043中所述的可溶性活化二價金屬陽離子，例如硫酸錳的存在下使用。[0237]在另一個方面，所述具有纖維素分解增強活性的GH61多肽在二氧化合物、二環(huán)化合物、雜環(huán)化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或從經(jīng)預處理的纖維素材料(如經(jīng)預處理的玉米秸桿(PCS))獲得的液體的存在下使用。[0238]所述二氧化合物可包括任何含有兩個或更多氧原子的合適化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模塊(moiety)。所述二氧化合物可包括一個或多個(例如幾個)羥基和/或羥基衍生物，但亦包括缺乏羥基和羥基衍生物的取代的芳基模塊。二氧化合物的非限定性實例包括鄰苯二酚或兒茶酚；咖啡酸；3，4-二羥基苯甲酸；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二酚；連苯三酚；沒食子酸；甲基_3，4，5-三羥基苯甲酸；2，3，4-三羥基二苯甲酮；2，6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5-二羥基苯甲酸；4-氯-1，2-苯二酚；4_硝基-1，2-苯二酚；鞋酸；沒食子酸乙酯；羥乙酸甲酯；二羥基延胡索酸；2_丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1，3_丙二醇；酒石酸；2，4_戊二醇；3-乙氧基-1，2-丙二醇；2，4，4’-三羥基二苯甲酮；順-2-丁烯-1，4-二醇；3，4_二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮；二羥基丙酮；乙酰丙烯醛(acroleinacetal);甲基_4_羥基苯甲酸；4_羥基苯甲酸；和甲基-3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸；或它們的鹽或溶劑合物(solvate)。[0239]所述二環(huán)化合物可包括任何如本文中所述的合適的取代稠環(huán)系統(tǒng)。所述化合物可包含一個或多個(例如幾個)另外的環(huán)，且除非另行說明，不限于具體的環(huán)數(shù)。在一個方面，所述二環(huán)化合物是類黃酮。在另一個方面，所述二環(huán)化合物是任選取代的異類黃酮(isoflavonoid)。在另一個方面，所述二環(huán)化合物是任選取代的花色舞離子(fIavyIiumion)，如任選取代的花色素或任選取代的花色苷，或其衍生物。二環(huán)化合物的非限定性實例包括表兒茶素(epicatechin);槲皮素(quercetin);楊梅黃酮(myricetin)；黃杉素(taxifolin);山奈酌.(kaempferol);桑素(morin);金合歡素(acacetin);柚皮素(naringenin);異鼠李黃素(isorhamnetin);療菜苷配基(apigenin);花青素(cyanidin);花色素苷(cyanin);kuromanin;花青素鼠李葡糖苷(keracyanin);或它們的鹽或溶劑合物。[0240]所述雜環(huán)化合物可為任何合適的化合物，如本文中所述的任選取代的包含雜原子的芳環(huán)或非芳環(huán)。在一個方面，所述雜環(huán)是包含任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊的化合物。在另一個方面，所述任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊是任選取代的五元雜環(huán)烷基或任選取代的五元雜芳基模塊。在另一個方面，任選取代的雜環(huán)烷基或任選取代的雜芳基模塊是選自如下的任選取代的模塊:吡唑基、呋喃基、咪唑基、異噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基(thienyl)、二氫噻吩-批唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫卻基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、異喹啉基、異Π引哚基、Π丫唳基、苯并異B,惡唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙內(nèi)酰脲、吡嗪基、四氫呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、嗎啉基、吲哚基、二氮雜環(huán)庚三烯基(diazepinyl)、氮雜環(huán)庚三烯基(azepinyl)、硫雜環(huán)庚三烯基(thiepinyl)、哌唳基和氧雜環(huán)庚三烯基(ox印inyl)。在另一個方面所述任選取代的雜環(huán)烷基模塊或任選取代的雜芳基模塊是任選取代的呋喃基。雜環(huán)化合物的非限定性實例包括(1，2-二羥乙基)-3，4-二氫呋喃-2(5H)-酮；4-羥基-5-甲基_3_呋喃酮；5-羥基-2(5H)-呋喃酮；[1，2-二羥乙基]呋喃_2，3，4(5H)-三酮；α-羥基-Y-丁內(nèi)酯；核糖酸Y-內(nèi)酯；己醒糖酸Y-內(nèi)酯(aldohexuronicaldohexuronicacidY-lactone);葡糖酸5-內(nèi)酯；4-羥基香豆素；二氫苯并呋喃；5-(羥甲基)糠醛；糠偶姻(fuiOin);2(5H)_呋喃酮；5，6-二氫-2H-吡喃-2-酮；和5，6-二氫-4-羥基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它們的鹽或溶劑合物。[0241]所述含氮化合物可為任何具有一個或多個(例如幾個)氮原子的合適化合物。在一個方面，所述含氮化合物包含胺、亞胺、輕胺或氧化亞氮(nitroxide)模塊。含氮化合物的非限定性實例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy);5，6，7，8-四氫生物蝶呤；6，7-二甲基-5，6，7，8-四氫蝶呤；和馬來酰胺酸；或它們的鹽或溶劑合物。[0242]所述醌化合物可為任何本文中所述的包含醌模塊的合適的化合物。醌化合物的非限定性實例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2_羥基-1，4-萘醌；2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或輔酶Qtl;2，3，5，6-四甲基-1，4-苯醌或四甲基對苯醌；1，4-二羥基蒽醌；3-羥基-1-甲基-5，6-二氫吲哚二酮或腎上腺色素；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；批咯并喹啉醌(pyrroloquinolinequinone);或它們的鹽或溶劑合物。[0243]所述含硫化合物可為任何包含一個或多個(例如幾個)硫原子的合適的化合物。在一個方面，所述含硫化合物包含選自如下的模塊:亞硫酰，硫醚，亞磺酰，磺酰，硫酰胺(sulfamide),磺酰胺(sulfonamide),磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定性實例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2_巰基乙磺酸；苯硫醇；苯-1，2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它們的鹽或溶劑合物。[0244]在一個方面，此種如上所述的化合物對纖維素材料的有效量，以對纖維素糖單元的摩爾比例計為約10_6至約10，例如約10_6至約7.5，約10_6至約5，約10_6至約2.5，約I(T6至約1，約I(T5至約1，約I(T5至約KT1，約I(T4至約KT1，約I(T3至約KT1，或約I(T3至約10'在另一個方面，如上所述的化合物的有效量為約0.1μM至約11?，例如約0.54]\1至約0.75Μ,約0.75μM至約0.5Μ,約IμM至約0.25Μ,約IμM至約0.1Μ,約5μM至約50mM，約10μM至約25mM，約50μM至約25mM，約10μM至約10mM，約5μM至約5mM，或約0.1mM至約ImM。[0245]術語“液劑(liquor)”意指在本文中所述的條件下，通過處理漿料中的木素纖維素和/或半纖維素材料，或其單糖例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等，所產(chǎn)生的溶液相，即水相、有機相或其組合，及其可溶性內(nèi)容物。用于GH61多肽的纖維素分解增強的液劑可通過，任選在催化劑例如酸的存在下，任選在有機溶劑的存在下，且任選與對所述材料的物理破壞相組合來藉由施加熱和/或壓力來處理纖維素材料或半纖維素材料(或原料)，然后將溶液與殘余固體分離來產(chǎn)生。此類條件決定了在借助纖維素酶制備物水解纖維素材料的過程中通過液劑和GH61多肽的組合可獲得的纖維素分解增強的程度。所述液劑可使用本領域中的標準方法如過濾、沉積或離心從經(jīng)處理的材料分離。[0246]在一個方面，所述液劑對纖維素的有效量為約10_6至約IOg每g纖維素，例如約10-6至約7.5g,約10-6至約5,約10-6至約2.5g,約10-6至約Ig,約10-5至約Ig,約10-5至約10、，約I(T4至約10、，約I(T3至約10、，或約I(T3至約10、每g纖維素。[0247]發(fā)璧?？赏ㄟ^一種或多種(例如幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領域的技術人員容易地確定。[0248]在發(fā)酵步驟中，作為預處理和酶水解步驟的結果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨或同時的。[0249]在實施本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質)和使用的方法來選擇所述材料，如本領域中所公知的。[0250]術語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。[0251]“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體，或它們的組合。己糖和戊糖發(fā)酵生物體在本領域均是公知的。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品。可產(chǎn)生乙醇的細菌和真菌發(fā)酵生物體的實例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。[0252]能發(fā)酵己糖的發(fā)酵微生物的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括假絲酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬，例如Candidasonorensis、馬克斯克魯維酵母和釀酒酵母的菌株。[0253]以其天然狀態(tài)能發(fā)酵戊糖的發(fā)酵生物體的實例包括細菌和真菌生物體，如一些酵母。優(yōu)選的木糖發(fā)酵酵母包括假絲酵母屬，優(yōu)選休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)或Candidasonorensis;和畢赤酵母屬,優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773的菌株。優(yōu)選的戍糖發(fā)酵酵母包括管囊酵母屬(Pachysolen),優(yōu)選嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)的菌株。不能夠發(fā)酵戍糖如木糖和阿拉伯糖的生物可通過本領域已知方法遺傳修飾而發(fā)酵戊糖。[0254]能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細菌的實例包括，例如，凝結芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridiumphytofermentans、地芽抱桿菌屬菌種、解糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum)和運動發(fā)酵單胞菌(Philippidis,1996,見上文)。[0255]其它發(fā)酵生物包括芽孢桿菌屬，如凝結芽孢桿菌；假絲酵母屬，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、C.naedodendra、C.blanki1、C.entomophilia、蕓薹假絲酵母(C.brassicae)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)、博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、產(chǎn)I元假絲酵母(Candidautilis)和休哈塔假絲酵母(C.scehatae)；梭菌屬，如丙酮丁醇梭菌、熱纖維梭菌和C.phytofermentans;大腸桿菌，特別是經(jīng)遺傳修飾促進乙醇產(chǎn)率(yield)的大腸桿菌菌株；地芽孢桿菌屬菌種；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala);克雷伯氏菌屬(Klebsiella),如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca);克魯維酵母屬，如馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母(K.latic)、K.thermotoIerans和脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如解糖熱厭氧桿菌,和發(fā)酵單胞菌屬，如運動發(fā)酵單胞菌的菌株。[0256]在一個優(yōu)選的方面,酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是Candidasonorensis。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是Candidablankii。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是CandidaentomophiIiia0在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是休哈塔假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個優(yōu)選的方面,酵母是克魯維酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是KluyveromycesthermotoIerans0在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。[0257]在一個優(yōu)選的方面，細菌是芽孢桿菌屬。在一個更優(yōu)選的方面，細菌是凝結芽孢桿菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是丙酮丁醇梭菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是Clostridiumphytofermentans。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是熱纖維梭菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是地芽孢桿菌屬菌種。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是熱厭氧桿菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是解糖熱厭氧桿菌。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是發(fā)酵單胞菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是運動發(fā)酵單胞菌。[0258]商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如BIOFERM?AFT和XR(NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),ETHANOLRED?酵母(RedStar/Lesaffre,USA)、FALI?(Fleischmann’sYeast,BurnsPhilpFoodInc.，USA)，F(xiàn)ERMIOL?(DSMSpecialties)，GERTSTRAND?(GertStrandAB,Sweden)以及SUPERSTART?和THERMOSACC?新鮮酵母(EthanolTechnology,WI,USA)?[0259]在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，以提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。[0260]已經(jīng)通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物構建了能將己糖和戊糖轉化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998,GeneticalIyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655—664;Beall等，1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243;Deanda等，1996,Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；W02003/062430,XyloseIsomerase)。[0261]在一個優(yōu)選的方面,經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是Candidasonorensis。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一個優(yōu)選的方面,所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是馬克斯克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單胞菌。[0262]本領域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質，如本文所述。[0263]通常向降解的纖維素材料或水解物加入發(fā)酵微生物，并進行約8至約96小時，例如約24至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，例如約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，例如約pH4-5、6或7。[0264]在一個方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進行約12至約96小時，如通常為24-60小時發(fā)酵。在另一個方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，例如約25°C至約50°C，并且約32°C至約50°C，約32°C至約50°C，并且pH通常為約pH3至約PH7，例如約pH4至約pH7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-1O12,優(yōu)選約IO7-1Oltl,特別是約2xl08活細胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關于使用酵母進行發(fā)酵的進一步指導可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdoml999)中找到，其通過提述并入本文。[0265]發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何工藝組合使用，以進一步改進發(fā)酵方法，而且特定地，改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡唆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E0參見，例如,Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通過提述并入本文。礦物質的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質和礦物質鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0266]發(fā)酵產(chǎn)物:發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、異丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；燒烴(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；環(huán)烷烴(例如環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、和環(huán)辛烷)；烯烴(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO));異戊二烯；酮(例如，丙酮)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質。[0267]在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖?，術語“醇”包括包含一個或多個(例如幾個)羥基基團的物質。在更優(yōu)選的方面，所述醇是正丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是異丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一個更優(yōu)選的方面,所述醇是甘油(glycerol)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnologyl9(6):595-603。[0268]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烷烴。所述烷烴是未支化或支化的烷烴。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是戊烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是己烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是庚烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是辛烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是壬烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是癸烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是十一烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烷烴是十二烷。[0269]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是環(huán)烷烴。在另一個更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)戊烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)己烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)庚烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)辛烷。[0270]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烯烴。所述烯烴可為未支化或支化的烯烴。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烯烴是戊烯。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烯烴是己烯。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烯烴是庚烯。在另一個更優(yōu)選的方面，所述烯烴是辛烯。[0271]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard,A.,^PMargaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。[0272]在另一個優(yōu)選的方面，所述物質是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47jPGunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1~2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0273]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是異戊二烯。[0274]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮。應理解的是，術語“酮”涵蓋了含有一個或多個(例如幾個)酮模塊的酮。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如Qureshi和Blaschek,2003,見上文。[0275]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435—448。[0276]在另一個優(yōu)選的方面,所述物質是聚酮化合物(polyketide)。[0277]可以使用本領域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達約96ν01%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒,或工業(yè)乙醇。[0278]通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例[0279]菌株[0280]里氏木霉菌株981-0-8(D4)是里氏木霉RutC30的誘變株(ATCC56765；Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)。[0281]里氏木霉菌株AgJgl15-104-7B1(PCT/US2010/061105，TO2011/075677)是里氏木霉菌株981-0-8(D4)的ku70衍生物。[0282]培養(yǎng)基和緩沖溶液[0283]2XYT加氨芐青霉素平板由16g的胰蛋白胨，IOg的酵母提取物，5g的氯化鈉，15g的Bacto瓊脂，和去離子水加至I升構成。在經(jīng)蒸汽滅菌的培養(yǎng)基冷卻至55°C之后添加一ml的100mg/ml氨芐青霉素溶液。[0284]SOC培養(yǎng)基由20g的Bacto-胰蛋白胨，5g的Bacto酵母提取物，0.5g的NaCl，2.5ml的IMKC1，和去離子水加至I升構成。在蒸汽滅菌之前，將pH用IONNaOH調整至7.0。然后在即將使用前添加20ml的滅菌IM葡萄糖。[0285]LB平板由IOg的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl,15g的Bacto瓊脂,和去離子水加至I升構成。[0286]COVE鹽溶液由26g的KC1，26g的MgSO4.7H20，76g的KH2PO4,50ml的COVE痕量金屬溶液，和去離子水加至I升構成。[0287]COVE痕量金屬溶液由0.04g的NaB4O7.IOH2O,0.4g的CuSO4.5H20，1.2g的FeSO4.7Η20，0.7g的MnSO4.H2O,0.8g的Na2MoO2.2H20,IOg的ZnSO4.7H20，和去離子水加至I升構成。[0288]COVE平板由342.3g的蔗糖，20ml的COVE鹽溶液，IOml的IM乙酰胺，IOml的1.5MCsCl,25g的Noble瓊脂(Difco),和去離子水加至I升構成。[0289]C0VE2平板由30g的蔗糖，20ml的COVE鹽溶液，IOml的IM乙酰胺，25g的Noble瓊脂(Difco),和去離子水加至I升構成。[0290]木霉屬痕量金屬溶液由216g的FeCl3.6Η20，58g的ZnSO4.7Η20，27g的MnSO4.Η20，IOg的CuSO4.5Η20，2.4g的H3BO3,336g的檸檬酸，和去離子水加至I升構成。[0291]CIM培養(yǎng)基由20g的纖維素，IOg的玉米衆(zhòng)固形物(cornsteepsolids),1.45g的(NH4)2SO4,2.08g的KH2PO4,0.28g的CaCl2,0.42g的MgSO4.7Η20，0.42ml的木霉屬痕量金屬溶液，1-2滴抑泡劑，和去離子水加至I升構成；pH調整至6.0。[0292]YP培養(yǎng)基由IOg的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨,和去離子水加至I升構成。[0293]YPG培養(yǎng)基由4g的酵母提取物，Ig的K2HPO4,0.5g的MgSO4,15.0g的葡萄糖，和去離子水加至I升(PH6.0)構成。[0294]PEG緩沖液由500g的聚乙二醇4000(PEG4000)，IOmMCaCl2,IOmMTris-HClpH7.5，和去離子水加至I升構成；過濾滅菌。[0295]PDA平板由39g的PotatoDextrose瓊脂(Difco)和去離子水加至I升構成。[0296]PDA覆蓋培養(yǎng)基由39g的PotatoDextrose瓊脂(Difco),2.44g的尿苷,和去離子水加至I升構成。將之前蒸汽滅菌的培養(yǎng)基在微波爐中熔融，然后在使用前冷卻至55°C。[0297]STC由IM山梨醇，IOmMmMCaCl2，和IOmMTris-HCl,pH7.5構成；過濾滅菌。[0298]TE緩沖液由IMTrisρΗ8.0和0.5ΜEDTAρΗ8.0構成。[0299]20ΧSSC由175.3g的NaCl，88.2g的檸檬酸鈉，和去離子水加至I升構成。[0300]TrMM-G培養(yǎng)基由20ml的COVE鹽溶液，6g的(NH4)2S04,0.6g的CaCl2,25g的Nobel瓊脂(Difco)，20g的葡萄糖,和去離子水加至I升構成。[0301]NZY+培養(yǎng)基由5g的NaCl,3g的MgSO4.7Η20，5g的酵母提取物，IOg的NZ胺，1.2g的MgCl2,4g的葡萄糖，和去離子水加至I升構成。[0302]NNCYP07-PCS培養(yǎng)基由5.0g的NaNO3,3.0g的NH4Cl，2.0g的MES(游離酸)，2.5g的檸檬酸，0.2g的CaClJH2O,1.0g的Bacto蛋白胨，5.0g的酵母提取物，0.2g的MgS047H20,4.0g的K2HPO4,1.0ml的COVE痕量金屬溶液，80.0g的經(jīng)預處理的玉米秸桿(PCS)，和去離子水加至I升構成。[0303]實施例1:里氏木霉cbhl-煙曲霉cbhl替代構建體pJfyS139的構建[0304]將煙曲霉纖維二糖水解酶(cbhl)編碼序列(SEQIDNO:1[DNA序列]和SEQIDNO:2[推導的氨基酸序列])從pEJG93(W02011/057140)使用下示的基因特異性正向和反向引物進行擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION?反應的插入位點同源的載體，而下劃線部分為引入的PacI位點[0305]正向引物:[0306]5，-cgcggactgcgcaccATGCTGGCCTCCACCTTCTCCTACC-3’(SEQIDNO:43)[0307]反向引物:[0308]5，-ctttcgccacggagcttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAATAATCA-3，(SEQIDNO:44)[0309]擴增反應物由20ng的pEJG93，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer(Stratagene,LaJolla,CA,USA),和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(Stratagene,LaJolla,CA,USA)構成，最終體積為50μI。將擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333epgradientS(EppendorfScientific,Inc.,Westbury,NY,USA)中溫育，其程序如下:I個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行I分鐘；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用40mMTris堿，20mM檸檬酸鈉，ImMEDTA二鈉鹽(TAE)緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中1.6kb片段從凝膠切出和使用MINELUTE?GelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照生廣商的實驗方案提取。[0310]將1.6kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit(Clontech,PaloAlto,CA,USA)依照生產(chǎn)商的實驗方案插入NcoI/Pac1-消化的pSMail55(W005/074647)。所述'IN-FUSION?,反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer(Clontech,PaloAlto,CA,USA)，125ng的NcoI/Pac1-消化的pSMail55,IOOng的所述1.6kbPCR產(chǎn)物，和IμI的TN-FUSION?Enzyme(Clontech,PaloAlto,CA,USA)構成，反應體積為10μI。將所述反應在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后，將40μI的TE緩沖液添加至反應，使用2μI等分試樣依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時，并將250μI鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板，并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過測序篩選，并鑒定出一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，將其命名為pJfyS139-A。將pJfyS139_A用于插入單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因。[0311]將單純皰疹病毒tk編碼序列(SEQIDNO:45[DNA序列]和SEQIDN0:46[推導的氨基酸序列])從PJfyS1579-8-6(W02010/039840)通過用BglII和BamHI消化該質粒而釋放出。對消化物進行使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳，其中2.3kb條帶從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將tk基因使用QUICKLIGAT10N?Kit(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MAUSA)依照生產(chǎn)商的實驗方案插入BamH1-消化的、小牛腸磷酸酶處理的pJfyS139-A。連接反應由50ng的所述BamH1-消化的、小牛腸磷酸酶處理的pJfyS139-A，50ng的2.3kbtk基因插入物，IXQUICKLIGATION?緩沖液(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich,MAUSA),和5單位的QUICKLIGASE?(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MAUSA)構成,最終體積為20μI。將反應在室溫溫育5分鐘，并使用2μI的反應物依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒，并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時，并將250μI鋪板于150_直徑2ΧΥΤ加氨芐青霉素平板，并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用XmaI的限制性消化分析來篩選，以確定插入物的存在和取向，并鑒定出一個含有所述插入物的克隆，將其命名為pJfyS139-B。將pJfyS139_B用于插入里氏木霉3’cbhl基因側翼序列。[0312]3’cbhl基因側翼序列從里氏木霉RutC30基因組DNA使用下述正向和反向引物擴增。下劃線部分代表用于克隆的引入的NotI位點。[0313]正向引物:[0314]5，-ttagactgcggccgcGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGAT-3，(SEQIDNO:47)[0315]反向引物:[0316]5，-agtagttagcggccgcACGGCACGGTTAAGCAGGGTCTTGC-3，(SEQIDNO:48)[0317]將里氏木霉RutC30在250ml帶擋板的搖瓶中50ml的補充2%葡萄糖(w/v)的YP培養(yǎng)基中在28°c在200rpm攪拌下生長2日。菌絲體通過使用MIRACLOTH?(Calbiochem,LaJolla,CA,USA)的過濾收獲,在去離子水中洗漆兩次,并在液氮下凍結。將凍結的菌絲體通過杵和研缽磨碎至精細粉末。總DNA使用DNEASY?PlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)分離，其中裂解溫育延長至2小時。[0318]擴增反應物由150ng的里氏木霉RutC30基因組DNA，各200μΜ的dNTP，0.4μΜ引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333epgradientS中溫育,其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分鐘30秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0319]對PCR反應物依照生產(chǎn)商的實驗方案施以MINELUTFRNucleotideRemovalKit(QIAGENInc.，Valencia,CA，USA)。將所得的PCR混合物用NotI消化，并將消化的PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1%瓊脂糖凝膠電泳分離。將含有3’cbhl基因側翼序列的1.3kb片段從凝膠切出，并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將所述1.3kb片段使用QUICKLIGATION?Kit插入Not1-直鏈化、小牛腸磷酸酶處理的pJfyS139_B。所述QUICKLIGATION?反應由IOOng的所述Not1-直鏈化、小牛腸磷酸酶處理的pJfyS139_B，20ng的所述1.3kb片段，IXQUICKLIGATION?Buffer，和5單位的QUICKLIGASE?構成，最終體積為20μI。將所述反應物在室溫溫育5分鐘，并將2μI的的所述反應物用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒，并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時，并將250μI鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板，并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用XmaI的限制性消化分析來篩選，以確定插入物的存在和取向，并對陽性克隆測序。將一個含有不具有PCR錯誤的3’cbhl基因側翼序列的克隆命名為pJfyS139(圖1)。將pJfyS139用作載體以替代里氏木霉cbhl基因。[0320]實施例2:里氏木霉原生質體生成和轉化[0321]原生質體制備和轉化使用Penttila等，1987，Gene61:155-164的修飾的實驗方案進行。簡言之，將里氏木霉菌株AgJgll5-104-7Bl(PCT/US2010/061105，W02011/075677)在補充2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25ml的YP培養(yǎng)基在27°C在90rpm的輕柔攪拌下培養(yǎng)17小時。菌絲體通過使用VacuumDrivenDisposableFiltrationSystem(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾來收集，并用去離子水洗滌兩次，并用1.2M山梨醇洗滌兩次。原生質體通過將經(jīng)洗漆的菌絲體在34°C在90rpm的輕柔振蕩下懸于20ml的含有15mg每ml的GLUCANEX?200G(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)和0.36單位每ml的殼多糖酶(SigmaChemicalC0.，St.Louis,MO,USA)的1.2M山梨醇中15-25分鐘來生成。將原生質體通過在400xg離心7分鐘并用冷1.2M山梨醇洗滌兩次來收集。將原生質體使用血細胞計數(shù)器計數(shù)，并在STC中重懸至IxlO8原生質體每ml的最終濃度。將過量的原生質體在-8CTC儲藏于Cryol°CFreezingContainer(Nalgene,Rochester,NY,USA)。[0322]下述實施例中所述的將大約100μg的轉化質粒用PmeI消化。將消化反應通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳來純化。將DNA條帶從凝膠切出，并使用QIAQUICK?GelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)提取。將所得的純化的DNA添加至100μI的原生質體溶液并輕柔地混合。添加PEG緩沖液(250μI)，混合，并在34°C溫育30分鐘。然后添加STC(3ml)，混合，并鋪板于補充IM蔗糖的PDA平板。在28°C溫育16小時之后，將20ml的補充35μg每ml的潮霉素B的覆蓋PDA培養(yǎng)基添加至每個平板。將平板在28°C溫育4-7日。[0323]實施例3:用煙曲霉cbhl編碼序列替代天然的里氏木霉cbhl基因[0324]為了用煙曲霉cbhl編碼序列(SEQIDNO:1[DNA序列]和SEQIDN0:2[推導的氨基酸序列])替代里氏木霉天然cbhl基因(SEQIDN0:23[DNA序列]和SEQIDN0:24[推導的氨基酸序列])，將里氏木霉ku70-菌株AgJgl15-104-7B1(PCT/US2010/061105，W02011/075677)用4x2μg的PmeI直鏈化的pJfyS139(實施例1)依照實施例2中所述的步驟來轉化。獲得了七個轉化體，并將每一個挑取并轉移至PDA平板，并在28°C溫育7日。將基因組DNA從轉化體根據(jù)實施例1中所述的步驟分離，并對每個轉化體施以Southern分析。[0325]對于Southern分析，將2μg的基因組DNA用33單位的BglII在50μI反應體積中消化，并對其進行TAE緩沖液中的1%瓊脂糖電泳。將凝膠中的DNA用一次在0.25ΝHCl中的10分鐘洗滌來去嘌呤，用兩次在0.5NNa0H-l.5MNaCl中的15分鐘洗滌來變性，用一次在IMTrispH8-l.5MNaCl中的30分鐘洗滌來中和，并在20XSSC中溫育5分鐘。將DNA使用TURB0BL0TTER?System(Whatman,Inc.,FlorhamPark,NJ,USA)依照生產(chǎn)商的實驗方案轉移至NYTRAN?Supercharge膜(Whatman,Inc.,FlorhamPark,NJ,USA。將DNA使用STRATALINKER?UVCrosslinker(Stratagene,LaJolla，CA，USA)UV交聯(lián)至膜，并在42°C在20ml的DIGEasyHyb(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)中予頁雜交I小時。[0326]雜交于3’cbhl基因側翼序列的探針使用DigProbeSynthesisKit(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生產(chǎn)商的指不用下不的正向和反向引物來生成。PCR反應由IXHERCULASE?ReactionBuffer,各400nM的引物，200μMDIG-標記的含dUTP-的dNTP，20ng的pJfyS139，和1.5單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；25個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行40秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0327]正向引物:[0328]5，-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3，(SEQIDNO:49)[0329]反向引物:[0330]5，-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQIDNO:50)[0331]將探針通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳純化，其中對應于探針的0.5kb條帶從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將探針煮沸5分鐘，在冰上冷卻2分鐘，并添加至IOml的DIGEasyHyb以產(chǎn)生雜交溶液。雜交在42°C進行15-17小時。然后將膜在低嚴格條件下在2XSSC加0.1%SDS中在室溫洗滌5分鐘，接著進行在0.5XSSC加0.1%SDS中在65°C的兩次高嚴格性洗滌，每次15分鐘。探針-靶雜交通過化學發(fā)光測定(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生產(chǎn)商的指示來檢測。Southern分析指示7個轉化體中的3個含有在cbhl基因座的替代盒,且選擇一個轉化體里氏木霉JfyS139_8用于消除(cure)hpt和tk標志物。[0332]生成孢子的新鮮平板，即，將在28°C生長7日齡PDA平板的孢子轉移至PDA平板，并在28°C溫育7日。將孢子在IOml的0.01%TWEEN?20中使用滅菌的涂布器收集。孢子的濃度使用血細胞計數(shù)器確定，并將IO5個孢子鋪板于含有補充IyM5-氟-2’-脫氧尿苷(FdU)的TrMM-G培養(yǎng)基的150mm平板上。[0333]獲得了三百個FdU抗性的孢子分離株，并從上述孢子分離株中的2個提取了DNA。將分離株通過Southern分析如上所述進行分析，且結果指示兩個孢子分離株均切出了替代盒的同源重復之間的hpt/tk區(qū)。選擇一個稱作里氏木霉JfyS139-8A的菌株用于替代cbhlI基因。[0334]實施例4:空里氏木霉cbhll替代構建體pJfyS142的構建[0335]為了生成構建體以用煙曲霉cbhll編碼序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDN0:4[推導的氨基酸序列])替代里氏木霉cbhll基因(SEQIDNO:25[DNA序列]和SEQIDNO:26[推導的氨基酸序列])，首先從里氏木霉RutC30基因組DNA使用下示的基因特異性正向和反向引物擴增里氏木霉cbhll啟動子。里氏木霉RutC30基因組DNA根據(jù)實施例1中所述的步驟制備。[0336]正向引物:[0337]5’-acgaattgtttaaacgtcgacCCAAGTATCCAGAGGTGTATGGAAATATCAGAT-3’(SEQIDN0:51)[0338]反向引物:[0339]5，-cgcgtagatctgcggccatGGTGCAATACACAGAGGGTGATCTT-3’(SEQIDNO:52)[0340]擴增反應物由20ng的里氏木霉RutC30基因組DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?中溫育，其程序如下:I個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；25個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行I分鐘30秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中1.6kb片段從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。[0341]將1.6kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入NcoI/Sal1-消化的pSMail55(W005/074647)。所述IN-FIJSION亂反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,125ng的NcoI/Sal1-消化的pSMail55,IOOng的所述1.6kbPCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。將所述反應在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將2μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時并將250μI鋪板于150_直徑2ΧΥΤ加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用PciI的限制性消化來篩選并對正向克隆測序以確保不存在PCR錯誤。鑒定出了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，并將其命名為pJfyS142-A。將質粒pJfyS142_A用于插入里氏木霉cbhll終止子。[0342]所述cbhll終止子從里氏木霉RutC30基因組DNA使用下示的基因特異性正向和反向引物擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION(a反應中的插入位點同源的載體。[0343]正向引物:[0344]5’-atctacgcgtactagttaattaaGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACA-3’(SEQIDNO:53)[0345]反向引物:[0346]5，-gcggccgttactagtggatccACTCGGAGTTGTTATACGCTACTCG-3’(SEQIDNO:54)[0347]擴增反應物由150ng的里氏木霉RutC30基因組DNA，各200μΜ的dNTP，0.4μΜ引物，1XHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；25個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，54°C進行30秒，和72°C進行50秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。將PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳來分離，其中將0.3kb片段從凝膠切出并使用MINELUTE?Ge'IExtractionKit提取。[0348]將所述0.3kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入PacI/BamH1-消化的pJfyS142_A。所述IN-FUSION?,反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,150ng的PacI/BamH1-消化的pJfyS142_A,50ng的0.3kbPCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。將所述反應在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將2μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?^T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時并將250μI鋪板于150_直徑2ΧΥΤ加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。通過序列分析篩選轉化體來鑒定陽性克隆和確保不存在PCR錯誤。鑒定出了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，并將其命名為pJfyS142-B。將質粒pJfyS142_B用于插入單純皰疹tk基因。[0349]將單純皰疹病毒tk基因從pJfyS1579-8_6(W02010/039840)通過用BglII和BamHI消化所述質粒來釋放出。對消化物施以使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳，其中2.3kb條帶從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將tk盒使用QUICKLIGAT10N?Kit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入BamH1-消化的、小牛腸磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B。所述連接反應由50ng的所述BamH1-消化的、小牛腸磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B，50ng的2.3kbtk基因插入物，IXQUICKLIGAT10N?Buffer，和5單位的QUICKLIGASE?構成，連接體積為20μI。將反應物在室溫溫育5分鐘并將2μI的所述反應物用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時并將250μI鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用XmaI和BamHI的限制性消化來篩選來確定插入物的存在和取向，并鑒定了含有插入物的克隆，并將其命名為pJfyS142-C。將質粒pJfyS142-C用于插入里氏木霉3’cbhll基因側翼序列。[0350]所述3’cbhll基因側翼序列使用下示的正向和反向引物從里氏木霉RutC30基因組DNA擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION?>反應中的插入位點同源的載體。[0351]正向引物:[0352]5’-atccatcacactggcggccgcGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGT-3’(SEQIDNO:55)[0353]反向引物:[0354]5，-gatgcatgctcgagcggccgcCTACCTTGGCAGCCCTACGAGAGAG-3，(SEQIDNO:56)[0355]擴增反應物由150ng的里氏木霉RutC30基因組DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，IXHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?1中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行I分鐘50秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。對PCR反應進行使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳，其中1.5kb條帶從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將所述3’cbhII基因側翼序列使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插ΛNot1-線性化的pJfyS142-C。所述IN-FUSION?.反應由1XIN-FUSION?ReactionBuffer,150ng的pJfyS142-C,80ng的所述1.5kbPCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。將所述反應在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將2μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時并將250μI鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用BglII的限制性消化來篩選，并將陽性克隆測序以確保不存在PCR錯誤。鑒定出了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，并命名為pJfyS142(圖2)。使用質粒pJfyS142插入煙曲霉cbhll編碼序列。[0356]實施例5:里氏木霉cbhll-煙曲霉cbhll替代構建體pJfyS144的構建[0357]所述煙曲霉cbhll編碼序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推導的氨基酸序列])從PAlLo33(W02011/057140)使用下示的正向和反向引物擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION?,反應的插入位點同源的載體。[0358]正向引物:[0359]5，-ctctgtgtattgcaccATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’(SEQIDNO:57)[0360]反向引物:`[0361]5，-ccggtcacgaaagccTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGTT-3’(SEQIDNO:58)[0362]擴增反應物由20ng的pAlLo33，各200μM的dNTP，0.4μM引物，ImMHERCULASE?ReactionBuffer,和1.875單位的HERCULASE?HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行2分鐘；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0363]對PCR反應進行使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳，其中1.7kb條帶從凝膠切出并使川MINELUTE?GelExtractionKit提取。將所述1.7kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入NcoI/Pac1-消化的pJfyS142(實施例4)。所述IN-FUSION?,反應由IXIN-FUSK)N?ReactionBuffer,120ng的NcoI/Pac1-消化的pJfyS142，70ng的1.7kbPCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。將所述反應在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將2μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?'Τ0Ρ10感受態(tài)細胞。將細胞在42°C熱休克30秒并添加250μI的SOC培養(yǎng)基。將管在37°C，200rpm溫育I小時并將250μI鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。對所得的轉化體測序以確保不存在PCR錯誤和確定插入物的存在。鑒定出了一個具有不含錯誤的序列的克隆并命名為pJfyS144(圖3)。使用質粒pJfyS144以用來自煙曲霉的cbhll編碼序列替代天然cbhll基因。[0364]實施例6:用煙曲霉cbhll編碼序列替代天然里氏木霉cbhll基因[0365]為了用煙曲霉cbhll編碼序列(SEQIDNO:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推導的氨基酸序列])替代天然里氏木霉cbhll基因(SEQIDNO:25[DNA序列]和SEQIDNO:26[推導的氨基酸序列])，將里氏木霉JfyS139-8A(實施例3)根據(jù)實施例2中所述的步驟用2μg的Pme1-直鏈化和凝膠純化的pJfyS144(實施例5)轉化。獲得了七個轉化體，挑取每一個，并轉移至PDA平板并在28°C溫育7日。使用下述的真菌孢子PCR方法以篩選攜帶基因替代的轉化體，其中使用了下示的退火于5’cbhll基因側翼序列上游超過整合區(qū)域的區(qū)域的正向引物，和下示的退火于煙曲霉cbhll編碼序列的反向引物。[0366]正向引物:[0367]5，-AGCCACATGCCGCATATTGACAAAG-3’(SEQIDNO:59)[0368]反向引物:[0369]5’-AGGGATTCAGTGTGCTACAGGCTGC-3’(SEQIDNO:60)[0370]僅在cbhll基因座處發(fā)生準確的基因替代時會生成1.8kbPCR產(chǎn)物。若盒整合至基因組的別處，不會導致擴增。[0371]將來自每個轉化體的少量孢子懸于25μI的TE緩沖液中，并在微波爐以“高”檔加熱I分鐘。將每個經(jīng)微波加熱的孢子懸液用作PCR反應中的模板。所述反應由IμI的所述微波加熱的孢子懸液，各IμI的IOmMdNTP,12.5μI的2ΧADVANTAGE?GC-MeltLA緩沖液(Clontech,MountainView,CA,USA),25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1.25單位的ADVANTAGE?GCGenomeLAPolymeraseMix(Clontech,MountainView,CA，USA)，和9.25μI的水構成。反應在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333epgradientS中溫育,其程序如下:1個循環(huán),在95°C進行10分鐘；35個循環(huán),每循環(huán)在95°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行I分鐘40秒；1個循環(huán)，在72°C進行7分鐘；和4°C維持。對PCR反應進行使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳。孢子PCR指示七個轉化體中的四個在靶向的基因座含有所述替代盒，且對其中三個進行Southern分析以確認替代盒為單拷貝。[0372]將基因組DNA從三個轉化體根據(jù)實施例1中所述的步驟分離，并對每個轉化體施以Southern分析。對于Southern分析,將2μg的基因組DNA用50μI反應體積中的50單位的DraI消化，并對其進行TAE緩沖液中的1%瓊脂糖電泳。將凝膠中的DNA用一次在0.25ΝHCl中的10分鐘洗滌來去嘌呤，用兩次在0.5ΝNaOH-1.5ΜNaCl中的15分鐘洗滌來變性，用一次在IMTrisρΗ8-1.5ΜNaCl中的30分鐘洗滌來中和，并在20ΧSSC中溫育5分鐘。將DNA轉移至NYTRAN?Supercharge膜。將DNA使用STRATALINKERtmUVCrosslinkerUV交聯(lián)至膜，并在42。。在20ml的DIGEasyHyb中預雜交I小時。[0373]雜交于3’cbhll基因側翼序列的探針使用DigProbeSynthesisKit依照生產(chǎn)商的指示用下示的正向和反向引物來生成。PCR反應由IXHERCULASE?ReactionBuffer,各400nM的引物，200μMDIG-標記的含dUTP-的dNTP,150ng的里氏木霉RutC30基因組DNA,和1.5單位的HERCULASE?NotStartHigh-FidelityDNAPolymerase。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，51°C進行30秒，和72°C進行40秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0374]正向引物:[0375]5，-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3，(SEQIDNO:61)[0376]反向引物:[0377]5，-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQIDNO:62)[0378]將探針通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳純化，其中對應于探針的0.5kb條帶從凝膠切出并使用Q丨AQUICK?GelExtractionKit提取。將探針煮沸5分鐘，在冰上冷卻2分鐘，并添加至IOml的DIGEasyHyb以產(chǎn)生雜交溶液。雜交在42°C進行大約17小時。然后將膜在低嚴格條件下在2XSSC加0.1%SDS中在室溫洗滌5分鐘，接著進行在0.5XSSC加0.1%SDS中在65°C的兩次高嚴格性洗滌，每次15分鐘。探針-靶雜交通過化學發(fā)光測定(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生產(chǎn)商的指示來檢測。Southern分析指示三個轉化體在cbhll基因座含有替代盒，且選擇所有三個(命名為JfyS139/144-5,-6，和-10)用于消除hpt和tk標志物。[0379]生成孢子的新鮮平板，即，將在28°C生長7日齡PDA平板的孢子轉移至新鮮PDA平板，并在28°C溫育7日。將孢子在IOml的0.01%TWEEN?20中使用滅菌的涂布器收集。孢子的濃度使用血細胞計數(shù)器確定，并將IO5和IO4個孢子鋪板于含有補充IμΜF(xiàn)dU的TrMM-G培養(yǎng)基的150mm平板上。[0380]從含有IO5個孢子的平板對于每個轉化體獲得了大約500個FdU抗性的孢子分離株，而從含有IO4個孢子的平板對于每個轉化體獲得了大約100個FdU抗性的孢子分離株。對于菌株JfyS139/144-5和-6挑取了八個孢子分離株，而對于菌株JfyS139/144_10挑取了四個。來自初級轉化體5的每個分離株I至8命名為JfyS139/144-5A至-5H。來自初級轉化體6的每個分離株I至8命名為JfyS139/144-6A至-6H。來自初級轉化體10的分離株對于分離株I至4命名為JfyS139/144-10A至10D。孢子PCR如上所述進行，使用下示的正向和反向引物，以確認hpt和tk標志物已正確地切出。[0381]正向引物:[0382]5，-GTTAAGCATACAATTGAACGAGAATGG-3’(SEQIDNO:63)[0383]反向引物:[0384]5，-GATGATATAATGGAGCAAATAAGGG-3’(SEQIDNO:64)[0385]PCR反應如上所述以下述循環(huán)參數(shù)進行:1個循環(huán)，在95°C進行2分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行6分鐘秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0386]使用退火于5’(正向)和3’(反向)側翼序列的引物進行cbhll基因替代。正確地切出htp/tk盒的菌株會顯示3.5kb片段，而具有完好的標志物的那些菌株會顯示8kb片段。PCR篩選指示所有的孢子分離株正確地切出了htp/tk盒。[0387]對于每個初級轉化體，從A和B孢子分離株提取了DNA，并對其進行了如上所述的Southern分析。Southern分析確認每個孢子分離株正確地切除了htp/tk盒。選擇孢子分離株里氏木霉JfyS139/144-10B以代表含有里氏木霉cbhl和cbhll基因二者均用來自煙曲霉的相應同源物替代的菌株。[0388]實施例7:里氏木霉ku70基因修復質粒PTH239的生成[0389]將四個DNA區(qū)段使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit合并以生成構建體，其用天然里氏木霉ku70編碼序列(SEQIDNO:65[DNA序列]和SEQIDN0:66[推導的氨基酸序列])替代了破壞的里氏木霉ku70編碼序列。含有原核復制起點的氨芐青霉素抗性標志物區(qū)從pJfyS139-B(實施例1)使用下示的序列特異性正向和反向引物(SEQIDN0:67和68)擴增。里氏木霉ku70基因上游序列(由來自ku70編碼序列上游的989bp和ku70編碼序列的最初IOlObp組成)從里氏木霉981-0-8基因組DNA使用下示的序列特異性正向和反向引物(SEQIDN0:69和70)擴增。里氏木霉ku70基因下游序列(由從上游PCR產(chǎn)物中擴增的ku70編碼序列的IOlObp區(qū)段的3’端重復的500bp的區(qū)段，和含有剩余ku70編碼序列的1067bp區(qū)段,和來自ku70編碼序列的下游的461bp組成)從里氏木霉981-0-8基因組DNA使用下示的序列特異性正向和反向引物(SEQIDN0:71和72)擴增。里氏木霉981-0-8基因組DNA根據(jù)實施例1中所述的步驟制備。[0390]正向引物:[0391]5’-GTGTGCGGCCGCTCGAGCATGCATGTTTAAACAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTT-3’(SEQIDNO:67)[0392]反向引物:[0393]5，-ATCAGCCCCGAGACGGCGCCGCGTTTAAACAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGT-3’(SEQIDNO:68)[0394]正向引物:[0395]5’-CATGATTACGAATTGTTTAAACGCGGCGCCGTCTCGGGGCTGATCTTGTCGAGGA-3’(SEQIDNO:69)[0396]反向引物:[0397]5’-GGCGGCCGTTACTAGTGGATCCAGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCCAGGTGCAA-3’(SEQIDNO:70)[0398]正向引物:[0399]5’-TGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCAGTTTCCATGTCCAACGTGTTGTTTTGCGC-3’(SEQIDN0:71)[0400]反向引物:[0401]5’-GCCAGTGCCAAGCTGTTTAAACATGCATGCTCGAGCGGCCGCACACGCCCTCTCCTCG-3’(SEQIDNO:72)[0402]為了擴增氨芐青霉素抗性標志物和原核復制起點區(qū)，所述反應由IOOng的里氏木霉981-0-8基因組DNA，200yMdNTPs，IμM的每種引物(SEQIDN0:67和70)，IXPHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymerase緩沖液(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA,USA),和1.0單位的PHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymerase(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA,USA)構成，最終體積為50μI。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:I個循環(huán)，在98°C進行30秒；30個循環(huán)，每循環(huán)在98V進行10秒，55°C進行30秒，和72°C進行I分鐘30秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。所述PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中2.692kb片段從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。[0403]為了擴增ku70基因上游序列或下游序列，所述反應由IOOng的pJfyS139_B,200μMdNTPs,IμΜ的每種引物(分別為SEQIDNO:69和70，或者71和72)，IXPHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymeraseBuffer,和1.0單位的PHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymerase構成，最終體積為50μI。所述擴增反應在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在98°C進行30秒；30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進行10秒，55°C進行30秒，和72°C進行I分鐘30秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中1.999kb和2.028kb片段分別從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。[0404]第四DNA區(qū)段從用NotI和BamHI對pJfyS139_B的限制性酶消化來生成。反應由5μg的pJfyS139_B,10單位的Not1,20單位的BamHI,和20μI的RestrictionEnzymeBuffer2(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich,MA,USA)構成，總體積為50μI。將所述反應在37°C溫育I小時，然后通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中4.400kb片段從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。[0405]將2，028bp,I,999bp和2，692bp的三種PCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入NotI和BamH1-消化的pJfyS139_B。所述IN-FUSION?」反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,50ng的NotI/BamH1-消化的pJfyS139-B，50ng的1.999kbku70基因上游PCR產(chǎn)物，50ng的2.028kbku70基因下游PCR產(chǎn)物，50ng的2.692kb氨芐青霉素抗性標志物和原核復制起點PCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。所述反應在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將3μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化大腸桿菌XL`lOGOLD?':感受態(tài)細胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。將細胞在42°C熱休克30秒，然后添加預加熱至42°C的500μI的NZY+培養(yǎng)基。將管在37°C在200rpm振蕩下溫育40分鐘，然后鋪板于150mm直徑2XYT加氨芐青霉素平板并在37°C溫育過夜。將所得的轉化體通過用HindIII和XbaI的限制性消化來篩選并對正向克隆測序以確保不存在PCR錯誤。鑒定了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆并命名為pTH239。[0406]實施例8:煙曲霉cbhl和cbh2替代菌株JfyS139/144_10B中ku70基因的修復[0407]將天然里氏木霉ku70基因在菌株里氏木霉JfyS139/144_10B(實施例6)中修復，以協(xié)助菌株操作，需要ku70基因在非同源末端連接中的功能。將里氏木霉JfyS129/144-10B用23x2μg的Pme1-直鏈化的pTH239(實施例7)根據(jù)實施例2中所述的步驟轉化。獲得了十九個轉化體，并將每一個分別轉移至PDA平板，并在28°C溫育7日。[0408]將所有十九個轉化體通過PCR篩選以確認pTH239PmeI片段在破壞的ku70基因基因座的同源整合。對于每個轉化體，使用滅菌的接種環(huán)來從7日齡PDA平板收集孢子。將孢子轉移至含有25μI的ImMEDTA-1OmMTris緩沖液的管，并在“高”檔微波處理I分鐘。將經(jīng)微波處理的孢子混合物的1μI等分試樣直接添加至PCR反應作為模板DNA。設計了下示的一組PCR引物以擴增整個ku70編碼序列的破壞的區(qū)域以區(qū)分具有ku70編碼序列(848bp)中的破壞的宿主基因組和感興趣的pTH239靶向的菌株(606bp)。所述PCR反應由IXADVANTAGE?基因組LAPolymeraseReactionBuffer(Clontech,MountainView,CA，USA)，各400nM的引物，各200μM的dNTP，IμI的經(jīng)微波處理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0單位的ADVANTAGE?,基因組LAPolymerase(Clontech,MountainView,CA，USA)構成。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:1個循環(huán)，在95°C進行10分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行60秒；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0409]正向引物:[0410]5，-CAATGACGATCCGCACGCGT-3，(SEQIDNO:73)[0411]反向引物:[0412]5，-CAATGACGATCCGCACGCGT-3，(SEQIDNO:74)[0413]十九個轉化體中僅有一個(#19)對于606bpPCR產(chǎn)物是陽性的且對于848bpPCR產(chǎn)物是陰性的，指示含有在ku70基因座同源整合的pTH239PmeI片段的菌株。[0414]將來自轉化體#19的7日`齡PDA平板的孢子在IOml的0.01%TWEEN?20中使用滅菌的涂布器收集。孢子的濃度使用血細胞計數(shù)器確認，并將IO6個孢子鋪板于含有補充IμM5-氟-2’-脫氧尿苷(FdU)的TrMM-G培養(yǎng)基的150mm平板，并在28°C培養(yǎng)5日。獲得了二十二個FdU-抗性孢子分離株，并將其轉化至PDA平板，并在28°C培養(yǎng)5日。[0415]將所有二十二個孢子分離株(#19A_V)通過PCR篩選在修復盒內(nèi)ku70編碼序列的同源重復之間存在的hpt/tk標志物區(qū)的切出。對于每個孢子分離株，使用滅菌接種環(huán)從7日齡PDA平板收集孢子。將孢子轉移至含有25μI的ImMEDTA-1OmMTris緩沖液的管，并在“高”檔微波處理I分鐘。將孢子混合物的IμI等分試樣直接添加至PCR反應作為模板基因組DNA。設計了下示的一組PCR引物以擴增整個hpt/tk區(qū)域以區(qū)分hpt/tk區(qū)域的存在(6kb)或不存在(1.1kb)。所述PCR反應由IXADVANTAGE?基因組LAPolymeraseReactionBuffer,各400nM的引物(見下)，各200μM的dNTP，IμI的微波處理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0單位的ADVANTAGE?.基因組LAPolymerase構成。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:I個循環(huán)，在95°C進行10分鐘；30個循環(huán)，每循環(huán)在95°C進行30秒，50V進行30秒，和72°C進行6分鐘；和I個循環(huán)，在72°C進行7分鐘。[0416]正向引物:[0417]5’-GACACTCTTTTCTCCCATCT-3’(SEQIDNO:75)[0418]反向引物:[0419]5，-GAGGAGCAGAAGAAGCTCCG-3’(SEQIDNO:76)[0420]所有二十二個孢子分離株對于對應于hpt/tk標志物區(qū)的6kbPCR產(chǎn)物是陰性的。[0421]將來自分離株#19A和#19L的7日齡PDA平板的孢子使用滅菌的涂布器在IOml的0.0i%TWEEN?20中收集。孢子的濃度使用血細胞計數(shù)器確定，并將ιο3，ιο2，和IO1個孢子鋪板于含有IM蔗糖的150mmPDA平板上，并在28°C培養(yǎng)3日。對于菌株#19A和#19L兩者從PDA平板選擇了十個孢子分離株，并將其轉移至新鮮PDA平板并置于28°C。[0422]根據(jù)實施例中所述的步驟從#19L和#19A兩者的6個孢子分離株提取基因組DNA，并對其施以Southern分析。[0423]對于Southern分析,將2μg的基因組DNA在50μI反應體積中用下述消化:(I)分別為5單位和10單位的AscI和XhoI或⑵分別為5單位和25單位的AscI和ApaI，并對其進行使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠中的DNA用一次在0.25ΝHCl中的10分鐘洗滌來去嘌呤，用兩次在0.5NNa0H-l.5MNaCl中的15分鐘洗滌來變性，用一次在IMTrispH8-l.5MNaCl中的30分鐘洗滌來中和，并在20XSSC中溫育5分鐘。將DNA使用TURB0BL0TTER?System依照生產(chǎn)商的實驗方案轉移至NYTRAN?Supercharge膜。將DNA使用STRATALINKER?UVCrosslinkerUV交聯(lián)至膜，并在42°C在20ml的DIGEasyHyb中預雜交I小時。[0424]雜交于ku70編碼序列的3’端的探針使用PCRDigProbeSynthesisKit(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示用下示的正向和反向引物來生成。為了生成純模板以供探針PCR反應，將ku70編碼序列的3’端從里氏木霉981-0-8基因組DNA擴增。所述PCR反應由IXPHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymeraseBuffer，各IμM的引物，各200μM的dNTP，165ng的里氏木霉981-0-8基因組DNA,和1.0單位的PHUSION?High-FidelityHotStartDNAPolymerase構成。擴增反應物在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS中溫育，其程序如下:I個循環(huán)，在98°C進行30秒；35個循環(huán)，每循環(huán)在98V進行10秒，60V進行30秒，和72°C進行15秒；和I個循環(huán)，在72°C進行10分鐘。[0425]正向引物:[0426]5，-gcatatataacccactcaagta-3’(SEQIDNO:77)[0427]反向引物:[0428]5，-attatcttggaccggccgcagg-3，(SEQIDNO:78)[0429]將0.5kb探針木板通過使用TAE緩沖液的I%瓊脂糖凝膠電泳純化并從凝膠切出，并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將純化的PCR產(chǎn)物用于使用如上所指示的引物和擴增條件如生產(chǎn)商的指示生成DIG標記的探針。將0.5kbDIG標記的探針通過使用TAE緩沖液的1%瓊脂糖凝膠電泳純化并從凝膠切出，并使用MINELUTE?GelExtractionKit提取。將探針煮沸5分鐘，在冰上冷卻2分鐘，并添加至IOml的DIGEasyHyb以產(chǎn)生雜交溶液。雜交在42°C進行15至17小時。然后將膜在低嚴格條件下在2XSSC加0.1%SDS中在室溫洗滌5分鐘，接著進行在0.5XSSC加0.1%SDS中在65°C的兩次高嚴格性洗漆，每次15分鐘。探針-1E雜交通過化學發(fā)光測定(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生產(chǎn)商的指示來檢測。Southern分析指示所有孢子分離株在ku70基因座含有修復/替代盒，并消除了hpt和tk標志物。選擇了一個命名為里氏木霉981-0-8.5#10B+Ku70#19L3的菌株進行進一步轉化。[0430]實施例9:煙曲霉GH61B多肽基因的克隆[0431]使用幾種已知的GH61多肽,包括桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽(GeneSeqP登錄號AEC05922)作為查詢項(query)進行了對煙曲霉部分基因座序列的tblastn檢索(Altschul等，1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402)(TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD,USA)。基于在氨基酸水平與查詢序列的高度相似性，將幾個基因鑒定為推定的GH61家族同源物。選擇一個與桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽序列在氨基酸水平具有大于70%序列同一性的大約850bp的基因組區(qū)進行進一步研究。[0432]將煙曲霉NN051616如美國專利號7，244，605中所述生長和收獲。將凍結的菌絲體通過杵和研缽磨碎至細微粉末，且基因組DNA使用DNEASY?PlantMaxiKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示來分離。[0433]設計了兩個下示的合成寡核苷酸引物以從基因組DNAPCR擴增煙曲霉家族GH61B多肽編碼序列。使用IN-FUSION?CloningKit(Clontech,PaloAlto,CA,USA)將片段直接克隆入表達載體pA1Lo2(W02004/099228)，而無需限制性消化和連接。[0434]正向引物:[0435]5’-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3’(SEQIDNO:79)[0436]反向引物:[0437]5’-TCACCTCTAGTTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAGGACCAG-3’(SEQIDNO:80)[0438]粗體字母代表編碼序列。剩余序列與pAlLo2的插入位點同源。[0439]將五十皮摩爾的每種上述引物用于PCR反應，所述反應由204ng的煙曲霉基因組DNA,IXPfxAmplificationBuffer(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),1.5μI的IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，2.5單位的PLATINUM?PfxDNAPolymerase(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)，和IμI的50mMMgS04構成，最終體積為50μI。擴增使用EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS進行，其程序如下:1個循環(huán)，在94°C進行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行I分鐘。加熱塊然后在72°C維持15分鐘，接著進行4°C浸泡循環(huán)。將反應產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將大約850bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTE?GelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。[0440]然后將850bp片段使用IN-FUSION?CloningKit克隆入pAlLo2。將質粒PAlLo2用NcoI和PacI消化。質粒片段通過如上所述的凝膠電泳和QIAQUICK'?GelPurificationKit純化。將基因片段和消化的載體在如下所述的反應中合并在一起,得到表達質粒PAG43(圖4)，其中煙曲霉GH61B多肽編碼序列的轉錄處于NA2_tpi啟動子的調控下。NA2-tpi啟動子是來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修飾的啟動子，其中未翻譯的前導序列被來自構巢曲霉丙糖磷酸異構酶基因的未翻譯的前導序列所替代。重組反應(20μ1)由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,IXBSA(Clontech,PaloAlto,CA,USA),IμI的TN-FUSION?Enzyme(1:10稀釋),166ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2,和IlOng的所述煙曲霉GH61B多肽純化的PCR產(chǎn)物構成。將反應在37°C進行15分鐘，接著在50°C進行15分鐘。將反應物用40μI的IOmMTris-0.1MEDTA緩沖液稀釋，并將2.5μI的稀釋的反應物用于轉化大腸桿菌XLlOSOLOPACK?Gold感受態(tài)細胞(Stratagene，LaJolla,CA，USA)。通過限制性酶消化鑒定出了含有pAG43(GH61B多肽編碼序列)的大腸桿菌轉化體，并使用BIOROBOT?9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)制備質粒DNA。[0441]所述862bpPCR片段的DNA測序用AppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)使用染料終止子化學(Giesecke等，1992,JournalofVirologyMethods38:47-60)和引物步移策略進行。使用下述載體特異性引物進行測序:[0442]pAllo25Seq:[0443]5’-TGTCCCTTGTCGATGCG3’(SEQIDNO:81)[0444]pAllo23Seq:[0445]5，-CACATGACTTGGCTTCC3，(SEQIDNO:82)[0446]就品質審視了核苷酸序列數(shù)據(jù)，并將所有序列在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協(xié)助下相互比較。[0447]基于編碼的蛋白與桔橙嗜熱子囊菌GH61A蛋白(GeneSeqP登錄號AEC05922)的相似性構建了針對煙曲霉序列的基因模型。煙曲霉GH61B多肽編碼序列的核苷酸序列和推導的氨基酸序列分別示于SEQIDN0:7和SEQIDN0:8?；蚪M片段編碼250個氨基酸的多肽，由53和56bp的2個內(nèi)含子中斷。編碼序列和成熟編碼序列的％G+C含量分別為53.9%和57%ο使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997,ProteinEngineeringlO:1-6)，預測了21個殘基的信號肽。預期的成熟蛋白含有221個氨基酸，具有23.39kDa的預期的分子量。[0448]實施例10:用于表達煙曲霉GH61B多肽的pSMai214的構建[0449]所述煙曲霉GH61B多肽編碼序列從質粒pAG43(實施例9)使用下示的基因特異性正向和反向引物擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION?,反應的插入位點同源的載體。[0450]正向引物:[0451]5’-GGACTGCGCACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3’(SEQIDNO:83)[0452]反向引物:[0453]5，-GCCACGGAGCTTAATTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAG-3，(SEQIDNO:84)[0454]將五十皮摩爾的每種上述引物用于PCR反應，所述反應由IOng的pAG43DNA，IXPfxAmplificationBuffer,1.5μI的IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，2.5單位的PLATINUM?PfxDNAPolymerase,和IμI的50mMMgS04構成，最終體積為50μI。擴增使川EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS進行，其程序如下:1個循環(huán)，在98°C進行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行I分鐘。加熱塊然后在72°C維持15分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中大約0.9kb片段從凝膠切出并使用MINELUTE?GelExtractionKit依照生產(chǎn)商的實驗方案提取。[0455]將質粒pMJ09(W02005/047499)用NcoI和PacI消化，通過ImMEDTA二鈉鹽-50mMTris堿-50mM硼酸(TBE)緩沖液中的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠切出，并使用QIAQUICK?GelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示提取。[0456]將所述0.9kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUSION?PCRCloningKit(Clontech,PaloAlto，CA，USA)依照生產(chǎn)商的實驗方案插入經(jīng)凝膠純化、NcoI/PacI消化的pMJ09。所述IN-FUSION?,反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,IOOng的經(jīng)凝膠純化、NcoI/PacI消化的pMJ09,37ng的0.9kbPCR產(chǎn)物，2μl的500μg/mlBSA，和1μl的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為20μl。將所述反應在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后，將30μI的TE緩沖液添加至反應。將2.5μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化SOLOPACK.?GoldSupercompetentCells。轉化體通過測序篩選，并鑒定了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，并命名為pSMai214(圖5)。質粒pSMai214可用PmeI消化以生成大約5.4kb片段以供里氏木霉轉化。所述5.4kb片段含有由里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因啟動子，煙曲霉GH61B多肽編碼序列，里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因終止子，和構巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因構成的表達盒。[0457]實施例11:用于表達煙曲霉CEL3Ai3-葡糖苷酶和煙曲霉GH61B多肽的串聯(lián)構建體pDM287的構建[0458]煙曲霉GH61B多肽表達盒從質粒pSMai214使用下示的基因特異性正向和反向引物擴增。斜體區(qū)域代表與IN-FUSION?,反應的插入位點同源的載體。[0459]正向引物:[0460]5’-CGCGGTAGTGGCGCGGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3’(SEQIDNO:85)[0461]反向引物:[0462]5，-TTACCAATTGGCGCGCCACTACCGCGTTCGAGAAGA-3’(SEQIDNO:86)[0463]將五十皮摩爾的每種上述引物用于PCR反應，所述反應由25ng的pSMai214DNA，1XPHUS10N?High-FidelityHotStartDNAPolymeraseBuffer，1μl的10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，和1單位的PHUS10N?High-FidelityHotStartDNAPolymerase構成，最終體積為50μl擴增使用EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333印gradientS進行，其程序如下:1個循環(huán)，在98°C進行30秒；35個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進行10秒，60°C進行30秒，和72°C進行1分鐘30秒；和I個循環(huán)，在72°C進行10分鐘。PCR產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中大約2.33kb片段從凝膠切出并使用NUCLEOSPIN?ExtractIIKit(Macherey-Nagel,Inc.,Bethlehem,PA,USA)依照生廣商的實驗方案提取。[0464]將大約2.3kbPCR產(chǎn)物使用IN-FUS.1ON?.AdvantagePCRCloningKit依照生產(chǎn)商的實驗方案插入Asc1-消化的pEJG107(W02005/047499)。質粒pEJG107包含煙曲霉CEL3Ai3-葡糖苷酶編碼序列(SEQIDNO:5[DNA序列]和SEQIDNO:6[推導的氨基酸序列])。所述IN-FUSION?,反應由IXIN-FUSION?ReactionBuffer,125ng的Asc1-消化的pEJG107，90ng的2.33kbPCR產(chǎn)物，和IμI的IN-FUSION?Enzyme構成，反應體積為10μI。將反應在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘。在溫育期之后將40μI的TE添加至反應。將2μI等分試樣用于依照生產(chǎn)商的實驗方案轉化ONESHOT?T0P10感受態(tài)細胞。將大腸桿菌轉化反應物鋪板于2XYT加氨芐青霉素平板上。通過測序篩選轉化體，并鑒定出了一個含有不具有PCR錯誤的插入物的克隆，并命名為pDM287(圖6)。質粒PDM287可用PmeI消化以生成大約9.9kb片段以供里氏木霉轉化。所述9.9kb片段含有兩個表達盒，所述表達盒由下述構成:(I)里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因啟動子，煙曲霉CEL3A3-葡糖苷酶編碼序列，和里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因終止子；和(2)里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因啟動子，煙曲霉GH61B多肽編碼序列，和里氏木霉Cel7A纖維二糖水解酶I基因終止子。所述9.9kb片段亦含有構巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。[0465]實施例12:煙曲霉β-葡糖苷酶和GH61B多肽在ku70+煙曲霉cbhl和cbh2替代菌株里氏木霉981-0-8.5#10B+Ku70#19L3中的表達[0466]為了表達煙曲霉葡糖苷酶和煙曲霉GH61B多肽，將里氏木霉菌株981-0-8.5#10B+Ku70#19L3(描述于實施例8)的原生質體如實施例2中所述生成，并用2μg的PmeI直鏈化的pDM287轉化。為了轉化，將100μI的原生質體轉移至14ml聚丙烯管，并向其添加2μg的經(jīng)PmeI直鏈化、凝膠純化的pDM287。添加二百五十μI的PEG緩沖液，并通過將管通過倒置6次輕柔地混合。將管在34°C溫育30分鐘，之后添加了3ml的STC0將管的內(nèi)容物分開并鋪板于兩個不同的150_直徑COVE平板，并在28°C溫育11日。轉化體使用滅菌的IμI接種環(huán)挑取，并轉移至新鮮的75mm直徑C0VE2+10mM尿苷平板，并在28°C溫育6日。[0467]將轉化體各自在搖瓶中生長，即用使用10μI接種環(huán)收集的孢子接種125ml聚碳酸酯不帶擋板的搖瓶中的25ml的CM培養(yǎng)基。將瓶在28°C在200rpm振蕩下溫育5日。通過將整個培養(yǎng)物傾入50ml錐底管并在SORVALL?LegendRT+浮桶離心機(swing-bucketcentrifuge)(T`hermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)中以2500rpm將樣品離心15分鐘來收獲搖瓶。將十ml的每份上清轉移至15ml的錐底管。將五μI的上清與5μI含5%β_巰基乙醇(SigmaAldrich,St.Louis,MO,USA)的Laemelli樣品緩沖液(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)在0.2ml微離心管中合并，并在EPPENDORF?MASTERCYCLER?5333epgradientS中在95°C煮沸5分鐘。樣品通過使用CRITERION?8-16%Tris-HClGel(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)的SDS-PAGE根據(jù)生產(chǎn)商的指示使用10μI的PRECISIONPLUStmAIIBlueProteinStandards(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)進行分析。凝膠使用B10-SAFE?Coomassie(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)染色和脫色。基于煙曲霉β-葡糖苷酶和煙曲霉GH61B多肽的高表達選擇了一個菌株(里氏木霉JfyS-DM287-23)。將十ml的里氏木霉JfyS-DM287-23搖瓶培養(yǎng)液使用滅菌的30ml注射器和MILLEX?GP0.22μm注射器式濾器(Millipore，Bedford,MA,USA)滅菌，轉移至新的15ml錐形管，并儲藏于-20°C。蛋白濃度使用MicroplateBCA?ProteinAssayKit(ThermoFischerScientific,Waltham,MA,USA)確定,其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標樣。[0468]實施例13:經(jīng)預處理的玉米秸桿水解測定[0469]將玉米稻桿在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(美國能源部國家可再生能源實驗室)(NREL)使用1.4wt%硫酸在165°C和107psi預處理8分鐘。預處理的玉米秸桿(PCS)中的不溶于水的固形物含有56.5%纖維素，4.6%半纖維素和28.4%木質素。通過兩階段硫酸水解，接著通過使用NREL標準分析程序(StandardAnalyticalProcedure)#002的高效液相色譜分析糖來測定纖維素和半纖維素。木質素在用硫酸水解纖維素和半纖維素級分之后使用NREL標準分析程序#003以重量分析法確定。[0470]經(jīng)磨制、未經(jīng)洗滌的PCS(干重量32.35%)通過在CosmosICMG40濕式多用途研磨機(EssE_Corporation,TamilNadu,India)中磨制全衆(zhòng)料PCS來制備。[0471]PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen,UnionCity,CA,USA)在1.0ml的總反應體積中進行。水解用50mg的不溶性PCS固體每ml的含有ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉pH5.0緩沖液和多種蛋白加載量的多種酶組合物(表示為mg蛋白每克纖維素)進行。制備酶組合物，然后以50μI至200μI范圍的體積同時添加至所有孔，至每個反應中Iml的終體積。然后使用ALPS-300?平板熱密封器(Abgene,Epsom,UnitedKingdom)密封平板,充分混合，并在特定溫度溫育72小時。所有報道的反應重復三次進行。[0472]在水解之后，使用0.45μmMULTISCREEN?96孔過濾板(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾樣品，然后如后文所述分析濾過物的糖含量。當不立即使用時，將過濾的等分試樣冷凍于_20°C。如下測量稀釋于0.005MH2SO4的樣品的糖濃度:使用4.6x250mmAMINEX?HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)通過在65°C用0.05%w/w苯甲酸-0.005MH2SO4以0.6ml每分鐘的流速洗脫，并通過從由純糖樣品校正的折光率檢測(CHEMSTATION?，AGILENT?1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)對所得的葡萄糖、纖維二糖和木糖信號的積分來進行定量。使用所得的葡萄糖和纖維二糖當量對于每個反應計算纖維素轉化的百分比。[0473]分別測量葡萄糖、纖維二糖和木糖。根據(jù)合適的稀釋因子調整測得的糖濃度。在未洗滌的PCS的情況下，酶法產(chǎn)生的糖的凈濃度通過就在零時點未洗滌的PCS中相應的背景糖濃度調整測得的糖濃度來確定。所有HPLC數(shù)據(jù)處理均使用MICROSOFTEXCEL?軟件(Microsoft,Richland,WA,USA)進行。[0474]使用下式計算纖維素轉化為葡萄糖的程度:％轉化=(葡萄糖濃度/限制消化中的葡萄糖濃度)x100。為了計算％轉化，基于纖維素酶對照(IOOmg的里氏木霉纖維素酶每克纖維素)設定100%轉化點，并將所有值除以該數(shù)值并接著乘以100。將三次重復數(shù)據(jù)點取平均值，并計算標準偏差。[0475]實施例14:米曲霉β-葡糖苷酶的制備[0476]米曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO:87[DNA序列]和SEQIDNO:88[推導的氨基酸序列])根據(jù)W002/095014使用米曲霉作為宿主重組制備。[0477]將米曲霉葡糖苷酶的過濾的培養(yǎng)液使用配置有IOkDa聚醚砜膜(PaliFiltron,Northborough,MA,USA)的切線流濃縮器(PallFiltron,Northborough,MA,USA)濃縮用20mMTris-HClpH8.0緩沖液交換。將經(jīng)緩沖液交換的樣品加載于用20mMTris-HClρΗ8.0平衡的"MonoQ?柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上，并將結合的蛋白用O至1000mM氯化鈉的線性梯度洗脫。將蛋白級分匯集并使用IOkDaMW-COAmiconUltra離心濃縮器(Millipore,Bedford,MA,USA)濃縮入20mMTris-HClpH8.0。蛋白濃度使用BCA?ProteinAssayKit確定，以牛血清白蛋白作為蛋白標樣。[0478]實施例15:煙曲霉酶組合物的制備[0479]煙曲霉Cel7A纖維二糖水解酶I的制備。煙曲霉Cel7A纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:1[DNA序列]和SEQIDNO:2[推導的氨基酸序列])如W02011/057140中所述在米曲霉中重組制備。煙曲霉Cel7A纖維二糖水解酶I根據(jù)W02011/057140純化。[0480]煙曲霉纖維二糖水解酶II的制備。煙曲霉GH6A纖維二糖水解酶II(SEQIDN0:3[DNA序列]和SEQIDNO:4[推導的氨基酸序列])如W02011/057140中所述在米曲霉中重組制備。將煙曲霉GH6A纖維二糖水解酶II的經(jīng)過濾的培養(yǎng)液使用400mlSEPHADEX?G-25柱(GEHealthcare,UnitedKingdom)根據(jù)生產(chǎn)商的指不緩沖液交換入20mMTrispH8.0。將級分收集、匯集，并調整至1.2M硫酸銨_20mMTrispH8.0。將經(jīng)平衡的蛋白加載于平衡于含1.2M硫酸銨的20mMTrispH8.0中的PHENYLSEPHAR0SE?6FastFlow柱(高端(highsub))(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)之上，且結合的蛋白用不含硫酸銨的20mMTrispH8.0洗脫。將級分匯集。[0481]煙曲霉菌株GH5內(nèi)切葡聚糖酶II的制備。煙曲霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶II(SEQIDNO:11[DNA序列]和SEQIDNO:12[推導的氨基酸序列])如W02011/057140中所述在米曲霉中重組制備。煙曲霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶II根據(jù)W02011/057140純化。[0482]具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61B多肽的制備。具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61B多肽(SEQIDNO:7[DNA序列]和SEQIDNO:8[推導的氨基酸序列])如W02011/057140中所述在米曲霉中重組制備。具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61B多肽根據(jù)W02011/057140純化。[0483]煙曲霉GHlO木聚糖酶的制備。煙曲霉GHlO木聚糖酶(xyn3)(SEQIDNO:17[DNA序列]和SEQIDNO:18[推導的氨基酸序列])根據(jù)W02006/078256使用米曲霉BECh2(W02000/39322)作為宿主重組制備。將煙曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的經(jīng)過濾的培養(yǎng)液使用HIPREP?26/10DesaltingColumn根據(jù)生產(chǎn)商的指示脫鹽和緩沖液交換入50mM乙酸鈉ρΗ5.0。[0484]煙曲霉Cel3AP-葡糖苷酶的制備。煙曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQIDNO:5[DNA序列]和SEQIDΝ0:6[推導的氨基酸序列])根據(jù)W02005/047499使用米曲霉作為宿主重組制備。將煙曲霉Cel3Ai3-葡糖苷酶的經(jīng)過濾的培養(yǎng)液使用配置有IOkDa聚醚砜膜的切線流濃縮器濃縮并用20mMTris-HClpH8.5緩沖液交換。將樣品加載于平衡于20mMTrispH8.5中的QSEPHAROSE⑧HighPerformance柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上，且結合的蛋白用O至600mM氯化鈉的線性梯度洗脫。將級分濃縮并加載于用20mMTris-150mM氯化鈉pH8.5平衡的SIJPERDEX?75HR26/60柱上。或者，將經(jīng)過濾的培養(yǎng)液用20%乙酸鈉調整至pH8.0，這使得溶液渾濁。為了去除渾濁，將溶液在20，OOOxg離心20分鐘，并將上清經(jīng)過0.2μm過濾單元(Nalgene,Rochester,NY,USA)過濾。將濾過物用去離子水稀釋以達到與50mMTris/HCl，pH8.0相同的電導率。將經(jīng)調整的酶溶液施于在50mMTris-HCl,ρΗ8.0中平衡的QSEPHAROSE?FastFlow柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)，并用0至500mM氯化鈉的線性梯度洗脫。將級分匯集，并用1%(w/v)活性炭處理以從β-葡糖苷酶匯集物去除顏色。所述炭通過將懸液經(jīng)過0.2μm過濾單元(Nalgene，Rochester,NY,USA)過濾來去除。將濾過物用20%乙酸調整至pH5.0，并用去離子水稀釋10倍。將經(jīng)調整的濾過物施于在IOmM琥珀酸pH5.0中平衡的SPSEPHAROSE?FastFlow柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA),并用0至500mM氯化鈉的線性梯度洗脫。級分通過SDS-PAGE分析。將其中在考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上僅發(fā)現(xiàn)一個條帶的級分匯集作為純化產(chǎn)物，并用于進一步實驗。[0485]煙曲霉菌株GH3P-木糖苷酶的制備。煙曲霉菌株GH3P-木糖苷酶(SEQIDNO:19[DNA序列]和SEQIDNO:20[推導的氨基酸序列])如W02011/057140中所述在米曲霉中重組制備。煙曲霉菌株GH3β-木糖苷酶根據(jù)W02011/057140純化。[0486]對于上述的每個單組分的蛋白濃度使用MicroplateBCA?ProteinAssayKit確定，其中將牛血清白蛋白用作蛋白標樣。煙曲霉酶組合物由如上所述制備的每個單組分如下所述構成:37%煙曲霉Cel7A纖維二糖水解酶I，25%煙曲霉Cel6A纖維二糖水解酶II，10%煙曲霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II，15%具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61B多肽，5%煙曲霉GHlO木聚糖酶(xyn3)，5%煙曲霉β-葡糖苷酶，和3%煙曲霉β-木糖苷酶。所述煙曲霉酶組合物在本文中命名為“煙曲霉酶組合物(單組分混合物)”。[0487]實施例16:煙曲霉野生型組合物的表達[0488]將煙曲霉菌株ΝΝ051616(ΕΧΤ2007-00107)接種在PDA平板上，并在45°C避光溫育4日。將數(shù)個菌絲體-PDA栓接種入含有100mL的NNCYP07-PCS培養(yǎng)基的500ml搖瓶中。將瓶在45°C在160rpm振蕩下溫育5日。將培養(yǎng)液使用0.45μmDURAPORE?Membrane(Millipore,Bedford,MA,USA)過濾。[0489]將3ml體積的濾過物使用ECONO-PAC?10-DG脫鹽柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示脫鹽和緩沖液交換入50mM乙酸鈉PH5.0。蛋白濃度通過SDS-PAGE光密度分析法使用CRITERION?8-16%Tris-HClGel,用GELC0DE?BlueStainReagent(Pierce,Rockford,IL,USA)染色，和通過ImageJ(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Maryland,USA)進行軟件分析來確定。[0490]所述煙曲霉酶組合物在本文中命名為“煙曲霉野生型酶組合物”。[0491]實施例17:將表達煙曲霉酶的里氏木霉菌株的酶組合物與基于里氏木霉的纖維素酶組合物和煙曲霉酶組合物比較的PCS水解測定[0492]將表達煙曲霉纖維二糖水解酶I，煙曲霉纖維二糖水解酶II，煙曲霉葡糖苷酶，和煙曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶組合物相對于基于里氏木霉的纖維素酶組合物(CELLUCLAST?1.5LFG；NovozymesA/S,BagSVcErd,Denmark，用5%米曲霉β-葡糖苷酶替代)，和煙曲霉酶組合物(單組分混合物)(實施例15)使用經(jīng)磨制、未經(jīng)洗滌的PCS在50°C進行評估。將結果與針對基于里氏木霉的纖維素酶組合物和煙曲霉酶組合物(單組分混合物)相比較。所有的組合物在2.0，4.0，和6.0mg蛋白g纖維素下使用。[0493]測定如實施例13中所述進行。用5%經(jīng)磨制、未經(jīng)洗滌的PCS的Iml反應在含有ImM硫酸錳的50mM檸檬酸鈉pH5.0緩沖液中進行72小時。所有反應進行一式三次，并設計在水解開始時的單次混合。[0494]圖7中所示的結果表明表達煙曲霉纖維二糖水解酶I，煙曲霉纖維二糖水解酶II，煙曲霉葡糖苷酶，和煙曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶組合物和煙曲霉酶組合物(單組分混合物)與基于里氏木霉的纖維素酶組合物相比，在所有三種加載情況下均產(chǎn)生顯著較高的水解。此外，表達煙曲霉纖維二糖水解酶I，煙曲霉纖維二糖水解酶II，煙曲霉β-葡糖苷酶，和煙曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶組合物與煙曲霉酶組合物(單組分混合物)相比產(chǎn)生更高的水解。[0495]實施例18:將煙曲霉野生型酶組合物與基于里氏木霉的纖維素酶組合物相比較的PCS水解測定[0496]將煙曲霉野生型酶組合物(實施例16)與基于里氏木霉的纖維素酶組合物(CELLUCLAST?1.5LFG；NovozymesA/S,BagSV3ei'd,Denmark,用5%米曲霉β-葡糖苷酶替代)在50°C使用經(jīng)磨制、未經(jīng)洗滌的PCS進行比較。此外，將煙曲霉野生型酶組合物用5%煙曲霉葡糖苷酶替代。所述煙曲霉野生型酶組合物和基于里氏木霉的纖維素酶組合物在2.0，4.0，和6.0mg蛋白每g纖維素下使用，且用5%煙曲霉β-葡糖苷酶替代的煙曲霉野生型酶組合物在2.0和4.0mg蛋白每g纖維素下使用。[0497]測定如實施例13中所述進行。用5%經(jīng)磨制、未經(jīng)洗滌的PCS的Iml反應在含有ImM硫酸錳的50mM檸檬酸鈉pH5.0緩沖液中進行72小時。所有反應進行一式三次，并設計在水解開始時的單次混合。[0498]圖8中所示的結果表明基于里氏木霉的纖維素酶組合物與煙曲霉野生型酶組合物和用5%煙曲霉β_葡糖苷酶替代的煙曲霉`野生型酶組合物相比，具有顯著更高的水解。用煙曲霉β-葡糖苷酶對煙曲霉野生型組合物的替代顯著增加纖維素水解至高于煙曲霉野生型組合物本身，但兩種混合物與基于里氏木霉的纖維素酶組合物相比，均產(chǎn)生顯著較少的水解。[0499]本發(fā)明進一步通過下述編號段落描述。[0500][I]一種重組木霉屬宿主細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼⑴煙曲霉纖維二糖水解酶I;(ii)煙曲霉纖維二糖水解酶II煙曲霉β_葡糖苷酶；和(iv)具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽；或其同源物。[0501][2]段I的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉纖維二糖水解酶I或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0502][3]段I或2的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉纖維二糖水解酶II或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為SEQIDNO:4的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:4的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0503][4]段1-3任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉葡糖苷酶或其同源物選自下組:α)β-葡糖苷酶，其包含或組成為SEQIDΝ0:6的成熟多肽；(?)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:6的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDΝ0:5的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0504][5]段1-4任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中所述具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽或其同源物選自下組:(i)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為SEQIDNO:8的成熟多肽；(ii)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:8的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%序列同一性；(iii)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0505][6]段1-5任一項的重組木霉屬宿主細胞,其進一步包含一種或多種多核苷酸,所述多核苷酸編碼一種或多種選自下組的酶:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I;(ii)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II;(iii)煙曲霉木聚糖酶；(iv)煙曲霉木糖苷酶；和(V)煙曲霉膨脹素。[0506][7]段的重組木霉屬宿主細胞6，其中所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I或其同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為SEQIDNO:10的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:10的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:9的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0507][8]段6或7的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II或其同源物選自下組:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為SEQIDN0:12的成熟多肽；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:12的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDN0:11的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0508][9]段6-8任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)煙曲霉木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:14,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:18的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:14,SEQIDN0:16，或SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:13,SEQIDNO:15,或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；或其全長互補鏈雜交。[0509][10]段6-9任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉β-木糖苷酶或其同源物選自下組:(i)β-木糖苷酶，其包含或組成為SEQIDΝ0:20的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:20的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDΝ0:19的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0510][11]段6-10任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉膨脹素或其同源物選自下組:(i)膨脹素，其包含或組成為SEQIDNO:22的成熟多肽；(ii)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:22的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0511][12]段1-11任一項的重組木霉屬宿主細胞，其選自下組:哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)和綠色木霉(Trichodermaviride)。[0512][13]段1-11任一項的重組木霉屬宿主細胞，其為里氏木霉。[0513][14]段1-13任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中對于所述木霉屬宿主為內(nèi)源的一種或多種纖維素酶基因，一種或多種半纖維素酶基因，或其組合已失活。[0514][15]段14的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬纖維二糖水解酶I基因或其同源物已失活。[0515][16]段15的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬纖維二糖水解酶I基因編碼SEQIDN0:24的成熟多肽或其同源物。[0516][17]段16的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬纖維二糖水解酶I基因同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:24的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0517][18]段14-17任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬纖維二糖水解酶II基因或其同源物已失活。[0518][19]段18的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬纖維二糖水解酶II基因編碼SEQIDN0:26的成熟多肽或其同源物。[0519][20]段19的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬纖維二糖水解酶II基因同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:26的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0520][21]段14-20任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬β-葡糖苷酶基因或其同源物已失活。[0521][22]段21的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬β-葡糖苷酶基因編碼SEQIDNO:28的成熟多肽或其同源物。[0522][23]段22的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬葡糖苷酶基因同源物選自下組:(i)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:28的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDΝΟ:27的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0523][24]段14-23任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因或其同源物已失活。[0524][25]段24的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因編碼的成熟多肽SEQIDΝ0:30或其同源物。[0525][26]段25的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:30的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:29的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:29的成熟多肽編碼序列或其`全長互補鏈雜交。[0526][27]段14-26任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因或其同源物已失活。[0527][28]段27的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因編碼SEQIDN0:32的成熟多肽或其同源物。[0528][29]段28的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因同源物選自下組:(i)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:32的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:31的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:31的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0529][30]段14-29任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬木聚糖酶I基因或其同源物已失活。[0530][31]段30的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶I基因編碼SEQIDNO:34的成熟多肽或其同源物。[0531][32]段31的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶I基因同源物選自下組:(i)木聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:34的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)木聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:33的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)木聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:33的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0532][33]段14-32任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬木聚糖酶II基因或其同源物已失活。[0533][34]段33的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶II基因編碼SEQIDNO:36的成熟多肽或其同源物。[0534][35]段34的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶II基因同源物選自下組:(i)木聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:36的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)木聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:35的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)木聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:35的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0535][36]段14-35任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬木聚糖酶III基因或其同源物已失活。[0536][37]段36的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶III基因編碼SEQIDNO:38的成熟多肽或其同源物。[0537][38]段37的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木聚糖酶III基因同源物選自下組:(i)木聚糖酶III，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:38的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)木聚糖酶III，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:37的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)木聚糖酶III，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:37的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0538][39]段14-38任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬β_木糖苷酶基因或其同源物已失活。[0539][40]段39的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬β-木糖苷酶基因編碼SEQIDNO:40的成熟多肽或其同源物。[0540][41]段40的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬木糖苷酶基因同源物選自下組:α)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:40的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDΝ0:39的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:39的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0541][42]段14-41任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬膨脹素基因或其同源物已失活。[0542][43]段42的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬膨脹素基因編碼SEQIDNO:42的成熟多肽或其同源物。[0543][44]段43的重組木霉屬宿主細胞，其中所述木霉屬膨脹素基因同源物選自下組:(i)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:42的成熟多肽具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(ii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:41的成熟多肽編碼序列具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件，例如至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:41的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。[0544][45]一種產(chǎn)生酶組合物的方法，其包括:在有助于所述酶組合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段1-44任一項的宿主細胞。[0545][46]段45的方法，進一步包括回收所述酶組合物。[0546][47]一種酶組合物，其包含段1-44任一項的重組木霉屬宿主細胞的回收的發(fā)酵液。[0547][48]段47的酶組合物，其具有移出的發(fā)酵液的一個或多個成分。[0548][49]段47的酶組合物，其不具有移出的發(fā)酵液的任何成分。[0549][50]一種降解纖維素材料的工藝，其包括用段47-49任一項所述酶組合物處理所述纖維素材料。[0550][51]段50的工藝，其中所述纖維素材料經(jīng)預處理。[0551][52]段50或51的工藝，進一步包括回收降解的纖維素材料。[0552][53]段52的工藝，其中所述降解的纖維素材料是糖。[0553][54]段53的工藝，其中所述糖`選自下組:葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和阿拉伯糖。[0554][55]一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括:(a)用段46_48任一項的酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0555][56]段55的工藝，其中所述纖維素材料經(jīng)預處理。[0556][57]段55或56的工藝，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時進行。[0557][58]段55-57任一項的工藝，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、烷烴、環(huán)烷烴、烯烴、氨基酸、氣體、異戊二烯、酮、有機酸或聚酮化合物。[0558][59]一種發(fā)酵纖維素材料的方法,其包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料事用段47-49任一項的酶組合物糖化的。[0559][60]段59的工藝,其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[0560][61]段60的工藝,進一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0561][62]段60或61的工藝，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、烷烴、環(huán)烷烴、烯烴、氨基酸、氣體、異戊二烯、酮、有機酸或聚酮化合物。[0562][63]段59-62任一項的工藝，其中所述纖維素材料在糖化之前經(jīng)預處理。[0563][64]段47-49的酶組合物，進一步包含木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I，木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II,或木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I和木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II。[0564][65]段64的酶組合物，其中所述木霉屬木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I。[0565][66]段64的酶組合物，其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II。[0566]本文描述和要求保護的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因為這些方面旨在作為本發(fā)明幾個方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準?！緳嗬蟆?.一種重組木霉屬宿主細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼α)煙曲霉纖維二糖水解酶煙曲霉纖維二糖水解酶II煙曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纖維素分解增強活性的煙曲霉GH61多肽；或其同源物。2.權利要求1的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉纖維二糖水解酶I或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽；(?)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；其中所述煙曲霉纖維二糖水解酶II或其同源物選自下組:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為SEQIDNO:4的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下，與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；其中所述煙曲霉葡糖苷酶或其同源物選自下組:(i)β-葡糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝΟ:6的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少.93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少.97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和其中所述煙曲霉具有纖維素分解增強活性的GH61多肽或其同源物選自下組:(i)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為SEQIDNO:8的成熟多肽；(?)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%序列同一性；(iii)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少.95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜父。3.權利要求1或2的重組木霉屬宿主細胞，其進一步包含一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸編碼一種或多種選自下組的酶:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I;(ii)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II煙曲霉木聚糖酶；(iv)煙曲霉木糖苷酶；和(V)煙曲霉膨脹素。4.權利要求3的重組木霉屬宿主細胞，其中所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶I或其同源物選自下組:⑴內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為SEQIDNO:10的成熟多肽；(?)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:10的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少.97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；其中所述煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II或其同源物選自下組:(i)煙曲霉內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為SEQIDNO:12的成熟多肽；(?)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少.84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少.92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少.80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少.88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少.96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；其中所述煙曲霉木聚糖酶或其同源物選自下組:(i)煙曲霉木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:14,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:18的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:14,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少.98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，其包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少.75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少.87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少.95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；或其全長互補鏈雜交；其中所述煙曲霉木糖苷酶或其同源物選自下組:(i)β-木糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:20的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:20的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少.93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交；和其中所述煙曲霉膨脹素或其同源物選自下組:(i)膨脹素，其包含或組成為SEQIDNO:22的成熟多肽；(?)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:22的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。5.權利要求1-4任一項的重組木霉屬宿主細胞，其選自下組:哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)和綠色木霉(Trichodermaviride)。`6.權利要求1-4任一項的重組木霉屬宿主細胞，其為里氏木霉。7.權利要求1-6任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中對于所述木霉屬宿主為內(nèi)源的一種或多種纖維素酶基因、一種或多種半纖維素酶基因，或其組合已失活。8.權利要求7的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬纖維二糖水解酶I基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬纖維二糖水解酶I基因或同源物編碼選自下組的纖維二糖水解酶I:(i)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為SEQIDNO:24的成熟多肽；(ii)纖維二糖水解酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:24的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。9.權利要求7或8的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬纖維二糖水解酶II基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬纖維二糖水解酶I基因或同源物編碼選自下組的纖維二糖水解酶II:(i)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為SEQIDNO:26的成熟多肽；(?)纖維二糖水解酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:26的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)纖維二糖水解酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。10.權利要求7-9任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬β-葡糖苷酶基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬葡糖苷酶基因或同源物編碼選自下組的葡糖苷酶:(i)β-葡糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:28的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝΟ:28的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少9`6%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。11.權利要求7-10任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶I基因或同源物編碼選自下組的內(nèi)切葡聚糖酶1:(i)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為SEQIDN0:30的成熟多肽；(?)內(nèi)切葡聚糖酶I，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:30的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少`92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(iii)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:29的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少，80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少，88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少，96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶I，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:29的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。12.權利要求7-11任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬內(nèi)切葡聚糖酶II基因或同源物編碼選自下組的內(nèi)切葡聚糖酶II:⑴內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為SEQIDNO:32的成熟多肽；(?)內(nèi)切葡聚糖酶II，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:32的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一I"生；(ii)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:31的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少，80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少，88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少，96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)內(nèi)切葡聚糖酶II，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:31的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。13.權利要求7-12任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬木聚糖酶基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬木聚糖酶基因或同源物編碼選自下組的木聚糖酶1:(i)木聚糖酶，其包含或組成為SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，或SEQIDNO:38的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，或SEQIDNO:38的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少，98%，或至少99%序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，其包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:33,SEQIDNO:35，或SEQIDNO:37的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少，75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少，87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少，95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:33,SEQIDNO:35，或SEQIDNO:37的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。14.權利要求7-13任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬β-木糖苷酶基因或其同源物已失活。其中所述木霉屬木糖苷酶基因或同源物編碼選自下組的木糖苷酶:(?)β-木糖苷酶，其包含或組成為SEQIDNO:40的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDΝ0:40的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDΝΟ:39的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:39的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。15.權利要求7-14任一項的重組木霉屬宿主細胞，其中木霉屬膨脹素基因或其同源物已失活；其中所述木霉屬膨脹素基因編碼選自下組的膨脹素:(i)膨脹素，其包含或組成為SEQIDNO:42的成熟多肽；(?)膨脹素，其包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:42的成熟多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；(iii)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:41的成熟多肽編碼序列具有至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性；和(iv)膨脹素，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴格條件或至少非常高嚴格條件下與SEQIDNO:41的成熟多肽編碼序列或其全長互補鏈雜交。16.一種產(chǎn)生酶組合物的方法，其包括:在有助于所述酶組合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權利要求1-15任一項的宿主細胞。17.權利要求16的方法，進一步包括回收所述酶組合物。18.—種酶組合物，其包含權利要求1-15任一項的重組木霉屬宿主細胞的回收的發(fā)酵液。19.一種降解纖維素材料的方法，其包括用權利要求18的酶組合物處理所述纖維素材料。20.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用權利要求18的酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。21.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料是用權`利要求18的酶組合物糖化的?！疚臋n編號】C12P19/02GK103890169SQ201280052444【公開日】2014年6月25日申請日期:2012年8月23日優(yōu)先權日:2011年8月24日【發(fā)明者】J.沙斯基,B.麥克布雷爾申請人:諾維信股份有限公司