用于提高桿狀細(xì)菌的生存力的手段和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白胨用于控制培養(yǎng)物中的細(xì)胞的體積和/或長(zhǎng)度與直徑比例的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】用于提高桿狀細(xì)菌的生存力的手段和方法
[0001]本發(fā)明涉及蛋白胨用于控制培養(yǎng)物中的細(xì)胞的體積和/或長(zhǎng)度與直徑比例的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
[0002]在這個(gè)說(shuō)明書中，引用了多份文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和制造商的手冊(cè)。盡管不認(rèn)為其與本發(fā)明的專利性相關(guān)，這些文獻(xiàn)的公開(kāi)通過(guò)引用整體并入本文。更具體地，所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入的程度與具體且單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)文獻(xiàn)通過(guò)引用并入相同。
[0003]乳酸菌(LAB)是在工業(yè)上重要的微生物，并且長(zhǎng)久以來(lái)，已用作起子培養(yǎng)物，用于制造乳產(chǎn)品，如例如，干酪、酸奶或酸乳酒。在過(guò)去十年中，越來(lái)越多的LAB作為益生菌補(bǔ)充物應(yīng)用于功能食品和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物中。在所使用的LAB中，乳桿菌屬{Lactobacillus')(Zi)特別重要。對(duì)于起子培養(yǎng)物和益生菌，制造商的主要挑戰(zhàn)是保持生物體的活力和生存力。益生菌的高生存力特別令人感興趣，這是由于在益生菌食品或藥品的貨架期結(jié)束時(shí)的活微生物的聲明量是主要的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到廣泛接受的FA0/WH0對(duì)于益生菌的定義(Guidelines for the evaluation of probiotics in food.Joint FAO/WHO WorkingGroup.Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in FoodLondon, Ontario, Canada (2002)),即益生菌是“在以足夠量施用時(shí)賦予宿主健康益處的活微生物”，制造商嘗試生產(chǎn)培養(yǎng)物，其盡可能強(qiáng)地耐受在不同加工步驟、貯存和在食用后通過(guò)胃腸道的 期間的條件。
[0004]術(shù)語(yǔ)多形性(Pleomorphism)來(lái)自希臘語(yǔ)=更多，morphe =嚴(yán)彩,并且在細(xì)菌學(xué)中是指細(xì)胞的生長(zhǎng)形式?？啥x為細(xì)菌細(xì)胞的大小和/或形狀的變化。
[0005]這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)中的微生物致病性領(lǐng)域中得到很好的研究，參見(jiàn)Justice 等人，(2008) (Morphological plasticity as a bacterial survival strategy;Nat Rev Microbiol, 6，162-168)。例如，已知絲狀形成有利于上皮細(xì)胞的瞬時(shí)進(jìn)入和退出，并且因此增強(qiáng)很多致病細(xì)菌的傳染性，如在致腎盂腎炎的大腸桿菌中(Escherichiacoli);參見(jiàn) Mulvey 等人,(1998) (Induction and evasion of host defenses by type1-piliated uropathogenic Escherichia col1.Science, 282， 1494-1497);和Justice等人，(^2004) (Differentiation and developmental pathways of uropathogenicEscherichia coli in urinary tract pathogenesis; Proc Natl Acad Sci USA, 101，1333-1338)。進(jìn)一步地，很好地研究了在多形性真菌(Rooney和Klein (2002) ; Linkingfungal morphogenesis with virulence; Cell Microbiol, 4， 127-137)和細(xì)菌(Chauhan 等人，(2006) ; Mycobacterium tuberculosis cells growing in macrophagesare filamentous and deficient in FtsZ rings.J Bacteriolj 188，1856-1865)中對(duì)吞噬作用的抗性。
[0006]Jeener 和 Jeener (1952) (Cytochemical observations on Thermobacteriumacidophilus R26 after inhibition of growth by desoxyribonucIeosides or uracil;Arch Int Physiol, 60，194-195)對(duì)嗜酸乳桿菌 i^actobacillus (Lb.) acidophilus)R-26的研究揭示，培養(yǎng)基中低于0.25 μ g/ml的DNA濃度除生長(zhǎng)抑制作用外，還導(dǎo)致細(xì)胞的延長(zhǎng)。這些形態(tài)學(xué)變化在向培養(yǎng)基添加DNA或尿嘧啶后3小時(shí)內(nèi)逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步地，因?yàn)樗鼘?duì)脫氧核糖核苷的獨(dú)特需要，嗜酸乳桿菌R-26被Siedler等人(1957) (Studieson improvements in the medium for Lactobacillus acidophilus in the assay fordeoxyribonucleic acid; J Bacteriol, 73, 670-675)用作對(duì)脫氧核糖核苷的測(cè)定生物。Reich和Soska (1973) (Thymineless death in Lactobacillus acidophilus R-26.11.Factors determining the rate of the reproductive inactivation; Folia Microbiol(Praha), 18，361-367)描述了由于培養(yǎng)基中缺少胸腺嘧啶和脫氧核糖核苷導(dǎo)致的嗜酸乳桿菌R-26的細(xì)胞死亡。對(duì)于這兩種作用，都由生殖活性的損失而導(dǎo)致。同樣對(duì)于嗜酸乳桿菌 R-26, Soska (1966) (Growth of Lactobacillus acidophilus in the absence offolic acid; J Bacteriol, 91，1840-1847)證明在將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到缺少胸腺嘧啶或脫氧核糖核苷的培養(yǎng)基后，DNA合成的終止。雖然，細(xì)胞在長(zhǎng)度上生長(zhǎng)并且細(xì)胞數(shù)量?jī)H增加2至4倍。此外，Soska (1996)發(fā)現(xiàn)磷酸鹽濃度降低至四十分之一導(dǎo)致僅有三分之一至一半大小的細(xì)胞。Beck 等人(1963) (Purification, kinetics, and repression control ofbacterial trans-N-deoxyribosylase; J Biol Chem, 238, 702-709)證實(shí)了對(duì)于乳桿菌菌株:萊士曼氏乳酸桿菌{Lb.、乳酸乳桿菌(JJ).Jacii1S)、嗜酸乳桿菌{Lb.acidophilus)和德氏乳桿菌Hb.,對(duì)至少一種外源脫氧核糖核苷的生長(zhǎng)依
賴性。有限的營(yíng)養(yǎng)條件與絲狀細(xì)胞的形成以及反式-N-脫氧核糖酶(EC 2.4.2.6)的活性增強(qiáng)相關(guān)，所述酶參與DNA合成并且在生長(zhǎng)需要外源脫氧核糖核苷的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。這種酶僅見(jiàn)于上述四種多形性菌株，相比之下，所研究的兩種其他生物，干酪乳桿菌{Lb.easel)和大腸桿菌15T {Escherichia co/i15T)沒(méi)有形成絲狀變體。對(duì)于嗜酸乳桿菌R-26,所述結(jié)果得到了 Sawula等人(1974)的確認(rèn)。
[0007]Deibel 等人(1956) (Filament formation by Lactobacillus leichmannii whendesoxyribosides replace vitamin B12 in the growth medium; J Bacteriol, 71,255-256)報(bào)告了生長(zhǎng)在維生素B12濃度為0.02 ng/ml且胸腺嘧啶濃度為0.5 mg/ml的培養(yǎng)基中的萊士曼氏乳酸桿菌313的細(xì)胞具有如絲狀的細(xì)胞形態(tài)。在0.5 ng/ml維生素B12濃度和5.0 mg/ml胸腺嘧啶濃度下，繁殖細(xì)胞形成正常的桿狀。作者論述兩種成分很可能在細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用。對(duì)于德氏乳桿菌Ab.7,類似的結(jié)果見(jiàn)于Kusaka和Kitahara (1962)(Effect of several vitamins on the cell division and the growth of Lactobacillusdelbrueckii ; J Vitaminol (Kyoto), 8, 115-120)。他們觀察到在 0.3 ng/ml 維生素 B12濃度下的細(xì)胞延長(zhǎng)，而細(xì)胞分裂需要高達(dá)I μ g/ml的濃度。這種差異被認(rèn)為是德氏乳桿菌的異常細(xì)胞延長(zhǎng)的原因。Dave 和 Shah (1998) (Ingredient supplementation effectson viability of probiotic bacteria in yogurt.J Dairy Sci, 81, 2804-2816)描述了關(guān)于L-半胱氨酸、乳清粉、乳清蛋白濃縮物、酸酪蛋白水解物和胰蛋白胨對(duì)酸奶中的益生菌生存力的影響的研究。
[0008]Webb (1949a) (The Influence of Magnesium on Cell Division: The Effectof Magnesium on the Growth and Cell Division of Various Bacterial Species inComplex Media; J Gen Microbiol, 3, 410-417)和 Webb (1949b) (The influence ofmagnesium on cell division; the effect of magnesium on the growth of bacteriain simple chemically defined media; J Gen Microbiol, 3, 418-424)石開(kāi)究了對(duì)于梭菌屬{Clostridium)和芽孢桿菌{Bacillus)的某些種，由鎂缺乏導(dǎo)致的多形性現(xiàn)象。在這些研究中，假定由鎂缺乏導(dǎo)致的細(xì)胞分裂抑制誘導(dǎo)正常的桿狀細(xì)菌的絲狀形成。Wright和 Klaenhammer (1981) (Calcium-1nduced Alteration of Cellular MorphologyAffecting the Resistance of Lactobacillus acidophilus to Freezing; Appl EnvironMicrobiol, 41，807-815)證實(shí)了生長(zhǎng)培養(yǎng)基的鈣補(bǔ)充誘導(dǎo)嗜酸乳桿菌NCFM濃縮物在冷凍期間的穩(wěn)定性增強(qiáng)。作者觀察到補(bǔ)充鈣的MRS培養(yǎng)液(de Man et aL，(1960) ; A Mediumfor the Cultivation of Lactobacilli; J.AppI.Bact.23，130-135)導(dǎo)致培養(yǎng)物從絲狀至棒桿(baccilloid rods)的形態(tài)轉(zhuǎn)變，和相關(guān)的鈣誘導(dǎo)的形態(tài)變化至穩(wěn)定性增加。令人感興趣的是，相同的作者隨后證實(shí)(Wright and Klaenhammer (1983a) ; Survival ofLactobacillus bulgaricus During Freezing and Freeze-Drying After Growth in thePresence of Calcium.Journal of Food Science, 48，773-777)，在兩個(gè)菌株保加利亞乳桿菌(ZA bulgaricus) 1234-0和F的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加鈣也誘導(dǎo)了在冷凍和凍干期間的穩(wěn)定性增強(qiáng)，但在這些研究中鈣補(bǔ)充對(duì)細(xì)胞形態(tài)或生長(zhǎng)沒(méi)有影響。錳和鎂鹽沒(méi)有在這些研究中發(fā)揮保護(hù)作用。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，相同的作者研究了磷酸鹽濃度對(duì)兩個(gè)菌株保加利亞乳桿菌1234-F和1489的生長(zhǎng)、酸生產(chǎn)和細(xì)胞形態(tài)的影響(Wright and Klaenhammer(1984); Phosphated Milk Adversely Affects Growth, Cellular Morphology, andFermentative Ability of Lactobacillus bulgaricus; J.Dairy Sc1., 67，44-51)。除了抑制酸生產(chǎn)和生長(zhǎng)之外，在包含2-3%磷酸鹽的乳或商業(yè)噬菌體抑制培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，兩個(gè)菌株的細(xì)胞形態(tài)變化。與在無(wú)補(bǔ)充乳中生長(zhǎng)的正常短桿相比，這些培養(yǎng)基誘導(dǎo)至相連細(xì)胞的長(zhǎng)鏈的轉(zhuǎn)變。觀察到的不良生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)的改變與用于正確生長(zhǎng)和細(xì)胞組裝的二價(jià)陽(yáng)離子需求相關(guān)，并且與作者早先的結(jié)果一致(Wright and Klaenhammer (1983b);Influence of Calcium and Manganese on Dechaining of Lactobacillus bulgaricus;Appl Environ Microbiol, 46，785-792)，其中，預(yù)計(jì)鈣和猛是相應(yīng)酶的足夠的脫鏈接活性(dechaining activity)所必需的。Kojima (1970a) (A study on the pleomorphismof Lactobacillus bifidus; Kobe Daigaku Igakubu Kiyoj 32，126-147)和Kojima等人(1970b) (Necessity o f calcium ion for cell division in Lactobacillus bifidus;J Bacteriol, 104，1010-1013)觀察到類似的結(jié)果，他們強(qiáng)調(diào)鈣離子對(duì)于雙歧乳桿菌(M.bifidus)中細(xì)胞分裂的必需作用。作者通過(guò)電子顯微鏡對(duì)鈣誘導(dǎo)的隔膜形成成像。
[0009]Altermann 等人(2004) (Identification and phenotypic characterizationof the cell-division protein CdpA; Gene, 342，189-197)能夠敲除嗜酸乳桿菌 NCFM中編碼細(xì)胞分離蛋白cdpA的開(kāi)放讀碼框細(xì)胞分裂受到抑制的這些突變體產(chǎn)生長(zhǎng)的細(xì)胞鏈，其中單個(gè)細(xì)胞在體積方面比野生型細(xì)胞大約2至3倍。進(jìn)一步地，這些細(xì)胞對(duì)于NaCl-、滲透-和乙醇-脅迫的穩(wěn)定性低于野生型，但對(duì)于牛膽汁處理更穩(wěn)定。Rechinger等人(2004) (2000) (〃Early〃 protein synthesis of Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus in milk revealed by [35S] methionine labeling and two-dimensionalgel electrophoresis; Electrophoresis, 21，2660-2669)觀察德氏乳桿菌保加利亞亞種、Lb.delbrueckii spp.bulgaricus)在復(fù)合培養(yǎng)基，例如MRS，或復(fù)原脫脂乳中的細(xì)菌生長(zhǎng)具有正常的桿狀形狀，而使用化學(xué)限定的培養(yǎng)基則導(dǎo)致絲狀細(xì)胞，表明缺少存在于復(fù)合培養(yǎng)基中的至少一種因子。Suzuki 等人(1986) (Growth of Lactobacillus bulgaricusin Milk.1.Cell Elongation and the Role of Formic Acid in Boiled Milk; J.DairySc1.，69，311-320)證實(shí)了保加利亞乳桿菌沒(méi)紐生長(zhǎng)于在100°C煮沸15分鐘的乳中時(shí)的異常延長(zhǎng)。這個(gè)過(guò)程減少了乳中的營(yíng)養(yǎng)含量，這導(dǎo)致本體RNA合成的抑制，并因此導(dǎo)致缺陷性細(xì)胞分裂進(jìn)程。Rhee 和 Pack (1980) (Effect of environmental pH on chain lengthof lactobacillus bulgaricus; J Bacteriol, 144, 865-868)報(bào)道了保加利亞乳桿菌服在堿性pH值(7.5以上)的穩(wěn)態(tài)連續(xù)培養(yǎng)中的鏈生成。作者可將這種現(xiàn)象關(guān)聯(lián)到在升高PH值下一種或多種脫鏈接酶的合成抑制。
[0010]盡管現(xiàn)有技術(shù)在多個(gè)情況下描述了一方面某些試劑是否存在與另一方面多形形式的出現(xiàn)之間的關(guān)系，但，幾乎不知道如何以系統(tǒng)性方式控制細(xì)胞形態(tài)，以達(dá)到更好的生物技術(shù)產(chǎn)物，例如益生菌產(chǎn)品或發(fā)酵起子的目的。因此，在用于培養(yǎng)微生物的改進(jìn)手段和方法的前提下，可看出本發(fā)明的根本技術(shù)問(wèn)題。
[0011]通過(guò)內(nèi)附權(quán)利要求書的主題解決了這個(gè)技術(shù)問(wèn)題。
[0012]第一方面，本發(fā)明涉及蛋白胨用于控制培養(yǎng)物中的細(xì)胞的體積和/或長(zhǎng)度與直徑比例的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
[0013]術(shù)語(yǔ)“蛋白胨”在本領(lǐng)域中具有確定的含義。它是指肽和氨基酸的混合物，其可通過(guò)從作為起始材料的動(dòng)物或植物蛋白的降解獲得。產(chǎn)生出肽和氨基酸的降解可由化學(xué)水解，例如酸，和/或由酶促消化實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選使用胃蛋白酶。胃蛋白酶以多種同種型出現(xiàn)，胃蛋白酶A、胃蛋白酶B和胃蛋白酶C是主要的同種型。相應(yīng)的酶委員會(huì)(EC)編號(hào)是3.4.23.1、
3.4.23.2和3.4.23.3。如果沒(méi)有另外說(shuō)明，“胃蛋白酶”是指胃蛋白酶A。商購(gòu)可得的胃蛋白酶通常是得自于豬胃的胃蛋白酶A。或者，酶促消化可使用胰蛋白酶或其他一種或多種內(nèi)肽酶實(shí)現(xiàn)。蛋白胨是用于微生物，例如細(xì)菌或酵母的培養(yǎng)基的典型成分。優(yōu)選的蛋白胨如下所述。
[0014]術(shù)語(yǔ)“桿狀細(xì)菌”是本領(lǐng)域中確認(rèn)的，并且是指共有常見(jiàn)形態(tài)的細(xì)菌。此術(shù)語(yǔ)不與分類標(biāo)準(zhǔn)相混淆。芽孢桿菌屬是桿狀細(xì)菌的特征性代表。如下文中的進(jìn)一步詳述，桿可以用幾何術(shù)語(yǔ)描述如下:開(kāi)放的柱面，其在任一末端具有半球形，從而形成封閉的凸起隔室。有時(shí)使用術(shù)語(yǔ)“桿菌”表示任何桿狀細(xì)菌，在這種情況下，它不與分類芽孢桿菌相混淆。桿狀細(xì)菌不同于球形或橢圓形細(xì)菌。在圖3右手側(cè)，可見(jiàn)各種長(zhǎng)度的桿。較長(zhǎng)的桿有時(shí)也稱作絲狀形式，而短桿有時(shí)也稱作棒桿(bacilloid)形式。
[0015]穩(wěn)定的桿狀結(jié)構(gòu)起因于比細(xì)胞膜更堅(jiān)硬的細(xì)胞壁的存在。細(xì)胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成，其產(chǎn)生比細(xì)胞膜的脂雙層更堅(jiān)硬的結(jié)構(gòu)。在外側(cè)的細(xì)胞壁和內(nèi)側(cè)的細(xì)胞膜之間，有也被稱作壁膜間隙的腔。
[0016]桿狀細(xì)菌的太企可根據(jù)其體積定義。用于測(cè)定細(xì)胞體積的儀器由技術(shù)人員配置，并且在實(shí)施例中描述。術(shù)語(yǔ)“體積”和“細(xì)胞體積”互換使用。
[0017]考慮到上文給出的幾何術(shù)語(yǔ)定義的桿，顯然可使用單個(gè)參數(shù)限定給定桿的整體濕猶。這個(gè)術(shù)語(yǔ)是長(zhǎng)度與直徑的比例，縮寫為“L/D比例”。測(cè)定長(zhǎng)度與直徑的比例的手段描述在下文中。具體地，在第一步中，測(cè)定所討論的細(xì)胞的體積，并且在第二步中，由此計(jì)算L/D比例。
[0018] 在L/D比例的計(jì)算過(guò)程中，一個(gè)選擇是假設(shè)具體的細(xì)胞直徑。在乳桿菌的情況下，特別是在嗜酸乳桿菌的情況下，但不限于此，I μ m的數(shù)值是細(xì)胞直徑D的良好估計(jì)值。在桿狀細(xì)菌的情況下，理解直徑D是指桿的圓柱部分的直徑。此外，本發(fā)明人觀察到平均細(xì)胞體積依賴于所使用的培養(yǎng)基而變化。為了良好的近似，細(xì)胞體積的變化起因于桿長(zhǎng)度的變化而不是桿直徑的變化。平均細(xì)胞體積，作為桿的圓柱部分的半徑r和長(zhǎng)度h的函數(shù)，定義如下:V = n r2 h +4/3 n r3。如上所述,假設(shè)D是I μ m且半徑r = 0.5 μ m,因此,可以從細(xì)胞體積V確定h。由于桿的總長(zhǎng)度L = h + 2r (在桿的圓柱部分末端的兩個(gè)半球)，并且直徑D = 2r = Ιμπι，因此，可確定L/D比例并將其用作表征根據(jù)本發(fā)明的桿狀細(xì)菌的形態(tài)的參數(shù)。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，桿狀細(xì)菌進(jìn)一步限定為桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌。如上文所述，益生菌是活微生物，其在以足夠量施用時(shí)，賦予宿主健康益處。優(yōu)選的落入所述定義的分類在下文詳述。由益生菌的定義可見(jiàn)，重要的是，益生菌在遞送至宿主時(shí)以及當(dāng)達(dá)到它們的目的地時(shí)，是活的。
[0020]術(shù)語(yǔ)“桿狀發(fā)酵菌”是指能夠發(fā)酵的任何桿狀細(xì)菌。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”具有本領(lǐng)域中確認(rèn)的普通含義，并且 是指氧化有機(jī)化合物，從而提取能量，例如以ATP形式的能量的生化過(guò)程。在作為發(fā)酵過(guò)程的一部分的氧化過(guò)程中，使用內(nèi)源電子受體。后一方面使發(fā)酵區(qū)別于呼吸作用。優(yōu)選地，所述桿狀發(fā)酵菌是桿狀細(xì)菌，當(dāng)它們用在生物技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程中時(shí)。這樣的生物技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程包括飲料、用于人或動(dòng)物食用的食品、飲食補(bǔ)充劑、功能食品和藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)。優(yōu)選的落入上述定義的分類在下文提供。
[0021]此外，本發(fā)明作為整體可應(yīng)用于作為生物控制劑，特別是作為生物農(nóng)藥和生物防腐劑使用的桿狀細(xì)菌。與化學(xué)品相反，術(shù)語(yǔ)“生物控制劑”是指可用于控制其他微生物的微生物。芽孢桿菌目可用作生物控制劑。生物農(nóng)藥的實(shí)例包括蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種(ifeci77i/5.thuringiensis ssp.aizawai)。生物防腐劑的實(shí)例包括植物乳桿菌{Lactobacillus plantarum)。
[0022]屬于發(fā)酵菌的進(jìn)一步的目標(biāo)細(xì)胞組是包含在發(fā)酵起子，有時(shí)也稱作“起子培養(yǎng)物”中的桿狀細(xì)菌的細(xì)胞。如本領(lǐng)域中已知的，發(fā)酵起子是在各種食品和發(fā)酵飲料的制備中輔助發(fā)酵過(guò)程起始的制品。細(xì)菌和/或酵母包含在典型的發(fā)酵起子中。包含在所述發(fā)酵起子中的優(yōu)選細(xì)菌根據(jù)下文的分類限定。
[0023]術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)(物)”在作為術(shù)語(yǔ)“起子培養(yǎng)物”的一部分使用時(shí)，具有特別的含義，即是指包含適合起始發(fā)酵的一種或多種微生物的組合物。另外并且一般而言，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)(物)”具有本領(lǐng)域中確認(rèn)的含義，并且一方面是指通過(guò)使微生物在受控的實(shí)驗(yàn)室和/或生產(chǎn)條件下在預(yù)定的培養(yǎng)基中繁殖而擴(kuò)增微生物的方法，并且另一方面是指其中發(fā)生培養(yǎng)的物質(zhì)組合物，所述物質(zhì)組合物包含培養(yǎng)基和微生物。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)(物)”是指包含或保持在任何容器或載體中，且任何物質(zhì)狀態(tài)的任何規(guī)模的培養(yǎng)(物)。例如，培養(yǎng)(物)可以是液體培養(yǎng)(物)?！芭囵B(yǎng)(物)”還可延伸至通過(guò)發(fā)酵獲得的組合物中的微生物的存在，優(yōu)選繁殖，這樣的組合物包括飲料、食品、飲食補(bǔ)充劑和藥物產(chǎn)品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)(物)”涉及在已經(jīng)添加蛋白胨或包含蛋白胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
[0024]如上所述，蛋白胨是培養(yǎng)基的典型成分。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)蛋白胨的選擇是影響細(xì)胞體積的手段，和特定微生物中的特定形態(tài)參數(shù)，所述形態(tài)參數(shù)是長(zhǎng)度與直徑的比例，且所述微生物是上述特定的桿狀細(xì)菌。所述“影響”是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，并且在本文中也稱作“控制”?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)桿的長(zhǎng)度和細(xì)胞體積顯著依賴于包含在培養(yǎng)基中的蛋白胨的選擇。通過(guò)減少體積和/或L/D比例，達(dá)到高細(xì)胞計(jì)數(shù)或濃度；參見(jiàn)，例如圖1中顯示的數(shù)據(jù)。此外，如下文進(jìn)一步討論的，降低體積和/或長(zhǎng)度與直徑的比例是使如本文定義的桿狀細(xì)菌更有活力且耐受機(jī)械、化學(xué)或熱脅迫條件(因?yàn)樗鼈兛赡茉谏锛夹g(shù)生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生)的手段。
[0025]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述控制是降低并且所述蛋白胨是食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物。術(shù)語(yǔ)“食用家畜蛋白胨”是指來(lái)自肥畜的蛋白胨。食用家畜蛋白胨可通過(guò)水解或消化蛋白或包含蛋白的組織，特別是食用家畜的肉獲得。術(shù)語(yǔ)“食用家畜”是指屠宰的動(dòng)物，例如豬和牛(包括家牛(Pos primigeniustaurus))。來(lái)自乳的蛋白胨，包括來(lái)自酪蛋白的蛋白胨不包含在“食用家畜蛋白胨”之下。術(shù)語(yǔ)“豬來(lái)源”是指從豬屬、Sus)的食用家畜獲得的任何組織，優(yōu)選豬{Sus scrofa)種，最優(yōu)選家豬{Sus scrofa domestica)。
[0026]本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)選擇食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，可改變根據(jù)本發(fā)明的桿狀細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)學(xué)，從而獲得較小體積和/或較短桿(較小的L/D比例)的細(xì)胞，和較高的細(xì)胞濃度。優(yōu)選地，所述蛋白胨是豬組織的胃蛋白酶消化物。胃蛋白酶消化物是在添加胃蛋白酶后，從起始材料獲得的制品。關(guān)于所述起始材料，給出的優(yōu)選是食用家畜的組織，特別是肉，特別是豬來(lái)源的，更特別是豬來(lái)源的胃組織。同時(shí)，設(shè)想到其他蛋白來(lái)源或包含豬來(lái)源的組織的蛋白的應(yīng)用。
[0027]盡管蛋白胨主要被認(rèn)為是氨基酸和肽的來(lái)源，但它們同時(shí)也包含其他成分，因?yàn)樵谄渲苽渲型ǔＪ褂猛暾慕M織。關(guān)于這些其他成分，給出的優(yōu)選是具有高濃度的核酸組件，例如核苷酸、核苷和核堿基以及其衍生物的蛋白胨。作為這樣的高濃度的指標(biāo)，可使用胸腺嘧啶和/或次黃嘌呤的濃度。胸腺嘧啶和次黃嘌呤因而優(yōu)選也以高濃度存在。次黃嘌呤的高濃度是高于50、100、150或200 μ g/g的濃度。胸腺嘧啶高濃度是高于20、40、60或70 μ g/g的濃度。設(shè)想使用滿足任一的這些標(biāo)準(zhǔn)的蛋白胨(高濃度的核酸組件、胸腺嘧啶和/或次黃嘌呤)，所述 蛋白胨不必限于食用家畜蛋白胨或豬來(lái)源的蛋白胨。
[0028]在本發(fā)明的過(guò)程中，本發(fā)明人通過(guò)使用不同來(lái)源和/或來(lái)自不同制造商的蛋白胨部分地制備了他們自己的培養(yǎng)基。以特別優(yōu)異的方式表現(xiàn)的豬來(lái)源的特定蛋白胨是Bacto?Proteose蛋白腺3號(hào)，可得自Becton Dickinson,此前稱作Difco? Proteose蛋白腺3號(hào)。盡管更改了名稱，但所述蛋白胨的制造方法沒(méi)有改變。關(guān)于Bacto? Proteose蛋白胨3號(hào)的進(jìn)一步信息可見(jiàn)于，例如第三版BD Bionutrients?技術(shù)手冊(cè)(2006年10月)；具體參見(jiàn)其9、42和43頁(yè)的表格。對(duì)于本發(fā)明的所有方面，Bacto? Proteose蛋白胨3號(hào)是特別優(yōu)選的豬來(lái)源的蛋白胨。Bacto? Proteose蛋白胨3號(hào)在本文中有時(shí)簡(jiǎn)稱為Proteose蛋白胨3號(hào)或蛋白胨3號(hào)。
[0029]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，在所述蛋白胨的存在下，所述細(xì)胞的平均體積低于3 μ m3，優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ m3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ m3之間，進(jìn)一步優(yōu)選的細(xì)胞體積包括1.0、1.2、1.3和1.5 μ m3 ;且平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于
5,優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5,更優(yōu)選低于2.2或低于2.1或低于2.0,且最優(yōu)選低于
1.8。圖1顯示了多種不同的培養(yǎng)條件下的平均細(xì)胞體積(“平均的細(xì)胞體積”)和細(xì)胞計(jì)數(shù)/ml。圖3顯示了如對(duì)于在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物測(cè)定的，細(xì)胞體積分布。
[0030]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，平均的長(zhǎng)度與直徑的比例是至少1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。在任何情況下，高于1.0的數(shù)值由術(shù)語(yǔ)“桿狀”表示，該術(shù)語(yǔ)需要存在圓柱狀的結(jié)構(gòu)；參見(jiàn)上文。[0031]第二方面，本發(fā)明提供了食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物，用于提高細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或細(xì)胞分裂的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
[0032]這個(gè)實(shí)施方式涉及本發(fā)明人的進(jìn)一步的意外發(fā)現(xiàn)，即允許控制細(xì)胞體積或長(zhǎng)度與直徑的比例的特異方式，即本發(fā)明的蛋白胨，進(jìn)一步提供用于提高細(xì)胞的培養(yǎng)物，以及包含所述細(xì)胞或由其所得物的組合物或制品的質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量參數(shù)是生存力、活力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和細(xì)胞分裂。
[0033]術(shù)語(yǔ)細(xì)胞的“生存力”是指它們是活著的的狀態(tài)。該狀態(tài)可表述為細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和增殖，并且對(duì)于很多問(wèn)題，是可通過(guò)積極培養(yǎng)力(positive cultivability)證實(shí)的。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞的“活力”是指它們具有指定的代謝活性的狀態(tài)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”是指能夠在某些時(shí)間段或在加工后維持生存力的能力，所述加工包括擠壓、冷凍干燥、冷凍、干燥和儲(chǔ)存。
[0034]“貨架期”是常用于表征商購(gòu)可得產(chǎn)品的參數(shù)。在本發(fā)明的情況下，該術(shù)語(yǔ)用于指定直到益生菌培養(yǎng)物或由其獲得的制品能夠賦予宿主上述健康益處之前的時(shí)間段，或者在一定程度上參照發(fā)酵菌，指后者進(jìn)行期望的發(fā)酵過(guò)程的能力。后三個(gè)質(zhì)量參數(shù)(DNA復(fù)制、隔膜形成和細(xì)胞分裂)可視為生存力的微觀或生化指標(biāo)。術(shù)語(yǔ)“隔膜”是指在細(xì)胞分裂期間，在分裂細(xì)胞之間形成的邊界。在使用本發(fā)明的特定蛋白胨時(shí)，可改進(jìn)一個(gè)或多個(gè)上述質(zhì)量參數(shù)。
[0035]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了選擇細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述培養(yǎng)基提高包含培養(yǎng)在所述培養(yǎng)基中的細(xì)胞的制品的細(xì)胞生存力或穩(wěn)定性或貨架期，其中所述細(xì)胞是桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌，優(yōu)選桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，所述方法包括測(cè)定培養(yǎng)物中所述細(xì)胞的平均體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑的比例，其中低平均體積或低的平均長(zhǎng)度與直徑的比例指示適合的培養(yǎng)基，優(yōu)選平均體積和平均長(zhǎng)度與直徑的比例是上文所定義的。
[0036]術(shù)語(yǔ)“革蘭氏陽(yáng)性”是本領(lǐng)域中確認(rèn)的。它是指某些細(xì)菌，即革蘭氏陽(yáng)性菌，在使用乙醇脫色后保留結(jié)晶紫染色的能力。這種能力不出現(xiàn)在革蘭氏陰性菌中。革蘭氏陽(yáng)性菌保留結(jié)晶紫染色的能力是由于富含肽聚糖的厚細(xì)胞壁的存在。芽孢桿菌目{Bacillales)、乳桿菌目{Lactobacillales)和雙歧桿菌目iBifidobacteriales)都是革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0037]本發(fā)明的這個(gè)方面涉及允許鑒定適合的細(xì)胞培養(yǎng)基的篩選方法。盡管此前的方面涉及桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌，并且進(jìn)一步限定蛋白胨為控制劑，但選擇根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法不限于具體試劑，例如蛋白胨。因此，它可應(yīng)用于通常的桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌。本發(fā)明的這個(gè)具體方面源自意外的發(fā)現(xiàn)，即降低桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌的培養(yǎng)物中的平均細(xì)胞體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑比例是提高生存力、穩(wěn)定性和/或貨架期的手段。
[0038]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基中的氨基酸和/或肽的來(lái)源在選擇細(xì)胞培養(yǎng)基的所述方法期間變化。具體地，設(shè)想比較酶消化物，例如動(dòng)物蛋白來(lái)源的胃蛋白酶消化物，特別是動(dòng)物的肉，包括食用家畜肉。
[0039]本發(fā)明，在進(jìn)一步的方面，涉及確認(rèn)培養(yǎng)物中的細(xì)胞的平均體積和/或平局長(zhǎng)度與直徑的比例的方法，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，其平均體積低于3 μ m3 ,優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ m3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ m3之間；且平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于5，優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5，更優(yōu)選低于2.2或低于2.1或低于2.0，且最優(yōu)選低于1.8，且所述方法包括在食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0040]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了在食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物的存在下在一定時(shí)間跨度培養(yǎng)所述細(xì)胞的方法。所述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選進(jìn)行直到達(dá)到活細(xì)胞的最大濃度和平均細(xì)胞體積的最小值。優(yōu)選的培養(yǎng)階段是所謂靜止生長(zhǎng)期，其中所述階段在10和48小時(shí)之間達(dá)到，優(yōu)選12和24小時(shí)之間，更優(yōu)選14和22小時(shí)之間，且最優(yōu)選16和20小時(shí)之間。
[0041]進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了提高細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或細(xì)胞分裂的方法，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，其中所述方法包括在食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0042]在上文公開(kāi)的用途和方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述益生菌或發(fā)酵菌選自桿狀的乳桿菌目和桿狀的雙歧桿菌目，優(yōu)選桿狀的乳桿菌科和桿狀的雙歧桿菌科，更優(yōu)選乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。進(jìn)一步優(yōu)選的分類是桿狀的芽孢桿菌目，優(yōu)選桿狀的芽孢桿菌科，優(yōu)選的屬是芽胞桿菌屬；和桿狀的梭菌目，優(yōu)選梭菌屬。
[0043]優(yōu)選地，所述乳桿菌選自:嗜酸乳桿菌(Lactobacillus、干酪乳桿菌{LactobaciIlus casei)、德氏乳桿菌{LactobaciIlus delbrueckii)、約氏乳桿菌{Lactobacillus 、鼠李糖乳桿菌{Lactobacillus ,和唾液乳桿菌{LactobaciIlus salivarius) 0
[0044]在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，(a)嗜酸乳桿菌是嗜酸乳桿菌或嗜酸乳桿菌NCFM ;(b)干釀乳桿菌是干釀乳桿菌鼠李糖亞種{Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus ；ATCC 7469) ； (c) 德氏乳桿菌是德氏乳桿菌乳亞種{Lactobacillus delbrueckiisubsp.1 act is)或德氏乳桿菌保加利亞亞種{Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus) ; (d)約氏乳桿菌是約氏乳桿菌Lal ； (e)鼠李糖乳桿菌是鼠李糖乳桿菌GG(ATCC 53103);或(f)唾液乳桿菌是唾液乳桿菌唾液亞種(lactobacillus salivariussubsp.salivarius)。
[0045]來(lái)自乳桿菌屬(“L.，，)和雙歧桿菌屬(“B.，，)的進(jìn)一步優(yōu)選的種和菌株是嗜酸乳桿菌R0052 (Lallemand)、干釀乳桿菌代田株(Z.casei;Yakult)、干釀乳桿菌immunitas 株(DN114001) (Danone)、副干酪乳桿菌CRL431 (Chr.Hansen)、副干酪乳桿菌STll (Nestle)、副干釀乳桿菌LP33 (GenMont Biotech)、副干釀乳桿菌F19 (Medipharm)、植物乳桿菌 299V (Probi AB/Lallemand)、加氏乳桿菌(Z.gasseri ；Merck/Seven Seas)、羅伊氏乳桿菌仏reuteri) SD2112 (Biogaia)、鼠李糖乳桿菌LGG (Valio)、鼠李糖乳桿菌GR-1 (Urex Biotech)、鼠李糖乳桿菌271 (Probi AB)、唾液乳桿菌UCCl 18 (Universityof Cork)、瑞士乳桿菌 CPN4 (Calpis, Japan)、瑞士乳桿菌(LKB16H) (Valio)、乳酸乳球菌{Lactococcus I act is) LlA (Es sum AB)、乳雙歧桿菌{B.1 act is) (DN 173010) (Danone)、乳雙歧桿菌 Bb_12 (Chr.Hansen)、長(zhǎng)雙歧桿菌{β.longum) ΒΒ-536(Morinaga)、長(zhǎng)雙歧桿菌 Rosell 152 (Lallemand)、長(zhǎng)雙歧桿菌 SBT-2928 (Snow BrandMilk Prod., Japan)、短雙歧桿菌(β.breve)株(Yakult)、乳雙歧桿菌 HN019 (Howaru,Danisco)。[0046]特別優(yōu)選嗜酸乳桿菌NCFM、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌鼠李糖亞種、鼠李糖乳桿菌GG和德氏乳桿菌乳亞種。
[0047]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述蛋白胨包含在培養(yǎng)基中，例如MRS培養(yǎng)基，優(yōu)選BD Difco?乳酸桿菌MRS培養(yǎng)液或GEM培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的，并且已描述于 de Man 等人的出版物中(1960) (de Man, J.D., Rogosa M.and Sharpe Μ.E.(1960)A Medium for the Cultivation of Lactobacill1.J.App1.Bact.23,130-135)。本發(fā)明人已測(cè)試了各種MRS培養(yǎng)基，所述MRS培養(yǎng)基在所包含的蛋白胨方面彼此不同。優(yōu)選的MRS培養(yǎng)基，本文中命名為“MRSD”是包含Proteose蛋白胨3號(hào)的MRS培養(yǎng)基，其有助于MRSD培養(yǎng)基的特別好的性能。MRSD培養(yǎng)基的成分提供在下文的實(shí)施例1中。在可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，使用如Saarela等人(2004) (Stationary-phase acid and heat treatmentsfor improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria;J Appl Microbiol, 96，1205-1214)所述的GEM (普通可食用培養(yǎng)基)。通常，GEM包含大豆蛋白胨；參見(jiàn)實(shí)施例1。GEM的其他組成也提供在實(shí)施例1中。根據(jù)本發(fā)明，大豆蛋白胨可替換為任何其他蛋白胨，其中，給出的優(yōu)選是豬來(lái)源的蛋白胨，特別是Proteose蛋白胨3號(hào)。
[0048]大體而言，優(yōu)選所述蛋白胨的濃度在5-50、10-14、12-30或15-25 g/Ι的范圍。
[0049]在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，(a)所述MRS培養(yǎng)基包含5_20 g/Ι，優(yōu)選約10 g/Ι的所述蛋白胨；或(b )所述GEM培養(yǎng)基包含10-50 g/Ι，優(yōu)選20-40g/l，更優(yōu)選約30 g/Ι的所述蛋白胨。如上所述，特別優(yōu)選的蛋白胨是Bacto ? Proteose蛋白胨3號(hào)。
[0050]對(duì)于采用GEM培養(yǎng)基的范圍，優(yōu)選所述GEM培養(yǎng)基進(jìn)一步包含吐溫80，優(yōu)選濃度
0.5-2 g/Ι,更優(yōu)選約 I g/1。
[0051]在本發(fā)明的用途和方法的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，(a)生存力是在培養(yǎng)物或制品中的生存力；(b)穩(wěn)定性是在制品中的穩(wěn)定性；(C)貨架期是在制品中的貨架期；(d)DNA復(fù)制是在培養(yǎng)物中的DNA復(fù)制；(e)隔膜形成是在培養(yǎng)物中的隔膜形成；和(f)細(xì)胞分裂是在培養(yǎng)物中的細(xì)胞分裂。
[0052]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制品選自其中所述細(xì)胞包封或包埋在保護(hù)性基質(zhì)中的制品，例如擠出物或球體；凍干物；冷凍制品；和干燥制品。
[0053]本領(lǐng)域中已知如上文定義的桿狀細(xì)菌，特別是桿狀益生菌的生存力可通過(guò)將其包封或包埋在保護(hù)性基質(zhì)中而進(jìn)一步增加。包封或包埋的優(yōu)選方法是擠出。優(yōu)選的保護(hù)性基質(zhì)是生面團(tuán)。所述保護(hù)性基質(zhì)的進(jìn)一步或可選組成是脫脂乳或LyoA;另參見(jiàn)實(shí)施例2。本文使用的“LyoA”是指明膠(1.5% (w/w))、甘油(1% (w/w))、麥芽糊精,優(yōu)選Glucidexl2?(5% (w/w))和單水合乳糖(5% (w/w))的水溶液。
[0054]產(chǎn)生出擠出物的擠出方法是本領(lǐng)域中已知的。一般而言，將凝膠或粘性或生面團(tuán)樣的組合物擠壓通過(guò)孔口。意大利面的制造是擠出的實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明，給出的優(yōu)選是在溫和條件下的擠出，也稱作“冷擠出”。在必要的程度下，在擠出過(guò)程中施加冷卻，所述冷卻用于保持溫度在約20°C至約15°C的范圍。如果根據(jù)本發(fā)明的桿狀細(xì)菌與生面團(tuán)組合，且將所述生面團(tuán)擠出，所述細(xì)菌細(xì)胞將固定在網(wǎng)絡(luò)中，特別是生面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)中。這個(gè)固定過(guò)程在本文中也稱作包封化或包埋。
[0055]優(yōu)選地，向待擠出的組合物添加甘油和/或椰子脂或椰子油。這提供了如包含在將在擠出過(guò)程中被擠出的和/或通過(guò)所得擠出物的任何下游加工獲得的組合物中的，根據(jù)本發(fā)明的桿狀細(xì)菌的生存力和/或穩(wěn)定性的進(jìn)一步強(qiáng)化。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及擠出包含桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的組合物的方法，其中，在擠出的步驟之前，向包含所述細(xì)菌的所述組合物添加甘油和/或椰子脂或椰子油。本文還提供了甘油和/或椰子脂或椰子油用于增強(qiáng)在擠出物中的根據(jù)本發(fā)明的桿狀細(xì)菌的生存力、穩(wěn)定性和/或貨架期的用途，甘油和/或椰子脂或椰子油在擠出過(guò)程中存在于所述擠出物中。
[0056]可通過(guò)如下生產(chǎn)球體:例如可通過(guò)將濕或干燥形式的細(xì)菌與保護(hù)性粘合材料，例如面粉、淀粉、纖維材料等和足夠量的液體混合以獲得碎屑樣的顆粒，可將所述顆粒擠壓成團(tuán)粒和/或進(jìn)一步加工，例如在滾圓機(jī)中加工，產(chǎn)生具有球形形狀且包含本發(fā)明的細(xì)菌的顆粒。
[0057]凍干物是通過(guò)冷凍干燥獲得的組合物。用于冷凍干燥的手段和方法是本領(lǐng)域中已知的并且由技術(shù)人員安排；另參見(jiàn)內(nèi)附的實(shí)施例。
[0058]術(shù)語(yǔ)“冷凍制品”是指包含如上文定義的桿狀細(xì)菌并在低于0°C的溫度，優(yōu)選在-10至-30°c的范圍，更優(yōu)選約-18至-20°c貯存的制品。
[0059]優(yōu)選地，所述擠出物是生面團(tuán)和/或包含面粉和水。
[0060]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了制備擠出物、凍干物或冷凍制品的方法，所述擠出物、凍干物或冷凍制品包含桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，所述方法包括:(aa)確認(rèn)如上定義的平均體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑比例的方法，或(ab)提高如上定義的細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或分裂的方法，和(b)分別擠出、凍干和/或冷凍的步驟。
[0061]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌，或由桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌組成，所述桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌的平均體積低于3 μ m3，優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ HI3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ HI3之間；和/或平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于5，優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5，更優(yōu)選低于
2.2或低于2.1或低于2.0,且最優(yōu)選低于1.8。
[0062]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物選自培養(yǎng)基、飲料、用于人或動(dòng)物食用的食品、飼料、飲食補(bǔ)充劑、生物控制劑、藥物產(chǎn)品、擠出物、凍干物、冷凍制品和干燥制品。
[0063]優(yōu)選的培養(yǎng)基是上文公開(kāi)的那些，特別是MRS和GEM培養(yǎng)基，其中在其涉及培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的所述組合物包含培養(yǎng)基(例如MRS或GEM培養(yǎng)基)和如上文定義的桿狀細(xì)菌或由其組成。
[0064]飲料和食品以及飲食補(bǔ)充劑的實(shí)例包括酸奶、干酪、凝乳和由此獲得的產(chǎn)品和益生菌。進(jìn)一步的實(shí)例是基于谷類的產(chǎn)品，例如即食谷物，包括脆玉米片；棒，例如巧克力棒；和牛奶什錦早餐。特別設(shè)想的是向這樣的制品添加本文公開(kāi)的擠出物。
[0065]生物控制劑以及其優(yōu)選的實(shí)施方式(生物農(nóng)藥、生物防腐劑)在上文討論。
[0066]此外，提供了包含桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌或由其組成的組合物，所述組合物可通過(guò)或通過(guò)(i)確認(rèn)如上文定義的平均體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑的比例的方法；(?)提高如上定義的細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或分裂的方法；或(iii)制備如上定義的擠出物、凍干物或冷凍制品的方法獲得。
[0067]在本發(fā)明的方法或組合物的優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選的桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌是如上文進(jìn)一步定義。
[0068]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了制備細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法包括在還原糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖和乳糖的存在下，在100°c和130°C之間的溫度下，處理食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物至少15分鐘。
[0069] 一般而言，溫度越高，在給定溫度下所需的處理時(shí)間越短。具體地，熱處理可以在標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌條件(121°C，20分鐘)下進(jìn)行，或通過(guò)培養(yǎng)基的蒸煮(100°C)進(jìn)行，其中溫育時(shí)間優(yōu)選大于I小時(shí)，大于4小時(shí),大于6小時(shí)或8小時(shí)。在低于120°C的溫度下的足夠熱處理的標(biāo)志可以是在420 nm波長(zhǎng)的吸光度的光度測(cè)量和與使用標(biāo)準(zhǔn)高壓滅菌條件(121°C，20分鐘)的所述吸光度的比較，其中所述吸光度數(shù)值優(yōu)選高于I，更優(yōu)選高于2，且最優(yōu)選高于 2.9。
[0070]本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)加熱一起處理還原糖和蛋白胨在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方面特別有益；另參見(jiàn)實(shí)施例6。
[0071]不希望受到具體理論的束縛，但認(rèn)為這種發(fā)現(xiàn)可以與加熱處理期間的有益反應(yīng)物的產(chǎn)生直接或間接相關(guān)，例如美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0072]美拉德反應(yīng)歸類為非酶促褐變，這是氨基酸、肽或蛋白和還原糖之間的化學(xué)反應(yīng)，其縮合并發(fā)展成部分未知的反應(yīng)產(chǎn)物的高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，所述產(chǎn)物統(tǒng)稱為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)受到很多因素的影響，例如溫度、時(shí)間、pH、水活性和反應(yīng)物來(lái)源和濃度(例如,Wijewickreme, A.N.and Kitts, D.D.(1997) Influence of Reaction Conditionson the Oxidative Behavior of Model Maillard Reaction Products.Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 45，4571-4576)。源自于加熱的糖-蛋白系統(tǒng)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性得到深入研究(例如，Jing，H.and Kitts, D.D.(2002)Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products.Food Chem Toxicol, 40，1007-1015 ;Yeboah，F(xiàn).K.，Allij 1.and Yaylayanj V.A.(1999) Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovineserum albumin.J Agric Food Chemj 47，3164-3172)，并且潛在地影響生長(zhǎng)行為。
[0073]美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可通過(guò)產(chǎn)生DNA-破壞活性改進(jìn)培養(yǎng)基質(zhì)量(Hiramoto，K.，Kidoj K.and Kikugawaj K.(1994) DNA Breaking by Maillard Productsof Glucose-Amino Acid Mixtures Formed in an Aqueous System.Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 42，689-694)。這種 DNA 破壞活性可作用于培養(yǎng)基成分并改進(jìn)在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)期間對(duì)細(xì)菌的DNA切割產(chǎn)物，核苷酸及其衍生物的供給，它們?cè)谂囵B(yǎng)基的加熱期間和/或在加熱后產(chǎn)生。Rogers等人(Rogers，D.，King, T.E.and Cheldelinj V.H.(1953) Growth stimulation of Lactobacillus gayoni byN-D-glucosylglycine.Proc Soc Exp Biol Medj 82，140-144)發(fā)現(xiàn)在熱滅菌期間生產(chǎn)培養(yǎng)基中扣除葡萄糖或酸水解酪蛋白減少了Lactobacillus的生長(zhǎng)剌激，這種作用與本文發(fā)現(xiàn)的相似(另參見(jiàn)實(shí)施例6)。然而，Rogers等人的貢獻(xiàn)中，僅描述了在培養(yǎng)液中記錄為光密度(600nm的0D)的生長(zhǎng)行為，并且沒(méi)有暗示與任何進(jìn)一步的細(xì)胞性質(zhì)(例如，細(xì)胞形態(tài)或穩(wěn)定性)的關(guān)聯(lián)。
[0074]附圖顯示了:
圖1:在不同制造商或不同組成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)16小時(shí)的嗜酸乳桿菌NCFM的細(xì)胞濃度和細(xì)胞體積。方括號(hào)中標(biāo)出了獨(dú)立試驗(yàn)的次數(shù)。一式兩份的測(cè)定表示為平均值土最大值和最小值。對(duì)于多個(gè)測(cè)定，數(shù)值表示為平均值土 S.D.。包含Bacto? Proteose蛋白胨3號(hào)的培養(yǎng)基(“GEM Bacto蛋白胨3號(hào)”和“MRSD”)的優(yōu)異性能是明顯的。數(shù)據(jù)以德國(guó)十進(jìn)制數(shù)格式表示。
[0075]圖2:作為貯存溫度的函數(shù)的冷凍干燥的嗜酸乳桿菌NCFM制品的線性化D-數(shù)值(D =十進(jìn)制減少時(shí)間)。培養(yǎng)液在包含大豆蛋白胨的GEM和MRSD中繁殖。每個(gè)數(shù)值是在相應(yīng)溫度下的至少3個(gè)貯存時(shí)間的平均值。
[0076]圖3:在包含大豆蛋白胨的GEM (A)、包含Proteose蛋白胨3號(hào)的GEM⑶和MRSD(C)中培養(yǎng)16小時(shí)的嗜酸乳桿菌NCFM的細(xì)胞體積分布和相襯圖片。顯不對(duì)于每個(gè)培養(yǎng)物的細(xì)胞濃度(CC)和平均細(xì)胞體積(CV)。棒大小:100 μ m。使用包含Proteose蛋白胨3號(hào)的GEM和MRSD培養(yǎng)基，觀察到顯著較小的平均細(xì)胞體積(CV)和較小的L/D比例。[0077]圖4:在37°C貯存后的冷凍-干燥的嗜酸乳桿菌NCFM制品的生存力損失。在冷凍干燥后，所有樣品的平均殘留含水量為3.3% 土 0.2%。平均重量偏移對(duì)于在11.3%相對(duì)濕度貯存的樣品(A)是+0.9 土 0.3% (w/w)，且對(duì)于在干燥且氣密方式貯存的樣品(B)是+0.3 ± 0.1% (w/w)。
[0078]圖5:在重復(fù)擠出過(guò)程中，嗜酸乳桿菌NCFM的細(xì)菌順次死亡。進(jìn)行一式三份的測(cè)定，并表示為平均值土 S.D.。
[0079]圖6:在不同加熱的MRS(D)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)18小時(shí)的嗜酸乳桿菌的總細(xì)胞濃度和平均細(xì)胞體積。此外，應(yīng)用的培養(yǎng)基的褐化程度表示為在420 nm的消光(或吸光度)。這說(shuō)明，甚至在121°C 20分鐘或在100°C 8小時(shí)的熱處理是達(dá)到完全刺激作用(小細(xì)胞體積和高細(xì)胞濃度)必需的。這種刺激作用與可能由美拉德反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)致的所得的培養(yǎng)基褐化相關(guān)。
[0080]圖7:在MRS(D)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)18小時(shí)的嗜酸乳桿菌的總細(xì)胞濃度和平均細(xì)胞體積，其中所選成分與本體培養(yǎng)基分離地高壓滅菌并隨后補(bǔ)充。此外，還顯示了應(yīng)用的培養(yǎng)基的抗氧化能力和褐化。從數(shù)據(jù)可見(jiàn)，本體培養(yǎng)基必須在葡萄糖和蛋白胨3號(hào)的存在下加熱處理，以達(dá)到完全刺激作用(小細(xì)胞體積和高細(xì)胞濃度)。數(shù)據(jù)以德國(guó)十進(jìn)制數(shù)格式表示。
[0081]以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明但不應(yīng)解釋為限制性的。
[0082]用于以下實(shí)施例的材料和方法:
菌株和培養(yǎng)基
嗜酸乳桿菌MCFM得自于丹麥哥本哈根的Danisco A/S。為了長(zhǎng)期貯存，將細(xì)菌作為甘油-原種(stock) (33% v/v)維持在-70° C。使用在本文中稱作MRSD的根據(jù)Man等人(1960) (Difco?, Becton Dickenson GmbH, Heidelberg, Germany)的預(yù)制MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)。MRSD每升包含IOg Proteose蛋白胨3號(hào)、IOg牛肉提取物、5g酵母提取物、20g右旋糖、Ig聚山梨醇酯80、2g檸檬酸銨、5g乙酸鈉、0.1g硫酸鎂，0.05 g硫酸錳和2g磷酸氫二鉀。對(duì)于單個(gè)試驗(yàn)，使用來(lái)自其他制造商但具有相同的成分濃度的預(yù)制MRS培養(yǎng)基。它們被標(biāo)明為 MRSR (Carl Roth GmbH & C0.KG, Karlsruhe, Germany) > MRSA (ApplichemGmbH, Darmstadt, Germany)和 MRSS (Scharlau Chemie S.A., Sentmenat, Spain)。使用0.2%葡萄糖或0.2%乳糖作為碳源研究MRSS。
[0083]進(jìn)一步地，使用VTT (Technical Research Centre of Finland) [Saarela 等人，(2004)]開(kāi)發(fā)的普通可食用培養(yǎng)基(GEM)。GEM每升包含30 g大豆蛋白胨(ServaElektrophorese GmbH, Heidelberg, Germany)、7 g 酵母提取物(Serva)、20 g 右旋糖(Carl Roth) >0.4 g 磷酸氫二鉀(Carl Roth)、I g 磷酸二氫鉀(Carl Roth)、I g 硫酸鎂(Merck)和I g聚山梨醇酯80 (Carl Roth)。在一些試驗(yàn)中，GEM中的大豆蛋白胨替換為不同的蛋白腺:Proteose蛋白腺3號(hào)(Difco ?或等同的Bacto ?，Becton Dickenson)、大豆蛋白腺(Fluka Chemie GmbH, Oberaching, Germany)、大豆腺(Difco?, BectonDickenson)、膜蛋白腺(Bacto?, Becton Dickinson)、酪蛋白腺(Merck KGaA, Darmstadt,Germany)。所有培養(yǎng)基作為完整組合物在IL的瓶中，在121°C滅菌20分鐘。
[0084]如上定義的培養(yǎng)基和條件已用于嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌鼠李糖亞種、德氏乳桿菌乳亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種、約氏乳桿菌LaU鼠李糖乳桿菌GG和唾液乳桿菌唾液亞種。
[0085]培養(yǎng)條件
對(duì)于預(yù)培養(yǎng)物的 制備，使用2 ml的甘油原種培養(yǎng)物接種50 ml MRSD并在37°C溫育6小時(shí)。除非另有說(shuō)明，主要的分批發(fā)酵物使用1% (v/v)預(yù)培養(yǎng)物接種，并在靜置培養(yǎng)中溫育16小時(shí)至靜止生長(zhǎng)期。所有發(fā)酵在37°C完成。
[0086]用于冷凍干燥的樣品制備
對(duì)于凍干物的制備，收獲樣品，通過(guò)離心分離(8 min，5000 x g)，并將上清液替換為相同體積的冷凍-和凍干保護(hù)基質(zhì)LyoA，其包含(w/w) 1.5%明膠、1%甘油、5%麥芽糊精(Glucidex 12?)和 5% 單水合乳糖[Wesenfeld (2005) (Vitalitat und Stabilitatvon probiotischen Mikroorganismen nach der Gefriertrocknung (LyophiIisation)；Dissertation an der Fakultat fiir Prozesswissenschaften der TechnischenUniversitat Berlin)]。這些混合物等分成5 ml玻璃管中的I ml部分,在_70°C冷凍至少20 小時(shí)并凍干(Gamma A, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode,Germany) 28小時(shí)，至0.022 mbar的最小壓力，使用以下貨架溫度概況:22 h -20°C、3 h+10°C>3 h +30°C。
[0087]用于包封試驗(yàn)的樣品制備
通過(guò)將天然培養(yǎng)液引入到硬粒小麥面粉基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的包封。對(duì)于生面團(tuán)制備，將生長(zhǎng)16小時(shí)的培養(yǎng)物在低于10°C冰水中冷卻，與硬粒小麥面粉以1:3 (g/g)混合，并使用手持式攪拌器手動(dòng)揉捏。因此，逐漸將面粉添加到容器中，確保產(chǎn)生均勻柔軟的生面團(tuán)。將所得生面團(tuán)轉(zhuǎn)移到單螺桿意大利面擠出機(jī)(PN 100, Haussler GmbH, Heiligkreuzthal,Germany)的混合槽中，并通過(guò)具有38.2 mm2的總模開(kāi)口面積的76 x 0.8 mm特富龍-包被模具以112.5 g/min的恒定質(zhì)量流擠出。使用意大利面切割設(shè)備進(jìn)行?；a(chǎn)生長(zhǎng)度約4-5 mm的團(tuán)粒。所有樣品取至少一式三份。
[0088]總細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞體積分布的測(cè)定
細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞體積分布使用 Beckman Multisizer? 3 Coulter Counter? (BeckmanCoulter GmbH, Krefeld, Germany)確定。通過(guò) Multisizer ? 3 軟件 3.53 版,將脈沖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為大小特征。此外，通過(guò)顯微鏡檢查(Axioskop 40 FL, Carl Zeiss GmbH, Germany)控制細(xì)胞形態(tài)。
[0089]細(xì)胞存活的測(cè)定通過(guò)在MRS-瓊脂(Applichem)上的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落形成單位(cfu)。平板在37°C有氧溫育48-72小時(shí)。在系列稀釋前，將凍干樣品在0.85% NaCl溶液中再水化。具有包封細(xì)菌的團(tuán)粒以1:10 (w/w)在預(yù)溫?zé)岬?37°C ) 0.85% NaCl溶液中再水化。樣品管夾在試管接頭上，并且在最大頻率(Vortex-Genie 2, Scientific Industries Inc.)下,在 37°C自動(dòng)混合30分鐘。將具有溶解的生面團(tuán)的溶液用于十倍稀釋，并如上所述進(jìn)行鋪板。在貯存期間的生存力損失通常表示為貯存后每克cfu的對(duì)數(shù)(N)除以在貯存開(kāi)始時(shí)每克cfu的起始數(shù)值(Ntl)。相同的計(jì)算應(yīng)用于通過(guò)擠出過(guò)程包封前(Ntl)和后(N)的樣品。
[0090]細(xì)菌制品的貯存
使用加速貨架期測(cè)試(ASLT)法[Achour 等人，(2001) (Application of theaccelerated shelf life testing method ASLT to study the survival rates offreeze-dried Lactococcus starter cultures; Journal of Chemical Technology &Biotechnology, 76, 624-628) ；King 等人，(1998) (Accelerated storage testing offreeze-dried and controlled low—temperature vacuum dehydrated Lactobacillusacidophilus; J Gen Appl Microbiol, 44, 160-165)]評(píng)估細(xì)菌制品在忙存后的存活率，預(yù)期阿倫尼斯模型(Arrhenius relationship)適合表征貨架期行為。因此，將冷凍干燥的制品和生面團(tuán)包封的團(tuán)粒避光貯存在由氣密帽密封的干燥玻璃瓶中或在具有指定相對(duì)濕度的氣氛中。在后一種情況下，將開(kāi)口瓶貯存在填充飽和氯化鋰(Merck)溶液的干燥器中，產(chǎn)生 11.3% 的相對(duì)濕度[Greenspan (1977) (Humidity fixed points of binarysaturated aqueous solutions; J Res Natl Bur Stand A., 81, 89 - 96)]。
[0091 ] D 和 z-信 為了比較不同的繁殖細(xì)菌的貯存行為，計(jì)算了 Dt (下標(biāo)的大寫字母T)和Z-值。叫是對(duì)于給定的貯存溫度T [°C ]在給定η貯存時(shí)間t [h]后的D-值(獲得種群中I個(gè)Log變化所需的時(shí)間)并以小時(shí)表示。Z-值是以攝氏度表示的，獲得D-值中的10倍變化所需的溫度跨度。
[0092]實(shí)施例1
生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)桿狀細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)的影響
嗜酸乳桿菌NCFM在不同的預(yù)制MRS培養(yǎng)基中和GEM中生長(zhǎng)16小時(shí)。選擇所述時(shí)間以保證種群達(dá)到靜止生長(zhǎng)期，并且因此取消由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的不同生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂率導(dǎo)致的不同程度的鏈生成的現(xiàn)象。
[0093]結(jié)果顯示在圖1中，其中數(shù)據(jù)按照細(xì)胞計(jì)數(shù)遞增的順序繪制。顆粒和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析揭示，不同培養(yǎng)基導(dǎo)致嗜酸乳桿菌NCFM的細(xì)胞大小形狀和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯著差異，分別達(dá)到2.8*107 (MRSR)至1.0*109 (MRSD)細(xì)胞/ml，且對(duì)應(yīng)的平均細(xì)胞體積為2.61至1.38μ m3 (圖1)。通常，平均細(xì)胞體積隨著細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少而增大。
[0094]為了研究蛋白胨對(duì)生長(zhǎng)行為和細(xì)胞形態(tài)的影響，將嗜酸乳桿菌NCFM在GEM中繁殖，其中將標(biāo)準(zhǔn)大豆蛋白胨替換為五種其他選擇的蛋白胨，包括兩種其他大豆蛋白胨，來(lái)自酪蛋白胨和Proteose蛋白胨3號(hào)的兩種蛋白胨(參見(jiàn)上文和圖1)。在修飾的GEM中，變化達(dá)到從對(duì)于測(cè)試的來(lái)自Difco?的大豆胨的6.9*108個(gè)細(xì)胞/ml到對(duì)于Proteose蛋白胨3號(hào)的8.1*108個(gè)細(xì)胞/ml。結(jié)果證明了所包含的蛋白胨對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小的高度影響。進(jìn)一步地，顯而易見(jiàn)的是包含Proteose蛋白胨3號(hào)的培養(yǎng)基的使用，導(dǎo)致最高的細(xì)胞計(jì)數(shù)和最小的平均細(xì)胞面積。
[0095]其他菌株和物種:已對(duì)嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌鼠李糖亞種、鼠李糖乳桿菌GG和德氏乳桿菌乳亞種觀察到類似的觀察結(jié)果(Proteose蛋白胨3號(hào)，特別是MRSD培養(yǎng)基的優(yōu)異性能)，從而證實(shí)Proteose蛋白胨3號(hào)對(duì)多種物種和菌株具有有益作用。
[0096]實(shí)施例2
對(duì)于兩種形態(tài)不同的種群應(yīng)用加速貯存測(cè)試
為了建立加速貨架期測(cè)試(ASLT)，將嗜酸乳桿菌NCFM的凍干制品貯存在不同的溫度(4、20、26、37、45和60°C )，并在從2天(60°C )至520天(4°C )的時(shí)期中頻繁分析。對(duì)在包含大豆蛋白胨的GEM和MRSD中生長(zhǎng)的細(xì)菌進(jìn)行這些系列測(cè)試。平均Log D-值與對(duì)應(yīng)的貯存溫度的繪圖(圖2)產(chǎn)生高于0.99的回歸系數(shù)(表1)。在MRSD中繁殖的細(xì)胞的制品比在GEM生長(zhǎng)的那些更穩(wěn)定。例如，在4°C貯存產(chǎn)生1.06的Log D4r -值的差異，這等于在由MRSD-培養(yǎng)物制成的制品中的貨架期比GEM-培養(yǎng)物的貨架期提高11倍。
[0097]表1:在不同培養(yǎng)基中繁殖的嗜酸乳桿菌NCFM的凍干制品的貯存行為的線性模型
【權(quán)利要求】
1.蛋白胨用于控制培養(yǎng)物中的細(xì)胞的體積和/或長(zhǎng)度與直徑比例的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述控制是降低并且所述蛋白胨是食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中在所述蛋白胨的存在下，所述細(xì)胞的平均體積低于3 μ m3，優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ m3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ m3之間；且平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于5，優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5，更優(yōu)選低于2.2或低于2.1或低于2.0,且最優(yōu)選低于1.8。
4.食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物，用于增加細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或細(xì)胞分裂的用途，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞。
5.選擇細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述培養(yǎng)基增加包含培養(yǎng)在所述培養(yǎng)基中的細(xì)胞的制品的細(xì)胞生存力或穩(wěn)定性或貨架期，其中所述細(xì)胞是桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌，優(yōu)選桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，所述方法包括測(cè)定培養(yǎng)物中所述細(xì)胞的平均體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑的比例，其中低的平均體積或低的平均長(zhǎng)度與直徑的比例指示適合的培養(yǎng)基，優(yōu)選平均體積和平均長(zhǎng)度與直徑的比例如權(quán)利要求3中的定義。
6.確認(rèn)培養(yǎng)物中的細(xì)胞的平均體積和/或平均長(zhǎng)度與直徑的比例的方法，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，其平均體積低于3 μ m3，優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ m3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ m3之間；且平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于5,優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5,更優(yōu)選低于2.2或低于2.1或低于2.0,且最優(yōu)選低于1.8，且所述方法包括在食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
7.增加細(xì)胞的生存力、穩(wěn)定性、貨架期、DNA復(fù)制、隔膜形成和/或細(xì)胞分裂的方法，其中所述細(xì)胞是桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，其中所述方法包括在食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途或權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述益生菌或發(fā)酵菌選自桿狀的乳桿菌目桿狀的雙歧桿菌目(Bifidobacteriales),桿狀的芽孢桿菌目(Bacillales)和桿狀的梭菌目{Clostridiales),優(yōu)選桿狀的乳桿菌科IactobaciIIaceae)、桿狀的雙歧桿菌科{Bifidobacteriaceae)和桿狀的芽孢桿菌科{BaciIIaceae),更優(yōu)選乳桿菌屬{Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteriuni)、芽抱桿菌(Bacillus)和梭菌屬{Clostridium)。
9.權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的用途或權(quán)利要求7或8的方法，其中 (a)生存力是在培養(yǎng)物或制品中的生存力；(b)穩(wěn)定性是在制品中的穩(wěn)定性；(c)貨架期是在制品中的貨架期；(d) DNA復(fù)制是在培養(yǎng)物中的DNA復(fù)制；(e)隔膜形成是在培養(yǎng)物中的隔膜形成；和(f)細(xì)胞分裂是在培養(yǎng)物中的細(xì)胞分裂。
10.權(quán)利要求9的用途或方法，其中所述制品選自其中所述細(xì)胞包封或包埋在保護(hù)性基質(zhì)中的制品，例如擠出物或球體；凍干物；冷凍制品；和干燥制品。
11.制備擠出物、凍干物或冷凍制品的方法，所述擠出物、凍干物或冷凍制品包含桿狀益生菌或桿狀發(fā)酵菌的細(xì)胞，所述方法包括如權(quán)利要求6或7中限定的方法和分別的擠出、凍干和/或冷凍的步驟。
12.組合物，其包含桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌，或由桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌組成，所述桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌的平均體積低于3 μ m3，優(yōu)選在2和3 μ m3之間，更優(yōu)選在1.4和2 μ m3之間，且最優(yōu)選在1.1和1.4 μ m3之間；和/或平均的長(zhǎng)度與直徑的比例低于5,優(yōu)選低于4或低于3或低于2.5,更優(yōu)選低于2.2或低于2.1或低于2.0,且最優(yōu)選低于1.8。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物選自培養(yǎng)基、飲料、用于人或動(dòng)物食用的食品、飼料、飲食補(bǔ)充劑、生物控制劑、藥物產(chǎn)品、擠出物、凍干物、冷凍制品和干燥制品。
14.組合物，其包含桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌，或由桿狀益生菌和/或桿狀發(fā)酵菌組成，其中所述組合物可得自于或得自于權(quán)利要求6、7或11中任一項(xiàng)的方法。
15.制備細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法包括在還原糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖和乳糖的存在下，在100°C和130°C之間的溫度下，處理食用家畜蛋白胨，優(yōu)選豬來(lái)源的蛋白胨，更優(yōu)選豬來(lái)源的胃蛋白酶消化物至少15分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103958664SQ201280054936
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月10日
【發(fā)明者】B.范倫格里奇, M.森茲, U.斯塔爾, E.馬斯特-格拉奇 申請(qǐng)人:通用工廠公司