含有層粘連蛋白和鈣粘蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基底的制作方法
【專利摘要】本公開涉及分離的層粘連蛋白-521、制備重組層粘連蛋白-521的方法、表達(dá)重組層粘連蛋白-521的宿主細(xì)胞、以及包含層粘連蛋白-521的組合物。層粘連蛋白-521能夠保持干細(xì)胞在體外的多能性，允許自我更新，并使人胚胎干細(xì)胞能夠單細(xì)胞存活。在被重組層粘連蛋白-521(層粘連蛋白-11)包被的平板中，當(dāng)在分化抑制劑或飼養(yǎng)細(xì)胞不存在的條件下培養(yǎng)多能人胚胎干細(xì)胞時，胚胎干細(xì)胞增殖并保持它們的多能性。還發(fā)現(xiàn)人重組層粘連蛋白-521(層粘連蛋白-11)使得干細(xì)胞在完全解離為單細(xì)胞懸液后能夠單細(xì)胞存活。本文還公開了有用的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至多3.9ng/ml的β成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
【專利說明】含有層粘連蛋白和鈣粘蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基底
[0001] 背景
[0002] 本專利申請要求于2011年9月22日提交的美國臨時專利申請序列 No. 61/537, 940、于2011年11月30日提交的美國臨時專利申請序列No. 61/565, 380、于 2011年12月1日提交的美國臨時專利申請序列No. 61/565, 849、于2012年4月16日提交 的美國臨時專利申請序列No. 61/624, 588、以及于2012年4月17日提交的美國臨時專利申 請序列No. 61/625,321的優(yōu)先權(quán)。這里以引用的方式將這些臨時申請的全文并入本文中。
[0003] 本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞分化、細(xì)胞治療、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)、人重組蛋白、 核酸和層粘連蛋白。
[0004] 基底層（基底膜）為片狀、與細(xì)胞相連的細(xì)胞外基質(zhì)，其在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì) 胞表型維持、組織發(fā)育和組織維持中起到核心作用。它們實際上存在于所有組織中，并且出 現(xiàn)在胚胎發(fā)育的最早期階段。
[0005] 基底層對各種構(gòu)建功能和細(xì)胞間相互作用功能而言是重要的。例如：
[0006] 1.它們作為組織的構(gòu)建支持體，為細(xì)胞提供粘附基質(zhì)。
[0007] 2.它們在阻礙細(xì)胞遷移的組織隔室之間建立選擇通透性屏障，并且被動調(diào)節(jié)大分 子的交換。以腎小球基底膜作為例子來描述這些功能，腎小球基底膜起到重要的過濾結(jié)構(gòu) 的作用，其建立了有效的血-組織屏障，使得大多數(shù)蛋白質(zhì)和細(xì)胞不能透過。
[0008] 3.基底層建立了高度的相互作用表面，其能夠在胚胎發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)過程中促進(jìn) 細(xì)胞遷移和細(xì)胞鋪展。在受傷后，它們提供了細(xì)胞依靠其再生以恢復(fù)正常組織功能的表面。
[0009] 4.基底層將其結(jié)構(gòu)中所編碼的信息呈遞給與其接觸的、對細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡抑 制和組織維持重要的細(xì)胞。該信息通過各種受體而傳遞給細(xì)胞，所述受體包括整聯(lián)蛋白、肌 營養(yǎng)不良蛋白聚糖和細(xì)胞表面蛋白聚糖。傳遞信號不僅依賴于基質(zhì)配體和相應(yīng)的受體（該 基質(zhì)配體和受體以足夠的親和力而相互作用）的存在，還依賴于地形因素，如三維基質(zhì)"景 觀"中的配體密度，以及依賴于基底層組分聚集受體的能力。由于這些基質(zhì)蛋白的壽命長， 因此，基底層在基底層中為居住性（resident)細(xì)胞和暫留性（transient)細(xì)胞建立了"表 面記憶"。
[0010] 基底層主要由層粘連蛋白和IV型膠原異三聚體構(gòu)成，這些組分組織成復(fù)雜的聚 合結(jié)構(gòu)。其它組分包括諸如凝集素和基底膜蛋白聚糖等蛋白聚糖和巢蛋白（觸覺蛋白）。 目前，已經(jīng)確認(rèn)了六種類型的IV型膠原多肽鏈和至少12種層粘連蛋白亞基鏈。這些鏈具 有共同的和獨特的功能，并且按特定的時間（發(fā)育）和空間（組織位點特異性）模式表達(dá)。 [0011] 層粘連蛋白為主要存在于基底層中的異源三聚體糖蛋白家族。它們通過一側(cè)與 相鄰的細(xì)胞受體進(jìn)行結(jié)合而相互作用，并且與其它層粘連蛋白分子或其它基質(zhì)蛋白（如膠 原、巢蛋白、或蛋白聚糖）結(jié)合而發(fā)揮作用。層粘連蛋白分子也是重要的信號分子，其能夠 強(qiáng)烈地影響細(xì)胞的行為和功能。層粘連蛋白對于維持細(xì)胞/組織表型，以及在組織修復(fù)和 發(fā)育中促進(jìn)細(xì)胞生長和分化是重要的。
[0012] 層粘連蛋白是大的多結(jié)構(gòu)域蛋白，其具有常見的結(jié)構(gòu)組織。層粘連蛋白分子在一 個分子中集合了不同的基質(zhì)和細(xì)胞相互作用的功能。
[0013] 層粘連蛋白蛋白分子包含一個α鏈亞基、一個β鏈亞基和一個Y鏈亞基，這些 亞基通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起成為三聚體。圖1示出了所得到的層粘連蛋白分子的 結(jié)構(gòu)。在天然的組織中，12種已知的層粘連蛋白亞基鏈能夠形成至少15種三聚體層粘連蛋 白類型。三聚體層粘連蛋白結(jié)構(gòu)中具有對其它層粘連蛋白和基底層分子以及膜結(jié)合受體有 結(jié)合活性的可識別結(jié)構(gòu)域。圖2分別示出了 3種層粘連蛋白鏈亞基。例如，VI、IVb和IVa 結(jié)構(gòu)域形成球狀結(jié)構(gòu)，V、IIIb和IlIa結(jié)構(gòu)域（其含有富含半胱氨酸的類EGF元件）形成 棒狀結(jié)構(gòu)。三種鏈的I和Π結(jié)構(gòu)域參與形成三股卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（長臂）。
[0014] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于人組織中的五種不同的α鏈、三種β鏈和三種Y鏈具有至少15 種不同的組合?；谒鼈兊陌l(fā)現(xiàn)歷史，這些分子被命名為層粘連蛋白-1至層粘連蛋白-15， 然而另一種命名法則是根據(jù)它們的鏈的組成來描述這些同種型，例如層粘連蛋白-111(層 粘連蛋白-1)，其包含α-l鏈、β-l鏈和Y-1鏈。已經(jīng)確認(rèn)了層粘連蛋白的四種結(jié)構(gòu)確定 的家族組。第一組的5種確認(rèn)的層粘連蛋白分子均具有β?鏈和Yl鏈，它們的α-鏈組成 (α?至α5鏈）有所不同。第二組的5種確認(rèn)的層粘連蛋白分子（包括層粘連蛋白-521) 均具有β2鏈和Yl鏈，它們的α-鏈組成也有所不同。第三組確認(rèn)的層粘連蛋白分子具 有一個確認(rèn)的成員（層粘連蛋白-332)，其鏈組成為α3β3γ2。第四組確認(rèn)的層粘連蛋白 分子具有一個確認(rèn)的成員（層粘連蛋白-213)，其具有新鑒定的Υ3鏈（α2β1γ3)。
[0015] 尚沒有對分離的層粘連蛋白-521的報道，其不含有其它層粘連蛋白鏈。到目前為 止，對層粘連蛋白-521的功能尚沒有研究。利用層粘連蛋白鏈抗體通過親和層析法從細(xì)胞 源中純化層粘連蛋白-521的嘗試在去除（例如）層粘連蛋白β1鏈（其為層粘連蛋白-411 和層粘連蛋白-511的成分）方面并不成功。提供含有層粘連蛋白-521(akaLN-521)的組 合物和制備層粘連蛋白-521的方法是人們所希望的。
[0016] 人胚胎干細(xì)胞（hES)為針對各種疾?。ㄈ缂顾韬托呐K損傷、I型糖尿病和諸如帕 金森病等神經(jīng)退行性疾?。┑脑偕t(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了希望。干細(xì)胞是一種未分化的細(xì)胞， 隨后由該細(xì)胞衍生出特化細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有廣泛的自我更新能力，并且具有有分化成 所有三種胚層的細(xì)胞的潛能的多能性。它們可用于治療的目的，并且可為組織替代治療、藥 物篩選、功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)提供無限的細(xì)胞來源
[0017] 用于再生醫(yī)學(xué)的由干細(xì)胞衍生的細(xì)胞的發(fā)育的前提條件包括：有一種能夠長期培 養(yǎng)多能干細(xì)胞的方法、一個化學(xué)成分確定且可重復(fù)的分化流程、以及一種不含異源物的細(xì) 胞培養(yǎng)體系。然而，在多能人胚胎干細(xì)胞（hES細(xì)胞）和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPS細(xì)胞）的 培養(yǎng)方面遇到了很多問題。一個主要的問題在于hES細(xì)胞緩慢地成簇生長，這需要人工分 離以進(jìn)行細(xì)胞增殖。細(xì)胞的解離通常導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，完全解離后，hES細(xì)胞的克隆效率 d
[0018] 多能hES細(xì)胞的維持需要復(fù)合培養(yǎng)基質(zhì)（例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白混合物，如鼠腫瘤 來源的Matrigel或成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層），其可能具有免疫原性和毒性，并且會產(chǎn)生大 的批間差異從而降低實驗的可靠性。到目前為止，用于hES細(xì)胞培養(yǎng)的最成功的不含飼養(yǎng) 細(xì)胞的基質(zhì)為Matrigel,其為得自鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤腫瘤組織的腫瘤 和BM類提取物復(fù)合物。Matrigel主要包含鼠LN-111、IV型膠原、基底膜蛋白聚糖和巢蛋 白，但也含有不同量的其它物質(zhì)，包括生長因子和細(xì)胞蛋白，因此其組成不確定并且批次間 是不同的。這種差異會導(dǎo)致科學(xué)結(jié)果的不可再現(xiàn)性，并且由于基質(zhì)是來源于動物的，使得 Matrigel不能用于人類細(xì)胞治療用hES細(xì)胞的擴(kuò)增和維持。
[0019] 然而，近來已經(jīng)報道成功研發(fā)了能夠支持hES和hiPS細(xì)胞自我更新的大致確定的 包被材料。已經(jīng)報道了重組玻連蛋白可支持hES細(xì)胞的粘附和自我更新。還研發(fā)出了包含 來自于各種ECM蛋白的各種多肽的丙烯酸酯包被物，并且已經(jīng)表明合成的甲基丙烯酸酯類 聚合物也有利于hES細(xì)胞的粘附和自我更新。
[0020]hES細(xì)胞大規(guī)模繁殖的主要問題之一在于它們在解離為單細(xì)胞懸液后再接種的存 活能力差。因此，這使得多次傳代以及大規(guī)模自動化擴(kuò)增變得不可能。然而，在rho-激酶 (ROCK)抑制劑10或細(xì)胞收縮抑制劑（blebbistatin) 11的存在下使用胰蛋白酶進(jìn)行處理而 釋放到單細(xì)胞懸液中的hES細(xì)胞能夠被接種并由單克隆進(jìn)行擴(kuò)增，但是所述分子不是天然 干細(xì)胞小生境（niche)的組分，并且它們會影響肌動蛋白細(xì)胞骨架，因此能夠?qū)е录?xì)胞的 破壞。因此，對于用于細(xì)胞治療目的hES細(xì)胞的長期擴(kuò)增而言，使用ROCK抑制劑可能不是 優(yōu)選的方案。
[0021] 為了再生醫(yī)學(xué)的目的，希望開發(fā)出這樣的方法，在化學(xué)成分確定、不含異源物、不 含病原體并且批次間穩(wěn)定的條件下，其使得多能干細(xì)胞能夠衍生和長期培養(yǎng)。此外，這樣的 方法應(yīng)當(dāng)允許快速且經(jīng)濟(jì)有效的擴(kuò)大培養(yǎng)，從而在短期內(nèi)獲得大量的多能hES/hiPS細(xì)胞。 優(yōu)選的是，這些方法還應(yīng)當(dāng)允許人ES細(xì)胞在不含合成的細(xì)胞凋亡抑制劑的培養(yǎng)基中克隆 存活，這將有利于涉及細(xì)胞分選或細(xì)胞內(nèi)基因敲除的科學(xué)應(yīng)用和臨床應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本公開提供了分離的層粘連蛋白-521 (還稱為LN-521或?qū)诱尺B蛋白-11)以及制 備分離的層粘連蛋白-521的方法。在進(jìn)一步的方面，本公開提供了表達(dá)層粘連蛋白-521 鏈并分泌重組層粘連蛋白-521的重組宿主細(xì)胞。
[0023] 在其它方面，本公開提供了GMP品質(zhì)的層粘連蛋白-521，其用于培養(yǎng)為了使細(xì)胞 發(fā)育以進(jìn)行人細(xì)胞治療的目的而分化和維持的細(xì)胞。本公開還提供了藥物組合物，其包含 分離的層粘連蛋白-521以及可藥用的載體。所述藥物組合物可任選地與其它細(xì)胞外基質(zhì) 組分一起提供。
[0024] 本公開還提供了有效地產(chǎn)生一定量的用于各種應(yīng)用的分離的層粘連蛋白-521的 方法。在這些用途的優(yōu)選實施方案中，使用了重組層粘連蛋白-521。還公開了試劑盒，其包 含一定量的能有效達(dá)到所需效果的分離的層粘連蛋白-521、或其藥物組合物，以及使用它 們的說明書。
[0025] 本公開還提供了用于以單層培養(yǎng)物方式（有利于細(xì)胞同質(zhì)性）培養(yǎng)干細(xì)胞的方 法、在單細(xì)胞懸液中從細(xì)胞培養(yǎng)平板或其它細(xì)胞支持物上移除干細(xì)胞的方法、以及在單細(xì) 胞懸液中重新接種干細(xì)胞以在顯著稀釋條件下進(jìn)行傳代和擴(kuò)增從而使得干細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò) 增并大規(guī)模生產(chǎn)該細(xì)胞的方法。
[0026] 在進(jìn)一步的方面，本公開描述了以單層培養(yǎng)方式在層粘連蛋白-521上培養(yǎng)多能 干細(xì)胞，在單細(xì)胞懸液中從細(xì)胞培養(yǎng)平板以及其它細(xì)胞支持材料上移除干細(xì)胞，并且將來 自于單細(xì)胞懸液中的干細(xì)胞以單層細(xì)胞的方式接種在含有層粘連蛋白-521的基質(zhì)上，以 使得該工藝可以用自動化機(jī)器人系統(tǒng)高效進(jìn)行。
[0027] 在進(jìn)一步的方面，本公開提供了改進(jìn)的醫(yī)療器件和植入物，其中所述改進(jìn)包括提 供具有有效量的分離的層粘連蛋白-521的醫(yī)療器件和植入物。
[0028] 在進(jìn)一步的方面，本公開通過向細(xì)胞培養(yǎng)裝置（用于細(xì)胞粘附和隨后的細(xì)胞停留 (stasis)、增殖、分化和/或遷移）提供有效量的分離的層粘連蛋白-521，提供了改進(jìn)的細(xì) 胞培養(yǎng)裝置，以及制造改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的方法，以用于使培養(yǎng)中的細(xì)胞生長并保持表 型。
[0029] 在其它方面，本公開提供了用于在體外培養(yǎng)未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞并使其快 速擴(kuò)增的組合物（例如人重組層粘連蛋白-521)和方法。該方法包括將人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行 單細(xì)胞解離，以及在不含任何Rho-相關(guān)激酶（ROCK)抑制劑（例如不含Y-27632)(參見文 獻(xiàn)"Watanabeetal·，NatureBiotechnology25, 681-686 (2007)"）的培養(yǎng)基中將它們接種 在包被有層粘連蛋白-521的細(xì)胞培養(yǎng)皿上。與常規(guī)的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物相比，這種改進(jìn) 為人胚胎干細(xì)胞在多能狀態(tài)下更快地擴(kuò)增提供了可能性。
[0030] 在進(jìn)一步的方面，本公開提供了新材料，例如人重組層粘連蛋白-521，其使得人胚 胎細(xì)胞在解離為單細(xì)胞懸液后能夠存活。這種改進(jìn)使人胚胎干細(xì)胞的克隆存活力增強(qiáng)，這 可能有利于分離克?。ɡ缭诨虿僮髦螅┗颢@得同質(zhì)且均勻的人胚胎干細(xì)胞群。
[0031] 在一些實施方案中公開了分離的重組層粘連蛋白-521，該重組層粘連蛋白-521 包含：α鏈，其包含與多肽序列SEQIDNO: 1有至少80% -致性的多肽；β鏈，其包含與多 肽序列SEQIDΝ0:2有至少70% -致性的多肽；以及γ鏈，其包含與多肽序列SEQIDΝ0:3 有至少70% -致性的多肽；其中所述α鏈、β鏈和γ鏈裝配成重組層粘連蛋白-521。
[0032] 在進(jìn)一步的實施方案中，所述α鏈多肽與所述多肽序列SEQIDNO: 1有至少90% 的一致性。所述β鏈多肽也可以與所述多肽序列SEQIDNO:2有至少90%的一致性。所 述Y鏈多肽也可以與所述多肽序列SEQIDN0:3有至少90%的一致性。
[0033] 在其它實施方案中，所述α鏈具有SEQIDNO: 1所示的多肽序列。此外，所述β 鏈可具有SEQIDΝ0:2所示的多肽序列。更具體而言，所述γ鏈可具有SEQIDΝ0:3所示 的多肽序列。
[0034]β鏈多肽可具有與多肽序列SEQIDNO:2至少80%的一致性。Y鏈多肽可具有 與多肽序列SEQIDNO:3至少80%的一致性。
[0035] 在實施方案中還公開了藥物組合物，其包含：a)權(quán)利要求1所述的分離的重組層 粘連蛋白-521 ;和b)可藥用的載體。
[0036] 在實施方案中還公開了能使在體外生長的多能干細(xì)胞自我更新（selfrenewal) 的組合物，其包含生長介質(zhì)和覆蓋在其上的包被物，所述包被物包含重組層粘連蛋白 521 (層粘連蛋白-11)。
[0037] 所述組合物還可包含生長因子。
[0038] 所述組合物可不含任何分化抑制劑。所述組合物還可不含任何飼養(yǎng)細(xì)胞。所述組 合物還可不含任何分化誘導(dǎo)物。在一些實施方案中，所述組合物不含任何分化抑制劑、飼養(yǎng) 細(xì)胞或分化誘導(dǎo)物。
[0039] 在實施方案中還公開了在體外保持多能干細(xì)胞的多能性的方法，包括：提供基底， 該基底包含生長介質(zhì)和覆蓋在其上的包被物，所述包被物包含重組層粘連蛋白521 (層粘 連蛋白-11);使多能干細(xì)胞解離為單細(xì)胞懸液；以及將所述單細(xì)胞懸液中的多能干細(xì)胞接 種在所述包被物上。
[0040] 生長介質(zhì)可包含一種生長因子或多種生長因子。示例性生長因子包括堿性成纖維 細(xì)胞生長因子和胰島素生長因子。
[0041] 有時，所述生長介質(zhì)和所述包被物不含任何分化抑制劑。例如，不存在白血病抑制 因子。
[0042] 所述組合物可不含任何飼養(yǎng)細(xì)胞，例如小鼠成纖維細(xì)胞或人包皮成纖維細(xì)胞。所 述組合物可不含任何分化誘導(dǎo)物，如頭蛋白或角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子。在一些實施方案中， 所述組合物不含任何分化抑制劑、飼養(yǎng)細(xì)胞或分化誘導(dǎo)物。
[0043] 可以以單層將所述多能干細(xì)胞接種在層粘連蛋白-521包被物上。
[0044] 所述多能干細(xì)胞可以以200個細(xì)胞/mm2或更低的密度接種在所述包被物上?？晒?選擇的是，所述多能干細(xì)胞可以以200個細(xì)胞/mm2或更高的密度接種在所述包被物上?？?供選擇的是，可以以任意兩個干細(xì)胞彼此不接觸的方式將所述多能干細(xì)胞接種在所述包被 物上。
[0045] 實施方案中還公開了由以下方法制備的分離的層粘連蛋白-521，所述方法包括： 提供表達(dá)重組層粘連蛋白-521的宿主細(xì)胞，其中所述重組層粘連蛋白-521包含：第一鏈， 其包含與多肽序列SEQIDN0:1有至少80% -致性的多肽；第二鏈，其包含與多肽序列SEQ IDNO: 2有至少70% -致性的多肽；以及第三鏈，其包含與多肽序列SEQIDNO: 3有至少 70% -致性的多肽；其中所述第一鏈、第二鏈和第三鏈裝配成重組層粘連蛋白-521。在刺 激所述重組層粘連蛋白-521鏈表達(dá)的條件下，使所述宿主細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長；使宿 主細(xì)胞培養(yǎng)基通過柱，其中所述柱包含能與所述重組層粘連蛋白-521結(jié)合的化合物；洗滌 所述柱以除去未結(jié)合的物質(zhì)；以及從所述柱上將所述結(jié)合的重組層粘連蛋白-521洗脫下 來。
[0046] 在其它實施方案中描述了在體外保持多能干細(xì)胞的多能性的方法，包括：取得其 上具有包被物的基底，所述包被物包含完整的層粘連蛋白；將多能干細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基置 于所述基底上；以及激活PI3-激酶/Akt通路。
[0047] 所述完整的層粘連蛋白可為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋白-511。在一些實施方 案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基不含任何生長因子，如β成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)。所述包被物 還可包含鈣粘蛋白。所述多能干細(xì)胞可以以200個細(xì)胞/mm2或更低的密度接種在所述包 被物上。
[0048] 本公開還涉及可以用于保持干細(xì)胞處于多能狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)基。在不同的實施方 案中描述了為多能干細(xì)胞提供營養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含大于〇至3. 9ng/mL的堿性成纖維 細(xì)胞生長因子（bFGF)。
[0049] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基可包含3. 5ng/mL或更少的bFGF,包括0.5ng/mL至3. 5ng/mL的 bFGF〇
[0050] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基還可包含至少一種無機(jī)鹽、至少一種微量礦物質(zhì)（trace mineral)、至少一種能量物質(zhì)、至少一種脂類、至少一種氨基酸、至少一種維生素或至少一 種附加生長因子。在特定的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基還包含至少一種無機(jī)鹽、至少一種 微量礦物質(zhì)、至少一種能量物質(zhì)、至少一種脂類、至少一種氨基酸和至少一種維生素。
[0051] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基可不含以下物質(zhì)中的任意一者：（1)白蛋白，（2)胰島素或胰島素 替代物，或（3)轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物。
[0052] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基還可包含白蛋白、胰島素、氯化鋰、GABA、TGFP1、哌啶酸、L-谷氨 酰胺、MEM非必需氨基酸溶液和DMEM/F12溶液。
[0053] 所述細(xì)胞培養(yǎng)基還可包含至少一種附加生長因子、至少一種微量礦物質(zhì)和至少一 種脂類。
[0054] 還公開了一種保持多能干細(xì)胞的體系，包含：細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有大于0至3. 9ng/ mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF);和為干細(xì)胞提供支持的基底。
[0055] 所述基底可包含層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋白-511。所述基底還可包含鈣粘蛋 白。
[0056] 下面將更詳細(xì)地描述本公開的這些以及其它的非限定性特征。
[0057] 附圖簡要說明
[0058] 本專利或申請文件包括至少一幅帶有顏色的圖。在提出請求并支付必要費用后， 官方將提供附有彩圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本。
[0059] 下面是附圖的簡要說明，其目的在于說明本文所公開的示例性實施方案，而不是 為了對其進(jìn)行限制的目的。
[0060] 圖1為重組層粘連蛋白分子的旋轉(zhuǎn)式投影電子顯微鏡照片。
[0061] 圖2不出了層粘連蛋白α、β和γ鏈的結(jié)構(gòu)基序。N端、內(nèi)部和C端的球狀結(jié)構(gòu) 域用白色橢圓形表示。卷曲螺旋形成結(jié)構(gòu)域（I和II)用白色長方形表示。棒狀結(jié)構(gòu)（V、 IIIb和IlIa結(jié)構(gòu)域）用灰色長方形表示。
[0062] 圖3示出了使用SDS-PAGE對人重組層粘連蛋白-521進(jìn)行鑒定的結(jié)果。在非還 原（標(biāo)記為ΟΧ)和還原（標(biāo)記為red)條件下進(jìn)行重組層粘連蛋白-521的免疫印跡。將 3-8%凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后用抗層粘連蛋白a5(2F7)、β2(ΜΑΒ2066)、 βUMAB1921)和γ1(Η-19)的抗體進(jìn)行染色。
[0063] 圖4和圖5示出了對培養(yǎng)1天后粘附至包被有以下物質(zhì)的培養(yǎng)皿中的人ES細(xì)胞 的結(jié)晶紫染色結(jié)果，所述物質(zhì)為Matrigel(Mg)、鼠層粘連蛋白-111 (mLNlll)、人重組-層 粘連蛋白-511 (r-層粘連蛋白-511或r-LN-511)、人重組-層粘連蛋白-521 (r-層粘連蛋 白-521或r-LN-521)、或r-層粘連蛋白-511和r-層粘連蛋白-521的混合物（mix)。在圖 4中，在不存在ROCK抑制劑的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。在圖5中，在存在ROCK抑制劑Y-27632 的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0064] 圖6為示出在不存在ROCK抑制劑下培養(yǎng)1小時后，人ES細(xì)胞對包被有人r-層粘 連蛋白-521 (記為LN521)、人r-層粘連蛋白-511 (LN511)和Matrigel(Mg)的培養(yǎng)皿的粘 附的圖。誤差線示出了測量的標(biāo)準(zhǔn)誤差（η= 3)。
[0065] 圖7為示出在不存在ROCK抑制劑下培養(yǎng)1天后，人ES細(xì)胞對包被有 Matrigel(Mg)、鼠層粘連蛋白-111 (mLNlll)、人r-層粘連蛋白-511 (LN511)、人r-層粘 連蛋白-521 (LN521)、或r-層粘連蛋白-511和r-層粘連蛋白-521的混合物（mix)的 培養(yǎng)皿的粘附的圖。還包括在培養(yǎng)1天后，對具有ROCK抑制劑和Matrigel(In&Mg)、 鼠層粘連蛋白-lll(In&mLNlll)、人r-層粘連蛋白-511(In&LN511)、人r-層粘連蛋 白-521(In&LN521)、或r-層粘連蛋白-511和r-層粘連蛋白-521的混合物（In&mix)的培 養(yǎng)皿的結(jié)果。對于這兩個實驗，將細(xì)胞以相同密度接種在相同的細(xì)胞培養(yǎng)皿上。誤差線示 出了測量的標(biāo)準(zhǔn)誤差（η= 3)。
[0066]圖8示出采用單細(xì)胞解離傳代的培養(yǎng)在r-層粘連蛋白-521(LN_521_1和 LN-521_2)上的人ES細(xì)胞的生長曲線，以及采用小簇傳代的培養(yǎng)在Matrigel(Mg_l和 Mg_2)上的人ES細(xì)胞的生長曲線。后一種情況按照文獻(xiàn)"Rodinetal.,NatureBiotechno I.，vol. 28,ρρ· 611-615(2010) " 所述對細(xì)胞進(jìn)行傳代。
[0067]圖9為在r-層粘連蛋白-521上進(jìn)行幾次單細(xì)胞解離傳代后，檢測人ES細(xì)胞的 〇CT4(多能性標(biāo)志物）的FACS分析。陽性細(xì)胞的百分比列在括號中。
[0068] 圖10為在Matrigel上采用以分開的小簇的方式傳代幾次后，檢測人ES細(xì)胞的 0CT4的FACS分析。陽性細(xì)胞的百分比列在括號中。
[0069] 圖11示出了實時定量RT-PCR分析的結(jié)果，其用于比較培養(yǎng)在人r-層粘連蛋 白-521 (LN521)上的進(jìn)行了幾次單細(xì)胞解離傳代后的人ES細(xì)胞中，以及培養(yǎng)在Matrigel 上的進(jìn)行了小簇傳代幾次后的細(xì)胞中的多能性標(biāo)志物0ct4和Nanog的mRNA轉(zhuǎn)錄本的數(shù) 目。誤差線示出了 95%置信區(qū)間。
[0070]圖12為比較接種在]\^1^61(]\%)、1^-111、1^-511和1^-521上，生長了1小時的 干細(xì)胞中的磷酸化肌球蛋白輕鏈（PHVILC)的水平的蛋白質(zhì)印跡（Westernblot)圖。
[0071]圖 13 為比較接種在]\&^1^61(]\%)、1^-111、1^-511和1^-521上，生長了6小時的 干細(xì)胞中的磷酸化肌球蛋白輕鏈（P-MLC)的水平的蛋白質(zhì)印跡圖。
[0072]圖14為比較接種在]\^1^61(]\%)、1^-111、1^-511和1^-521上，生長了5至7小 時的人胚胎干細(xì)胞的相對遷移量的圖。
[0073] 圖15為比較施加了IgG和IgM封閉抗體（IgGM)和施加了抗整聯(lián)蛋白βl(bl)的 功能性封閉抗體，生長在LN-521上的人胚胎干細(xì)胞的相對遷移量的圖。這表明封閉整聯(lián)蛋 白極大地降低了運動性。
[0074] 圖16為比較在水、01^0、1^294002仏肚抑制劑）、渥曼青霉素（？131(/^肚抑制劑） 和TO98059 (MEKl抑制劑）的存在下，hES細(xì)胞在LN-521上的相對存活率的圖。這表明PI3K/ Akt的激活是hES細(xì)胞在LN-521上存活所必要的。培養(yǎng)基中包含bFGF。
[0075] 圖17為比較在DMSO、LY294002 (Akt抑制劑）和TO98059 (MEKl抑制劑）的存在 下，hES細(xì)胞在LN-521上的相對存活率的圖。不存在外源性bFGF。
[0076] 圖18為接種在LN-521上1小時后收集并用LY294002處理的細(xì)胞與對照細(xì)胞 (DMSO)比較的蛋白質(zhì)印跡。
[0077] 圖19為接種在LN-521上1小時后收集并用PD98059處理的細(xì)胞與對照細(xì)胞 (DMSO)比較的蛋白質(zhì)印跡。
[0078]圖 20 為示出采用ELISA獲得的，接種在Matrigel(Mg)、LN-lll、LN-511 或LN-521 上1小時后收集的細(xì)胞的裂解物中的Akt2磷酸化的相對水平的圖。
[0079]圖 21 為示出采用ELISA獲得的，接種在Matrigel(Mg)、LN-lll、LN-511 或LN-521 上1小時后收集的細(xì)胞的裂解物中的Aktl磷酸化的相對水平的圖。
[0080] 圖22為示出培養(yǎng)在低bFGF培養(yǎng)基（03_3. 9)中的HS181hES細(xì)胞相比于培養(yǎng)在較 高bFGFF培養(yǎng)基（03_100)中的HS181hES細(xì)胞的生長曲線的圖。
[0081] 圖23為示出培養(yǎng)在低bFGF培養(yǎng)基（03_3. 9)中的HS181hES細(xì)胞相比于培養(yǎng)在較 高bFGFF培養(yǎng)基（03_100)中的HS181hES細(xì)胞中的兩種多能性標(biāo)志物（0ct4和Nanog)的 RNA表達(dá)的相對水平的圖。
[0082]圖24為示出新的人胚胎干細(xì)胞系HS841在層粘連蛋白-521/E-鈣粘蛋白基質(zhì)上 的早期分化的照片。

【具體實施方式】
[0083] 結(jié)合附圖，可對本文所述的組合物和方法有更完整的理解。為了方便且易于理解 本發(fā)明，這些圖僅為示意性代表圖，因此它們的意圖不在于定義或限制示例性實施方案的 范圍。
[0084] 盡管為了清楚的目的，在下文中使用了專用術(shù)語，但這些術(shù)語旨在僅用于表示被 選擇用來說明附圖的實施方案的特定結(jié)構(gòu)，并且不意味著定義或限制本公開的范圍。在附 圖和下文中，應(yīng)當(dāng)理解相似的數(shù)字標(biāo)記表示具有類似功能的組分。
[0085] 本文所述所有的出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0086] 除非另有說明，本申請所用的技術(shù)可參見幾個公知參考文獻(xiàn)中的任何一篇， 如：MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrooketal.,1989,ColdSpring HarborLaboratoryPress)、GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology, Vol. 185,editedbyD.Goeddel, 1991，AcademicPress,SanDiego,Calif·)、"Guide toProteinPurification^inMethodsinEnzymology(M.P.Deutshcer,ed., (1990) AcademicPress,Inc. )；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis etal.,1990.AcademicPress,SanDiego,Calif. ) >CultureofAnimalCells:AManual ofBasicTechnique,SecondEd. (R.I.Freshney. 1987.Liss,Inc.NewYork,N.Y. ) >Gene TransferandExpressionProtocols,pp. 109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPress Inc.，Clifton,N.J.)、或者Ambionl998Catalog(Ambion,Austin,Tex.) 〇
[0087] 本文所用的術(shù)語"分離的核酸序列"是指不含在該核酸所來自的有機(jī)體的基因組 DNA中與該核酸為天然側(cè)翼序列的基因序列（S卩，在該核酸所來自的有機(jī)體的基因組DNA中 與該所分離的核酸分子的基因相鄰的遺傳序列）的核酸序列。然而，所述"分離的"序列可 連接至與所述序列不為天然側(cè)翼序列的其它核苷酸序列，例如異源啟動子序列或其它載體 序列。對所分離的核酸序列而言，不必認(rèn)為其必須不含其它細(xì)胞物質(zhì)才是"分離的"，因為本 公開的核酸序列可以是用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的一部分（見下文）。
[0088] 本公開提供了重組表達(dá)載體，其包含人層粘連蛋白β2鏈的全長層粘連蛋白β2 鏈核酸序列（SEQIDΝ0:4)。在一些實施方案中，該表達(dá)載體含有由SEQIDΝ0:4編碼的核 酸，其被有效連接（operativelylinked)至異源啟動子（即，不是給定層粘連蛋白β2鏈 的天然存在的啟動子）上。當(dāng)啟動子能夠啟動層粘連蛋白β2鏈DNA表達(dá)為RNA時，該啟 動子和層粘連蛋白β2鏈核酸序列即被"有效連接"。
[0089] 本文所用的術(shù)語"載體"是指能夠運載其所連接的另一核酸的核酸分子。一種類型 的載體為"質(zhì)粒"，其是指能夠克隆其中的另外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA。另一種類型的 載體為病毒載體，其中另外的DNA片段可被克隆至病毒基因組。某些載體能夠自動在它們 被引入的宿主細(xì)胞中復(fù)制（如具有細(xì)菌的復(fù)制起點的細(xì)菌載體、和哺乳動物游離型載體）。 其它載體（如哺乳動物非游離型載體）在被引入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中， 從而隨著宿主基因組進(jìn)行復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)其有效連接的基因的表達(dá)。在本 文中這樣的載體稱為"重組表達(dá)載體"或簡稱為"表達(dá)載體"。在本公開中，通過將本發(fā)明的 啟動子序列有效連接至待表達(dá)的基因，本發(fā)明的啟動子序列可指導(dǎo)層粘連蛋白多肽序列的 表達(dá)。一般來講，重組DNA技術(shù)中所用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒的形式。由于質(zhì)粒是最常用 的載體形式，因此在本說明書中"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用。然而，本公開意欲包括表 達(dá)載體的其它形式，例如起到同等功能的病毒載體（如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和 腺伴隨病毒）。
[0090] 載體還可包含其它的序列，如用于亞克隆其它核酸序列的多位點接頭、或使轉(zhuǎn)錄 本進(jìn)行合適的多腺苷酸化的多腺苷酸化信號。我們認(rèn)為，多腺苷酸化信號的本性不是成功 實現(xiàn)本發(fā)明的方法的關(guān)鍵，并且可采用任何這樣的序列，包括但不限于SV40和牛生長激素 poly-A位點。預(yù)期所述載體還可以包含的元件為終止序列，其能夠用于提高信息水平并使 從構(gòu)建體到其它序列的通讀最小化。另外，表達(dá)載體通常具有選擇性標(biāo)記，其通常為抗生素 抗性基因的形式，從而能夠使攜帶這些載體的細(xì)胞被篩選出來。
[0091] 在另一實施方案中，本公開提供了被表達(dá)層粘連蛋白β2鏈的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 的宿主細(xì)胞。本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指已經(jīng)引入了本公開的核酸（如重組表達(dá)載 體）的細(xì)胞。該細(xì)胞可以為原核細(xì)胞，其可用于例如快速產(chǎn)生大量的本公開的表達(dá)載體，或 者可以為真核細(xì)胞以用于功能性研究。
[0092] 在本文中術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"可以互換使用。應(yīng)當(dāng)理解這些術(shù)語 不僅僅指特定的受試細(xì)胞，還指該細(xì)胞的子代細(xì)胞或是潛在的子代細(xì)胞。由于變異或受到 環(huán)境影響，傳代時可能發(fā)生一定的改變，因此實際上這樣的子代可能不會與母代細(xì)胞完全 相同，但它們?nèi)匀话ㄔ诒疚乃玫男g(shù)語的范圍中。
[0093] 可以用本公開的一種或多種表達(dá)載體瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。將表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染入原核或真核細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)實現(xiàn)，所述技術(shù)包括但不限于：標(biāo) 準(zhǔn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、或脂質(zhì)體介導(dǎo)的_、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的_、聚陽離子 介導(dǎo)的_、或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。（參見（例如）文獻(xiàn)"MolecularCloning:ALaboratory Manual(Sambrooketal. ,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress"；''Cultureof AnimalCells:AManualofBasicTechnique, 2ndEd. (R.I.Freshney. 1987.Liss,Inc.New York,N.Y.) "）。
[0094] 另一方面，本公開提供了由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu)成的分離的全長人層粘 連蛋白β2鏈多肽。
[0095] 本文所用的"分離的多肽"是指基本上不含其它蛋白質(zhì)（包括其它層粘連蛋白鏈） 和膠凝試劑（如聚丙烯酰胺和瓊脂糖）的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，分離的層粘連蛋白 多肽不含可檢測到的污染層粘連蛋白鏈。因此，所述蛋白可以是從天然來源分離的，或者是 從上述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中分離的重組蛋白。
[0096] 在另一方面，本公開提供了分離的層粘連蛋白-521。本文所用的術(shù)語"層粘連蛋 白-521"是指由α5、β2和Yl鏈結(jié)合在一起而形成的蛋白質(zhì)。該術(shù)語應(yīng)當(dāng)被理解為既包 括重組層粘連蛋白-521，也包括天然來源的異三聚體層粘連蛋白-521。在優(yōu)選的實施方案 中，層粘連蛋白-521包括重組層粘連蛋白-521 (或"r-層粘連蛋白-521"）。
[0097] 本文所用的術(shù)語"r-層粘連蛋白-521"是指重組異三聚體層粘連蛋白-521，其 由已經(jīng)轉(zhuǎn)染了一種或多種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞表達(dá)，所述表達(dá)載體含有至少一種編碼選自α5、β2和Y1鏈的層粘連蛋白-521鏈的核酸序列；或者是指該重組異三聚體層粘連蛋 白-521的加工或分泌形式。因此，所述r-層粘連蛋白-521可包含來自同一一個有機(jī)體或 不同有機(jī)體的α5、β2和Yl序列。各種層粘連蛋白-521鏈DNA序列是本領(lǐng)域已知的， 并且預(yù)期可以使用任意這樣的序列來制備本公開所述的r-層粘連蛋白-521。（參見，例如 "Pouliot，N.etal·,ExperimentalCellResearch261 (2):360-71，（2000)"；"Kikkawa，Y. etal·，JournalofCellSciencell3(Pt5):869-76，（2000)"；"Church，HJ.etal·， BiochemicalJournal332(Pt2) :491-8, (1998)，' ；"Sorokin，LM.etal. ,Developmental Biologyl89 (2) :285-300, (1997)" ；"Miner，JH.etal·,JournalofBiologicalChemist ry270 (48) :28523-6, (1995)" ；"Sorokin，L.etal·,EuropeanJournalofBiochemistry〗 23(2):603-10, (1994)")。在優(yōu)選的實施方案中，r-層粘連蛋白-521由重組人a5、β2和 Y 1多肽鏈形成。
[0098] 本公開包括這樣的層粘連蛋白分子，其中重組異三聚體層粘連蛋白-521中的僅 一條鏈或兩條鏈?zhǔn)怯蓛?nèi)源性層粘連蛋白-521鏈編碼的。在優(yōu)選的實施方案中，a5、β2和 Y 1多肽鏈均為重組表達(dá)的。
[0099] 層粘連蛋白-521是完整的蛋白質(zhì)。術(shù)語"完整的"是指該蛋白質(zhì)由a-鏈、β_鏈 和Y-鏈的所有結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，并且所述3條鏈結(jié)合在一起形成異三聚體結(jié)構(gòu)。該蛋白質(zhì)沒 被拆成獨立的鏈、片段或功能結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"鏈"是指層粘連蛋白的α、β或Υ鏈的整體。 術(shù)語"片段"是指包含一個、兩個或三個具有與另一分子或受體的結(jié)合活性的功能性結(jié)構(gòu)域 的任何蛋白質(zhì)片段。然而，鏈不應(yīng)當(dāng)被理解為片段，因為每條鏈都具有多于3個的這樣的結(jié) 構(gòu)域。相似地，完整的層粘連蛋白不應(yīng)當(dāng)被理解為片段。功能性結(jié)構(gòu)域的例子包括結(jié)構(gòu)域 I、II、III、IV、V、VI和G結(jié)構(gòu)域。
[0100] 層粘連蛋白-521是分泌型蛋白，其能由信號序列被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)、分泌小泡 和細(xì)胞外間隙。如果分泌型蛋白被釋放到細(xì)胞外間隙，那么該分泌型蛋白能夠經(jīng)過細(xì)胞外 加工而成為"成熟的"蛋白質(zhì)。所述加工的情況可以不同，因此可以產(chǎn)生不同形式的最終的 "成熟蛋白質(zhì)"。例如，各蛋白的a5、β2和Yl鏈的長度可以不同。然而，雖然鏈的長度不 同，但最終的成熟蛋白質(zhì)仍然具有相同的功能。本公開的分離的層粘連蛋白-521包括含有 全長多肽鏈的異三聚體，也包括任何經(jīng)所述天然加工的層粘連蛋白-521多肽鏈。
[0101] 如本文所用，層粘連蛋白-521多肽鏈?zhǔn)侵敢韵乱环N或多種多肽鏈：
[0102] (a)包含選自由R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3 和R2-R4 組成 的組中的多肽結(jié)構(gòu)的多肽鏈，其中Rl為氨基末端甲硫氨酸；R2為能引導(dǎo)多肽分泌的信號序 列，其中該信號序列可以為針對特定的層粘連蛋白鏈的天然信號序列、或者是另一種分泌 型蛋白的信號序列、或者是人工序列；R3為分泌型的層粘連蛋白鏈，其選自由α5鏈、β2鏈 和Y1鏈組成的組中；并且R4為還包含附加表位（如下文所述的那些）的分泌型的α5、 β2或γ1層粘連蛋白鏈，所述附加表位可位于所述層粘連蛋白鏈氨基酸序列的任意位置； 或
[0103] (b)由在高或低嚴(yán)格條件下與本文公開的一種或多種重組層粘連蛋白-521鏈DNA 序列（SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6)的編碼區(qū)或編碼區(qū)的一部分雜交或者與它 們的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸編碼的多肽鏈；或
[0104] (C)與本文所公開的一種或多種層粘連蛋白-521多肽鏈氨基酸序列（SEQID N0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3)有至少70% -致性的多肽鏈，優(yōu)選有至少80%的一致性， 最優(yōu)選有至少約90%的一致性。
[0105] 本文所用的雜交"嚴(yán)格度"或"嚴(yán)格條件"是指核酸雜交體的洗滌條件，在該條件下 被洗滌時該核酸雜交體是穩(wěn)定的。本公開還包括在高嚴(yán)格條件下（如本文中所定義）與本 文所公開的層粘連蛋白鏈多核苷酸的編碼序列的全部或一部分雜交或者與它們的互補(bǔ)序 列雜交的核酸。該雜交核酸的雜交部分的長度通常為至少50個核苷酸。如本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的，雜交體的穩(wěn)定性由該雜交體的解鏈溫度（Tm)反映。序列同源性每降低1%， Tm降低約1°C至1.5°C。通常，雜交體的穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)。通常，雜交反 應(yīng)在嚴(yán)格度較低的條件下進(jìn)行，然后在不同且較高的嚴(yán)格度下洗滌。如本文所用，高嚴(yán)格度 是指在以下溶液中在42°C下孵育過夜，然后將濾膜在約65°C下在0.IXSSC中洗滌，所述溶 液包含50%甲酰胺、5\33(：(75〇1111似(：1、751111檸檬酸鈉）、5〇1111磷酸鈉（?!17.6)、5\鄧哈特 溶液（〇6111^1(11:'8 8〇1111:;[011)、10(%硫酸葡聚糖和2(^8/1111變性的、切斷的鮭魚精子0嫩。
[0106] 本發(fā)明還包括在嚴(yán)格度較低的雜交條件下與本公開的多核苷酸雜交的編碼層粘 連蛋白-521的核酸序列。改變雜交的嚴(yán)格度以及檢測信號主要通過控制甲酰胺的濃度 (甲酰胺的百分比較低導(dǎo)致嚴(yán)格度較低）、鹽濃度或溫度來完成。例如，低嚴(yán)格條件包括在 以下溶液中在37°C下孵育過夜，然后在50°C下用1XSSPE、0. 1%SDS洗滌，所述溶液包含 6XSSPE(20XSSPE= 3MNaCl;0·2ΜNaH2PO4 ;0·02ΜEDTA,pH7. 4)、0.5%SDS、30% 甲酰胺、 100μg/ml鮭魚精子封閉DNA。此外，為了達(dá)到更低的嚴(yán)格度，嚴(yán)格雜交后進(jìn)行的洗滌可以 在更高的鹽濃度（如5XSSC)下完成。
[0107] 請注意，上述條件的改變可以通過引入和/或替換可選的封閉試劑來完成，所述 封閉試劑用于抑制雜交實驗的背景信號。典型的封閉試劑包括鄧哈特試劑（Denhardt'S reagent)、BLOTTO、肝素、變性鮭魚精子DNA、以及市售的專用制劑。由于相容性的問題，可 能需要對上述雜交條件進(jìn)行改變來包含具體的封閉試劑。
[0108] 如本文所用，兩種氨基酸或兩種核酸的"一致性"百分比是采用由Karlin和 Altschul提出（參見"Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264.2268, 1990"）并由Karlin 和Altschul改進(jìn)（參見"Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877, 1993"）的算法確定 的。該算法被并入Altschul等（參見"J.Mol.Biol. 215:403-410, 1990"）的NBLAST和 XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索利用NBLAST程序進(jìn)行，設(shè)定分值為100,詞長=12,從 而確定核苷酸序列與本公開核酸分子的一致性。BLAST蛋白搜索是用XBLAST程序進(jìn)行 的，設(shè)定分值=50,詞長=3,從而確定氨基酸序列與本公開多肽的一致性。為了獲得空 位比對（gappedalignment)結(jié)果以進(jìn)行比較，按照Altschul等（SM"NucleicAcids. Res. 25:3389-3402, 1997"）所述使用GappedBLAST。當(dāng)使用BLAST和GappedBLAST程序 時，使用相應(yīng)程序（如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。
[0109] 本公開的進(jìn)一步的實施方案包括編碼層粘連蛋白-521鏈多肽的多核苷酸，所述 層粘連蛋白-521鏈多肽與包含在SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6中的一種或 多種多肽序列有至少70%的一致性，優(yōu)選至少80%的一致性，最優(yōu)選至少90%的一致性。 [0110] 如本文所用，"α5多核苷酸"是指編碼層粘連蛋白α5鏈的多核苷酸。該多核苷 酸可以由以下一者或多者表征：（a)編碼與選自SEQIDN0:5的序列有至少70 % -致性、 優(yōu)選80%-致性、最優(yōu)選至少90%-致性的多肽的多核苷酸；(b)在低或高嚴(yán)格條件下與 SEQIDNO: 5的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸；或（c)編碼具有選自由R1-R2-R3、 R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4組成的組中的通用結(jié)構(gòu)的層粘連蛋白α5 鏈多肽的多核苷酸，其中Rl和R2如上所述，R3為分泌型的α5鏈，R4為含有附加表位的分 泌型的α5鏈。
[0111] 如本文所用，"β2多核苷酸"是指編碼同名的β2層粘連蛋白鏈的多核苷酸。該多 核苷酸可以由以下一者或多者表征：（a)編碼與SEQIDΝ0:4的序列有至少70%-致性、優(yōu) 選至少80%-致性、最優(yōu)選至少90%-致性的多肽的多核苷酸；(b)在低或高嚴(yán)格條件下 與SEQIDNO: 4的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸；或（c)編碼具有選自R1-R2-R3、 R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3和R2-R4中的通用結(jié)構(gòu)的多肽的多核苷酸，其中Rl 和R2如上所述，R3為分泌型的β2鏈，R4為含有附加表位的分泌型的β2鏈。
[0112] 如本文所用，"Y1多核苷酸"是指編碼同名的Y1層粘連蛋白鏈的多核苷酸。該 多核苷酸可以由以下一者或多者表征：（a)編碼與SEQIDΝ0:6的序列具有至少70%-致 性、優(yōu)選至少80%-致性、最優(yōu)選至少90%-致性的多肽的多核苷酸；(b)在低或高嚴(yán)格 條件下與SEQIDNO:6的編碼序列或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸；或（c)編碼具有選自 R1-R2-R3、R1-R2-R4、R3、R4、R1-R3、R1-R4、R2-R3 和R2-R4 中的通用結(jié)構(gòu)的多肽的多核苷 酸，其中Rl和R2如上所述，R3為分泌型的γ1鏈，R4為含有附加表位的分泌型的γ1鏈。
[0113] 本文所用的術(shù)語"附加表位"是指作為嵌合蛋白的一部分被表達(dá)的多肽序列，其中 該附加表位為用于與針對該附加表位而產(chǎn)生的抗體結(jié)合的識別位點，或者為用于與其它分 子結(jié)合的識別位點，所述其它分子可以用于親和純化含有該表位的序列。
[0114] 在優(yōu)選的實施方案中，將編碼層粘連蛋白α5、β2和Y1鏈、或它們的片段的cDNA 亞克隆至表達(dá)載體中?？晒┻x擇的是，可以使用包含一個或多個內(nèi)含子的層粘連蛋白α5、 β2和/或Yl基因序列，將它們亞克隆至表達(dá)載體中。
[0115] 在其它方面，本公開提供了表達(dá)層粘連蛋白-521的細(xì)胞，該細(xì)胞已被包含與核酸 序列有效連接的啟動子序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，所述核酸序列編碼至少一種包含選自由層粘 連蛋白-521的α5、β2和γ1鏈組成的組中的序列的多肽序列，其中所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能 分泌含有重組層粘連蛋白鏈的異三聚體層粘連蛋白-521。在優(yōu)選的實施方案中，該細(xì)胞被 包含與核酸序列有效連接的啟動子序列的多個重組表達(dá)載體系統(tǒng)地轉(zhuǎn)染，所述核酸序列編 碼包含層粘連蛋白-521的α5、β2和γ1鏈（它們更優(yōu)選均為人類來源的鏈）的多肽序 列。多重轉(zhuǎn)染后，該細(xì)胞表達(dá)重組層粘連蛋白-521鏈，其然后形成異三聚體r-層粘連蛋 白-521。
[0116] 將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中可通過本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)完成,所述技術(shù)包括 但不限于：磷酸鈣共沉淀、電穿孔、或脂質(zhì)體介導(dǎo)的-、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的-、聚陽離子介導(dǎo) 的_、或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可通過標(biāo)準(zhǔn)方法完成。
[0117] 在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法以及選擇已被合適轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。在其它優(yōu)選的實施方案中，在人胚腎293細(xì)胞系中使用CMV 啟動子驅(qū)動的表達(dá)載體。
[0118] 可以使用能表達(dá)和分泌r-層粘連蛋白-521的任意細(xì)胞。優(yōu)選地，使用真核細(xì)胞， 并且最優(yōu)選地使用哺乳動物細(xì)胞，其包括但不限于腎和上皮細(xì)胞系。用于驅(qū)動單個的鏈或 r-層粘連蛋白-521的表達(dá)的啟動子序列可以是組成型的（由各種啟動子中的任意啟動子 啟動，包括但不限于〇1^、5￥40、1?￥、肌動蛋白3朽或誘導(dǎo)型的（由各種可誘導(dǎo)的啟動子中 的任意啟動子啟動，包括但不限于四環(huán)素、蛻皮激素、類固醇應(yīng)答性的啟動子）。認(rèn)為糖類和 二硫化物翻譯后修飾是層粘連蛋白-521折疊和發(fā)揮功能所必需的。這使得優(yōu)選使用真核 細(xì)胞來制備功能性r-層粘連蛋白-521，盡管其它體系有利于獲得（例如）用于生產(chǎn)抗體的 抗原。在最優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物細(xì)胞不會內(nèi)源性表達(dá)層粘連蛋白β2鏈。在其它 優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞不會內(nèi)源性表達(dá)所有層粘連蛋白-521鏈。
[0119] 所述蛋白可包含有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)純化的附加序列，例如附加表位和轉(zhuǎn)運信號。 所述附加表位的例子包括但不限于FLAG(SigmaChemical公司，圣路易斯，密蘇里州）、 myc(9E10)(Invitrogen公司，卡爾斯班，加利福尼亞州）、6_His(Invitrogen公司；Novagen 公司，麥迪遜，威斯康星州）、和HA(BoehringerManheimBiochemicals公司）。所述轉(zhuǎn)運 信號的例子包括但不限于輸出信號、分泌信號、核定位信號和質(zhì)膜定位信號。
[0120] 在一些實施方案中，至少一種層粘連蛋白鏈多肽序列或其片段被有效與編碼"附 加表位"的核酸序列連接，從而至少一種所述鏈被表達(dá)為具有所表達(dá)的附加表位的融合蛋 白。附加表位可以表達(dá)作為氨基末端、羧基末端、或位于含有r-層粘連蛋白-521的任意多 肽鏈的內(nèi)部，只要所得r-層粘連蛋白-521仍然具有功能性即可。
[0121] 在其它實施方案中，r-層粘連蛋白-521鏈中的一種被表達(dá)為具有第一附加表位 的融合蛋白，并且至少另一種r-層粘連蛋白鏈被表達(dá)為具有不同的第二附加表位的融合 蛋白。這允許進(jìn)行多次純化?？晒┻x擇的是，可以將相同的附加表位用于制備具有多于一 種r-層粘連蛋白鏈的融合蛋白。
[0122] 在進(jìn)一步的實施方案中，可以將附加表位設(shè)計為可從r-層粘連蛋白-521鏈上切 除。可供選擇的是，沒有附加表位與任何r-層粘連蛋白-521鏈融合，r-層粘連蛋白-521 通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離，所述技術(shù)包括但不限于使用層粘連蛋白-521特異性抗體或其它的層 粘連蛋白-521結(jié)合性分子的親和層析。
[0123] 首先通過蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)法，利用層粘連蛋白鏈特異性抗體對被單一 層粘連蛋白鏈轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)染后通常在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單一層粘連蛋白 鏈。通過任意適當(dāng)?shù)姆椒z測顯示出對單一一種所轉(zhuǎn)染的鏈有反應(yīng)性的克隆，從而確定引 入了所轉(zhuǎn)染的基因，所述方法例如PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、或核酸雜交。優(yōu)選的是，通過PCR，利用 層粘連蛋白鏈特異性引物對對由所述克隆制備的基因組DNA進(jìn)行分析。通過任意合適的方 法（包括蛋白質(zhì)印跡分析和細(xì)胞結(jié)合檢驗）對產(chǎn)生所有三種鏈的轉(zhuǎn)染克隆的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn) 一步分析，從而分析r-層粘連蛋白-521的分泌和/或活性。
[0124] 在優(yōu)選的實施方案中，通過使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基通過抗體親和柱來完成r-層粘 連蛋白-521的純化。在一些實施方案中，將針對在至少一種重組鏈上表達(dá)的多肽表位的抗 體連接至親和柱，該抗體會與分泌到培養(yǎng)基中的r-層粘連蛋白-521結(jié)合。通過使過量的 多肽流過柱子來從柱子上除去r-層粘連蛋白-521。利用任意合適的方法分析洗脫部分，所 述方法包括凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析。在另一實施方案中，純化后可切除多肽表位。在 其它實施方案中，兩種或三種獨立的r-層粘連蛋白鏈被表達(dá)為融合蛋白，每種均具有不同 的附加表位，從而允許兩次或三次純化以及雙重或三重分離的r-層粘連蛋白-521?？梢栽O(shè) 計附加表位，使得純化后附加表位可以從r-層粘連蛋白-521鏈上切除。可供選擇的是，沒 有附加表位與任何r-層粘連蛋白-521鏈融合，r-層粘連蛋白-521通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離，所 述技術(shù)包括但不限于使用層粘連蛋白-521特異性抗體或其它的層粘連蛋白-521結(jié)合性分 子的親和層析。
[0125] 在其它實施方案中，通過使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基通過凝膠過濾層析柱來完成r-層 粘連蛋白-521的純化。通過任意合適的方法分析洗脫部分，所述方法包括凝膠電泳和蛋白 質(zhì)印跡分析。收集含有r-層粘連蛋白-521的部分并通過任意合適的方法評價樣品的純 度，所述方法包括凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析。在一些實施方案中，可以使蛋白質(zhì)溶液再次 通過凝膠過濾層析柱以獲得更高純度的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，為了使r-層粘連蛋 白-521溶液達(dá)到更高的純度，可以使經(jīng)前述純化步驟獲得的培養(yǎng)基或r-層粘連蛋白-521 溶液通過離子交換柱。通過任意合適的方法分析洗脫部分，所述方法包括凝膠電泳和蛋白 質(zhì)印跡分析。收集含有r-層粘連蛋白-521的部分并通過任意合適的方法（包括上述方 法）評價樣品的純度。
[0126] 本公開的層粘連蛋白-521多肽鏈還包括：（i) 一個或多個非保守性氨基酸殘基的 替換，其中替換的氨基酸殘基可以由或不由遺傳密碼編碼，或（ii) 一個或多個具有取代基 的氨基酸殘基的替換，或（iii)成熟多肽與另一種化合物的融合，所述化合物為，例如，能 增加多肽的穩(wěn)定性和/或可溶性的化合物（例如聚乙二醇），或（iv)多肽與其它氨基酸的 融合，例如IgGFc融合區(qū)肽段、或?qū)蚧蚍置谛蛄小⒒蚶诩兓男蛄?。本領(lǐng)域技術(shù)人員根 據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)能夠理解該變體多肽在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0127] 例如，包含將帶電氨基酸替換為其它帶電或中性氨基酸的多肽變體可以產(chǎn)生具有 改善的特征（例如減少聚集）的蛋白質(zhì)。由于聚集體的免疫活性，藥物配制物的聚集會降低 活性并提高清除率（參見文獻(xiàn)："Pinckardetal.，Clin.Exp.Immunol. 2:331-340 (1967) "； "Robbinsetal.,Diabetes36:838_845(1987)";"Clelandetal·,Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrierSystemslO:307-377(1993)"）。
[0128] 在特定的實施方案中，分離的層粘連蛋白-521包含3條鏈。第一鏈包含與多肽序 列SEQIDNO: 1 (即α5層粘連蛋白鏈）有至少80%-致性的多肽。第二鏈包含與多肽序 列SEQIDΝ0:2(即β2層粘連蛋白鏈）有至少70%-致性的多肽。第三鏈包含與多肽序 列SEQIDN0:3(S卩Yl層粘連蛋白鏈）有至少70%-致性的多肽。這些第一鏈、第二鏈和 第三鏈裝配成重組層粘連蛋白-521。
[0129] 在更具體的實施方案中，第一鏈的多肽與多肽序列SEQIDNO: 1具有至少80%的 一致性，第二鏈的多肽與多肽序列SEQIDN0:2具有至少80%的一致性，第三鏈的多肽與多 肽序列SEQIDNO:3具有至少80%的一致性。
[0130] 在更具體的實施方案中，第一鏈的多肽與多肽序列SEQIDNO: 1具有至少90%的 一致性，第二鏈的多肽與多肽序列SEQIDN0:2具有至少90%的一致性，第三鏈的多肽與多 肽序列SEQIDNO:3具有至少90%的一致性。
[0131] 在具體的實施方案中，第一鏈包含多肽序列SEQIDNO: 1，第二鏈包含多肽序列 SEQIDN0:2,第三鏈包含多肽序列SEQIDN0:3。
[0132] 在具體的實施方案中，第一鏈為多肽序列SEQIDNO:1，第二鏈為多肽序列SEQID N0:2,第三鏈為多肽序列SEQIDN0:3。
[0133] 本公開還提供了包含分離的層粘連蛋白-521和可藥用的載體的藥物組合物。在 優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物包含分離的r-層粘連蛋白-521。根據(jù)本公開的這些方 面，根據(jù)所處理的病癥，所述藥物組合物可以包含其它試劑。所述藥物組合物還可包含一種 或多種其它化合物，其包括但不限于以下物質(zhì)中的任意一者，所述物質(zhì)為膠原、其它種類的 層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、鈣粘蛋白、整聯(lián)蛋白、α-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、觸覺蛋白 /巢蛋白、α-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、糖蛋白、蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、粘多糖、表 皮生長因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、或神經(jīng)生長因子、及其多肽片 段。
[0134] 包含分離的層粘連蛋白-521的藥物制劑可以被制備為任意合適的形式，并且其 通常包含分離的層粘連蛋白-521以及可藥用的載體。所述載體可以為可注射載體、局部載 體、透皮載體等。所述制劑可以有利地為用于局部給藥的形式，例如軟膏、凝膠、乳劑、噴霧 齊?、分散劑、懸浮劑或糊劑。所述制劑還可在組合物中有利地包含防腐劑、抗菌劑、抗真菌 齊U、抗氧化劑、滲透劑和類似物質(zhì)，并且其量為常規(guī)用量。用于本公開的合適的溶液為無菌 的，并且是對所需應(yīng)用無害的，并且可經(jīng)過常規(guī)的藥劑操作如滅菌和/或可包含常規(guī)的佐 齊U，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖劑等。為了幫助配制本公開的組合物，可參見文 獻(xiàn)''Remington'sPharmaceuticalSciences, 15thEd. ,MackPublishingCo. ,Easton,Pa. (1975)，，。
[0135] 在進(jìn)一步的方面，本公開包括生物相容性提高的醫(yī)療器件，其中該器件的外表面 包被有分離的層粘連蛋白-521或其藥物組合物，該分離的層粘連蛋白-521或其藥物組合 物單獨包被或與用于提高器件表面的生物相容性的其它蛋白質(zhì)或試劑一起包被。經(jīng)包被的 器件可刺激細(xì)胞粘附（如內(nèi)皮細(xì)胞粘附），并且可在該器件的植入部位提供減少的炎癥和/ 或感染。
[0136] 該醫(yī)療器件可以為用于植入體內(nèi)的任意材料，并且優(yōu)選由生物相容性金屬（如不 銹鋼或鈦）制備或包被?？晒┻x擇的是，該器件由陶瓷材料或聚合物制備或包被，所述聚合 物如聚酯、聚乙醇酸或聚半乳糖-聚乙醇酸共聚物。
[0137] 如果所述器件是由天然或合成的生物可降解性材料制成的網(wǎng)、片或織物的形式， 那么分離的層粘連蛋白-521或其藥物組合物可以直接涂敷于其表面。然后可將合適的細(xì) 胞培養(yǎng)在該基質(zhì)上以形成可移植的或可植入的器件，包括牙科支持片、針、金屬針或棒；留 置導(dǎo)管；結(jié)腸造口術(shù)管；外科用網(wǎng)狀物以及任意其它需要以分離的層粘連蛋白-521包被的 器具。可供選擇的是，可以將所述器件植入，并且可使細(xì)胞在體內(nèi)粘附。
[0138] 對分離的層粘連蛋白-521的偶聯(lián)可為非共價的方式（例如通過吸附）或者是共 價的方式?？蓪⑺銎骷诜蛛x的層粘連蛋白-521或其藥物組合物中浸漬、孵育，或者用 分離的層粘連蛋白-521或其藥物組合物噴涂。
[0139] 利用本公開的分離的層粘連蛋白-521進(jìn)行各種治療的給藥方案取決于一系列因 素，包括損傷或病癥的類型、年齡、體重、性別、個體的醫(yī)療情況、病癥的嚴(yán)重程度以及給藥 途徑。因此，給藥方案可以非常廣泛，但可以由醫(yī)師利用標(biāo)準(zhǔn)方法常規(guī)地確定。層粘連蛋白 是非常有效的分子，在每個細(xì)胞中一個或幾個分子就可以產(chǎn)生效果。因此，如果優(yōu)化了給藥 方式，有效劑量可以在每暈升皮克的范圍內(nèi)。
[0140] 在其它方面，本公開提供了新的材料，即分離的層粘連蛋白-521，其使得人胚胎干 細(xì)胞在解離為單細(xì)胞懸液后能夠存活。通過胰蛋白酶-EDTA處理將干細(xì)胞解離為單細(xì)胞懸 液,離心使其成團(tuán),重懸于03培養(yǎng)基中，用40μm篩過濾，并且以3萬個細(xì)胞/cm2的密度接 種在由分離的層粘連蛋白-521、層粘連蛋白-511或Matrigel預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。培 養(yǎng)一天后，如本領(lǐng)域所知，接種在Matrigel中的細(xì)胞死亡。接種在層粘連蛋白-521上的人 胚胎干細(xì)胞，以及大部分情況下接種在層粘連蛋白-511上的人胚胎干細(xì)胞存活并開始增 殖，由此形成多能細(xì)胞的小克隆。
[0141] 在進(jìn)一步的方面，本公開提供了擴(kuò)增多能狀態(tài)下的人胚胎干細(xì)胞的方法。已經(jīng)顯 示，以單細(xì)胞懸液方式接種在層粘連蛋白-521上的人胚胎干細(xì)胞存活，并且以比本領(lǐng)域已 知的經(jīng)典方法更高的速率增殖。3代后（1個月），以單細(xì)胞懸液方式傳代的細(xì)胞經(jīng)歷了與 在Matrigel上以片的方式傳代20代（3個月）的細(xì)胞培養(yǎng)物相同的細(xì)胞分裂次數(shù)。因此， 所述新方法在時間和人力方面是有益的，其可以提供顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
[0142] 層粘連蛋白-521通常由人多能胚胎干細(xì)胞表達(dá)和分泌，并且也可見于腎、神經(jīng)肌 肉接頭、肺和胎盤。
[0143] 能夠獲得純的層粘連蛋白-521將能夠研究該蛋白對細(xì)胞分化和細(xì)胞表型維持的 影響。因此，如果能夠獲得純的完整的分離的層粘連蛋白-521，那么在包括但不限于治療 組織損傷、促進(jìn)細(xì)胞粘附、擴(kuò)增和遷移、來自體外（exvivo)的細(xì)胞療法、改善醫(yī)療器件的生 物相容性、以及制備改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置和媒介等大量的研究和治療目的方面將會取得進(jìn) 步。此外，由于層粘連蛋白-521在早期哺乳動物胚胎中表達(dá)，因此純的層粘連蛋白-521對 干細(xì)胞的影響對研究非常重要。
[0144] 因此，在本領(lǐng)域中，需要分離的層粘連蛋白-521用于研究和治療目的，并且需要 制備分離的層粘連蛋白-521的方法。層粘連蛋白-521可以作為解離的人ES和誘導(dǎo)的多 能干（iPS)細(xì)胞在化學(xué)成分完全確定、不含飼養(yǎng)細(xì)胞且不含動物蛋白質(zhì)（不含異源物）條 件下進(jìn)行長期自我更新和快速增殖的基質(zhì)?；贚N-521的體系易于使用并且易于自動化 操作，并且允許快速擴(kuò)大人ES/iPS的培養(yǎng)。
[0145] 本公開還涉及能用于為細(xì)胞（特別是干細(xì)胞）提供營養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。在這一方 面，培養(yǎng)干細(xì)胞通常需要兩種物質(zhì)：（1)為干細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持的基底或包被物；以及（2) 為干細(xì)胞提供營養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述基底或包被物（1)通常置于（例如）有蓋培養(yǎng)皿中 或其它容器中。
[0146] 本文所用的術(shù)語"自我更新"是指干細(xì)胞經(jīng)過多次細(xì)胞分裂周期并保持未分化狀 態(tài)（即多能性）的能力。多能性本身是指干細(xì)胞分化為任意細(xì)胞類型的能力。術(shù)語"增殖" 是指干細(xì)胞分裂的能力。存活是指分化或未分化的干細(xì)胞生存的能力，其不需要干細(xì)胞保 持其分裂或分化的能力。
[0147] 本公開的細(xì)胞培養(yǎng)基特別適合與含有層粘連蛋白-521和/或?qū)诱尺B蛋白-511的 基底一起使用。這些層粘連蛋白激活α6β1整聯(lián)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致PI3K/Akt通路的激活。 這增強(qiáng)了干細(xì)胞的多能性、自我更新和/或增殖。認(rèn)為基底可由完整的、獨立的鏈、或片段 形式的層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋白-511組成。重組層粘連蛋白-521和重組層粘連蛋 白-511是市售可得的。許多不同的分子可以激活PI3K/Akt通路，盡管具有不同的效率。例 如，TGFβ1和bFGF激活該通路。使用層粘連蛋白-521和/或?qū)诱尺B蛋白-511使得這些分 子在細(xì)胞培養(yǎng)基中的用量降低。層粘連蛋白-521通過α6β1整聯(lián)蛋白傳送最高劑量的信 號，由此激活PI3K/Akt通路。使用層粘連蛋白-521允許以單細(xì)胞懸液方式傳代而不需要加 入對細(xì)胞不利的rho激酶（ROCK)抑制劑來提高單細(xì)胞酶解后的細(xì)胞存活率。之前，進(jìn)行人 ES細(xì)胞單細(xì)胞酶催化傳代而不使用人工凋亡抑制劑是不可能的。傳代程序簡單化意味著實 驗方差降低，并且允許該過程自動化以進(jìn)行高通量細(xì)胞培養(yǎng)，并且導(dǎo)致不需要細(xì)胞培養(yǎng)人 員的大量訓(xùn)練和花費。另外，接種在層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋白-511上的人ES和iPS 細(xì)胞以單層生長，由于細(xì)胞相等地暴露于基質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基，因此這使得培養(yǎng)同質(zhì)化。與生 長在Matrigel上以簇的方式傳代的細(xì)胞相比，在化學(xué)成分確定且不含異源物的環(huán)境中、在 層粘連蛋白-521上生長，在缺乏ROCK抑制劑的條件下以單細(xì)胞傳代的人ES細(xì)胞培養(yǎng)物可 以以更高的生長速率連續(xù)擴(kuò)增數(shù)月。這些多能的長期擴(kuò)增的細(xì)胞均一地表達(dá)0ct4,并且保 持核型正常。因此，人們可以獲得具有持續(xù)存活和增殖能力的人ES和iPS細(xì)胞。
[0148] 相比于其它可用的基底，培養(yǎng)在層粘連蛋白-511上的細(xì)胞的平均接觸面積和鋪 展均勻性更大。在層粘連蛋白-511上生長超過3個月的人ES細(xì)胞保持了多能性，并且在 植入SCID小鼠后能產(chǎn)生畸胎瘤。層粘連蛋白-511還支持小鼠ES細(xì)胞自我更新超過5個 月，而不需要LIF或飼養(yǎng)細(xì)胞的存在，而其它已知的物質(zhì)在持續(xù)支持細(xì)胞方面卻不能超過 幾周。
[0149] 生長在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成 體干細(xì)胞、胎兒干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞、以及通常的任意多能干細(xì)胞。
[0150] 通常，細(xì)胞培養(yǎng)基包含大量的各種生長因子和細(xì)胞因子以抑制分化并提高增殖。 本公開的細(xì)胞培養(yǎng)基的一個優(yōu)點在于其不包含種類如此多或量如此高的生長因子或細(xì)胞 因子。
[0151] 最通常地，與通常使用的細(xì)胞培養(yǎng)基相比，本公開的細(xì)胞培養(yǎng)基需要較少量的堿 性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)。認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng)基可包含大于0至3. 9納克/毫升（ng/mL) 的bFGF。該bFGF為人bFGF，從而該細(xì)胞培養(yǎng)基為完全人源的且成分確定的。在一些更具 體的實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基可包含3. 5ng/mL或更少的bFGF。在其它實施方案中，所 述細(xì)胞培養(yǎng)基可包含〇. 5ng/mL至3. 5ng/mL的bFGF。在一些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可具 有零bFGF，即不存在bFGF。
[0152] 一般來講，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含液體相，其中溶解有至少一種無機(jī)鹽、至少一種微 量礦物質(zhì)、至少一種能量物質(zhì)、至少一種脂類、至少一種氨基酸、至少一種維生素和至少一 種生長因子（除bFGF之外）。下表1列出了可存在于本公開的細(xì)胞培養(yǎng)基中的各種成分， 以及存在該成分時的最低和最高濃度。數(shù)值用科學(xué)計數(shù)法表示。例如"4. 1E-01"應(yīng)當(dāng)被理 解為 4.lxlO-01。
[0153]表L
[0154]

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)胞培養(yǎng)基底，其包含層粘連蛋白和鈣粘蛋白，其中所述層粘連蛋白為完整的 蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋 白-511。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述層粘連蛋白為有效的重組層粘連蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述鈣粘蛋白為e_鈣粘蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 15:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 10:1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基底，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述鈣粘 蛋白為e_|丐粘蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基底，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量 比為約5:1至約15:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基底，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量 比為約5:1至約10:1。
10. -種細(xì)胞培養(yǎng)體系，包含： 細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含至少〇. 3mM的白蛋白；以及 基底，其包含層粘連蛋白和鈣粘蛋白，其中所述層粘連蛋白為完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì) 片段。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為加入了附加的白蛋白使白蛋 白濃度達(dá)到至少0. 3mM的mTeSRl培養(yǎng)基。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為含有約0.39mM白蛋白的 mTeSRl培養(yǎng)基。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述白蛋白為人血清白蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的體系，其中所述人血清白蛋白為重組人血清白蛋白。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋 白-511。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白為有效的重組層粘連蛋白。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白。
18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 15:1.
19. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 10:1。
20. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述鈣 粘蛋白為e_ |丐粘蛋白。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的體系，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約15:1.
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的體系，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約10:1。
23. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述基底和所述培養(yǎng)基不含任何分化抑制劑、 飼養(yǎng)細(xì)胞、分化誘導(dǎo)物或凋亡抑制劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述 鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白，所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量比為約5:1至約 15:1，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)基為含有約0. 39mM白蛋白的mTeSRl培養(yǎng)基。
25. -種細(xì)胞培養(yǎng)體系，包含： mTeSRl細(xì)胞培養(yǎng)基；以及 基底，其包含層粘連蛋白和鈣粘蛋白，其中所述層粘連蛋白為完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì) 片段。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中加入附加的白蛋白以使白蛋白終濃度達(dá)到至少 0? 3mM〇
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中加入附加的白蛋白以使白蛋白終濃度達(dá)到約 0. 39mM。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋 白-511。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白為有效的重組層粘連蛋白。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白。
31. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 15:1。
32. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 10:1。
33. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述鈣 粘蛋白為e_ |丐粘蛋白。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的體系，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約15:1。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的體系，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約10:1。
36. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述基底和所述培養(yǎng)基不含任何分化抑制劑、 飼養(yǎng)細(xì)胞、分化誘導(dǎo)物或凋亡抑制劑。
37. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的體系，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述 鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白，所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量比為約5:1至約 15:1，并且所述mTeSRl培養(yǎng)基含有約0. 39mM白蛋白。
38. -種保持干細(xì)胞的方法，包括： 將所述干細(xì)胞接種在含有層粘連蛋白和鈣粘蛋白的基底上，其中所述層粘連蛋白為完 整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段；以及 將所述干細(xì)胞暴露于含有至少〇. 3mM白蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為加入了附加的白蛋白使白蛋 白濃度達(dá)到至少0. 3mM的mTeSRl培養(yǎng)基。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為含有約0. 39mM白蛋白的 mTeSRl培養(yǎng)基。
41. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述白蛋白為人血清白蛋白。
42. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述人血清白蛋白為重組人血清白蛋白。
43. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋 白-511。
44. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白為有效的重組層粘連蛋白。
45. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白。
46. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 15:1。
47. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 10:1。
48. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述鈣 粘蛋白為e_ |丐粘蛋白。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約15:1。
50. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約10:1。
51. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述基底和所述培養(yǎng)基不含任何分化抑制劑、 飼養(yǎng)細(xì)胞、分化誘導(dǎo)物或凋亡抑制劑。
52. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述 鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白，所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量比為約5:1至約 15:1，并且所述細(xì)胞培養(yǎng)基為含有約0. 39mM白蛋白的mTeSRl培養(yǎng)基。
53. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述干細(xì)胞以200個細(xì)胞/mm2或更低的密度接 種。
54. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述干細(xì)胞以200個細(xì)胞/mm2或更高的密度接 種。
55. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述干細(xì)胞以兩個干細(xì)胞彼此不接觸的方式接 種。
56. -種保持干細(xì)胞的方法，包括： 將所述干細(xì)胞接種在含有層粘連蛋白和鈣粘蛋白的基底上，其中所述層粘連蛋白為完 整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段；以及 將所述干細(xì)胞暴露于mTeSRl細(xì)胞培養(yǎng)基。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中加入附加的白蛋白以使白蛋白終濃度達(dá)到至少 0? 3mM〇
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中加入附加的白蛋白以使白蛋白終濃度達(dá)到約 0. 39mM。
59. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521或?qū)诱尺B蛋 白-511。
60. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白為有效的重組層粘連蛋白。
61. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白。
62. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 15:1。
63. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白與所述鈣粘蛋白的重量比為約 5:1 至約 10:1。
64. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述鈣 粘蛋白為e_ |丐粘蛋白。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約15:1。
66. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重 量比為約5:1至約10:1。
67. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述基底和所述培養(yǎng)基不含任何分化抑制劑、 飼養(yǎng)細(xì)胞、分化誘導(dǎo)物或凋亡抑制劑。
68. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述層粘連蛋白為層粘連蛋白-521并且所述 鈣粘蛋白為e-鈣粘蛋白，所述層粘連蛋白-521與所述e-鈣粘蛋白的重量比為約5:1至約 15:1，并且所述mTeSRl培養(yǎng)基含有約0. 39mM白蛋白。
69. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述干細(xì)胞以200個細(xì)胞/mm2或更低的密度接 種。
70. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述干細(xì)胞以200個細(xì)胞/mm2或更高的密度接 種。
71. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述干細(xì)胞以兩個干細(xì)胞彼此不接觸的方式接 種。
【文檔編號】C12M3/00GK104364263SQ201280057413
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月22日
【發(fā)明者】卡爾·特呂格瓦松, 謝爾蓋·羅丁 申請人:卡爾·特呂格瓦松, 謝爾蓋·羅丁