?；?酰基載體蛋白(acyl-acp)蠟酯合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在經(jīng)改造以表達(dá)?；?ACP蠟酯合酶和形成醇的酰基-ACP還原酶的重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蠟酯的非?；?CoA依賴性方法。本發(fā)明方法可在光合微生物中且特別是在藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行。還提供表達(dá)?；?ACP蠟酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP還原酶的分離核苷酸分子和載體，表達(dá)?；?ACP蠟酯合酶和任選地形成醇的?；?ACP還原酶的重組宿主細(xì)胞，以及用于通過(guò)非?；?CoA依賴性路徑產(chǎn)生蠟酯的系統(tǒng)。
【專利說(shuō)明】?；??；d體蛋白(ACYL-ACP)蠟酯合酶
[0001]相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考
[0002]本申請(qǐng)案主張對(duì)2011年9月27日申請(qǐng)的標(biāo)題為“形成脂肪醇的?；?ACP還原酶(Fatty Alcohol Forming Acyl-ACP Reductases) ” 的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第 61/539，640號(hào)的優(yōu)先權(quán)益，其是全文以引用方式并入。
[0003]參考序列表
[0004]本申請(qǐng)案含有參考作為序列表文本文檔“60930881_1.1.txt”(大小為138千字節(jié)(KB)，創(chuàng)建于2012年2月23日)與本文同時(shí)提交的氨基酸序列和/或核酸序列。上文所提到的序列表是依據(jù)37C.F.R.§ 1.52(e) (5)全文以引用方式并入本文中。 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及生物改造、代謝生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及在重組微生物中產(chǎn)生可用于產(chǎn)生燃料和化學(xué)品的脂質(zhì)，例如蠟酯。
【背景技術(shù)】
[0006]全球不斷增長(zhǎng)的能源需求已導(dǎo)致耗盡化石燃料，其為埋藏的有機(jī)物質(zhì)的可燃地質(zhì)沉積物，其已轉(zhuǎn)化為原油、煤、天然氣或重油。因?yàn)榛剂鲜峭ㄟ^(guò)在地殼中的熱量和壓力下暴露數(shù)億年以上才形成，所以其為有限的不可再生的資源。此外，人們認(rèn)為化石燃料的燃燒在全球變暖中起關(guān)鍵作用。因此，業(yè)內(nèi)需要非化石燃料能源。
[0007]來(lái)自生物來(lái)源的烴代表更清潔可持續(xù)的替代能源。此外，許多工業(yè)(包括塑料和化學(xué)品制造商)非常依賴烴在制造工藝中的可用性。目前，富含能量的脂質(zhì)和脂肪酸(“自然界的石油”)是從植物和動(dòng)物油分離以產(chǎn)生多種產(chǎn)物例如燃料和油性化學(xué)品。最近業(yè)內(nèi)致力于通過(guò)成本有效的生物工藝用微生物產(chǎn)生脂肪酸和脂肪酸衍生物。在微生物宿主中產(chǎn)生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的方法闡述于(例如)以下文獻(xiàn)中:PCT公開(kāi)案第W02007/136762 號(hào)、第 W02008/119082 號(hào)、第 W02009/009391 號(hào)、第 W02009/076559 號(hào)、第W02009/111513 號(hào)、第 W02010/006312 號(hào)、第 W02010/044960 號(hào)、第 W02010/118410 號(hào)、第W02010/126891 號(hào)、第 W02011/008535 號(hào)和第 W02011/019858 號(hào)以及席爾默(Schirmer)等人，科學(xué)(Science) 329 (5991):559-562 (2010)。
[0008]已知游離脂肪酸可對(duì)細(xì)胞膜造成損傷且因此很難以足以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的量來(lái)產(chǎn)生。將脂肪酸還原為諸如蠟酯等更中性的脂質(zhì)可有助于避免游離脂肪酸毒性。蠟酯相對(duì)于諸如乙醇等較短鏈生物燃料產(chǎn)物具有高能量密度，且可在培養(yǎng)細(xì)胞中通過(guò)一系列酶促過(guò)程來(lái)產(chǎn)生。蠟酯在(例如)醫(yī)學(xué)、化妝品和飲食工業(yè)中具有多種商業(yè)應(yīng)用。例如，蠟酯可用作蠟燭、化妝品、潤(rùn)滑劑、印刷油墨、溶劑和燃料的組份。
[0009]具有從脂肪醇衍生的‘A’鏈和從酰基-硫酯分子(例如?；?CoA)衍生的‘B’鏈的蠟酯是通過(guò)脂肪?；?硫酯底物與脂肪醇之間由蠟酯合酶催化的縮合反應(yīng)產(chǎn)生。已在(例如)以下物種中鑒別出臘酯合酶:不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)(井茂(Ishige)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.) 68:1192-1195(2002);卡爾朔伊爾(Kalscheuer)和斯泰因比歇爾(Steinbuchel),生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 278:8075-8082(2003);卡爾朔伊爾等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)72:1373-1379 (2006))、海桿菌屬(Marinobacter)(何查波(Holtzapple)和施密特-丹納特(Schmidt-Dannert),細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.) 189:3804-3812(2007))、擬南芥屬(Arabidopsis)(李(Li)等人，植物生理學(xué)(Plant Physiol.) 148:97-107(2008))、牽?；?petunia)(金(King)等人，植物科學(xué)(Planta) 226:381-394(2007))、荷荷巴(jojoba)(拉蒂澤巴(Lardizabal)等人，植物生理學(xué)122 =645-655(2000)和哺乳動(dòng)物物種(程(Cheng)和羅素(Russell)，生物化學(xué)雜志 279:37798-37807(2004);延(Yen)等人，脂質(zhì)研究雜志(J.Lipid Res.) 46:2388-2397(2005))ο
[0010]脂肪酸酯也可 通過(guò)蠟酯合酶產(chǎn)生，其為?；?Cok分子與任何鏈長(zhǎng)度的醇之間的縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。例如，脂肪酸酯可為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇或戊醇與?；?CoA分子的縮合產(chǎn)物。在一些情況下，諸如脂肪酸甲基酯(“FAME”)或脂肪酸乙基酯(“FAEE”)等脂肪酸酯可通過(guò)將反應(yīng)中所用的醇(例如，甲醇或乙醇)供應(yīng)到培養(yǎng)基來(lái)產(chǎn)生。類似地，蠟酯可通過(guò)將脂肪醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇等)供應(yīng)到表達(dá)蠟合酶的宿主微生物的培養(yǎng)基來(lái)產(chǎn)生。
[0011]然而，如果要完全通過(guò)宿主微生物來(lái)產(chǎn)生蠟酯，那么宿主微生物必須產(chǎn)生脂肪醇底物。將脂肪?；?硫酯轉(zhuǎn)化為脂肪醇或脂肪醛的酶一般稱為脂肪酰基還原酶(“FAR”)。已在(例如)以下物種中鑒別出FAR:眼蟲(chóng)屬(Euglena)(例如，參見(jiàn)提拉萬(wàn)池潘(Teerawanichpan)等人,脂質(zhì)(Lipids) 45:263-273 (2010))、擬南芥屬(例如，參見(jiàn)羅蘭(Rowland)等人，植物生理學(xué)142:866-877 (2006);多恩(Doan)等人，植物生理學(xué)雜志166:787-796(2009);和多梅爾格(Domergue)等人，植物生理學(xué) 153:1539-1554(2010))、蒿屬(Artemisia)(例如，參見(jiàn)梅斯(Maes)等人，新植物學(xué)家(New Phytol.) 189:176-189(2011))、荷荷巴(例如，參見(jiàn)梅茨(Metz)等人，植物生理學(xué)122:635-644(2000))、蛾(例如，參見(jiàn)倫納德(Lienard)等人，國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.) 107:10955-10960 (2010))、蜜蜂(例如，參見(jiàn)提拉萬(wàn)池潘等人，昆蟲(chóng)生物化學(xué)和分子生物學(xué)(Insect Biochemistry and Molecular Biology) 40:641-649 (2010))和哺乳動(dòng)物(例如，參見(jiàn)本初(Honsho)等人，生物化學(xué)雜志285:8537-8542 (2010))。人們認(rèn)為某些形成醇的酰基-Cok還原酶可從?；?Cok直接生成脂肪醇。?；?Cok到脂肪醇的基于酶的轉(zhuǎn)化還可在二酶兩步式反應(yīng)中進(jìn)行；在第一步中，形成醛的酰基-CoA還原酶將?；?CoA還原為脂肪醛，且在第二步中，脂肪醛還原酶將脂肪醛還原為脂肪醇。
[0012]通常，為在微生物中產(chǎn)生脂肪酸酯或蠟酯，細(xì)胞除了蠟酯合酶以外還需要產(chǎn)生各種酶，且如果蠟酯完全由細(xì)胞產(chǎn)生，那么細(xì)胞還需要產(chǎn)生生成脂肪醇底物的形成醇的還原酶。例如，在不內(nèi)源性產(chǎn)生?；?CoA的宿主中，可能需要引入(例如)編碼脂肪?；蝓ッ傅幕蛞詫Ⅴ；??；d體蛋白(?；?ACP)轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸，且需要引入編碼?；?CoA合成酶的基因以將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；?CoA。例如，藍(lán)細(xì)菌不產(chǎn)生酰基-CoA，且迄今為止已測(cè)序的藍(lán)細(xì)菌基因組不包括編碼以下酶的基因:酰基-ACP硫酯酶、?；?CoA硫酯酶或?；?CoA合成酶，如已證實(shí)最初注釋為編碼酰基-CoA合成酶的藍(lán)細(xì)菌基因編碼用于脂肪酸再循環(huán)的?；?ACP合成酶(卡茲馬茲克(Kaczmarzyk)和富爾達(dá)(Fulda) (2010)植物生理學(xué)152 =1598-1610)。還將編碼脂肪酰基硫酯酶和/或?；?CoA合成酶的基因添加到天然產(chǎn)生?；?Cok的宿主生物體中以確保有足夠水平的酰基-CoA用于產(chǎn)生蠟酯。然而，引入若干種異源路徑組份可能導(dǎo)致難以適當(dāng)平衡以足以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的高產(chǎn)率產(chǎn)生所需蠟酯終產(chǎn)物的酶表達(dá)和活性。此外，諸如游離脂肪酸和脂肪醇等中間體的積累可對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性。
[0013]因此，業(yè)內(nèi)仍需要其它可放大規(guī)模的有效且經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)生脂肪酸酯和蠟酯的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明提供用于產(chǎn)生脂肪酸酯、例如(但不限于)蠟酯的非?；?CoA依賴性方法。本發(fā)明部分基于
【發(fā)明者】的以下發(fā)現(xiàn):僅有兩個(gè)基因的非酰基-CoA依賴性路徑可在缺少?；?CoA的微生物中產(chǎn)生蠟酯。第一基因編碼能使用非酰基-CoA底物產(chǎn)生脂肪醇的脂肪?；€原酶，而第二基因編碼能使用非酰基-CoA?；孜锖椭敬甲鳛榈孜锂a(chǎn)生蠟酯的蠟酯合酶。將所述兩個(gè)基因引入重組宿主細(xì)胞(例如，微生物宿主細(xì)胞)，由此容許非?；?Cok依賴性地產(chǎn)生蠟酯。
[0015]本文所揭示的非酰基-Cok依賴性蠟酯生物合成路徑可繞過(guò)可對(duì)宿主細(xì)胞具有毒性的?；?CoA路徑中間體、例如游離脂肪酸的生成，由此改良宿主細(xì)胞活力。此外，因?yàn)榉酋；?CoA依賴性路徑不需要從游離脂肪酸形成脂肪?；?CoA底物的ATP依賴性步驟，所以這條路徑可比傳統(tǒng)的?；?CoA依賴性路徑更能量有效。
[0016]由本文所揭示轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蠟酯合酶可使用除了酰基-CoA以外的底物作為?；?硫酯底物。例如，蠟酯合酶可使用?；?ACP作為底物(且因此可在本文中稱作“酰基-ACP蠟酯合酶”)。酰基-ACP蠟酯合酶可將短鏈醇(例如，C1、C2、C3、C4或C5醇)或脂肪醇(例如 C6、C7、C8、CIO、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24 或更長(zhǎng)鏈醇)與酰基-ACP縮合形成脂肪酸酯。與酰 基-ACP縮合的醇可由轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞產(chǎn)生或在(例如)培養(yǎng)基中供應(yīng)到轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
[0017]
【發(fā)明者】在本文中證實(shí)，某些來(lái)自除烴海桿菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)的臘酯合酶能在本發(fā)明方法中起酰基-ACP臘酯合酶作用。除烴海桿菌臘酯合酶的表達(dá)以及藍(lán)細(xì)菌株系集胞藻屬(Synechocystis)PCC6803(其不能天然合成?；?CoA、脂肪醇或蠟酯)中形成醇的酰基-ACP還原酶Maqu_2220的表達(dá)導(dǎo)致非?；?CoA依賴性蠟酯產(chǎn)生。
[0018]本發(fā)明提供經(jīng)遺傳改造用于產(chǎn)生一或多種脂肪酸酯的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞含有編碼蠟酯合酶的非天然核酸序列，其中所述蠟酯合酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)后能以非?；?CoA依賴性路徑產(chǎn)生脂肪酸酯。例如，重組宿主細(xì)胞可包括編碼能使用?；?ACP作為底物的蠟酯合酶的外源基因。
[0019]包括編碼蠟酯合酶的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?CoA合成酶的外源基因的重組宿主細(xì)胞。另外或或者，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的重組宿主細(xì)胞可為如下重組宿主細(xì)胞:其不包括編碼?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因，或其具有減弱表達(dá)的編碼酰基-CoA合成酶的內(nèi)源基因或編碼?；?CoA合成酶的突變基因，從而使得所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生減少量的?；?CoA合成酶或活性較低或無(wú)活性的?；?CoA合成酶。在上述實(shí)施例中的任一實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可為不產(chǎn)生?；?Cok的重組宿主細(xì)胞。例如，重組宿主細(xì)胞可為如下宿主細(xì)胞:其不包括外源?；?CoA合成酶基因，且缺少內(nèi)源?；?CoA合成酶基因或具有減弱表達(dá)的內(nèi)源酰基-Cok合成酶基因，從而使得不產(chǎn)生所述酶。
[0020]對(duì)于上述任一者，另外或或者，包括編碼酰基-ACP蠟合酶的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的外源基因的細(xì)胞。另外，重組宿主細(xì)胞可為不表達(dá)酰基-ACP硫酯酶和?；?CoA硫酯酶中的一者或二者或具有其減弱表達(dá)的細(xì)胞?；蛘撸?jīng)改造用于產(chǎn)生脂肪酸酯的宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?ACP硫酯酶的外源基因或編碼酰基-CoA硫酯酶的外源基因且進(jìn)一步不包括編碼酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主細(xì)胞。另外，經(jīng)改造用于產(chǎn)生脂肪酸酯、例如(但不限于)蠟酯的宿主細(xì)胞可為不包括編碼酰基-ACP硫酯酶的外源基因或編碼?；?CoA合成酶的外源基因且具有減弱表達(dá)的編碼酰基-CoA合成酶的內(nèi)源基因的宿主細(xì)胞。
[0021]或者，經(jīng)改造用于產(chǎn)生脂肪酸酯的宿主細(xì)胞可為缺少編碼?；?ACP硫酯酶的內(nèi)源基因或具有其減弱表達(dá)且缺少編碼?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因或具有其減弱表達(dá)的宿主細(xì)胞，例如宿主細(xì)胞可缺少?；?ACP硫酯酶和?；?Cok硫酯酶中的一者或二者的內(nèi)源基因，且可進(jìn)一步缺少?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因。所述宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生脂肪酸酯(包括但不限于蠟酯)，其中一或多種醇可由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或提供給宿主細(xì)胞以供納入脂肪酸酯產(chǎn)物中。
[0022]在某些實(shí)施例中，用于產(chǎn)生蠟酯的轉(zhuǎn)基因微生物包括可使用?；?ACP作為底物的蠟酯合酶，且進(jìn)一步包括可使用?；?ACP作為底物的脂肪?；€原酶(且因此分別稱作“?；?ACP蠟酯合酶”和“形成醇的?；?ACP還原酶”)。例如，作為第一步驟，形成醇的?；?ACP還原酶可將?；?ACP直接轉(zhuǎn)化為脂肪醇(例如，參見(jiàn)圖10)，且作為第二步驟，酰基-ACP蠟酯合酶將所 產(chǎn)生的脂肪醇與?；?ACP縮合形成蠟酯(例如，參見(jiàn)圖11)。
[0023]因?yàn)樾纬纱嫉孽；?ACP還原酶能將?；?ACP直接轉(zhuǎn)化為脂肪醇，且?；?ACP蠟酯合酶能使用酰基-ACP作為底物與宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪醇縮合，因此可避免引入若干種酶并平衡其表達(dá)水平和/或活性用于產(chǎn)生蠟酯的困難。例如，本文所揭示用于產(chǎn)生蠟酯的微生物可為不包括外源?；?ACP或?；?CoA硫酯酶基因中的一者或二者且另外可缺少外源?；?CoA合成酶基因的微生物。因此，可避免引入這些額外基因(或用于上調(diào)內(nèi)源硫酯酶或?；?CoA合成酶的改造株系)的步驟。其它優(yōu)點(diǎn)包括僅誘變兩個(gè)基因或改變其表達(dá)水平比多個(gè)基因更易于實(shí)現(xiàn)(例如)較高產(chǎn)生水平或不同鏈長(zhǎng)度特異性。
[0024]
【發(fā)明者】在本文中證實(shí)，某些鑒別為形成醇的還原酶的脂肪?；€原酶(例如那些來(lái)自水油海桿菌(Marinobacter aquaeolei)株系VT8和來(lái)自濟(jì)州何氏菌(Hahellachejuensis)株系KCTC2396的還原酶)是泛宿主性的形成醇的脂肪酰基還原酶,其能還原一或多種除了?；?CoA以外的?；蝓サ孜?，且能在本發(fā)明方法中起形成醇的?；?ACP還原酶的作用。先前表征為醛還原酶(例如，參見(jiàn)瓦倫(Wahlen)等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)75 =2758-2764(2009)和美國(guó)專利公開(kāi)案第2010/0203614號(hào))的水油海桿菌還原酶(“Maqu_2220”)的氨基酸序列可以基因庫(kù)(GenBank)登錄號(hào)ABM19299 (SEQ ID NO:2)獲得。濟(jì)州何氏菌還原酶(“Hch_05075”)的氨基酸序列可以基因庫(kù)登錄號(hào)YP_436183(SEQID NO:4)獲得。
[0025]包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列和編碼如本文所揭示可使用酰基-ACP作為底物的蠟酯合酶的非天然核酸序列的經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?CoA合成酶的外源基因的重組宿主細(xì)胞。另外，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?Cok合成酶的內(nèi)源基因或具有減弱表達(dá)的編碼酰基-Cok合成酶的內(nèi)源基因的重組宿主細(xì)胞。在上述實(shí)施例中的任一實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可為不產(chǎn)生?；?Cok的重組宿主細(xì)胞。例如，重組宿主細(xì)胞可為如下宿主細(xì)胞:其不包括外源?；?CoA合成酶基因且缺少內(nèi)源?；?CoA合成酶基因或具有減弱表達(dá)的內(nèi)源?；?CoA合成酶基因，從而使得以低水平產(chǎn)生所述酶或不產(chǎn)生所述酶。另外或或者，重組宿主細(xì)胞可包括內(nèi)源?；?CoA合成酶基因，其中所述基因已突變以使得產(chǎn)生活性較低或無(wú)活性的酶。
[0026]對(duì)于上述任一者，另外或或者，包括編碼?；?ACP蠟合酶的非天然核酸序列和編碼酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?ACP硫酯酶的外源基因或編碼酰基-Co硫酯酶的外源基因的細(xì)胞。另外，重組宿主細(xì)胞可為不表達(dá)?；?ACP硫酯酶和?；?CoA硫酯酶中的一者或二者或具有其減弱表達(dá)的細(xì)胞?；蛘?，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?ACP硫酯酶的外源基因或編碼酰基-CoA硫酯酶的外源基因且進(jìn)一步不包括編碼?；?CoA合成酶的外源基因的宿主細(xì)胞。另外，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的宿主細(xì)胞可為如下宿主細(xì)胞:其不包括編碼?；?ACP硫酯酶的外源基因或編碼?；?CoA合成酶的外源基因，且具有減弱表達(dá)的編碼?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因，或表達(dá)具有減弱活性的突變體?；?CoA合成酶。 [0027]或者，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的宿主細(xì)胞可為缺少編碼酰基-ACP硫酯酶的內(nèi)源基因或具有其減弱表達(dá)且缺少編碼?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因或具有其減弱表達(dá)的宿主細(xì)胞。例如，宿主細(xì)胞可缺少?；?ACP硫酯酶和?；?Cok硫酯酶中的一者或二者的內(nèi)源基因，且可缺少?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因。所述宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生脂肪酸酯或蠟酯，其中一或多種醇可由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或提供給宿主細(xì)胞以供納入脂肪酸酯產(chǎn)物中。
[0028]在具體實(shí)施例中由非天然核酸序列編碼的蠟酯合酶可與SEQ ID N0:19或SEQ IDNO:21的氨基酸序列或與SEQ ID N0:19或SEQ ID NO:21的多肽的功能性片段具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 % 一致性。例如，由非天然核酸序列編碼的蠟酯合酶可為或可包含與SEQ ID NO:19或其功能性片段具有至少85%—致性的多肽，或蠟酯合酶可為或可包含與SEQ ID NO:19或其功能性片段具有至少90%—致性的多肽。蠟酯合酶可為或可包含(例如)SEQ ID NO:19的多肽或其功能性片段。在替代性實(shí)例中，由非天然核酸序列編碼的蠟酯合酶可為或可包含與SEQ ID NO:21的多肽或其功能性片段具有至少85%—致性的多肽，或蠟酯合酶可為或可包含與SEQ IDN0:21的多肽或其功能性片段具有至少90% —致性的多肽。蠟酯合酶可為或可包含(例如)SEQ ID N0:21的多肽或其功能性片段。
[0029]或者或另外，編碼蠟酯合酶的核酸序列可與SEQ ID NO: 18的核苷酸序列或與其編碼SEQ ID NO:19的多肽的功能性片段的一部分具有至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 % 一致性。例如，核酸序列可包含與SEQ ID NO: 18的核苷酸序列或與其編碼SEQ ID NO: 19的多肽的功能性片段的一部分具有至少85%或至少90%的核苷酸序列。例如,核酸序列可為或可包含SEQ ID N0:18的核苷酸序列。在其它實(shí)例中，編碼蠟酯合酶的核酸序列可與SEQ ID NO:20的核苷酸序列或與其編碼SEQ ID NO:21的多肽的功能性片段的一部分具有至少30%、至少40%、至少45%、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 % 一致性。例如，核酸序列可包含與SEQ ID NO:20的核苷酸序列或與其編碼SEQ ID NO:21的多肽的功能性片段的一部分具有至少85%或至少90%的核苷酸序列。例如,核酸序列可為或可包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
[0030]對(duì)于上述實(shí)施例，或者，非天然核酸序列可編碼與SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 或 43 的氨基酸序列或與其編碼 SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分具有至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 % —致性的具有?；?ACP蠟酯合酶活性的多肽。例如，非天然核酸分子可編碼與SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或與其編碼SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分具有至少至少85%或至少90%的具有?；?ACP蠟酯合酶活性的多肽。例如，蠟酯合酶可為或可包含SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽。在具體實(shí)施例中，編碼蠟酯合酶的核酸序列 可具有至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%或至少 99% —致性與 SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 或 42 的核苷酸序列或與其編碼 SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分。例如，非天然核酸分子可編碼與SEQ ID NO:
22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 或 42 的核苷酸序列或與其編碼 SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段具有至少至少85%或至少90%的具有?；?ACP蠟酯合酶活性的多肽。在一些實(shí)施例中，核酸序列是或包含SEQ ID NO =22,24,26,28、30、32、34、36、38、40 或 42 的核苷酸序列。
[0031]由非天然核酸分子編碼的蠟酯合酶可為重組宿主細(xì)胞的異源酶，且任選地編碼蠟酯合酶的核酸序列可經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可為光合宿主細(xì)胞，例如藻類細(xì)胞，且蠟酯合酶可經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在光合宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一些實(shí)施例中，由非天然核酸序列編碼的蠟酯合酶可源自海桿菌屬、湖沉積桿菌(Limnobacter)、食燒菌(Alcanivorax)、何氏菌(Hahella)、海洋桿菌屬(Oceanobacter)、Y-變形菌綱(gammaproteobacterium)或分枝桿菌屬(Mycobacterium)。
[0032]另外，在上文所提到的任一實(shí)施例中，可將編碼蠟酯合酶的核酸序列整合到重組宿主細(xì)胞的染色體中，且或者或另外，其可存在于重組宿主細(xì)胞中的載體中。可將如本文所揭示的宿主生物體中的編碼蠟酯合酶的核酸序列可操作連接到啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。各個(gè)替代實(shí)施例中的啟動(dòng)子可為相對(duì)于蠟酯合酶基因的異源啟動(dòng)子，且可為相對(duì)于宿主生物體的異源或同源啟動(dòng)子，可為可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子和/或可為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
[0033]重組宿主細(xì)胞、例如段落中闡述的光合宿主細(xì)胞除了非天然?；?ACP蠟酯合酶核酸序列以外還可包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列。形成醇的?；?ACP 還原酶可與 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8 或 SEQ IDNO:10的氨基酸序列或與這些多肽中任一者的功能性片段具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %序列一致性。例如，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含與SEQ ID NO:2具有至少85%或至少90%—致性的多肽。例如，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含SEQ ID NO:
2的多肽?；蛘?，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含與SEQ ID NO:4具有至少85%或至少90% —致性的多肽。例如，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含SEQ ID NO:4的多肽。在其它替代實(shí)施例中，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含與SEQ ID NO:6、SEQID NO:8或SEQ ID NO:10具有至少85%或至少90% —致性的多肽。例如，本發(fā)明重組宿主細(xì)胞可包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列，所述還原酶是或包含SEQID NO:6、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10 的多肽。
[0034]?；?ACP還原酶可源自海洋細(xì)菌，例如海桿菌屬、食烷菌、海洋桿菌屬、湖沉積桿菌、變形菌綱或何氏菌。如本文所揭示重組宿主細(xì)胞中所含的編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列可為(例如)與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDN0:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %序列一致性的核酸序列。例如，如本文所揭示重組宿主細(xì)胞中所含的編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列可為(例如)與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少85%或至少90%序列一致性的核酸序列。在一些實(shí) 施例中，編碼形成醇的?；?ACP還原酶的核酸序列可為重組宿主細(xì)胞的異源序列，且可任選地經(jīng)密碼子優(yōu)化以供在光合宿主細(xì)胞中表達(dá)。形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然基因可存在于載體中，其可任選地為包含?；?ACP蠟合酶非天然基因的相同載體。編碼?；?ACP還原酶的非天然基因可連接到可操作連接到酰基-ACP蠟合酶基因的相同啟動(dòng)子，或可被可操作連接到不同啟動(dòng)子?？刹僮鬟B接到非天然酰基還原酶基因和非天然?；?ACP蠟合酶基因中的一者或二者的啟動(dòng)子可為相對(duì)于宿主生物體的異源啟動(dòng)子，且可為可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，且可任選地為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，可將形成醇的?；?ACP還原酶的非天然基因和/或?；?ACP蠟合酶的非天然基因整合到重組宿主細(xì)胞的染色體中，或在替代實(shí)施例中，一個(gè)或兩個(gè)非天然基因可存在于自主復(fù)制的附加體上。
[0035]在如本文所提供的重組宿主細(xì)胞的各個(gè)實(shí)施例中，由非天然核酸序列編碼的形成醇的?；?ACP還原酶和?；?ACP蠟酯合酶二者源自微生物物種，且在一些實(shí)施例中，形成醇的?；?ACP還原酶和?；?ACP蠟酯合酶中的一者或二者源自原核物種。在一些實(shí)例中，形成醇的?；?ACP還原酶和酰基-ACP蠟酯合酶可源自相同屬。例如,在具體實(shí)施例中，如本文所提供的重組宿主細(xì)胞中的形成醇的?；?ACP還原酶和?；?ACP蠟酯合酶可二者都源自相同或不同海桿菌屬，或可二者都源自相同或不同的何氏菌、湖沉積桿菌、食烷菌、海洋桿菌屬、變形菌綱或分枝桿菌屬。
[0036]在其它實(shí)施例中，經(jīng)改造用于產(chǎn)生蠟酯的本發(fā)明重組宿主細(xì)胞除了編碼?；?ACP蠟酯合酶和形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列以外還可包括編碼形成脂肪醛的諸_|1(PSeUdOmOnaS) Λ4Ι-Η爾31(ArthrObaCter) 二.^^爾31(NOCardia) λ 待襟爾31(RhodoCOCCUS)ΜΛΛ?爾(GlUCOnObaCter) O
〔003SU 哲鈄沖簾|將_窆丑駕湔鄰客_降勐旰鑿諸剄4決傘勐旰鑿諸，窆哲決傘寒旰蓉，窆哲寒猶媽_鑿_。窆哲，掛丨腺將Ma丑，W降勐旰鑿諸剄4泛-^_鑿_
(AgmenellUm) λ _端PjS (Anabaena)W^H廻pjs (AnabaenOPSiS) λ fM?pjs (Anacystisri^mmm(APhaniZOmenOn) Λ^^ρjS (ArthrOSPira) λ M^PM(ASterOCaPSa) λ?Fppll(BOrZia) - M 0Μ (CalOthriX) λ _spjS (ChamaeSiPhOn) λ 造雜 IhM?_ jS(ChloroglOeOPSiS) λ^陳襟猶?(ChroocoCCidiOPSiS) λ[(6^猶31(ChrooCOCCUS) λ^?尊猶 iS (CrinaliUm) ΛΚ?_Λ^^ΡΙ1(CyanObiUm) Λκ?ι^__ (CyanOCyStiS) Λκ?_31(CyanOSPira) λκι-ηρμ(CyanOtheCe) Λ--諸猶Si(CylindroSPermOPSiS) Λ^^ριι(CylindrOSPermUm) Λκ?-Κ潘擬滅(DactylocoCCOPSiS) λ 令兩姻K?爾31(DermOCarPella) λ室Η?ρΜ(FiSCherella) Λ?κ:ρ_ (Fremyella) λ _#liJ?pK?_js Seitleria) Λ^φι?ι?p^^K?_js (Geitlerinema) Λ^_ρSloeobacter) ΛΙΠ^Ρ_ (GlOeOCaPSa) λ Ι^-ΗρM(GlOeOtheCe) λ 陣藏靜猶Si(HalOSPirUlina) >浙&PjS (Iyengariella) λ 礙黯隊(duì)pjs(LePtOlyngbya) λ莖隊(duì)PjS (LimnOthriX) Λ5Ι隊(duì)PjS (Lyngbya) λ 寒黯PjS (Microcoleus) λ0000 (Microcystis) ΛΙΠ?Ρ_ (MyXOSarCina) Λ--^ΡΙΙ(NOdUlaria) λ 誇梁pjs(NOStOC) λ 造誇#猶?(NostOChOPSiS) λμρμ(OSCillatOria) λ^ρμ(PhOrmidiUm) λ4?隊(duì)猶_ (PlanktOthriX) λ 禪襟猶|1(PleUrOCaPSa) ΛΜ雜襟pll(ProchloroCOCCUS) ΛΜ雜00 (PrOChlOrOn) ΛΜ雜姊 _js (PrOChlOrOthriX) 乂；_端猶_ (PSeUdanabaena) λ 薄強(qiáng)猶31(RiVUlaria) λ 猶強(qiáng)猶31(SChiZOthriX) Λ^ΙΚΡΙΙ(SCytOnema) Λ?靜猶31(spirulinarsi§vs^K_js (Stanieria) 攝^--ρκ__ (Starria) ΛΜ^ΡΜ(StigOnema) ΛΜΡ_(SymPlOCa) Λ^襟pjs (SyrlechoCOCCUS) Λ?諸猶_^_致織襟猶(ThermosyrlechoCOCCUS) λ^^pll(TOlyPOthriX) λμλ\ρ_ (TriChOdeSmiUm) λ 遞隊(duì)猶(TyChOnema)m^^pll(XenoCOCCUSi)。宣咎，_降^傘寒味蓉^^織襟猶_>?諸pjsmR_^織襟P。m雄、_降
黯隊(duì)pjsm^*^lK[B(LePtOlyngba)。
〔003S 掛嶙方將Ma尹_降勐旰鑿諸剄4 (窆哲)泛T* SM貧寒猶:S




11殼藻屬（Achnanthes)、苗形藻屬（Amphiprora)、雙眉藻屬（Amphora)、纖維藻 屬（Ankistrodesmus)、星胞藻屬（Asteromonas)、金藻（Boekelovia)、保羅氏 藻（Borodinella)、葡萄藻屬（Botryococcus)、微細(xì)綠藻（Bracteococcus)、角毛 藻屬（Chaetoceros)、四鞭藻屬（Carteria)、衣藻屬（Chlamydomonas)、綠球藻 屬（Chlorococcum)、綠梭藻屬（Chlorogonium)、小球藻屬（Chlorella)、藍(lán)隱藻 屬（Chroomonas)、金球藻屬（Chrysosphaera)、球 I丐板藻屬（Cricosphaera)、隱甲 藻屬（Crypthecodinium)、隱藻屬（Cryptomonas)、小環(huán)藻屬（Cyclotella)、杜氏 藻屬（Dunaliella)、捕圓藻屬（Ellipsoidon)、球石藻屬（Emiliania)、獨(dú)球藻屬 (Eremosphaera)、厄諾氏藻屬（Ernodesmius)、眼蟲(chóng)屬、被刺藻屬（Franceia)、脆桿 藻屬（Fragilaria)、_ 絲藻屬（Gloeothamnion)、紅球藻屬（Haematococcus)、嗜鹽 古菌(Halocafeteria)、膜胞藻屬(Hymenomonas)、等鞭金藻(Isochrysis)、鱗孔藻 屬（Lepocinclis)、微星藻屬（Micractinium)、富油微藻（Monoraphidium)、微綠球 藻（Nannochloris)、微擬球藻（Nannochloropsis)、舟形藻屬（Navicula)、新綠球 藻(Neochloris)、腎鞭藻屬(Nephrochloris)、腎藻屬(Nephroselmis)、菱形藻屬 (Nitzschia)、棕鞭藻屬（Ochromonas)、鞘藻屬(Oedogonium)、卵囊藻屬(Oocystis)、 蟲(chóng)毛球藻屬（Ostreococcus)、巴夫藻（Pavlova)、擬小球藻屬（Parachlorella)、杜 氏亞屬鹽藻（Pascheria)、褐指藻屬（Phaeodactylum)、卩遼菌體屬（Phagus)、匹克 氏藻屬（Picochlorum)、扁藻屬（Platymonas)、顆石藻（Pleurochrysis)、肋球藻 屬（Pleurococcus)、原壁菌屬（Prototheca)、偽小球藻屬（Pseudochlorella)、偽 新綠球藻（Pseudoneochloris)、塔抱藻（Pyramimonas)、?？霸鍖伲≒yrobotrys)、 柵藻屬（Scenedesmus)、骨條藻屬（Skeletonema)、水綿屬（Spyrogyra)、裂絲藻屬 (Stichococcus)、四片藻屬（Tetraselmis)、海鏈藻屬（Thalassiosira)、小球藻微藻 (Viridiella)或團(tuán)藻屬（Volvox)。在一些實(shí)施例中，重組宿主細(xì)胞可為娃藻,例如雙眉藻 屬、角毛藻屬、小環(huán)藻屬、舟形藻屬、褐指藻屬或海鏈藻屬。在一些實(shí)施例中，重組宿主細(xì)胞 可為小球藻屬、微擬球藻、柵藻屬或四片藻屬的物種。
[0040]在另一方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生脂肪酸酯的方法，其包含以下步驟：在適宜培養(yǎng)基 中培養(yǎng)包括編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞，和容許表達(dá)編碼 ?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列以產(chǎn)生脂肪酸酯。例如，宿主細(xì)胞可產(chǎn)生可通過(guò)由宿 主細(xì)胞表達(dá)的蠟合酶與?；?ACP縮合的醇，其可為（例如）短鏈醇（例如，乙醇、丙醇、丁 醇、異丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇）?；蛘撸景l(fā)明提供通過(guò)以下方式產(chǎn)生蠟酯的方法： 在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞，將 至少一種醇供應(yīng)到培養(yǎng)基中，和容許表達(dá)編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列以產(chǎn) 生蠟酯。所述醇可為（例如）短鏈醇或脂肪醇。
[0041]本發(fā)明還提供通過(guò)以下方式產(chǎn)生蠟酯的方法：在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括編碼酰 基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列和編碼形成脂肪醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序 列的重組宿主細(xì)胞，且容許表達(dá)編碼?；?ACP還原酶和酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸 序列以產(chǎn)生蠟酯。另外，可在不包括醇、例如短鏈醇或脂肪醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細(xì) 胞。
[0042]用于本文所揭示任一方法中的重組宿主細(xì)胞可為如本文所揭示的（例如）不包括編碼酰基-CoA合成酶的外源核酸分子的重組宿主細(xì)胞?；蛘呋蛄硗?，用于產(chǎn)生脂肪酸酯和蠟酯的方法中的重組宿主細(xì)胞可為缺少編碼?；?CoA合成酶的內(nèi)源基因的重組細(xì)胞，或者用于所述方法中的重組細(xì)胞可為經(jīng)改造以減弱或消除?；?CoA產(chǎn)生的細(xì)胞。例如，重組宿主細(xì)胞可為不產(chǎn)生?；?Cok和/或不產(chǎn)生酰基-Cok合成酶的細(xì)胞。 [0043]另外，如本文所揭示，用于所述方法中的宿主細(xì)胞可為不包括外源酰基-ACP或外源?；?CoA硫酯酶基因中的一者或兩者的宿主細(xì)胞。另外，用于產(chǎn)生脂肪酯或蠟酯的宿主細(xì)胞可缺少編碼酰基-ACP硫酯酶的內(nèi)源基因或編碼?；?CoA硫酯酶的內(nèi)源基因，或在某些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可具有減弱表達(dá)的內(nèi)源酰基-ACP硫酯酶基因和/或內(nèi)源?；?CoA硫酯酶基因，從而使得不產(chǎn)生或以減少量產(chǎn)生所述酶。例如，用于所述方法中的重組宿主細(xì)胞可為不產(chǎn)生?；?ACP硫酯酶或?；?CoA硫酯酶的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)例中，用于所述方法中的重組宿主細(xì)胞可為不產(chǎn)生?；?ACP硫酯酶或酰基-Cok硫酯酶且不產(chǎn)生?；?Cok的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)例中，用于所述方法中的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼酰基-ACP硫酯酶或?；?CoA硫酯酶的外源基因且不包括編碼?；?CoA合成酶的外源基因的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)例中，用于所述方法中的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼酰基-ACP硫酯酶或?；?CoA硫酯酶的內(nèi)源基因且不包括編碼酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)例中，用于所述方法中的重組宿主細(xì)胞可為不包括編碼?；?ACP硫酯酶、?；?Cok硫酯酶和?；?CoA合成酶中的任一者的內(nèi)源或外源基因的宿主細(xì)胞。
[0044]產(chǎn)生脂肪酸酯或蠟酯的非?；?CoA依賴性方法可使用具有編碼任何酰基-ACP蠟酯合酶、例如本文所述的任一者和(在蠟酯完全由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的方法中)任何形成醇的?；?ACP還原酶、例如本文所述的任一者的非天然基因的重組細(xì)胞。
[0045]在具體實(shí)施例中，所述方法可使用具有編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然基因的重組細(xì)胞，所述?；?ACP蠟酯合酶與除烴海桿菌WSl (SEQ ID NO: 19)或WS2 (SEQ ID NO:21)具有至少 40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,85%,90%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%或 99%氨基酸序列一致性，或與 SEQ ID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 或 43 的氨基酸序列具有至少 40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% —致性。例如，產(chǎn)生諸如蠟酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括編碼酰基-ACP蠟酯合酶的基因的改造微生物，所述酰基-ACP蠟酯合酶與除烴海桿菌WSl (SEQ ID NO: 19)具有至少85%或90%氨基酸序列一致性?；蛘?，產(chǎn)生諸如蠟酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括編碼?；?ACP蠟酯合酶的基因的改造微生物，所述?；?ACP蠟酯合酶與除烴海桿菌WS2 (SEQ ID NO:21)具有至少85%或90%氨基酸序列一致性。在一些實(shí)例中，本發(fā)明提供使用由核酸序列編碼的?；?ACP蠟酯合酶產(chǎn)生蠟酯的非?；?CoA依賴性方法，其與編碼WSl (SEQ ID NO: 18)或WS2 (SEQ ID NO:20)的核酸序列具有至少 30%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,85%,90%,92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。例如，產(chǎn)生諸如蠟酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括與除烴海桿菌WSl (SEQ ID NO:18)具有至少85%或90%序列一致性的基因的改造微生物。或者，產(chǎn)生諸如蠟酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括與除烴海桿菌WS2(SEQ ID NO:22)具有至少85%或90%序列一致性的基因的改造微生物。
[0046]?；?ACP蠟酯合酶的一些或所有脂肪醇底物可在包括編碼任何形成醇的酰基-ACP還原酶、例如本文所述的任一者的非天然核酸序列的重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。例如，所述方法可使用具有編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然基因的重組細(xì)胞，所述形成醇的?；?ACP 還原酶與 Maqu_2220(SEQ ID NO:2)或 Hch_05075 (SEQ ID NO:4)具有至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列一致性，或與SEQ ID NO:6、8或10的氨基酸序列具有至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %或99 % —致性。例如，產(chǎn)生蠟酯的方法可包括使用包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的基因的改造微生物，所述形成醇的?；?ACP還原酶與Maqu_2220 (SEQ IDNO:2)具有至少85%或90%氨基酸序列一致性?；蛘?，產(chǎn)生蠟酯的方法可包括使用包括編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的基因的改造微生物，所述形成醇的酰基-ACP還原酶與Hch_05075 (SEQ ID NO:4)具有至少85%或90%氨基酸序列一致性。例如，產(chǎn)生蠟酯的方法可包括使用包括與Maqu_2220(SEQ ID NO:1)具有至少85%或90%序列一致性的基因的改造微生物?；蛘?，產(chǎn)生蠟酯的方法可包括使用包括與Hch_05075(SEQ ID NO:3)具有至少85 %或90 %序列一致性的基因的改造微生物。
[0047]相對(duì)于在所有方面與所述重組宿主細(xì)胞相同只是缺少編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列和編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列(如果存在)的對(duì)照宿主細(xì)胞，重組宿主細(xì)胞可產(chǎn)生提高水平的脂肪酸酯或蠟酯。例如，在一些實(shí)施例中，相對(duì)于缺少編碼蠟酯合酶的非天然核酸序列的對(duì)照宿主細(xì)胞，重組宿主細(xì)胞可產(chǎn)生多至少50%之脂肪酸酯?；蛘呋蛄硗?，相對(duì)于缺少編碼蠟酯合酶的非天然核酸序列和酰基-ACP還原酶的非天然編碼序列的對(duì)照宿主細(xì)胞，重組宿主細(xì)胞可產(chǎn)生多至少50%之蠟酯。在一些實(shí)例中，相對(duì)于缺少編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列和編碼?；?ACP還原酶的非天然序列的對(duì)照宿主細(xì)胞，重組宿主細(xì)胞可產(chǎn)生多至少100%之蠟酯。
[0048]另外，在所述方法的一些實(shí)例中，重組宿主細(xì)胞可在約I天到約30天、例如約3天到約15天或約5天到約10天的培養(yǎng)期中產(chǎn)生至少lmg/L、2mg/L、5mg/L或10mg/L臘酯。另外或或者，重組宿主細(xì)胞 可在約I天到約30天、例如約3天到約15天或約5天到約10天的培養(yǎng)期中產(chǎn)生少于約lg/L、500mg/L、200mg/L、100mg/L或50mg/L蠟酯。
[0049]在本文所提供方法的一些實(shí)例中，所述方法包括產(chǎn)生至少一種蠟酯分子，其中從脂肪醇衍生的A鏈和從?；孜?例如，?；?ACP)衍生的B鏈?zhǔn)怯伤拗骷?xì)胞、例如如本文所揭示的重組微生物產(chǎn)生，且A鏈和B鏈二者可具有C8-C24的鏈長(zhǎng)度。例如，至少一種通過(guò)本文所揭示方法產(chǎn)生的蠟酯分子可具有C12-C18的A鏈和B鏈二者。另外但任選地，通過(guò)本文所述任一方法產(chǎn)生的蠟酯的至少一部分可由宿主細(xì)胞分泌。另外但任選地，所述方法可進(jìn)一步包括分離蠟酯或蠟酯產(chǎn)物的步驟。
[0050]另外但任選地，產(chǎn)生蠟酯的重組宿主細(xì)胞還可優(yōu)選地表達(dá)形成脂肪醛的還原酶，例如形成脂肪醛的酰基-ACP還原酶。形成脂肪醛的還原酶可為重組宿主細(xì)胞的內(nèi)源酶，或者可為重組宿主細(xì)胞的外源酶。
[0051]另外但任選地，可通過(guò)(例如)表達(dá)或過(guò)表達(dá)一或多種外源或內(nèi)源多肽(例如β -酮酰基合成酶、乙?；?CoA羧化酶、丙二酰CoA = ACP轉(zhuǎn)酰酶、?；?ACP合成酶或酰基載體蛋白)來(lái)上調(diào)重組宿主細(xì)胞中的?；?ACP產(chǎn)生。例如，重組宿主細(xì)胞可表達(dá)或過(guò)表達(dá)一或多種促進(jìn)碳固定或提高光合集光效率或促進(jìn)蠟酯產(chǎn)物分泌的外源或內(nèi)源多肽，例如核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶、藻膽蛋白或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一些實(shí)施例中，重組宿主細(xì)胞具有減弱表達(dá)的以下酶中的一或多者:甘油-3-磷酸脫氫酶、乙醛CoA脫氫酶、丙酮酸脫氫酶或乙酸鹽激酶。
[0052]產(chǎn)生蠟酯的重組宿主細(xì)胞還可任選地表達(dá)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多藥排出蛋白或RND泵)以促進(jìn)蠟酯分泌。
[0053]本發(fā)明進(jìn)一步提供在光合宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蠟酯的非?；?CoA依賴性方法。光合宿主細(xì)胞能使用無(wú)機(jī)碳(例如，二氧化碳或碳酸鹽或碳酸氫鹽化合物)作為碳源，且可由此提供比完全依賴還原碳源和/或較長(zhǎng)鏈碳源的宿主細(xì)胞更有效且更成本有效的蠟酯產(chǎn)生方法。
[0054]本發(fā)明提供產(chǎn)生脂肪酸酯的方法，其包含以下步驟:在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列的光合宿主細(xì)胞和容許表達(dá)編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列以產(chǎn)生脂肪酸酯。一些實(shí)例中的光合宿主細(xì)胞可產(chǎn)生一或多種醇(其可為(例如)短鏈或脂肪醇)用作蠟合酶的底物。適宜培養(yǎng)基可為(例如)不包括大量還原碳源的培養(yǎng)基和/或可為不包括醇(例如短鏈或脂肪醇)的培養(yǎng)基。
[0055]或者，本發(fā)明提供通過(guò)以下方式產(chǎn)生蠟酯的方法:在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列的重組光合宿主細(xì)胞，將至少一種醇供應(yīng)到培養(yǎng)基，和容許表達(dá)編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列以產(chǎn)生蠟酯。所供應(yīng)醇可為(例如)短鏈醇或脂肪醇。
[0056]本發(fā)明還提供通過(guò)以下方式產(chǎn)生蠟酯的方法:在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列和編碼形成脂肪醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列的光合宿主細(xì)胞，且容許表達(dá)編碼?；?ACP還原酶和?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列以產(chǎn)生蠟酯?？稍诓话ㄋ?yīng)醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)光合微生物。另外，可在不包括大量還原碳源(例如醇、糖或有機(jī)酸)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組光合宿主細(xì)胞。另外，所述方法可包括在至少一部分培養(yǎng)期中將培養(yǎng)物暴露于光。
[0057]光合宿主細(xì)胞可包括編碼如本文所揭示的任何?；?ACP蠟酯合酶基因的非天然核酸序列，且可進(jìn)一步包括編碼酰基-ACP還原酶(例如本文所揭示的任一者)的非天然核酸序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的非?；?CoA依賴性方法是在光合微生物(例如藍(lán)細(xì)菌或真核微藻)中實(shí)施。在某些實(shí)施例中，光合微生物不內(nèi)源性產(chǎn)生?；?CoA。
[0058]用于產(chǎn)生蠟酯的重組光合宿主細(xì)胞可為真核微藻，例如曲殼藻屬、繭形藻屬、雙眉藻屬、纖維藻屬、星胞藻屬、金藻、保羅氏藻、葡萄藻屬、微細(xì)綠藻、角毛藻屬、四鞭藻屬、衣藻屬、綠球藻屬、綠梭藻屬、小球藻屬、藍(lán)隱藻屬、金球藻屬、球鈣板藻屬、隱甲藻屬、隱藻屬、小環(huán)藻屬、杜氏藻屬、捕圓藻屬、球石藻屬、獨(dú)球藻屬、厄諾氏藻屬、眼蟲(chóng)屬、被刺藻屬、脆桿藻屬、麗絲藻屬、紅球藻屬、嗜鹽古菌、膜胞藻屬、等鞭金藻、鱗孔藻屬、微星藻屬、富油微藻、微綠球藻、微擬球藻、舟形藻屬、新綠球藻、腎鞭藻屬、腎藻屬、菱形藻屬、棕鞭藻屬、鞘藻屬、卵囊藻屬、蠔球藻屬、巴夫藻、擬小球藻屬、杜氏亞屬鹽藻、褐指藻屬、卩遼菌體屬、匹克氏藻屬、扁藻屬、顆石藻、肋球藻屬、原壁菌屬、偽小球藻屬、偽新綠球藻、塔孢藻、桑椹藻屬、柵藻屬、骨條藻屬、水綿屬、裂絲藻屬、四片藻屬、海鏈藻屬、小球藻微藻或團(tuán)藻屬。
[0059]本發(fā)明方法可有利地在藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞中實(shí)施。藍(lán)細(xì)菌合成?；?ACP，但無(wú)法天然地制備?；?CoA、脂肪醇或蠟酯。此外，藍(lán)細(xì)菌基因組不包括編碼?；?ACP硫酯酶或?；?CoA硫酯酶的基因。因此，藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過(guò)以下方式經(jīng)改造以產(chǎn)生蠟酯:引入編碼?；?ACP蠟酯合酶(例如，WSI (SEQ ID NO:19)或WS2 (SEQ ID NO:21)，或與 WSl 或WS2 具有至少 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的蠟酯合酶，或如本文所揭示的其它酶，例如SEQID NO:23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中的任一者)的核酸分子和單一形成醇的?；?ACP 還原酶基因(例如，編碼與(例如)Maqu_2220(SEQ ID NO:2)、Hch_05075 (SEQ IDNO:4)、MDG893_11561(SEQ ID NO:6)、HP15_810 (SEQ ID NO:8)或 RED65_09894 (SEQ ID NO:10)具有至少 30%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,85%,90%,92%,93%,94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列一致性的?；?ACP還原酶，或如本文所揭示的其它酶)，而無(wú)需減弱或消除用于?；?CoA依賴性路徑的內(nèi)源基因(例如硫酯酶或?；?CoA合成酶)的表達(dá)。此外，由于藍(lán)細(xì)菌是可利用無(wú)機(jī)(非還原)碳源(例如CO2)的光合微生物，所以與(例如)依賴必須添加到培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源(例如糖)的異養(yǎng)細(xì)胞相比，經(jīng)?；?ACP蠟酯合酶和形成醇的?；?ACP還原酶基因轉(zhuǎn)型的藍(lán)細(xì)菌可提供更具流線型且能量更有效的用于產(chǎn)生蠟酯的生物系統(tǒng)。
[0060]可用作宿主細(xì)胞的藍(lán)細(xì)菌包括(例如)阿格門(mén)氏藻、魚(yú)腥藻屬、項(xiàng)圈藻屬、倒囊藻屬、絲囊藻屬、節(jié)螺藻屬、星球藻屬、博氏藻屬、眉藻屬、管孢藻屬、擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬、擬色球藻屬、色球藻屬、發(fā)毛針藻屬、雙色藻屬、藍(lán)囊胞菌屬、藍(lán)螺菌屬、藍(lán)桿藻屬、柱胞藻屬、筒孢藻屬、藍(lán)纖維藻屬、小皮果藍(lán)細(xì)菌屬、側(cè)生藻屬、費(fèi)氏藻屬、蓋特勒氏藍(lán)細(xì)菌屬、吉特勒氏線狀藍(lán)細(xì)菌屬、膠菌藻、粘球藻屬、粘桿藻屬、鹽螺旋藻屬、英加藻屬、瘦鞘絲藻屬、湖絲藻屬、鞘絲藻屬、微鞘藻屬、微囊藻屬、粘囊藻屬、節(jié)球藻屬、念珠藻屬、擬念珠藻屬、顫藻屬、席藻屬、浮絲藻屬、寬球藻屬、原綠球藻屬、原綠菌屬、原綠發(fā)菌屬、假魚(yú)腥藻屬、膠須藻屬、裂須藻屬、雙歧藻屬、螺旋藻屬、斯塔尼爾藍(lán)菌屬、斯塔爾氏藍(lán)菌屬、真枝藻屬、束藻屬、聚球藻屬、集胞藻屬、嗜熱聚球藻、單岐藻屬、束毛藻屬、常絲藻或異球藻屬。例如，重組光合微生物可為聚球藻屬、集胞藻屬或嗜熱聚球藻?；蛘?，重組光合微生物可為雙色藻屬、藍(lán)桿藻屬或藍(lán)細(xì)菌，或另外或者，重組光合微生物可為膠菌藻、鞘絲藻屬或立普妥藍(lán)巴。
[0061]本發(fā)明還提供以非?；?Cok依賴性方式通過(guò)(例如)培養(yǎng)不產(chǎn)生?；?Cok且表達(dá)酰基-ACP蠟酯合酶的重組微生物產(chǎn)生脂肪酸酯的系統(tǒng)，以及使用所述宿主和系統(tǒng)產(chǎn)生的蠟酯。例如，本文提供產(chǎn)生蠟酯的系統(tǒng)，其包括在不包括大量還原碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的具有編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列的重組光合微生物，其中在至少一部分產(chǎn)生期中使所述光合微生物暴露于光。另外，光合微生物可進(jìn)一步包括編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列。任選地，所述系統(tǒng)可進(jìn)一步包括無(wú)機(jī)(例如，非還原)碳源，例如CO2、碳酸、碳酸鹽或碳酸氫鹽。優(yōu)選實(shí)施例中的無(wú)機(jī)碳源為蠟酯產(chǎn)物的合成提供碳。在一些實(shí)例中，光合微生物是藍(lán)細(xì)菌。
[0062]本發(fā)明還提供編碼?；?ACP蠟酯合酶的分離核酸分子、編碼形成醇的?；?ACP還原酶的分離核酸分子以及編碼?；?ACP蠟酯合酶和形成醇的?；?ACP還原酶的分離核酸分子。在一些實(shí)施例中，分離核酸分子進(jìn)一步包含來(lái)自光合微生物的至少50個(gè)核苷酸的另一核酸序列。此外，本發(fā)明提供載體和重組宿主細(xì)胞，其包含至少一種編碼?；?ACP蠟酯合酶的分離核酸分子或載體，且任選地進(jìn)一步包含至少一種編碼形成醇的?；?ACP還原酶的分離核酸分子或載體，或包含至少一種編碼酰基-ACP蠟酯合酶與形成醇的?；?ACP還原酶二者的分尚核酸分子。[0063]在本發(fā)明的另一方面中，提供包括蠟酯的組合物。所述蠟酯是通過(guò)本文提供的方法來(lái)產(chǎn)生，且可包括一或多種具有鏈長(zhǎng)度為C8-C24的A鏈和B鏈二者的蠟酯。在一些實(shí)施例中，所述組合物包含至少一種通過(guò)本文所揭示方法產(chǎn)生的具有C12-C18的A鏈和B鏈二者的蠟酯分子。根據(jù)某些實(shí)施例，本發(fā)明組合物包含不同蠟酯的混合物，其中所述混合物以與通過(guò)本發(fā)明重組宿主細(xì)胞所產(chǎn)生蠟酯類似的比例(例如，在+/-20%內(nèi))包含不同蠟酯。另外或或者，根據(jù)某些實(shí)施例，通過(guò)檢測(cè)組合物中的次要雜質(zhì)并鑒別其來(lái)源為本發(fā)明重組宿主細(xì)胞，本發(fā)明蠟酯組合物可經(jīng)鑒別是根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生。例如，組合物可含有一或多種核酸分子作為次要組份，其可通過(guò)(例如)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或通過(guò)可選序列特異性核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)，其中核酸分子可具有編碼酰基-ACP蠟合酶的至少一部分的對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 或 42 等的至少一部分的序列或與其具有至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,85%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97 %、98 %或99 %序列一致性的序列，和/或核酸分子可具有編碼?；?ACP還原酶的至少一部分的對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11等的至少一部分的序列或與其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列一致性的序列。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0064]圖1顯示水油海桿菌株系VT8Maqu_2220?；?ACP還原酶的氨基酸序列(“Maqu_2220” ；SEQ ID NO:2)。
[0065]圖2顯示濟(jì)州何氏菌株系KCTC2396形成醇的?；?ACP還原酶的的氨基酸序列(“Hch_05075” ；SEQ ID NO:4)。
[0066]圖3顯不棲藻海 桿菌(Marinobacter algicola)株系DG893形成醇的酸基-ACP還原酶的氨基酸序列(“MDG893_11561”；SEQ ID NO:6)。
[0067]圖4顯不粘附海桿菌(Marinobacter adhaerens)株系HP15形成醇的酸基-ACP還原酶的氨基酸序列(“HP15_810”；SEQ ID NO:8)。
[0068]圖5顯示海洋桿菌屬株系RED65形成醇的酰基-ACP還原酶的氨基酸序列(“RED65_09894” ；SEQ ID NO:10)。
[0069]圖6顯示除烴海桿菌株系8798WS1蠟酯合酶的氨基酸序列(“WS1蠟酯合酶”;SEQID NO:19)。
[0070]圖7顯示除烴海桿菌株系8798WS2蠟酯合酶的氨基酸序列(“WS2蠟酯合酶”;SEQID NO:21)。
[0071]圖8顯示海桿菌屬株系ELB17蠟酯合酶的氨基酸序列(“ELB17蠟酯合酶”，SEQID NO:43)。
[0072]圖9是脂肪酸衍生物代謝路徑的示意圖。
[0073]圖10是從酰基-ACP產(chǎn)生脂肪醇的實(shí)例性代謝路徑的示意圖。
[0074]圖11是從脂肪醇和?；?ACP產(chǎn)生蠟酯的兩步式代謝路徑的示意圖。
[0075]圖12顯示用密碼子優(yōu)化的Maqu_2220?；?ACP還原酶基因構(gòu)建的整合載體的質(zhì)粒圖(pSGE05075)。RSl-下和RSl-上是指在集胞藻PCC6803的染色體上的整合位點(diǎn)。
[0076]圖13A)顯示光養(yǎng)生長(zhǎng)且表達(dá)Maqu_2507?；?CoA還原酶(SEQ ID NO:12)的集胞藻PCC6803的氣相色譜色譜圖。B)顯示光養(yǎng)生長(zhǎng)且表達(dá)編碼密碼子優(yōu)化的Maqu_2220?；?ACP還原酶(SEQ ID N0:11)的基因的集胞藻PCC6803的氣相色譜色譜圖。在頂端標(biāo)記脂質(zhì)產(chǎn)物的每個(gè)峰。
[0077]圖14顯示展示與表達(dá)使用酰基-CoA作為底物的Maqu_2507 (5076)?；?CoA還原酶的集胞藻PCC6803相比，表達(dá)野生型(5074)和6803密碼子優(yōu)化的(5075)Maqu_2220?；?ACP還原酶的集胞藻PCC6803的脂肪醇(C16:0-醇和C18:0-醇)的量的圖。在任何樣品中都沒(méi)有檢測(cè)到脂肪醛。
[0078]圖15顯示展示不表達(dá)異源?；?ACP還原酶(“Wt6803”)或表達(dá)Hch_05075形成脂肪醇的酰基-ACP還原酶(“何氏菌FAR”)的集胞藻PCC6803的總脂肪醇的圖。
[0079]圖16顯示用Maqu_2220?；?ACP還原酶基因和WSl基因構(gòu)建的整合載體的質(zhì)粒圖(pSGE05175)。RSl-下和RSl-上是指集胞藻PCC6803的染色體上的整合位點(diǎn)。
[0080]圖17 顯示展示表達(dá) WSl (SEQ ID NO: 19)和 Maqu_2220 (SEQ ID NO:2)的集胞藻PCC6803 ( “5175 (WSl) ”)、表達(dá)牽?；?WS (SEQ ID NO:45)和 Maqu_2220 (SEQ ID NO:2)的集胞藻PCC6803( “5174(牽牛花WS)”)和不表達(dá)異源基因的集胞藻PCC6803 ( “6803陰性對(duì)照”)中的蠟酯和脂肪醇產(chǎn)生的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0081]本發(fā)明提供在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蠟酯的非?；?CoA依賴性方法，以及用于通過(guò)非?；?CoA依賴性路 徑產(chǎn)生蠟酯的分離核苷酸分子、載體和重組宿主細(xì)胞和系統(tǒng)，以及包括通過(guò)本發(fā)明方法制備的蠟酯的組合物。
[0082]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，本申請(qǐng)案的揭示內(nèi)容包括實(shí)施例的揭示內(nèi)容，所述實(shí)施例包含為方便起見(jiàn)通過(guò)參考特定實(shí)施例闡述的兩個(gè)或更多個(gè)特征的組合。申請(qǐng)案內(nèi)的標(biāo)題只是為了方便讀者，并不以任何方式限制本發(fā)明或其實(shí)施例的范圍。
[0083]本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)案都是以引用方式并入本文中，如同明確且個(gè)別地指示以引用方式并入每一個(gè)別出版物或?qū)＠暾?qǐng)案一般。
[0084]定義
[0085]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般所了解相同的含義。
[0086]在本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例通篇中，詞語(yǔ)"包含(comprise)"或諸如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"等變化形式將理解為暗示包括所述實(shí)體、項(xiàng)目或項(xiàng)目組，但不包括任何其它實(shí)體、項(xiàng)目或項(xiàng)目組。
[0087]除非上下文明確指示其它情況，否則單數(shù)冠詞“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義。例如，在提到一細(xì)胞時(shí)，包括多個(gè)細(xì)胞。
[0088]如本文中在諸如“A和/或B”等詞組中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”計(jì)劃包括“A和B”、“A 或 B”、“A” 和 “B”。
[0089]術(shù)語(yǔ)“形成醇的?；?ACP還原酶”是指能將酰基-ACP轉(zhuǎn)化為脂肪醇的蛋白質(zhì)。“形成醇的?；?CoA還原酶”是能將?；?CoA轉(zhuǎn)化為脂肪醇的蛋白質(zhì)“形成醇的脂肪酰基還原酶”是指可將?；?ACP或?；?CoA轉(zhuǎn)化為脂肪醇的酶，且包括能使用?；?ACP和?；?CoA 二者作為底物來(lái)產(chǎn)生脂肪醇的“泛宿主性的形成醇的脂肪?；€原酶”。[0090]“短鏈醇”是具有I到5個(gè)碳原子的醇。短鏈醇可為直鏈或具支鏈。短鏈醇的非限制性實(shí)例包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丁醇、2-甲基丁醇和3-甲基丁醇。
[0091]“脂肪醇”是具有式ROH的伯醇，其中R是脂肪族基團(tuán)，優(yōu)選地是烷基。R可包含介于約6個(gè)與約24個(gè)之間的碳原子。脂肪族鏈可為飽和、單不飽和或多不飽和鏈?！耙换蚨喾N脂肪醇”是指一或多種具有不同鏈長(zhǎng)度和/或飽和模式的脂肪醇，例如C16:1脂肪醇、C18:2脂肪醇和C14脂肪醇是具體脂肪醇。
[0092]術(shù)語(yǔ)“形成醛的?；€原酶”或“形成醛的還原酶”是指從?；孜?例如羧酸(例如，游離脂肪酸)、?；?ACP或?；?CoA)產(chǎn)生脂肪醛的酶。“形成醛的?；?ACP還原酶”是指將酰基-ACP轉(zhuǎn)化為脂肪醛的蛋白質(zhì)。
[0093]“脂肪酸酯”是脂肪酸與醇的酯。源自醇的碳鏈稱為A鏈，且源自脂肪酸(脂肪酸部分可由?；蝓ヌ峁?的碳鏈稱作B鏈。脂肪酸酯可具有任何長(zhǎng)度的A側(cè)鏈，例如長(zhǎng)度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或24個(gè)以上碳。脂肪酸酯可具有任何長(zhǎng)度的B側(cè)鏈，例如長(zhǎng)度為4、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或24個(gè)以上碳。脂肪酸酯中A鏈和B鏈的長(zhǎng)度可獨(dú)立地變化。例如，甲醇(Cl)與C4或更長(zhǎng)?；?脂肪酸或?；?硫酯)的縮合可產(chǎn)生脂肪酸甲基酯(“FAME”)，且乙醇與?；湹目s合可產(chǎn)生脂肪酸乙基酯(“FAEE”)。脂肪醇(CS或以上)與?；蝓?CS或更長(zhǎng))的縮合產(chǎn)生蠟酯。
[0094]“蠟酯”是 脂肪酸與長(zhǎng)鏈脂肪族醇的酯。蠟酯具有從脂肪醇衍生的至少8個(gè)碳的A鏈和從?；?硫酯衍生的至少8個(gè)碳的B鏈。蠟酯的A鏈和B鏈中的碳數(shù)可獨(dú)立地變化。
[0095]“蠟酯合酶”或“蠟合酶”是催化脂肪醇與?；?硫酯(例如?；?CoA或酰基-ACP)縮合以產(chǎn)生蠟酯的酶。蠟合酶還可縮合短鏈醇與酰基硫酯以(例如)產(chǎn)生諸如脂肪酸甲基酯或脂肪酸乙基酯等脂肪酸酯。
[0096]術(shù)語(yǔ)“?；?ACP蠟酯合酶”或“?；?ACP蠟合酶”是指能將?；湉孽；?ACP底物轉(zhuǎn)移到脂肪醇以形成蠟酯的蛋白質(zhì)。酰基-ACP蠟酯合酶包括僅使用?；?ACP作為?；?硫酯底物的蠟酯合酶和能使用除了?；?ACP以外的其它?；?硫酯底物(例如，?；?CoA)的?；?ACP蠟酯合酶。
[0097]術(shù)語(yǔ)“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，但“肽”在一些情況下可用于指具有不超過(guò)約100個(gè)氨基酸或不超過(guò)約60個(gè)氨基酸的多肽。
[0098]術(shù)語(yǔ)“功能性片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，其中剩余氨基酸序列與參考序列中的相應(yīng)位置具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、99%或100%序列一致性，且所述多肽保留全長(zhǎng)多肽的活性的約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%。功能性片段可包含(例如)全長(zhǎng)多肽的90%或更低、80%或更低、70%或更低、60%或更低、50%或更低、40%或更低、30%或更低或20%或更低，且可包括(例如)全長(zhǎng)多肽的最高約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0099]本申請(qǐng)案通過(guò)在由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)維護(hù)的早已建立且被廣泛參考的數(shù)據(jù)庫(kù)中使用的標(biāo)識(shí)符揭示且提到核酸和多肽。登錄號(hào)是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(United States National Institutes ofHealth)維護(hù)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(ncb1.nlm.nih.gov)可公開(kāi)獲得的序列記錄的唯一標(biāo)識(shí)符。"基因信息(GenInfo)標(biāo)識(shí)符"(GI)序列標(biāo)識(shí)號(hào)對(duì)核苷酸或氨基酸序列具有特異性。如果序列以任一方式變化，那么指定新GI號(hào)。可使用序列修正史(SequenceRevision History)工具來(lái)追蹤在特定基因庫(kù)記錄中出現(xiàn)的序列的不同GI號(hào)、版本號(hào)和更新日期?；诘卿浱?hào)和GI號(hào)檢索并獲得核酸或基因序列或蛋白質(zhì)序列為(例如)細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)中所熟知。
[0100]相對(duì)于氨基酸或核苷酸序列的一致性或同源性百分比在本文中定義為，在比對(duì)序列以獲得最大一致性百分比并引入間隙以實(shí)現(xiàn)最大同源性百分比之后，候選序列中與已知多肽一致的氨基酸或核苷酸殘基的百分比。在核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或一致性可使用業(yè)內(nèi)已知的方法來(lái)測(cè)定，包括(但不限于)使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx米 用的算法的BLAST(喊基局部比對(duì)檢索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool))分析(阿特休爾(Altschul) (1997),核酸研究(Nucleic Acids Res.) 25,3389-3402 ;和卡爾林(Karlin) (1990)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊87，2264-2268)，其經(jīng)調(diào)整用于序列相似性檢索。
[0101]“Pfam”是由Pfam協(xié)會(huì)(Pfam Consortium)維護(hù)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)家族的大型集合，且可在若干受資助的萬(wàn)維網(wǎng)站點(diǎn)獲得，包括:pfam.sanger.ac.uk/(惠康基金會(huì)(Welcome Trust),桑格學(xué)院(Sanger Institute)) ;pfam.sbc.su.se/(斯德哥爾摩生物信息中心(Stockholm Bioinformatics Center)) ;pfam.janelia.0rg/(珍利亞農(nóng)場(chǎng)(JaneliaFarm),霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Institute)) ；pfam.jouy.1nra.fr/(國(guó)家農(nóng)業(yè)石開(kāi)究院(Institut national de la Recherche Agronomique));和 pfam.ccbb.re.kr/。Pfam的最新版是基于UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)2020_05版的Pfam26.0(2011年11月，13，672個(gè)家族)。Pfam結(jié)構(gòu)域和家族是使用多序列比對(duì)和隱馬爾可夫模型(hiddenMarkov model,HMM)來(lái)鑒別。基于高質(zhì)量比對(duì)的Pfam-A家族是通過(guò)使用蛋白質(zhì)家族的代表性成員的策劃種子比對(duì)(curated seed alignment)和基于種子比對(duì)的剖面隱馬爾可夫模型來(lái)生成。(除非另外指明，否則所詢問(wèn)蛋白質(zhì)與Pfam的匹配是Pfam-A匹配。)然后使用所有經(jīng)鑒別屬于所述家族的序列自動(dòng)生成所述家族的全比對(duì)(松哈默(Sonnhammer)等人(1998)核酸研究(Nucleic Acids Research) 26:320-322 ;貝特曼(Bateman)等人(2000)核酸研究26:263-266 ;貝特曼等人(2004)核酸研究32，數(shù)據(jù)庫(kù)專輯(Database Issue):D138-D141 ;費(fèi)恩(Finn)等人(2006)核酸研究數(shù)據(jù)庫(kù)專輯34:D247_251 ;費(fèi)恩等人(2010)核酸研究數(shù)據(jù)庫(kù)專輯38:D211-222)。通過(guò)登錄pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，使用任何上文所提到的網(wǎng)站)，可使用HMMER同源性檢索軟件(例如，HMMER3,hmmer.janelia.0rg/)針對(duì)HMM詢問(wèn)蛋白質(zhì)序列。將詢問(wèn)蛋白質(zhì)鑒別為在Pfam家族中(或鑒別為具有具體pfam結(jié)構(gòu)域)的顯著匹配是其中比特分?jǐn)?shù)(bit score)大于或等于Pfam結(jié)構(gòu)域的集聚閾值的匹配。還可使用期望值(e值)作為在pfam中包括所詢問(wèn)蛋白質(zhì)或確定所詢問(wèn)蛋白質(zhì)是否具有具體pfam結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)則，其中低e值(遠(yuǎn)低于1.0，例如低于0.1或低于或等于0.01)代表因偶然而匹配的概率較低。
[0102]多肽的“保守變體”是相對(duì)于參考多肽具有一或多個(gè)保守氨基酸取代的多肽，其中多肽的活性(例如對(duì)轉(zhuǎn)錄的效應(yīng))、對(duì)共調(diào)節(jié)因子或配體的親和性或DNA結(jié)合親和性與參考多肽沒(méi)有顯著差異。
[0103]術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸取代”或“保守突變”是指用一個(gè)胺基酸置換另一個(gè)具有共同性質(zhì)的氨基酸。定義個(gè)別氨基酸之間的共同性質(zhì)的有用方式是分析同源生物體的相應(yīng)蛋白質(zhì)之間的氨基酸變化的標(biāo)準(zhǔn)化頻率(舒爾茨(Schulz) (1979)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理(Principlesof Protein Structure),施普林格出版社(Springer-Verlag))。根據(jù)所述分析,可定義氨基酸組，其中組內(nèi)的氨基酸優(yōu)先彼此交換，且因此在其對(duì)整體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響中彼此最為相似(舒爾茨(1979)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理，施普林格出版社)。以這種方式定義的氨基酸組的實(shí)例可包括:“帶電荷/極性組”，包括Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His ;“芳香族或環(huán)狀組”，包括 Pro、Phe、Tyr 和 Trp ;以及“脂肪族組”，包括 Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys。在每一組內(nèi)，還可鑒別亞組。例如，帶電荷/極性氨基酸組可細(xì)分為多個(gè)亞組，包括:“帶正電荷亞組”，包含Lys、Arg和His ;“帶負(fù)電荷亞組”，包含Glu和Asp ;以及“極性亞組”，包含Asn和Gin。在另一實(shí)例中，芳香族或環(huán)狀組可細(xì)分為多個(gè)亞組，包括:“氮環(huán)亞組”，包含Pro、His和Trp ;和“苯基亞組”，包含Phe和Tyr。在另一實(shí)例中，脂肪族基團(tuán)可細(xì)分為多個(gè)亞組，包括:“大型脂肪族非極性亞組”，包含Val、Leu和Ile ;“脂肪族弱極性亞組”，包含Met、Ser、Thr和Cys ；以及“小殘基亞組”，包含Gly和Ala。保守突變的實(shí)例包括上述亞組內(nèi)氨基酸的氨基酸取代，例如(但不限于):Lys取代Arg或反之亦然，從而使得可維持正電荷；Glu取代Asp或反之亦然,從而使得可維持負(fù)電荷；Ser取代Thr或反之亦然，從而使得可維持游離-OH ；以及Gln取代Asn或反之亦然，從而使得可維持游離-NH2。
[0104]術(shù)語(yǔ)“基因”在廣義上用于指核酸分子(通常是DNA，但任選地是RNA)的編碼蛋白質(zhì)或所表達(dá)RNA的任何區(qū)段。因此，基因包括編碼所表達(dá)RNA (其可包括多肽編碼序列)的序列?；蚩蛇M(jìn)一步包含其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列?；蚩蓮亩喾N來(lái)源獲得，包括從目標(biāo)來(lái)源克隆或從已知或預(yù)測(cè)的序列信息合成，且可包括經(jīng)設(shè)計(jì)以具有所需參數(shù)的序列。
[0105]術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸分子”是指(例如)DNA或RNA (例如，mRNA)。核酸分子可為雙鏈或單鏈；單鏈RNA或DNA可為編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。
[0106]可分離或純化本發(fā)明核酸分子。如本文所用“經(jīng)分離”核酸分子或核苷酸序列是指?jìng)?cè)翼沒(méi)有通常在基因或核苷酸序列側(cè)翼(如在基因組序列中)的核苷酸序列的核酸分子或核苷酸序列，且其因此可為重組核酸分子或序列，和/或已完全或部分從其天然環(huán)境(例如細(xì)胞、組織)移除。例如，已從細(xì)胞移除或純化的核酸分子被視為經(jīng)分離。在一些情況下，經(jīng)分離材料將形成組合物(例如，含有其它物質(zhì)的粗萃取物)、緩沖系統(tǒng)或試劑混合物的一部分。在一些實(shí)施例中，核酸分子可經(jīng)純化到接近同質(zhì)性，例如如通過(guò)PAGE或諸如HPLC等柱色譜所測(cè)定。分離核酸分子或核苷酸序列可包括使用重組DNA技術(shù)或使用任何其它適宜方法化學(xué)合成的核酸分子或核苷酸序列。載體中含有的核酸也可包括在如本文所用的“經(jīng)分離”的定義中。本發(fā)明經(jīng)分離DNA分子的活體內(nèi)和活體外RNA轉(zhuǎn)錄物也涵蓋于“經(jīng)分離”核苷酸序列中。
[0107]術(shù)語(yǔ)“密碼子優(yōu)化的”是指編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的密碼子向具體生物體中優(yōu)先使用的密碼子變化，從而使得所編碼蛋白質(zhì)在目標(biāo)生物體中有效表達(dá)。在一些實(shí)施例中，編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可經(jīng)密碼子優(yōu)化以獲得宿主生物體中蛋白質(zhì)的最佳產(chǎn)生。如本發(fā)明上下文中所使用，本發(fā)明的“密碼子優(yōu)化的”基因或核酸分子不需要使每一密碼子都改變以符合計(jì)劃宿主生物體的密碼子優(yōu)先性，也不需要使“密碼子優(yōu)化的”基因或核酸分子的經(jīng)改變密碼子變?yōu)槟繕?biāo)生物體使用的最普遍密碼子。例如，密碼子優(yōu)化的基因可使一或多個(gè)密碼子變?yōu)楸瘸跏济艽a子更常用的密碼子，不管其在生物體中是否最常用于編碼具體氨基酸。
[0108]術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”和“表達(dá)構(gòu)筑物”是指已通過(guò)人類干預(yù)(包括通過(guò)重組方式和/或直接化學(xué)合成)生成的核酸分子，其具有一系列允許在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯具體核酸的指定核酸“表達(dá)控制元件”。表達(dá)載體可為質(zhì)粒、質(zhì)粒的一部分、病毒構(gòu)筑物、核酸片段或諸如此類或其組合。
[0109]如本文所用的“表達(dá)盒”是指可操作連接到表達(dá)控制元件的編碼蛋白質(zhì)或功能性RNA (例如tRNA、短發(fā)夾RNA、一或多種微小RNA、核糖體RNA等)的核苷酸序列，所述表達(dá)控制元件是(例如)啟動(dòng)子和任選地其它影響基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸序列的任一者或組合，例如(但不限于)轉(zhuǎn)錄終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、剪接位點(diǎn)或剪接識(shí)別序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等?！翱刹僮鬟B鎖”或“可操作連接”是指兩個(gè)核酸序列(例如控制序列(例如啟動(dòng)子)與所連接序列(例如編碼蛋白質(zhì)和/或功能性RNA的序列)之間的功能性連鎖。如果啟動(dòng)子可介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子與核酸序列可操作連鎖。源自宿主微生物基因組的核酸序列可與宿主微生物的外源核酸序列可操作連接，其中源自基因組的序列可促進(jìn)同源重組，從而導(dǎo)致將外源核酸序列插入宿主微生物的基因組中。例如，本發(fā)明核酸分子可包括宿主微生物的編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的外源核酸序列，其中將外源核酸序列可操作連接到源自宿主微生物的容許將外源核酸序列重組到宿主基因組中的序列(例如，以序列為側(cè)翼)。
[0110]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“操縱子”是指在單一調(diào)節(jié)信號(hào)或啟動(dòng)子控制下的一個(gè)以上基因的單元。所述基因可轉(zhuǎn)錄為(例如)單一 mRNA分子。
[0111]用于核苷酸序列雜交的“嚴(yán)格性條件”是指培育和洗滌條件，例如溫度和緩沖液濃度條件，其允許具體核酸與第二核酸雜交；第一核酸可與第二核酸完全(即，100% )互補(bǔ)，或第一與第二核酸可共享一定程度的小于完全互補(bǔ)的互補(bǔ)性，例如60%、75%、85%、95%或更高。例如，可使用某些區(qū)別完全互補(bǔ)核酸與較低互補(bǔ)性核酸的高嚴(yán)格性條件。
[0112]在最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)(2011)約翰威利父子公司(John ffiley&Sons))中解釋用于核酸雜交的“高嚴(yán)格性條件”、“中嚴(yán)格性條件”和“低嚴(yán)格性條件”。決定雜交嚴(yán)格性的確切條件不僅取決于洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度(例如0.2XSSC、0.1父33(:等)、溫度(例如，23°C、42°C、68°C等)和諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑或諸如SDS等變性劑的濃度，還取決于諸如以下等因素:核酸序列的長(zhǎng)度、堿基組成、雜交序列之間的錯(cuò)配百分比和所述序列亞組在其它非一致性序列內(nèi)出現(xiàn)的頻率。因此，高、中或低嚴(yán)格性條件可憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。
[0113]通過(guò)將雜交條件從不發(fā)生雜交的嚴(yán)格性水平變?yōu)槭状斡^察到雜交的水平，可確定將容許給定序列與樣品中的最相似序列雜交的條件。
[0114]實(shí)例性雜交條件闡述于克勞斯(Krause) (1991)酶學(xué)方法(Methods inEnzymology), 200, 546-556中。洗漆是其中條件通常經(jīng)設(shè)定以確定雜合體的最低互補(bǔ)性水平的步驟。一般來(lái)說(shuō)，在保持SSC濃度不變的同時(shí)，從僅發(fā)生同源雜交的最低溫度開(kāi)始，最終洗滌溫度每降低一度(°C)，即容許雜交序列之間的最高錯(cuò)配程度增加1%。一般來(lái)說(shuō)，SSC的濃度加倍會(huì)使Tm升高。使用這些導(dǎo)則，可依據(jù)所尋求的錯(cuò)配水平憑經(jīng)驗(yàn)確定用于高、中或低嚴(yán)格性的洗滌溫度。實(shí)例性高嚴(yán)格性條件包括(但不限于)在50%甲酰胺、lMNaCl、1% SDS中在37°C下雜交，和在0.1XSSC中在60°C下洗滌。嚴(yán)格性逐漸升高的條件的實(shí)例包括在雜交后用0.2 X SSC和0.1 % SDS在約室溫下洗滌(低嚴(yán)格性條件)；用0.2 X SSC和0.1% SDS在約42°C下洗滌(中嚴(yán)格性條件)；和用0.1 X SSC在約68°C下洗滌(高嚴(yán)格性條件)。洗滌可僅使用這些條件中的一種(例如高嚴(yán)格性條件)來(lái)實(shí)施，洗滌可涵蓋兩種或更多種嚴(yán)格性條件以提高嚴(yán)格性。最佳條件將依據(jù)所涉及的具體雜交反應(yīng)而變化，且可憑經(jīng)驗(yàn)確定。
[0115]可通過(guò)以下方式來(lái)確定等效條件:改變?nèi)鐦I(yè)內(nèi)已知作為實(shí)例給定的一或多種參數(shù)，同時(shí)維持靶核酸分子與所用引物或探針之間的類似程度的一致性或相似性。例如，可雜交核苷酸序列可用作探針和引物以鑒別包含本發(fā)明核酸的生物體和/或分離本發(fā)明核酸。
[0116]“經(jīng)純化”核酸分子或核苷酸序列或蛋白質(zhì)或多肽序列實(shí)質(zhì)上不含細(xì)胞材料和細(xì)胞組份。經(jīng)純化核酸分子或蛋白質(zhì)可不含(例如)除了緩沖液或溶劑以外的化學(xué)品。“實(shí)質(zhì)上不含”并不計(jì)劃意指除了新穎核酸分子以外的其它組份是不可檢測(cè)的。
[0117]“重組”或“改造”核酸分子是已通過(guò)人類處理改變的核酸分子。作為非限制性實(shí)例，重組核酸分子是如下核酸分子，其:1)已在活體外使用(例如)核酸分子的化學(xué)或酶促技術(shù)合成或修飾(例如，通過(guò)使用化學(xué)核酸合成，或通過(guò)使用用于以下目的的酶:復(fù)制、聚合、消化(核酸外切或核酸內(nèi)切)、連接、反轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄、堿基修飾(例如，包括甲基化)或重組(包括同源重組和位點(diǎn)特異性重組))；2)包括在自然界中不連結(jié)的連結(jié)核苷酸序列，3)已使用分子克隆技術(shù)進(jìn)行改造以使得其相對(duì)于天然核酸分子序列缺少一或多個(gè)核苷酸，和/或4)已使用分子克隆技術(shù)進(jìn)行處理以使得其相對(duì)于天然核酸序列具有一或多個(gè)序列變化或重排。作為非限制性實(shí)例，cDNA是重組DNA分子，如同是已通過(guò)活體外聚合酶反應(yīng)生成的，或已附接有連接體的，或已整合到載體(例如克隆載體或表達(dá)載體)中的任何核酸分子。
[0118]在用于生物體時(shí)，術(shù)語(yǔ)重組、改造或遺傳改造是指已通過(guò)將異源或重組核酸序列引入生物體中來(lái)處理的生物體，且包括基因敲除(knockout)、靶向突變和基因置換、啟動(dòng)子置換、缺失或插入，以及將轉(zhuǎn)基因引入生物體中?？蓪愒椿蛑亟M核酸分子整合到重組/遺傳改造生物體的基因組中，或在其它情況下不將其整合到重組/遺傳改造生物體的基因組中。
[0119]如本文所用術(shù)語(yǔ)“重組蛋白質(zhì)”是指通過(guò)遺傳改造產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
[0120]術(shù)語(yǔ)“天然的”和“野生型”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式。例如，天然或野生型核酸分子、核苷酸序列或蛋白質(zhì)可存在于天然來(lái)源中并從所述天然來(lái)源分離，且沒(méi)有通過(guò)人類處理有意修飾。
[0121]如本文所用“減弱的”意指數(shù)量、程度、強(qiáng)度(intensity)或強(qiáng)度(strength)降低。減弱的基因表達(dá)可是指顯著降低的所述基因的數(shù)量和/或轉(zhuǎn)錄比率，或所編碼蛋白質(zhì)的翻譯、折疊或組裝。減弱的基因可為使所編碼蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不可檢測(cè)的經(jīng)破壞或缺失基因。
[0122]“外源核酸分子”或“外源基因”是指已被引入(“經(jīng)轉(zhuǎn)型”)到細(xì)胞中的核酸分子或基因。經(jīng)轉(zhuǎn)型細(xì)胞可被稱作重組細(xì)胞，可向其中引入其它外源基因。如果經(jīng)核酸分子轉(zhuǎn)型的細(xì)胞的后代已繼承所述外源核酸分子，那么其也被稱作“經(jīng)轉(zhuǎn)型”。相對(duì)于所轉(zhuǎn)型細(xì)胞，外源基因可來(lái)自不同物種(且因此為“異源”)或來(lái)自相同物種(且因此為“同源”)?！皟?nèi)源”核酸分子、基因或蛋白質(zhì)因?yàn)槠浯嬖谟谒拗髦谢蛴伤鏊拗魈烊划a(chǎn)生而是天然核酸分子、基因或蛋白質(zhì)。[0123]術(shù)語(yǔ)“異源”在這個(gè)方面中在廣義上用于指引入宿主細(xì)胞中的核酸分子或蛋白質(zhì)，其中所述核酸分子或蛋白質(zhì)源自不同株系/生物體。異源基因可在經(jīng)轉(zhuǎn)型宿主中具有等效性，即通常執(zhí)行相同或類似功能的基因，或外源異源基因可編碼在宿主株系/生物體中不具有內(nèi)源同系物的蛋白質(zhì)。在提到基因調(diào)節(jié)序列或用于維持或處理基因序列的輔助核酸序列(例如5’非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸添加序列、內(nèi)含子序列、剪接位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列、基因組同源性區(qū)域、重組位點(diǎn)等)時(shí)，“異源”意指調(diào)節(jié)序列或輔助序列與在構(gòu)筑物、基因組、染色體或附加體中與調(diào)節(jié)或輔助核酸序列并置的基因來(lái)自不同來(lái)源。因此，即使啟動(dòng)子可源自與其所連接基因相同的物種(或在一些情形中源自相同生物體)，可操作連接到在其天然狀態(tài)中(即在未遺傳改造的生物體的基因組中)未可操作連接的基因的啟動(dòng)子在本文中稱作“異源啟動(dòng)子”。
[0124]術(shù)語(yǔ)“天然”在本文中用于指在宿主中天然存在的核酸序列或氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“非天然”在本文中用于指在宿主中并非天然存在的核酸序列或氨基酸序列。已從宿主細(xì)胞移除的、經(jīng)受實(shí)驗(yàn)室處理的或引入或再引入宿主細(xì)胞的核酸序列或氨基酸序列被視為“非天然”。引入宿主細(xì)胞的合成或部分合成基因是“非天然”。非天然基因進(jìn)一步包括宿主微生物的可操作連接到一或多個(gè) 已重組到宿主基因組中的異源調(diào)節(jié)序列的內(nèi)源基因。
[0125]術(shù)語(yǔ)“蠟酯組合物”是指包含至少一種蠟酯分子的組合物。蠟酯包括(例如)僅包含蠟酯分子的組合物(即，不含除了蠟酯分子以外的脂肪酸衍生物的組合物)以及包含蠟酯和至少一種其它類型的選自(例如)醇、醛、烯烴、炔烴和烷烴的脂肪酸衍生物的組合物。蠟酯可僅包含一種類型的蠟酯分子或一種以上類型的蠟酯分子。
[0126]術(shù)語(yǔ)“脂肪醇組合物”是指包含至少一種脂肪醇分子的組合物。脂肪醇組合物包括(例如)僅包含脂肪醇分子的組合物(即，不含除了脂肪醇分子以外的脂肪酸衍生物的組合物)以及包含脂肪醇和至少一種其它類型的選自(例如)醛、酯、烯烴、炔烴和烷烴的脂肪酸衍生物的組合物。脂肪醇組合物可僅包含一種類型的脂肪醇分子或一種以上類型的脂肪醇分子。
[0127]如本文所用術(shù)語(yǔ)“釋放”和“分泌”可互換使用，其是指跨過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的主動(dòng)和/或被動(dòng)機(jī)制。所述轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的實(shí)例包括(但不限于)被動(dòng)擴(kuò)散、梯度擴(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和其組合。
[0128]術(shù)語(yǔ)“重組”、“改造”或“遺傳改造”在用于宿主細(xì)胞時(shí)是指已通過(guò)將非天然(例如，異源或重組)核酸序列引入宿主細(xì)胞中或從宿主細(xì)胞缺失天然核酸序列來(lái)處理的細(xì)胞，且包括(例如)基因敲除；靶向突變和基因置換；啟動(dòng)子置換、缺失或插入；以及將轉(zhuǎn)基因引入宿主細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，將所引入的非天然核酸分子整合到重組/遺傳改造宿主的基因組中。在其它實(shí)施例中，不將所引入的非天然核酸分子整合到重組/遺傳改造宿主的基因組中。
[0129]如本發(fā)明上下文中所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)型”、“轉(zhuǎn)染”、“接合”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”計(jì)劃包含多種所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于將外來(lái)核酸(例如，外源DNA)引入宿主細(xì)胞中的方法，包括磷酸鈣和/或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、自然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔、粒子轟擊或諸如此類或其組合。轉(zhuǎn)染可為瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(例如，基因組整合)。用于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)型和/或轉(zhuǎn)染的適宜方法的實(shí)例可參見(jiàn)(例如)分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning-A Laboratory Manual) (2010),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)。
[0130]術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”是指通過(guò)使用所選條件和/或受控條件有意養(yǎng)育一或多種細(xì)胞的生長(zhǎng)(例如細(xì)胞大小、細(xì)胞內(nèi)容物和/或諸如生物分子的產(chǎn)生等細(xì)胞活性的增加)和/或繁殖(例如細(xì)胞數(shù)通過(guò)有絲分裂增加)。生長(zhǎng)與繁殖二者的組合可稱為增殖。所選條件和/或受控條件的非限制性實(shí)例可包括使用限定培養(yǎng)基(具有諸如pH、離子強(qiáng)度和/或碳源等已知特征)、指定溫度、氧張力、二氧化碳水平、在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)或諸如此類或其組合。
[0131]術(shù)語(yǔ)“生物反應(yīng)器”是指其中任選地在懸浮液中，且在懸浮時(shí)優(yōu)選地在水性液體中培養(yǎng)細(xì)胞(例如，微藻細(xì)胞)的外殼或部分外殼。生物反應(yīng)器可用于培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)其生理周期的各個(gè)階段。
[0132]代謝路徑
[0133]脂肪酸生物合成路徑在原核生物和真核藻類和高等植物的葉綠體中高度保守。圖9繪示細(xì)菌中從中心代謝物乙?；?CoA開(kāi)始的脂肪酸生物合成路徑。脂肪酸生物合成是通過(guò)由乙?；?CoA羧化酶(ACC酶)催化將乙酰基-CoA轉(zhuǎn)化為丙二?；?CoA來(lái)起始。然后由丙二?；?CoA-ACP轉(zhuǎn)酰酶(FabD)催化將丙二酰基-CoA轉(zhuǎn)化為丙二?；?ACP。最后，由酶復(fù)合體脂肪酸合酶(FAS)催化將丙二?；?ACP轉(zhuǎn)化為?；?ACP。脂肪酸合酶復(fù)合體通過(guò)首先由β -酮?；?ACP合酶III (例如，F(xiàn)abH)催化縮合丙二?；?ACP與乙?；?ACP來(lái)起始延伸循環(huán)。通過(guò)3-酮酰基-ACP還原酶(例如FabG)將通過(guò)FabH反應(yīng)形成的β -酮?；?ACP (3-酮?；?ACP)還原為β -羥酰基-ACP (3-羥?；?ACP)。然后β -羥?；?ACP脫水酶(例如FabA、FabZ)作用于β -羥?；?ACP以形成反式_2_烯?；?ACP，其又通過(guò)烯?；?ACP還原酶(例如Fab 1、Fab K、FabL)還原以形成延伸2個(gè)碳的?；?ACP產(chǎn)物。后續(xù)循環(huán)是通過(guò)β -酮?；?ACP合酶I或II (例如，F(xiàn)abB或FabF)催化的丙二?；?ACP與?；?ACP的縮合來(lái)起始。重復(fù)縮合、還原、脫水和還原的循環(huán)，每一循環(huán)從丙二酰基-ACP添加兩個(gè)碳，直到將?；溚ㄟ^(guò)硫酯酶(例如葉綠體中的FatA或FatB)從ACP裂解以形成游離脂肪酸或通過(guò)轉(zhuǎn)酰酶轉(zhuǎn)移到另一分子(例如甘油3-磷酸)為止。
[0134]與植物葉綠體不同，藍(lán)細(xì)菌不產(chǎn)生游離脂肪酸，且與大腸桿菌(E.coli)和其它異養(yǎng)細(xì)菌不同，藍(lán)細(xì)菌不產(chǎn)生?；鵢CoA。在用共價(jià)結(jié)合到酰基載體蛋白的?；溠由熘舅岷螅；D(zhuǎn)移酶可將?；溵D(zhuǎn)移到甘油主鏈以產(chǎn)生膜脂質(zhì)。
[0135]為在藍(lán)細(xì)菌中產(chǎn)生諸如蠟酯等脂肪酸衍生物，通常認(rèn)為需要引入若干種編碼用于產(chǎn)生?；?CoA和將?；?CoA轉(zhuǎn)化為所需終產(chǎn)物(例如，醇、醛、烷烴、烯烴、脂肪酸酯或蠟酯)的酶的外源基因。如圖9中所示，可引入編碼硫酯酶(例如，?；?ACP硫酯酶，3.1.2.20)的基因以水解?；?ACP硫酯，由此釋放游離脂肪酸。可引入?；?CoA合成酶(例如，6.2.1.3)基因以將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為?；?CoA。
[0136]如果脂肪醛和/或烷烴是所需終產(chǎn)物那么可引入編碼形成醛的脂肪醛還原酶(例如，形成醛的酰基-CoA還原酶，1.2.1.42或1.2.1.50 ;還參見(jiàn)美國(guó)專利第6，143，538號(hào))的基因以將酰基-CoA還原為脂肪醛；另外或或者，可引入羧酸還原酶基因(例如，參見(jiàn)W02010/135624和W02010/042664)以將游離脂肪酸還原為脂肪醛。此外，可引入一或多種編碼脂肪醇氧化酶(例如，1.1.3.20)或脂肪醇脫氫酶(例如，1.1.1.164)的基因以將脂肪醇轉(zhuǎn)化為脂肪醛?？赏ㄟ^(guò)引入編碼脂肪醛脫羰基酶(例如，4.1.99.5)的基因?qū)⒅救┻M(jìn)一步處理為烷烴。[0137]如果脂肪醇、烯烴和/或蠟酯是所需終產(chǎn)物那么可引入編碼形成醇的脂肪酰基還原酶(例如，形成醇的酰基-CoA還原酶，1.2.1.50)的基因。此外，可引入脂肪醛還原酶基因以將脂肪醛還原為脂肪醇。可通過(guò)引入編碼脂肪醇脫水酶的基因和/或通過(guò)催化脫水將脂肪醇進(jìn)一步處理為烯烴。蠟酯可通過(guò)引入編碼蠟酯合酶的基因以催化脂肪醇與脂肪酰基硫酯的縮合來(lái)形成(圖9)。
[0138]如本文所展示，某些酶能將?；?ACP直接轉(zhuǎn)化為脂肪酸衍生物。例如，如2011年9月27日申請(qǐng)的標(biāo)題為“形成脂肪醇的?；?ACP還原酶”的共同受讓的美國(guó)專利申請(qǐng)案61/539，640中所揭示，某些?；?ACP還原酶(例如Maqu_2220?；?ACP還原酶和Hch_05075?；?ACP還原酶)可將?；?ACP直接轉(zhuǎn)化為脂肪醇。所述酶在本文中稱作“形成醇的酰基-ACP還原酶”。此外，如本發(fā)明所體現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些蠟酯合酶(例如除烴海桿菌的WSl和WS2)能縮合?；?ACP與脂肪醇以產(chǎn)生蠟酯。本發(fā)明由此提供在僅需要以下兩種外源酶的無(wú)?；?CoA路徑中產(chǎn)生蠟酯的新方法:形成醇的酰基-ACP還原酶和?；?ACP蠟酯合酶。
[0139]在一些實(shí)施例中，?；?ACP轉(zhuǎn)化為脂肪醇可通過(guò)脂肪醛的合成來(lái)進(jìn)行，其中在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形成脂肪醛的還原酶(例如，形成醛的?；?ACP還原酶)首先將?；?ACP還原為脂肪醛。例如，在某些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可經(jīng)改造以過(guò)表達(dá)內(nèi)源形成脂肪醛的?；?ACP還原酶(例如，通過(guò)在?；€原酶基因附近插入啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄控制元件)。在其它實(shí)施例中，宿主細(xì)胞可經(jīng)改造以表達(dá)外源形成脂肪醛的?；€原酶。
[0140]蠟酯合酶
[0141]已發(fā)現(xiàn)多種 鑒別或表征為?；D(zhuǎn)移酶的多肽具有蠟酯合酶活性且在本文中稱作蠟合酶或蠟酯合酶，所述多肽包括脂肪?；D(zhuǎn)移酶、醇?；D(zhuǎn)移酶(AAT，EC2.3.1.84)、醇合酶/?；?CoA:二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶、二?；视蚈-酰基轉(zhuǎn)移酶或二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT，EC2.3.1.20)、0_?；D(zhuǎn)移酶(例如，長(zhǎng)鏈醇O-脂肪?；D(zhuǎn)酰酶(EC2.3.1.75)或酰基-Cok:醇?；D(zhuǎn)移酶、膜結(jié)合的O-?；D(zhuǎn)移酶(MBOAT))、酰基-Cok蠟醇?；D(zhuǎn)移酶和雙功能蠟酯合酶/?；?Cok?；D(zhuǎn)移酶。?；?ACP蠟酯合酶可使用?；?ACP作為?；w通過(guò)催化酰基-ACP與醇(例如脂肪醇)的反應(yīng)產(chǎn)生脂肪酸酯(例如蠟酯)。
[0142]可使用(例如)業(yè)內(nèi)或本文所揭示的方法來(lái)測(cè)試蠟酯合酶使用?；?ACP作為底物的能力。在一些實(shí)例中，可利用酰基-ACP底物的蠟酯合酶可被鑒別為具有“蠟酯合酶樣?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶” Pfam結(jié)構(gòu)域PF03007，其中與所述結(jié)構(gòu)域的匹配的比特分?jǐn)?shù)高于20.6的集聚截止值；且任選地還可具有“未知功能DUF1298蛋白質(zhì)” Pfam結(jié)構(gòu)域PF06974，其中匹配的比特分?jǐn)?shù)為至少20.7 (PF06974的集聚截止值)。利用?；?ACP的蠟酯合酶還可基于與除烴海桿菌中WSl (SEQ ID NO:19)或WS2 (SEQ ID NO:21)的至少(例如)30%、40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的氨基酸序列一致性來(lái)鑒別。例如，宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)基因微生物)可包括編碼與WSl (SEQ ID N0:19)具有至少85%一致性的?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。在一些實(shí)例中，宿主細(xì)胞可包括編碼與WSl (SEQ ID NO:19)具有至少90%或至少95%—致性的酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主細(xì)胞可包括編碼SEQ ID NO: 19的?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。或者，宿主細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)基因微生物)可包括編碼與WS2 (SEQ ID N0:21)具有至少85% —致性的?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主細(xì)胞可包括編碼與WS2 (SEQ IDNO:21)具有至少90%或至少95%—致性的?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主細(xì)胞可包括編碼SEQ ID NO:21的酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列。
[0143]具有較低一致性程度但具有相當(dāng)?shù)纳锘钚?即，與本文所述?；?ACP蠟酯合酶蛋白質(zhì)的生物活性相當(dāng))的氨基酸序列被認(rèn)為等效。展示并測(cè)量?；?ACP蠟酯合酶的活性的方法可使用已知分析(例如，US6, 492, 509 ；US7, 118,896 ；US7, 897, 369)，其中可用?；?ACP取代?；?Cok底物；或可為檢測(cè)表達(dá)假定?；?ACP蠟合酶的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物產(chǎn)生的蠟酯的分析，其中所述細(xì)胞不產(chǎn)生和/或未提供有?；?CoA底物(例如，使用(例如)氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、薄層色譜等測(cè)量蠟酯產(chǎn)生的速率/水平)。
[0144]編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列可與SEQ ID N0:18或與SEQ ID NO: 18中編碼蠟酯合酶的功能性片段的部分具有至少約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%,75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97 %、98 %、99 %或100 %序列一致性。例如，編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列可與SEQ ID NO:18具有至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列一致性?；蛘?，編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列可與SEQ ID N0:20或與SEQ ID NO:20中編碼蠟酯合酶的功能性片段的部分具有至少約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%,75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97 %、98 %、99 %或100 %序列一致性。例如，編碼?；?ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列可與SEQ ID NO:20具有至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列一致性。
[0145]在一些實(shí)施例中，非天然核酸序列編碼來(lái)自海洋細(xì)菌(即，海洋環(huán)境中天然存在的細(xì)菌)的編碼?；?ACP蠟酯合酶的核酸序列。在某些實(shí)施例中，海洋細(xì)菌是海桿菌屬物種，例如棲藻海桿菌、堿性海桿菌(M.alkaliphilus)、水油海桿菌、粘附海桿菌、北極海桿菌(M.arcticus)、苔蘚蟲(chóng)海桿菌(M.bryozoorum)、濟(jì)州島海桿菌(M.daepoensis)、異常海桿菌(M.excellens)、黃海海桿菌(M.fIavimaris)、狐多尼斯海桿菌(M.guadonensis)、除烴海桿菌、韓國(guó)海桿菌(M.koreenis)、解脂海桿菌(M.1ipolyticus)、岸海桿菌(M.1itoralis)、綠島海桿菌(M.1utaoensis)、近海生海桿菌(M.maritimus)、沉積物海桿菌(M.sediminum)、海桿菌ELB17、斯闊倫海桿菌(M.squalenivirans)、強(qiáng)酒海桿菌(M.vinifirmus)等。在其它實(shí)施例中，?；?ACP蠟酯合酶源自海洋細(xì)菌，例如以下物種:不動(dòng)桿菌屬、食烷菌(例如，泊庫(kù)島食烷菌(A.borkumensis)或食烷菌DG881)、Y -變形菌(gammaproteobacteria)(例如,UPF0089)、濟(jì)州何氏菌(例如，3839139)或湖沉積桿菌(例如，湖沉積桿菌MED105AT)。
[0146]在一些實(shí)施例中，非天然核酸序列編碼與選自以下的假定蠟酯合酶具有至少約 40 %A5 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,86 %,87 %,88 %,8990%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100 % 氨基酸序列一致性的酰基-ACP蠟酯合酶:
[0147]表1.微生物蠟酯合酶基因
[0148]
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)遺傳改造以供從?；??；d體蛋白ACP產(chǎn)生脂肪酸酯的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞包含編碼酰基-ACP蠟酯合酶的非天然核酸序列，且另外其中所述重組宿主細(xì)胞不表達(dá)以下酶中的一或多者: a)外源酰基-ACP硫酯酶； b)外源?；?CoA硫酯酶；和 c)外源?；?CoA合成酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞不包括編碼酰基-ACP硫酯酶、?；?CoA硫酯酶或?；?CoA合成酶中的任一者的外源核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞不內(nèi)源性產(chǎn)生?；?_CoA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造以減弱或消除酰基-CoA產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述蠟酯合酶與選自由SEQID NO:19,SEQ ID NO:2U SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41 或 SEQ IDNO:43組成的群組的多肽或與所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50%序列一致性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述蠟酯合酶包含與SEQID N0:19或SEQ ID NO:21的所述多肽或與所述多肽的功能性片段具有至少85%序列一致性的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼形成醇的?；?ACP還原酶的非天然核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述重組宿主細(xì)胞不包括編碼?；?ACP硫酯酶、?；?CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者的外源核酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述形成醇的酰基-ACP還原酶與選自由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:10 組成的群組的多肽或與所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50%序列一致性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述形成醇的?；?ACP還原酶包含與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或與所述多肽的功能性片段具有至少85%序列一致性的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中將編碼所述蠟酯合酶的所述核酸序列、編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的核酸序列或編碼所述蠟酯合酶的所述核酸序列和編碼所述形成醇的?；?ACP還原酶的所述核酸序列二者整合到所述重組宿主細(xì)胞的染色體中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組宿主細(xì)胞，其中將編碼所述蠟酯合酶的所述核酸序列和編碼所述形成醇的酰基-ACP還原酶的所述核酸序列可操作連接到相同啟動(dòng)子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是光合微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述光合微生物是藍(lán)細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述光合微生物是阿格門(mén)氏藻、魚(yú)腥藻屬、項(xiàng)圈藻屬、倒囊藻屬、絲囊藻屬、節(jié)螺藻屬、星球藻屬、博氏藻屬、眉藻屬、管孢藻屬、擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬、擬色球藻屬、色球藻屬、發(fā)毛針藻屬、藍(lán)細(xì)菌、雙色藻屬、藍(lán)囊胞菌屬、藍(lán)螺菌屬、藍(lán)桿藻屬、柱胞藻屬、筒孢藻屬、藍(lán)纖維藻屬、小皮果藍(lán)細(xì)菌屬、側(cè)生藻屬、費(fèi)氏藻屬、蓋特勒氏藍(lán)細(xì)菌屬、吉特勒氏線狀藍(lán)細(xì)菌屬、膠菌藻、粘球藻屬、粘桿藻屬、鹽螺旋藻屬、英加藻屬、瘦鞘絲藻屬、湖絲藻屬、鞘絲藻屬、微鞘藻屬、微囊藻屬、粘囊藻屬、節(jié)球藻屬、念珠藻屬、擬念珠藻屬、顫藻屬、席藻屬、浮絲藻屬、寬球藻屬、原綠球藻屬、原綠菌屬、原綠發(fā)菌屬、假魚(yú)腥藻屬、膠須藻屬、裂須藻屬、雙歧藻屬、螺旋藻屬、斯塔尼爾藍(lán)菌屬、斯塔爾氏藍(lán)菌屬、真枝藻屬、束藻屬、聚球藻屬、集胞藻屬、嗜熱聚球藻、單岐藻屬、束毛藻屬、常絲藻或異球藻屬。
16.一種用于產(chǎn)生蠟酯的方法，其包含以下步驟: a)在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞；和 b)容許表達(dá)編碼形成醇的酰基-ACP還原酶的非天然核酸序列和編碼蠟酯合酶的非天然核酸序列，其中所述表達(dá)引起產(chǎn)生所述蠟酯。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述適宜培養(yǎng)基不包括醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞不內(nèi)源性產(chǎn)生酰基-CoA。
19.根據(jù)權(quán)利要 求16所述的方法，其中所述重組宿主細(xì)胞相對(duì)于缺少所述編碼蠟酯合酶的核酸序列的對(duì)照宿主細(xì)胞產(chǎn)生提高水平的所述蠟酯。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述蠟酯包含至少一種蠟酯分子，其中從脂肪醇衍生的A鏈和從?；?ACP衍生的B鏈二者的鏈長(zhǎng)度為C8到C24。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述蠟酯包含至少一種蠟酯分子，其中所述A鏈和所述B鏈二者都是C12到C18。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中至少一部分所產(chǎn)生的蠟酯是由所述宿主細(xì)胞分泌。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是光合微生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述光合微生物是藍(lán)細(xì)菌。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述藍(lán)細(xì)菌是阿格門(mén)氏藻、魚(yú)腥藻屬、項(xiàng)圈藻屬、倒囊藻屬、絲囊藻屬、節(jié)螺藻屬、星球藻屬、博氏藻屬、眉藻屬、管孢藻屬、擬綠膠藍(lán)細(xì)菌屬、擬色球藻屬、色球藻屬、發(fā)毛針藻屬、雙色藻屬、藍(lán)囊胞菌屬、藍(lán)螺菌屬、藍(lán)桿藻屬、柱胞藻屬、筒孢藻屬、藍(lán)纖維藻屬、小皮果藍(lán)細(xì)菌屬、側(cè)生藻屬、費(fèi)氏藻屬、蓋特勒氏藍(lán)細(xì)菌屬、吉特勒氏線狀藍(lán)細(xì)菌屬、膠菌藻、粘球藻屬、粘桿藻屬、鹽螺旋藻屬、英加藻屬、瘦鞘絲藻屬、湖絲藻屬、鞘絲藻屬、微鞘藻屬、微囊藻屬、粘囊藻屬、節(jié)球藻屬、念珠藻屬、擬念珠藻屬、顫藻屬、席藻屬、浮絲藻屬、寬球藻屬、原綠球藻屬、原綠菌屬、原綠發(fā)菌屬、假魚(yú)腥藻屬、膠須藻屬、裂須藻屬、雙歧藻屬、螺旋藻屬、斯塔尼爾藍(lán)菌屬、斯塔爾氏藍(lán)菌屬、真枝藻屬、束藻屬、聚球藻屬、集胞藻屬、嗜熱聚球藻、單岐藻屬、束毛藻屬、常絲藻或異球藻屬。
26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述適宜培養(yǎng)基不包含大量還原碳源。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103975070SQ201280057444
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月27日
【發(fā)明者】埃里克·霍爾特薩普爾, 約翰·H·韋魯托 申請(qǐng)人:艾克森美孚研究與工程公司