與工業(yè)制藥應(yīng)用相容的可放大的慢病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組慢病毒載體生產(chǎn)的工業(yè)化，以便制造用于治療性應(yīng)用例如基因療法和/或DNA疫苗接種的足夠的材料，以用于臨床試驗(yàn)和/或商業(yè)用途。
【專利說明】與工業(yè)制藥應(yīng)用相容的可放大的慢病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)
[0001]本發(fā)明涉及重組慢病毒載體生產(chǎn)的工業(yè)化，以便制造用于治療性應(yīng)用例如基因療法和/或DNA疫苗接種的足夠的材料，以用于臨床試驗(yàn)和/或商業(yè)用途。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]重組病毒載體用于基因療法和DNA疫苗接種應(yīng)用的用途的進(jìn)步產(chǎn)生了大規(guī)模制造臨床級病毒載體以轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的需要。一種這樣的病毒載體家族是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的慢病毒屬。
[0003]用于基因療法應(yīng)用的慢病毒載體常規(guī)是利用慢病毒構(gòu)建物DNA系統(tǒng)通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞而制造的，所述轉(zhuǎn)染需要培養(yǎng)基中有胎牛血清(Merten等，2011，Hum GeneTher.22(3):343-56)。培養(yǎng)物中存在這種動物來源的組分構(gòu)成了安全性風(fēng)險(xiǎn)，限制了該方法的GMP合規(guī)性。此外，這種生產(chǎn)方法就擴(kuò)大規(guī)模而言嚴(yán)重受限，并且不適用于基因療法的治療、商業(yè)和/或工業(yè)應(yīng)用所要求的生產(chǎn)大量載體粒子。例如，現(xiàn)有的常規(guī)方法允許在純化前在一次運(yùn)行中產(chǎn)生24至48L慢病毒載體懸液，其滴度為約IX 17至3 X 17個(gè)功能性載體粒子/mL，在20%的標(biāo)準(zhǔn)純化產(chǎn)率下，這會在終產(chǎn)物中產(chǎn)生最多3X1011個(gè)粒子。相比而言,I期臨床試驗(yàn)需要至少5X 111個(gè)功能性慢病毒載體粒子(McGregor等,2001,Hum GeneTher.，12:2028-2029)。因此，現(xiàn)今強(qiáng)烈需要工業(yè)化慢病毒載體生物制造方法，其將滿足當(dāng)每個(gè)患者需要大量載體或者必須對大量患者進(jìn)行治療時(shí)對于足夠量的治療性載體的需要，或者更通常地對將成本保持在合理水平并且維持優(yōu)良制造規(guī)范(good manufacturingpractice) (GMP)的合規(guī)性的需要。
[0004]改進(jìn)的一個(gè)潛在途徑是使用在不存在胎牛血清(FBS)的化學(xué)條件培養(yǎng)基中懸浮生長的細(xì)胞培養(yǎng)物，以克服與使用FBS有關(guān)的安全性風(fēng)險(xiǎn)以及對導(dǎo)致常規(guī)方法缺乏可放大性的主要原因的細(xì)胞培養(yǎng)容器的需要。例如，最近已經(jīng)描述了在不存在血清的懸浮培養(yǎng)物中通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)病毒載體。具體地，Ansorge等已經(jīng)提出了在灌注培養(yǎng)物中通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染懸浮生長的HEK293SF-3F6細(xì)胞來生產(chǎn)慢病毒的方法(Ansorge等，2009，J Gene Med,11:868-876)。然而，所提出的方法既復(fù)雜，又在規(guī)模上受限。事實(shí)上，Ansorge等的方法是在灌注培養(yǎng)物中進(jìn)行的，這需要數(shù)個(gè)收獲步驟以及復(fù)雜的控制措施。此外，那項(xiàng)研究中提出的生產(chǎn)局限于3升的體積。Segura等也已提出通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)物來生產(chǎn)慢病毒載體的方法(Segura 等，2007, B1technology and B1engineering, 98 (4):789-799)。盡管如此，所提出的方法是復(fù)雜的，因?yàn)槠湫枰獢?shù)個(gè)收獲步驟以及在轉(zhuǎn)染后第3、4和5天更換全部培養(yǎng)基以及復(fù)雜的控制措施對照測量。此外，病毒載體的生產(chǎn)局限于3升的體積，而且據(jù)報(bào)道，僅僅是重組蛋白的生產(chǎn)，而非病毒載體的生產(chǎn)已經(jīng)被放大至60L規(guī)模。因此，盡管存在這些報(bào)道，仍然需要開發(fā)用于從懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)慢病毒載體的簡單明了的工業(yè)化方法，其能同時(shí)解決商業(yè)規(guī)模的基于慢病毒的疫苗和/或基因療法產(chǎn)品所面對的數(shù)量和質(zhì)量問題。本發(fā)明通過公開一種能夠提高病毒產(chǎn)量的優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)物和慢病毒生產(chǎn)方法，解決并滿足了這些需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及制藥級重組慢病毒載體的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)方法。下面顯示的結(jié)果表明，發(fā)明人已經(jīng)能夠提供一種在產(chǎn)量和質(zhì)量方面與利用貼壁細(xì)胞的現(xiàn)有GMP生產(chǎn)方法一樣好或者更好、但具有大得多的放大生產(chǎn)潛能的方法。
[0006]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)重組慢病毒載體、慢病毒和假病毒的方法，其包括:
[0007]-在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，所述哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染有至少一種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒，所述培養(yǎng)在至少5L的體積中進(jìn)行；
[0008]-從培養(yǎng)基中收獲所產(chǎn)生的重組慢病毒載體。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是人胚腎293T細(xì)胞(也被稱為HEK293T細(xì)胞或293T細(xì)胞)，其能夠在無血清條件下懸浮生長。發(fā)明人已經(jīng)顯示，這些細(xì)胞特別適合于工業(yè)化生產(chǎn)滿足數(shù)量和質(zhì)量要求兩者的大量重組慢病毒載體以用于療法、特別是基因療法臨床試驗(yàn)和商業(yè)應(yīng)用。
[0010]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)至72小時(shí)之間、優(yōu)選在48小時(shí)后收獲慢病毒載體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)以至少1L的規(guī)模，或優(yōu)選至少50L的規(guī)模，或者甚至優(yōu)選至少100L的規(guī)模實(shí)施，并且特別適合于慢病毒載體的工業(yè)化生產(chǎn)，使得能夠收獲至少17個(gè)感染性基因組IG/mL。本發(fā)明的方法首次使得能夠進(jìn)行慢病毒工業(yè)化生產(chǎn)，并且將獲得非常高水平的病毒載體，正如由實(shí)驗(yàn)部分中示出的從10mL到50L的線性規(guī)模擴(kuò)大所表明的。因此，通過實(shí)施本方法可獲得非常高水平的病毒載體(例如在1000L的規(guī)模下)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，收獲步驟由單次慢病毒收獲組成。據(jù)發(fā)明人所知，這是首次報(bào)道在如此高的規(guī)模下實(shí)施單次收獲來生產(chǎn)慢病毒載體。該實(shí)施方案的優(yōu)勢在于提供了一種簡單明了的方法，該方法需要盡可能少的步驟并且能夠控制成本。
[0011]此外，本發(fā)明還涉及上述方法，其中哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且收獲步驟由在轉(zhuǎn)染后48至72小時(shí)之間實(shí)施的單次收獲組成。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步公開了在培養(yǎng)用于生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞之前對轉(zhuǎn)染過程進(jìn)行優(yōu)化。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用聚乙烯亞胺(PEI)和質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，上述方法包括轉(zhuǎn)染步驟，其中用PEI和質(zhì)粒的這種混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)特定的變體中，利用至少1.5 μ g/106個(gè)細(xì)胞的總質(zhì)粒DNA的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)特定的變體中，PEI是20-25kD的線性PEI。在又一個(gè)特定的變體中，本發(fā)明提供的優(yōu)化還涉及混合物中每種組分的相對量。具體地，在本發(fā)明的一個(gè)特定的變體中，在轉(zhuǎn)染前將PEI和質(zhì)粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每個(gè)寡核苷酸磷酸的PEI氮原子數(shù)目。在一個(gè)優(yōu)選的變體中，N/P比率為6左右。在又一個(gè)特定的變體中，還已經(jīng)探索了在加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中之前PEI和質(zhì)粒之間的接觸時(shí)間，接觸時(shí)間理想地可能在5至30分鐘之間，接觸時(shí)間具體地是10分鐘左右。
[0013]可以通過在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基，對本發(fā)明的生產(chǎn)方法有利地進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)選地，丁酸鈉以2mM至12mM之間、具體地在2mM至1mM之間或5mM至12mM之間(例如5、8或12mM左右)的終濃度，更具體地是5mM的終濃度加入到培養(yǎng)物中。
[0014] 在本發(fā)明方法的又一個(gè)實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)染在細(xì)胞中的質(zhì)粒包括4種質(zhì)粒，包括:編碼包膜蛋白的質(zhì)粒(Env質(zhì)粒)，該質(zhì)粒可以來源于所討論的慢病毒，但也可以來源于其他包膜病毒；編碼慢病毒Gag和Pol蛋白的質(zhì)粒(Gag-Pol質(zhì)粒);編碼慢病毒Rev蛋白的質(zhì)粒(Rev質(zhì)粒)；以及在慢病毒3’ -LTR和慢病毒5’ LTR之間包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(TOI)表達(dá)盒的質(zhì)粒(TOI質(zhì)粒)。
[0015]在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了細(xì)胞培養(yǎng)裝置(或生物反應(yīng)器)，其中所述培養(yǎng)裝置含有至少5L體積的無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含轉(zhuǎn)染有至少一種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒的哺乳動物細(xì)胞，所述細(xì)胞在所述培養(yǎng)裝置中懸浮生長。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞是HEK293T細(xì)胞。
[0016]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及通過在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞而對慢病毒載體的生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化的方法，所述哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染有所述生產(chǎn)所需的質(zhì)粒，該方法包括在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基。優(yōu)選地，丁酸鈉以5mM的終濃度加入。

【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明涉及制藥級重組慢病毒載體的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)方法。所生產(chǎn)的載體可以用于治療有需要的動物對象、具體地是哺乳動物、更具體地是人類對象中的病癥。
[0018]用于生產(chǎn)慢病毒的質(zhì)粒
[0019]慢病毒是哺乳動物的外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并形成逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)屬。慢病毒載體(LV)來源于多種靈長類動物慢病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)-1或-2或多種猴免疫缺陷病毒(SIV)，或者來源于非靈長類動物慢病毒，例如馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)或山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)。
[0020]可用于生產(chǎn)重組慢病毒載體的慢病毒組分是本領(lǐng)域已知的。參見例如Zufferey等，1997，Nat.B1technol.15:871-875 和 Dull 等，1998，J.Virol.72(11):8463-8471 ? “第二代”慢病毒載體系統(tǒng)是指缺少功能性附加基因的包裝系統(tǒng)，例如其中附加基因vif、vpr,vpu和nef已經(jīng)缺失或失活的包裝系統(tǒng)(Zufferey等,在前引用)?！暗谌甭《据d體系統(tǒng)是指具有第二代載體系統(tǒng)的特性并且進(jìn)一步缺少功能性tat基因的慢病毒包裝系統(tǒng)，例如其中tat基因已經(jīng)缺失或失活的慢病毒包裝系統(tǒng)。通常，編碼Rev的基因被提供在單獨(dú)的表達(dá)構(gòu)建物上(參見例如Dull等，在前引用)。對于可用于生產(chǎn)重組慢病毒載體的慢病毒載體系統(tǒng)的最新概述，還參見 Schweizer 和 Merten, 2010, Current Gene TherapylO (6),474-486,更具體地是第2.2部分(“慢病毒載體系統(tǒng)”)。Schweizer和Merten報(bào)道了不可工業(yè)化的方法。
[0021]可以通過任意數(shù)量的質(zhì)粒來向細(xì)胞提供慢病毒載體生產(chǎn)所必需的不同功能。具體地，這些功能可以通過至少1、2、3或4種質(zhì)粒來提供。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過適合于生產(chǎn)慢病毒載體的4種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、具體地是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，來向哺乳動物細(xì)胞(具體地是在無血清條件下懸浮生長的293T細(xì)胞)提供慢病毒載體生產(chǎn)所必需的不同功能，其中一種質(zhì)粒編碼包膜蛋白(Env質(zhì)粒),一種質(zhì)粒編碼慢病毒Gag和Pol蛋白(Gag-Pol質(zhì)粒)，一種質(zhì)粒編碼慢病毒Rev蛋白(Rev質(zhì)粒)，并且一種質(zhì)粒在慢病毒3’ -LTR和慢病毒5’ LTR之間包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(TOI)表達(dá)盒(Τ0Ι質(zhì)粒)。
[0022]每種功能(或組分)可以來源于任何適合的慢病毒。然而，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，gag-pol、rev和慢病毒基因組(3’ -LTR和5’ LTR)來源于HIV病毒，具體地來源于HIV-1 或 HIV-2。
[0023]此外，重組慢病毒載體可以是假型載體，其包含經(jīng)修飾的包膜蛋白、來源于不同病毒的包膜蛋白或嵌合包膜蛋白。因此，例如Env質(zhì)?？梢跃幋aVSV-G Env蛋白，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到可以使用其他env基因。
[0024]當(dāng)然，質(zhì)粒中使用的TOI取決于慢病毒載體所預(yù)期的特定用途。TOI的說明性但非限制性實(shí)例包括編碼治療性RNA的TOI (例如編碼與靶RNA或DNA序列互補(bǔ)的反義RNA的Τ0Ι)、編碼在患病對象中缺陷或缺失的蛋白的基因療法Τ0Ι，以及用于DNA疫苗接種的疫苗TOI，即編碼的蛋白的表達(dá)會誘導(dǎo)受體生物體對所述蛋白的疫苗接種。
[0025]哺乳動物懸浮細(xì)胞
[0026]用于生產(chǎn)慢病毒的哺乳動物細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的。這種細(xì)胞的代表性實(shí)例包括人胚腎(HEK) 293細(xì)胞及其衍生物(例如293SF-3F6細(xì)胞系)，所述衍生物因能夠在無血清條件下懸浮生長而被選擇，并且理想地是高度可轉(zhuǎn)染的。其他細(xì)胞類型包括但不限于HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、KB細(xì)胞、CKTl細(xì)胞、NIH/sT3細(xì)胞、Vero細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或支持慢病毒生命周期的任意真核細(xì)胞。
[0027]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的293T細(xì)胞。293T可從許多供應(yīng)商商購。這些細(xì)胞對應(yīng)于來源于需要胎牛血清進(jìn)行生長并轉(zhuǎn)化有SV40大T抗原的人胚腎細(xì)胞的細(xì)胞系。具體地，HEK293細(xì)胞系最初來源于轉(zhuǎn)染有5型人腺病毒(Ad5)的機(jī)械剪切片段的人胚腎細(xì)胞，所述人胚腎細(xì)胞通過對表現(xiàn)出許多Ad轉(zhuǎn)化特性的細(xì)胞進(jìn)行選擇而得到。人腺病毒的轉(zhuǎn)化區(qū)含有早期區(qū)I (El)，其由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元Ela和Elb組成，其產(chǎn)物對于哺乳動物細(xì)胞被Ad轉(zhuǎn)化而言是必要且充分的。這些293細(xì)胞是初始Frank Graham293細(xì)胞的亞克隆，所述Frank Graham293細(xì)胞因更高的病毒產(chǎn)率(可能是腺病毒)和更好的細(xì)胞生長而被選擇(Graham等，1977,J Gen Virol,36,59-74)。在Michele Calos (Stanford University)實(shí)驗(yàn)室中通過用編碼SV-40T抗原的基因和新霉素抗性基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染而從HEK293細(xì)胞產(chǎn)生了 293T細(xì)胞系。
[0028]先前，貼壁的293T細(xì)胞已經(jīng)用于生產(chǎn)慢病毒載體。然而，本發(fā)明的發(fā)明人首次提出一種從適合于無血清懸浮培養(yǎng)條件的這些細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒載體的有效方法，以滿足慢病毒載體的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。事實(shí)上，在本申請的實(shí)施例中，發(fā)明人首次示出了一種生產(chǎn)慢病毒載體的方法，其規(guī)模從10mL線性擴(kuò)大至50L。因此，通過實(shí)施該方法可得到非常高水平的病毒載體(例如在1000L的規(guī)模下)。
[0029]在根據(jù)所使用的具體細(xì)胞而選擇的并且允許生產(chǎn)慢病毒載體的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。無血清培養(yǎng)基使得能夠生產(chǎn)適合于治療性應(yīng)用的慢病毒載體。對于無血清培養(yǎng)基的綜述，參見《動物細(xì)胞的培養(yǎng):基本技術(shù)手冊(Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique)》的第9章(無血清培養(yǎng)基(serum-free media)) ；Ed.Freshen, RI, 2000,ffiley-Lisps,pp.89-104和105-120。一般來說，對無血清培養(yǎng)基進(jìn)行操控以增強(qiáng)所培養(yǎng)的各個(gè)細(xì)胞系的生長，其可能包括以下任一種:選擇分泌的細(xì)胞蛋白、可擴(kuò)散的營養(yǎng)物、氨基酸、有機(jī)和/或無機(jī)鹽、維生素、痕量金屬、糖和脂質(zhì)以及可能還有其他化合物例如促生長物質(zhì)(例如細(xì)胞因子)。還希望這種培養(yǎng)基增補(bǔ)有谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物例如本文中公開的GlutaMAX?。這種培養(yǎng)基是可商購的，并且根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步知識，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇對于哺乳動物宿主細(xì)胞來說合適的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以增補(bǔ)有添加劑，例如用于在懸浮培養(yǎng)物中控制剪切力的非離子型表面活性劑例如Pluronic? F68(Invitrogen，目錄號24040-032)、抗結(jié)塊劑(例如來自Invitrogen,目錄號0010057AE)以及L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺替代物例如L-丙氨?；?L-谷氨酰胺二肽，例如GlutaMAX?(Invitrogen，目錄號35050-038)。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基和添加劑有利地是符合GMP的。例如，可用于293T細(xì)胞懸浮生長的可商購的代表性無血清培養(yǎng)基包括F17培養(yǎng)基? (Invitrogen)和Ex-Cell 293? (SAFC)。具體地，293T細(xì)胞可以生長在增補(bǔ)有防止細(xì)胞聚集體形成的添加劑的定制的F17培養(yǎng)基?中。具體地，本文中表明，當(dāng)F17培養(yǎng)基?增補(bǔ)有0.05%至0.1 %之間、更具體地是0.08%的Pluronic? F68，0.01 %至0.1 %之間、更具體地是0.01 %的GIBCO?;抗結(jié)塊劑，以及2至6mM之間、更具體地是4mM終濃度的GlutaMAX?時(shí)，本發(fā)明的方法得到改進(jìn)。以本文中提供的量使用的這些添加劑是有利的，因?yàn)樗鼈兡軌蜃罴训胤乐?93T細(xì)胞聚集。
[0030]有利地，本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基和添加劑是無血清且無動物組分的，它們遵守GMP并因此允許工業(yè)化生產(chǎn)可用于動物、特別是人的治療的慢病毒載體。
[0031]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞可以以0.8至1.3 X 16個(gè)細(xì)胞/mL之間的細(xì)胞密度使用。
[0032]瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
[0033]在本發(fā)明的方法中，哺乳動物細(xì)胞、特別是如上面所描述的293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染有一種或多種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
[0034]可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)將核酸分子導(dǎo)入到細(xì)胞中。這種技術(shù)包括:利用化合物例如磷酸鈣、陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物進(jìn)行化學(xué)促進(jìn)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，非化學(xué)方法例如電穿孔、粒子轟擊或微注射，以及用含有目標(biāo)核酸分子的病毒進(jìn)行感染(有時(shí)稱為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”)。
[0035]然而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，利用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。PEI在表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性的同時(shí)在很多細(xì)胞系中具有高基因轉(zhuǎn)移活性，是成本有效的，并因此與工作化規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用相容。該聚合物可以以線性和分支異構(gòu)體兩者獲得，具有寬范圍的分子量和多分散性，這些理化參數(shù)對于高效的基因轉(zhuǎn)移活性來說是關(guān)鍵的(Godbey ff.T.等，J.Control Release, 60，149160 (1999))。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的PEI是20-25kD的線性PEI。例如，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的 PEI 是JetPEI?:或PEIPro? ( 二者均可從 PolyPlus 獲得)。JetPEI?和PEIPro?轉(zhuǎn)染試劑是線性聚乙烯亞胺衍生物，不含動物來源的組分，這提供了高度有效且可重現(xiàn)的基因遞送。用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其他PEI或與其結(jié)構(gòu)類似的陽離子聚合物被公開在美國專利號6，013，240 和 EP 專利號 0770140 中。
[0036]在加入到培養(yǎng)基中之前將質(zhì)粒與PEI混合。
[0037]N/P比率是對復(fù)合物的離子平衡的度量。在使用JetPEI?或PEIPro?的情況下，N/P比率是指每個(gè)寡核苷酸磷酸的JetPEI?氮?dú)埢鶖?shù)目。優(yōu)選地，N/P比率低于10。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該比率為約6。優(yōu)化該比率允許獲得由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所產(chǎn)生的慢病毒載體的最佳產(chǎn)率以及有限的毒性。
[0038]質(zhì)粒與PEI在轉(zhuǎn)染步驟之前的接觸時(shí)間本身也是一個(gè)重要的參數(shù)，以便適當(dāng)?shù)厥官|(zhì)粒DNA與PEI分子復(fù)合。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)能夠證實(shí)，使質(zhì)粒與PEI接觸5至30分鐘導(dǎo)致混合物具有非常好的轉(zhuǎn)染能力。優(yōu)選地，接觸時(shí)間為約10分鐘，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染混合物的形成。
[0039]還可以調(diào)整用于生產(chǎn)慢病毒的不同質(zhì)粒之間的摩爾比率，以優(yōu)化這種生產(chǎn)的規(guī)模擴(kuò)大。根據(jù)本文中提供的結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使該參數(shù)適合于其所使用的用于生產(chǎn)目標(biāo)慢病毒的特定質(zhì)粒。例如，本發(fā)明的發(fā)明人在此顯示，1:1: 2:1的比率(Env質(zhì)粒:Gag-Pol質(zhì)粒:Rev質(zhì)粒:TOI質(zhì)粒)導(dǎo)致更穩(wěn)健的轉(zhuǎn)染,并且就實(shí)施例中所示的慢病毒而言，滿足慢病毒的生產(chǎn)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使該比率適合于所要生產(chǎn)的特定慢病毒?；诒景l(fā)明的教導(dǎo)(參見下面的實(shí)施例)和重組慢病毒生產(chǎn)領(lǐng)域的公知常識，可以容易地使該比率適合于每種新情況(例如就用于轉(zhuǎn)染的每個(gè)特定質(zhì)粒載體而言)。具體地，需要考慮質(zhì)粒的摩爾比率，以優(yōu)化這些質(zhì)粒中每種質(zhì)粒的量。使用摩爾比率而非重量比率這樣的理念并非是顯而易見的，因?yàn)樵诒景l(fā)明的領(lǐng)域中，一般使用重量比率來確定病毒載體生產(chǎn)所需要的每種質(zhì)粒的量。
[0040]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使轉(zhuǎn)染方法適合于所使用的特定細(xì)胞培養(yǎng)物。具體地，總DNA量(具體地包含重組慢病毒生產(chǎn)所需要的4種質(zhì)粒)可以變化。然而，在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該量是至少l.Syg/lO6個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該量是至少2 μ g/106個(gè)細(xì)胞，具體地是至少2.5 μ g/106個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，總DNA的量是大約2μ8/106個(gè)細(xì)胞。
[0041]細(xì)朐培養(yǎng)物
[0042]在轉(zhuǎn)染后，例如在將DNA與PEI的混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中之后，使該細(xì)胞培養(yǎng)物生長一段時(shí)間，所述時(shí)間可以是在轉(zhuǎn)染后36至72小時(shí)之間，具體地是48小時(shí)后。
[0043]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基與用于轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的培養(yǎng)基相同。例如，在用PEI和質(zhì)粒的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染的情況下，所述混合物可以在F17培養(yǎng)基⑧1中制備，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后也可以在所述F17培養(yǎng)基⑧中生長。
[0044]培養(yǎng)可以在多種培養(yǎng)裝置中進(jìn)行，例如適合于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可以是單次使用(一次性)或者可重復(fù)使用的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器例如可以選自培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋以及罐式反應(yīng)器。非限制性代表性生物反應(yīng)器包括玻璃生物反應(yīng)器(例如B-DCU? 2L-10L，Sartorius)、利用搖擺運(yùn)動振蕩的單次使用的生物反應(yīng)器例如波浪生物反應(yīng)器(例如Cultibag RM? 10L-25L，Sartorius)、單次使用的攪拌器罐式生物反應(yīng)器(Cultibag STR?50L, Sartorius)或不銹鋼罐式生物反應(yīng)器。生長在受控條件下進(jìn)行(例如，對于本文所示實(shí)施例中所報(bào)道的293T細(xì)胞的培養(yǎng)來說，pH = 7.2，p02 = 50%，37°C，以及根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行特定振蕩)。
[0045]根據(jù)一個(gè)特定的方面，本發(fā)明因而還涉及含有至少5L體積的無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)裝置(即生物反應(yīng)器)，所述無血清培養(yǎng)基中包含轉(zhuǎn)染有至少一種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒的哺乳動物細(xì)胞，所述細(xì)胞適合于在所述培養(yǎng)裝置中懸浮生長。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是HEK293T細(xì)胞。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，培養(yǎng)裝置含有至少10L、至少50、至少100L、至少200L或至少1000L體積的如上面所定義的無血清培養(yǎng)基。在其他實(shí)施方案中，無血清培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染條件、培養(yǎng)條件以及細(xì)胞如上面所定義。
[0046]然后可以通過一個(gè)或多個(gè)收獲步驟收獲(或收集)慢病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的慢病毒進(jìn)行單次收獲。這是本發(fā)明超越現(xiàn)有技術(shù)的顯著進(jìn)步，現(xiàn)有技術(shù)中可獲得的報(bào)道一般建議通過多次更換培養(yǎng)基對培養(yǎng)物進(jìn)行數(shù)次收集。此處，優(yōu)選的實(shí)施方案包括單次收獲，從接種到生物反應(yīng)器中直至收獲，無需更換培養(yǎng)基，這是一種簡單明了、成本有效的工業(yè)化相容性方法。在又一個(gè)特定的實(shí)施方案中，單次收獲在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行。然后，可以根據(jù)技術(shù)人員公知的方法收獲并純化由此產(chǎn)生的慢病毒粒子。
[0047]正如上面所提及的，可以將2mM至1mM 丁酸鈉加入到培養(yǎng)基中，丁酸鈉在存在血清的貼壁細(xì)胞系統(tǒng)中是慢病毒生產(chǎn)的已知誘導(dǎo)物。出乎意料地，從本文中使用的條件(無血清培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng))來說，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)顯示，當(dāng)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到培養(yǎng)基中時(shí)，特別是當(dāng)丁酸鈉以5mM的濃度使用時(shí)，可以在無血清條件下在懸浮培養(yǎng)中獲得優(yōu)化的生產(chǎn)。
[0048]進(jìn)一步的目標(biāo):
[0049]本發(fā)明還涉及一種用于大規(guī)模生產(chǎn)重組慢病毒載體的方法，其包括:
[0050]-用PEI與質(zhì)粒的混合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞，所述質(zhì)粒適合于生產(chǎn)重組慢病毒載體；
[0051]-在無血清培養(yǎng)基中以至少5L的體積在分批培養(yǎng)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；以及
[0052]-從培養(yǎng)基中收獲所產(chǎn)生的重組慢病毒載體。
[0053]在該方法的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包括編碼包膜蛋白的質(zhì)粒(Env質(zhì)粒)、編碼慢病毒Gag和Pol蛋白的質(zhì)粒(Gag-Pol質(zhì)粒)、編碼慢病毒Rev蛋白的質(zhì)粒(Rev質(zhì)粒)以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5，LTR之間包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(TOI)表達(dá)盒的質(zhì)粒。在一個(gè)特定的變體中，利用至少1.5 μ g/106個(gè)細(xì)胞的總DNA量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。優(yōu)選的細(xì)胞是適合于懸浮生長的293T細(xì)胞。此外，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用聚乙烯亞胺(PEI)和DNA的混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中所述PEI是20-25kD的線性PEI。在一個(gè)特定的變體中，在轉(zhuǎn)染前將PEI和質(zhì)粒依照少于10的N/P比率(例如比率為6左右)混合，其中N/P是指每個(gè)寡核苷酸磷酸的PEI氮原子數(shù)目。可以對在加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中之前PEI與質(zhì)粒之間的接觸時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，但是該時(shí)間具體地在5至30分鐘之間，例如10分鐘左右?？梢栽诶甾D(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)物中丁酸鈉的終濃度可以在2mM至1mM之間?？梢砸詥未问斋@對細(xì)胞進(jìn)行收獲，具體地是在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)至72小時(shí)之間進(jìn)行單次收獲。本發(fā)明的方法可以以至少1L或更大的規(guī)模進(jìn)行。該方法可以具體地涉及高規(guī)模生產(chǎn)慢病毒載體的方法，其允許收獲至少17個(gè)感染性基因組/mL，優(yōu)選至少3 X 17IG/mL。
[0054]在以下非限制性實(shí)施例中對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1是實(shí)施例中示出的研究中所使用的4種質(zhì)粒的圖示。
[0056]圖2是表示在含有HEK293F細(xì)胞的10mL搖瓶中測試不同轉(zhuǎn)染條件以及通過流式細(xì)胞術(shù)測定GFP陽性細(xì)胞的圖。
[0057]圖3是表示在含有HEK293F細(xì)胞的10mL搖瓶中測試不同轉(zhuǎn)染條件以及通過P24ELISA測試測定p24HIV衣殼抗原的量的圖。
[0058]圖4是表示在含有HEK293T的10mL搖瓶中測試不同轉(zhuǎn)染條件以及通過流式細(xì)胞術(shù)測定GFP陽性細(xì)胞的圖。
[0059]圖5是表示在含有HEK293T細(xì)胞的10mL搖瓶中測試不同轉(zhuǎn)染條件以及通過P24ELISA測試測定p24HIV衣殼抗原的量的圖。
[0060]圖6是表不對于轉(zhuǎn)染復(fù)合物的生成而言兩種不同的SFM培養(yǎng)基對生產(chǎn)產(chǎn)率的影響的圖(F17 培養(yǎng)基?:和 OptiProSFM? )。
[0061]圖7是顯示在質(zhì)粒最佳摩爾比率(I: I: 2: I)下轉(zhuǎn)染以生產(chǎn)具有不同大小的兩種不同產(chǎn)物(不同Τ0Ι)的圖。在最佳轉(zhuǎn)染條件下在10mL的搖瓶中進(jìn)行該測定。
[0062]圖8是顯示丁酸鈉加入策略對生產(chǎn)率的影響的圖，其中測定了上清液中p24的濃度。
[0063]圖9是顯示丁酸鈉加入策略對生產(chǎn)率的影響的圖，其中測定了上清液中感染性基因組(IG)的濃度。
[0064]圖10是顯示丁酸鈉加入策略對生產(chǎn)率的影響的圖，其中測定了上清液中物理粒子/感染性粒子的比率(PP/IP)。
[0065]圖11是表示10mL搖瓶中HIV-VSVG_WASp的6次生產(chǎn)的平均值的圖，其中丁酸鈉在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以在培養(yǎng)物中5mM的終濃度加入。
[0066]圖12是顯示無血清培養(yǎng)基中懸浮生長HEK293T的10mL懸浮方案與10層細(xì)胞工廠的標(biāo)準(zhǔn)方案在生產(chǎn)HIV-VSVG-WASP慢病毒載體中的比較、轉(zhuǎn)染后48小時(shí)上清液中的IG結(jié)果和PP/IP比率的圖。
[0067]圖13是表示對不同細(xì)胞培養(yǎng)裝置(旋轉(zhuǎn)、波浪和攪拌罐)中以不同規(guī)模(10mL至50L)進(jìn)行的本發(fā)明懸浮方法的評估以及與利用血清的常規(guī)貼壁細(xì)胞的比較的圖。
[0068]實(shí)施例
[0069]本研究的目的是生產(chǎn)符合工業(yè)化應(yīng)用規(guī)模的慢病毒載體，其中在生物反應(yīng)器中在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。有利地，該過程已經(jīng)發(fā)展至50L，并且生產(chǎn)可以容易地適合于至少100L、200L生物反應(yīng)器規(guī)模，或者甚至至少1000L。
[0070]對于重組慢病毒的生產(chǎn)，我們使用4種質(zhì)粒(參見圖1中的策略)。
[0071]材料和方法
[0072]細(xì)胞培養(yǎng):
[0073]所有載體的生產(chǎn)和細(xì)胞培養(yǎng)利用貼壁依賴型(anchorage dependent)HEK293T工作細(xì)胞庫(WCB)進(jìn)行，其最初在胎牛血清存在下生長，被調(diào)整以適合在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長，建立了新的工作細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充了 Pluronic?F68 (Invitrogen) > GIBCO? 抗凝集劑(Ant1-Clumping Agent) (Invitrogen)和 4mMGlutaMAX?(Invitrogen)的改良的F17培養(yǎng)基:?i中。對于所描述的方法的開發(fā)，在受控條件下使用不同的培養(yǎng)容器:
[0074]-對于10mL的規(guī)模,在受控條件(37°C,120rpm)下使用搖瓶(Techne, UK)
[0075]-對于較大規(guī)模:在受控條件(pH= 7.2，p02 = 50%,37°C,以及根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行特定振蕩) 下使用玻璃生物反應(yīng)器(B-DCU? 2L-10L，Sartorius)、波浪式生物反應(yīng)器(CultibagRM? 10L-25L，Sartorius)、一次性攪拌罐式生物反應(yīng)器(Cultibag STR?50L, Sartorius)
[0076]載體和質(zhì)粒:
[0077]Zanta-Boussif 等，2009，Gene Ther.；16 (5):605-19 中描述的Wl.6-huffASP-WPRE載體通過利用4種質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞而產(chǎn)生，所述4種質(zhì)粒由Wl.6-huffASP-WPREmut6-K轉(zhuǎn)移質(zhì)粒分別聯(lián)合編碼HIV_lgag-pol、rev基因以及不相關(guān)的皰疹性口腔炎病毒G糖蛋白的GagPol、VSV-G、Rev質(zhì)粒組成。所有質(zhì)粒均含有卡那霉素抗性基因。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)提供于上文引用的Merten等中。
[0078]HIV-VSVG-GFP載體利用相同的試劑產(chǎn)生，除了轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒是pRRLSINcPPT-PGK-eGFP-WPRE。
[0079]丁酸鈉:
[0080]丁酸鈉可商購獲得(丁酸鈉≥98.5% (GC) | Sigma-Aldrich)。儲備溶液在定制的F17培養(yǎng)基⑧丨中以500mM制備并進(jìn)行0.22 μ m過濾。
[0081]培養(yǎng)基:
[0082]F17 培養(yǎng)基? (Invitrogen)通過補(bǔ)充終濃度為 0.08% 的Pluronic? F68、0.01%的GIBCO?抗凝集劑(Invitrogen)和 4mM 的 GlutaMAX? 而定制。
[0083]慢病毒載體的生產(chǎn):
[0084]以0.2X 16個(gè)細(xì)胞/mL接種懸浮培養(yǎng)容器或袋。接種后72小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度在0.8至1.3 X 16個(gè)細(xì)胞/mL之間。
[0085]WASp生產(chǎn)的實(shí)例(最佳模式):
[0086]本研究中使用的4種質(zhì)粒示于圖1中。已經(jīng)對不同的總DNA量進(jìn)行了測試。已經(jīng)測試了不同的濃度，但是在最佳條件下，所使用的總DNA量是大約2μ g/ΙΟ6個(gè)細(xì)胞。所使用的轉(zhuǎn)染試劑是JetPEI? (Polyplus的產(chǎn)品)，N/P比率大約為6。在培養(yǎng)基中分別稀釋DNA和JetPEI?，隨后溫和混合大約10分鐘。這種混合使得形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將其直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，加入丁酸鈉，使其終濃度大約為5mM。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收獲含有慢病毒載體粒子的條件培養(yǎng)基，以用于分析目的。
[0087]滴度測定:
[0088]所產(chǎn)生的物理粒子通過利用特定的ELISA試劑盒測定p24 (HIV衣殼蛋白)的量而進(jìn)行定量。對易受慢病毒載體感染的細(xì)胞系進(jìn)行感染后，如先前Merten等(上文)中所描述利用qPCR (TaqMan)測定感染粒子的滴度。
[0089]益果
[0090]A-對使HEK293T細(xì)胞適合于在無血清條件下在化學(xué)限定性培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的描述
[0091]-HEK293T細(xì)胞系的來源:
[0092]細(xì)胞來自一小瓶培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM中的貼壁的GMP種源(工作)293T細(xì)胞庫。
[0093]-適合于在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng):
[0094]在T75組織培養(yǎng)瓶(DMEM+10% FBS)中使細(xì)胞解凍。傳代2次并在T175組織培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)后，我們對貼壁細(xì)胞進(jìn)行徹底的培養(yǎng)基的更換，用改良的F17培養(yǎng)基? (無血清培養(yǎng)基)替換DMEM。更換培養(yǎng)基后48小時(shí)，使所有細(xì)胞從支持物上脫離，其活力仍然在90%左右。在T175組織培養(yǎng)瓶中在F17中持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在F17中傳代3次并在T225組織培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)后，在50ml懸浮條件下將細(xì)胞接種于搖瓶中(利用一次性搖瓶，Corning)。在第8次(P8)傳代時(shí)，產(chǎn)生了 54小瓶的懸浮293T細(xì)胞(50xl06細(xì)胞/小瓶)的細(xì)胞庫。
[0095]-細(xì)胞庫產(chǎn)生。
[0096]用于冷凍保藏的制劑是:80% F17,10% DMSO和10%甲基纖維素1%。
[0097]B-在經(jīng)典的HEK293F和HEK293T中牛產(chǎn)表汰緑色熒光蛋白的慢病毒載體
[0098]我們的工作目的之一是建立在無血清條件下通過懸浮培養(yǎng)制造慢病毒載體以用于工業(yè)化應(yīng)用的方法。
[0099]最初，實(shí)驗(yàn)利用HEK293F細(xì)胞系進(jìn)行，其是一種經(jīng)改造以適合于在無血清條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的市售細(xì)胞系。
[0100]為了通過(Zanta-Boussif 等，2009, Gene Ther.； 16 (5):605-19)中描述的 4 種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生HIV-GFP慢病毒載體，將HEK293F細(xì)胞以I X 16個(gè)細(xì)胞/mL接種于10mL搖瓶中。在100L的規(guī)模下對不同的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行測試:可變參數(shù)是:每I X 16個(gè)細(xì)胞所使用的總DNA量，以及4種質(zhì)粒間的摩爾比率/IX 16個(gè)細(xì)胞。盡管這些參數(shù)可能發(fā)生改變，但是利用轉(zhuǎn)染試劑(JetPEI?)形成復(fù)合物的接觸時(shí)間(10分鐘)以及DNA/PEI比率(N/P=6)固定作為用于生產(chǎn)慢病毒的最佳條件。
[0101]在1mLOptiPro SFM? (Invitrogen)、一種化學(xué)限定性培養(yǎng)基中產(chǎn)生DNA/PEI復(fù)合物。接觸10分鐘后，將DNA/PEI復(fù)合物直接加入到培養(yǎng)物中。
[0102]為了評估轉(zhuǎn)染效率，通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分析，以測定綠色熒光蛋白的表達(dá)。
[0103]此外，對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行p24ELISA測試，以測定HIV p24衣殼抗原的濃度，所述抗原指示慢病毒粒子的存在。
[0104]結(jié)果展示于圖2和3中。
[0105]轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的轉(zhuǎn)染效率
[0106]結(jié)果顯示，即使在一定的DNA濃度和比率條件下(分別為2.5 μ g，1:1:1:1和1:1:1: 2)HEK293F能夠被有效轉(zhuǎn)染，但是可以檢測到的p24抗原的量極少(< 50ng/mL)。p24的量大于150ng/mL表示慢病毒有效生產(chǎn)，而較低數(shù)值基本上是由于游離的p24。利用ELISA試劑盒(聯(lián)合HIV-1P24抗原ELISA試劑盒(480測試)，PerkinElmer)，我們可以將p24的量與物理粒子的量相關(guān)聯(lián),所述試劑盒提供以下信息:lng p24 = 1.2X107PP。
[0107]C-從 HEK293T 牛產(chǎn) HIV-GFP
[0108]利用HEK293T細(xì)胞在相似條件下進(jìn)行慢病毒載體HIV-GFP的生產(chǎn)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)確定轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中P24抗原的濃度。
[0109]結(jié)果展示于圖4和5中。
[0110]結(jié)果顯示，在相似的轉(zhuǎn)染效率(2和2.5μ g DNA、比率為1:1: 2:1時(shí)，~90% )下，HEK293T細(xì)胞在產(chǎn)生p24抗原以及因而產(chǎn)生HIV慢病毒載體粒子方面比HEK293F更加有效(198ng/mL 和 314ng/mL)。
[0111]總之，這些實(shí)驗(yàn)使得我們確定了在HEK293T細(xì)胞中小規(guī)模產(chǎn)生慢病毒載體的有效條件。進(jìn)一步研究那些條件，以評估在無血清條件下以允許工業(yè)化應(yīng)用的規(guī)模通過懸浮培養(yǎng)制造慢病毒載體的可行性。
[0112]D-在缺少胎牛血清的情況下在懸浮HEK293T細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒載體的方法的優(yōu)化
[0113]Dl-不使用OptiProSFM?:培養(yǎng)基來產(chǎn)生PEI/DNA復(fù)合物。
[0114]為了簡化方法，我們研究了直接在F17培養(yǎng)基中產(chǎn)生PEI/DNA復(fù)合物以避免使用不同培養(yǎng)基(OptiProSFM?)的可能性。利用先前實(shí)驗(yàn)中確定的轉(zhuǎn)染條件，即使用HEK293T細(xì)胞，質(zhì)粒摩爾比率為1:1: 2: 1，總DNA為2.5 μ g/1 X 16個(gè)細(xì)胞，在搖瓶中以10mL的規(guī)模進(jìn)行慢病毒載體的生產(chǎn)。收獲細(xì)胞和上清液以進(jìn)行測試，結(jié)果顯示于圖6中。
[0115]結(jié)果顯示，與F17相比，如果從復(fù)合在Optipro培養(yǎng)基中的PEI/DNA產(chǎn)生的話，p24濃度沒有大的差異。 在整個(gè)過程中僅使用F17培養(yǎng)基而非利用兩種不同類型的培養(yǎng)基，構(gòu)成了使得所述方法適合于工業(yè)化規(guī)模的重大改進(jìn)。
[0116]D2-生產(chǎn)系統(tǒng)中使用質(zhì)粒摩爾比率代替質(zhì)粒(DNA)質(zhì)量比率的重要性-由于使用摩爾比率而帶來的過程的靈活性:
[0117]本實(shí)驗(yàn)中使用的慢病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)涉及4種質(zhì)粒。其中3種(Gag-Pol質(zhì)粒、VSV-G質(zhì)粒和Rev質(zhì)粒)是所有慢病毒載體共有的，因?yàn)槠渚幋a形成慢病毒粒子本身所必需的反式作用功能，即結(jié)構(gòu)性元件(載體衣殼，VSV-G包膜)、酶類蛋白(逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶)和表達(dá)調(diào)控因子(Rev蛋白)。唯一變化的因子是編碼載體基因組的質(zhì)粒。由于由載體基因組質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒可以以不同大小(不同啟動子，cDNA)出現(xiàn)，產(chǎn)生功能性粒子所必需的質(zhì)粒的最終量可以隨載體而不同，并且具有不同的表達(dá)盒。因此，假設(shè)摩爾比率1:1:2:1 (Env質(zhì)粒:Gag-Pol質(zhì)粒:Rev質(zhì)粒:TOI質(zhì)粒)給出了最佳結(jié)果,我們想要證明通過保持摩爾比率不變，我們能夠可再現(xiàn)地維持慢病毒生產(chǎn)的產(chǎn)率，即使質(zhì)粒大小發(fā)生變化。由于該摩爾比率保持每種質(zhì)粒分子的數(shù)量不隨其以堿基對為單位的大小(因而其重量)而改變，無論產(chǎn)物如何，我們均能夠保證最佳的轉(zhuǎn)染條件。
[0118]圖7顯示了一個(gè)實(shí)施例，其中我們對編碼GFP蛋白cDNA(質(zhì)?？偞笮?7388bp)的慢病毒載體與編碼Wiskott-Aldrich蛋白(WASp) cDNA (質(zhì)粒總大小=9780bp)的慢病毒載體進(jìn)行比較。
[0119]結(jié)果顯示，通過在分子數(shù)量方面保持質(zhì)粒比率相等(這反過來影響所使用的個(gè)體質(zhì)粒的量)，慢病毒載體的產(chǎn)率保持不變。這些結(jié)果表明，利用總量為2.5 μ g/1 X 16個(gè)細(xì)胞、摩爾比率為1:1: 2: 1、在無血清條件下在懸浮培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒載體的方法，能夠用于不同的載體，無論其大小如何。當(dāng)然，盡管是最佳的，這些條件可以由這些數(shù)值起始而發(fā)生改變，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使得參數(shù)適合于用于生產(chǎn)所期望慢病毒載體的特定細(xì)胞和質(zhì)粒。
[0120]D3-生產(chǎn)率的改進(jìn):使用丁酸鈉
[0121]已經(jīng)報(bào)道丁酸鈉在貼壁細(xì)胞系統(tǒng)中能夠增強(qiáng)慢病毒載體的生產(chǎn)(Gasmi等，1999年3月)。我們想要確定丁酸鈉是否可以用于這種懸浮培養(yǎng)物中。然而，如果情況是這樣的，丁酸鈉的使用不應(yīng)當(dāng)使方法更加冗長，優(yōu)先的是保持方法可應(yīng)用于工業(yè)化應(yīng)用。因此，我們決定測試轉(zhuǎn)染后加入丁酸鈉而不更換培養(yǎng)基是否能夠在先前建立的條件下(HEK293T，懸浮培養(yǎng)，無血清，2.5 μ g/mL質(zhì)粒，比率為1:1: 2:1)對慢病毒載體的產(chǎn)率產(chǎn)生積極影響。
[0122]在搖瓶中以10mL的規(guī)模進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在定制的F17培養(yǎng)基?中制備丁酸鈉，并在轉(zhuǎn)染后以5mM的終濃度加入。通過利用ELISA測定p24抗原以及通過利用qPCR(TaQman)測定感染性粒子的濃度，評估對慢病毒載體生產(chǎn)的影響。測定兩種參數(shù)使得能夠計(jì)算PP/IP比率(粒子總數(shù)量比感染性粒子)，其指示慢病毒載體制備物的質(zhì)量。當(dāng)PP/IP比率在100-250之間(在GENETH0N的GMP生產(chǎn)中通常觀察到的結(jié)果)時(shí)，生產(chǎn)質(zhì)量被認(rèn)為是可接受的。
[0123]最初，我們對將丁酸鈉加入到10mL搖瓶中的不同策略進(jìn)行測試。一種策略是轉(zhuǎn)染后6小時(shí)將其直接加入到培養(yǎng)物中。另一種策略是轉(zhuǎn)染后24小時(shí)徹底更換培養(yǎng)基并將丁酸鈉加入到用于重懸細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基中。最終，給出最佳結(jié)果的策略是轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉直接加入到培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基。
[0124]注意:在更換培養(yǎng)基的過程中，使細(xì)胞于500g離心5分鐘，隨后在新鮮F17中將其重懸。
[0125]我們在3個(gè)搖瓶中進(jìn)行了一項(xiàng)平行實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)先前的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在圖8、9和10中。
[0126]結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以5mM的終濃度加入丁酸鈉使載體生產(chǎn)率就感染性粒子而言增加了 3-4倍，以及所產(chǎn)生的p24的量也有增加。
[0127]圖10展示了我們在本實(shí)驗(yàn)中得到的PP/IP比率。
[0128]該圖表明，丁酸鈉不僅使得生產(chǎn)率增加，還通過給出在可接受范圍內(nèi)的PP/IP比率(100-250)而保持可接受的生產(chǎn)質(zhì)量。
[0129]通過利用相同實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行6個(gè)搖瓶的實(shí)驗(yàn)，評估這種策略的穩(wěn)健性。結(jié)果顯示于圖11中。
[0130]這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，根據(jù)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的IG濃度和與PP/IP比率有關(guān)生產(chǎn)質(zhì)量，較好的收獲時(shí)間是轉(zhuǎn)染后48小時(shí)。
[0131]E-擴(kuò)大規(guī)樽
[0132]El-表明在無血清條件下在懸浮生長的細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒載體的方法給出了與在存在血清條件下在貼壁細(xì)胞中生產(chǎn)慢病毒載體的常規(guī)系統(tǒng)相似的結(jié)果。
[0133]通常，在存在血清條件下利用HEK293貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染進(jìn)行大規(guī)模慢病毒載體的生產(chǎn)，以用于研究或臨床目的。由于載體滴度的原因，HEK293T是最常使用的細(xì)胞。生產(chǎn)方案基本上基于使用2層或10層細(xì)胞工廠或等效的復(fù)盤(multitray)系統(tǒng)。參見Schweizer和 Merten, 2010Current Gene TherapylO (6), 474-486,最具體的是第 2.3 部分("largescale process, Including Transient Transfect1n")。
[0134]已經(jīng)將這種基于貼壁細(xì)胞的方案與上面定義的最佳方法進(jìn)行了比較，在所述最佳方法中，HEK293T細(xì)胞在無血清條件下懸浮生長，并用2.5μ g DNA/1 X 16個(gè)細(xì)胞以質(zhì)粒摩爾比率1:1: 2:1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中轉(zhuǎn)染后24小時(shí)以5mM加入丁酸鈉而不更換培養(yǎng)基。
[0135]圖12顯示了對于生產(chǎn)HIV-VSVG-WAS慢病毒載體而言，使用HEK293T的10mL懸浮培養(yǎng)方案與10層細(xì)胞工廠中的標(biāo)準(zhǔn)之間的比較。
[0136]結(jié)果表明，懸浮系統(tǒng)以與貼壁細(xì)胞系統(tǒng)相似的產(chǎn)率和質(zhì)量產(chǎn)生慢病毒載體。
[0137]E2-表明根據(jù)本發(fā)明的在無血清條件下通過懸浮培養(yǎng)的慢病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)能夠擴(kuò)大規(guī)模并應(yīng)用于工業(yè)化應(yīng)用。
[0138]在慢病毒載體HIV-VSVG-WASp的情況下，根據(jù)粒子(p24ELISA)和感染性粒子(qPCR，TaqMan)的產(chǎn)率，在多種培養(yǎng)物體積中對上面描述的慢病毒生產(chǎn)最佳方法(HEK293T細(xì)胞在無血清條件下懸浮培養(yǎng)，利用2.5μ g/mL DNA/1 X 16個(gè)細(xì)胞，質(zhì)粒比率為1:1:2: 1，加入丁酸鈉)的可放大性進(jìn)行了評估。對于每種規(guī)模，計(jì)算如上面所描述的PP/IP比率，并制成柱狀圖，示出在圖13中，其中與在存在血清的條件性在貼壁細(xì)胞中利用常規(guī)生產(chǎn)方法獲得的結(jié)果進(jìn)行對比。
[0139]結(jié)果顯示，慢病毒載體生產(chǎn)的新型系統(tǒng)的載體生產(chǎn)率(感染性基因組的數(shù)量，IG)和質(zhì)量(PP/IP)在廣泛的培養(yǎng)物體積中均能夠保持，并且其能夠與使用生長于含血清培養(yǎng)基中的貼壁細(xì)胞的常規(guī)生產(chǎn)方法所獲得的那些結(jié)果有利相比(在所有規(guī)模下質(zhì)量和產(chǎn)率相同，并可與細(xì)胞工廠方法相競爭)。
[0140]這些結(jié)果表明，通過懸浮培養(yǎng)的慢病毒生產(chǎn)新型方法將效率與實(shí)用性相結(jié)合，因此能夠用于慢病毒載體的工業(yè)化規(guī)模應(yīng)用中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于生產(chǎn)重組慢病毒載體的方法，其包括: -在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞，所述哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染有至少一種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒，所述培養(yǎng)在至少5L的體積中進(jìn)行； -從培養(yǎng)基中收獲所產(chǎn)生的重組慢病毒載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動物細(xì)胞是HEK293T細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中收獲步驟由單次慢病毒收獲組成。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)染是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且單次收獲在轉(zhuǎn)染后48至72小時(shí)之間實(shí)施。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其包括轉(zhuǎn)染步驟，其中用聚乙烯亞胺(PEI)和質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述PEI是20-25kD的線性PEI。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中利用至少1.5 μ g/106個(gè)細(xì)胞的DNA總量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
8.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的方法，其中在轉(zhuǎn)染前將PEI和質(zhì)粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每個(gè)寡核苷酸磷酸的PEI氮原子數(shù)目。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述N/P比率為6左右。
10.權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)的方法，其中在加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中之前PEI和質(zhì)粒之間的接觸時(shí)間是在5至30分鐘之間，接觸時(shí)間具體地是10分鐘左右。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求11的方法，其中丁酸鈉以在培養(yǎng)物中2mM至12mM之間、具體地在2mM至1mM之間的終濃度，更具體地是5mM的終濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。
13.權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法，其中用4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述4種質(zhì)粒包括編碼包膜蛋白的質(zhì)粒(Env質(zhì)粒)、編碼慢病毒GagPol蛋白的質(zhì)粒(Gag-Pol質(zhì)粒)、編碼慢病毒Rev蛋白的質(zhì)粒(Rev質(zhì)粒)以及在慢病毒3’ -LTR和慢病毒5’ LTR之間包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(TOI)的質(zhì)粒(Τ0Ι質(zhì)粒)。
14.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)在至少50L的體積中實(shí)施。
15.權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的方法，其中產(chǎn)生了至少17個(gè)感染基因組/mL。
16.權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中: -細(xì)胞是293T細(xì)胞； -利用PEI與所需質(zhì)粒的混合物進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染； -在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入丁酸鈉而不更換培養(yǎng)基；并且 -對所產(chǎn)生的慢病毒載體進(jìn)行單次收獲。
17.一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述培養(yǎng)裝置含有至少5L體積的無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含轉(zhuǎn)染有至少一種適合于生產(chǎn)慢病毒載體的質(zhì)粒的哺乳動物細(xì)胞，所述細(xì)胞在所述培養(yǎng)裝置中懸浮生長。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其中所述細(xì)胞是HEK293T細(xì)胞。
19.一種通過在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞而對慢病毒載體的生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化的方法，所述哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染有所述生產(chǎn)所需的質(zhì)粒，所述方法包括在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將丁酸鈉加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中而不更換培養(yǎng)基。
20.權(quán)利要求19 的方法，其中所述丁酸鈉以5mM的終濃度加入。
【文檔編號】C12N7/02GK104136605SQ201280058157
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月24日
【發(fā)明者】尼可拉斯·馬索, 梅迪·加思密 申請人:吉尼松公司