用于在微生物中生產蛋白質的來自枯草芽孢桿菌的核糖體啟動子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了微生物中改善的表達系統(tǒng)的方法和組合物。所述方法和組合物包含來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種微生物的核糖體啟動子，例如核糖體RNA啟動子或核糖體蛋白啟動子。
【專利說明】用于在微生物中生產蛋白質的來自枯草芽孢桿菌的核糖體 啟動子
[0001] 優(yōu)先權
[0002] 本專利申請要求于2011年12月9日提交的美國臨時申請序列號61/569, 202和 于2011年12月19日提交的美國臨時申請序列號61/577,491的優(yōu)先權，特此將這兩個臨 時專利申請以引用的方式全文并入。

【技術領域】
[0003] 本發(fā)明涉及蛋白質在微生物內的生產。具體來講，本發(fā)明提供了微生物中改善的 表達系統(tǒng)的方法和組合物。在某些實施例中，所述方法和組合物包含來源于芽孢桿菌屬 (Bacillus)菌種微生物的核糖體啟動子。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 基因工程使得用作工業(yè)生物反應器或細胞工廠的微生物得以改善。例如，芽孢桿 菌屬菌種產生并且分泌大量可用的蛋白質和代謝物。工業(yè)中使用的最常見芽孢桿菌屬菌種 是地衣芽孢桿菌（B. licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens)和枯草芽 孢桿菌（B. subtilis)。由于它們屬于GRAS(-般認為安全）情形，因此這些芽孢桿菌屬菌 種的菌株成為食品和制藥工業(yè)中用于生產蛋白質的天然候選物。重要的生產酶包括α-淀 粉酶、中性蛋白酶和堿性（或絲氨酸）蛋白酶。然而，盡管已在理解芽孢桿菌屬宿主細胞生 產蛋白質方面已取得進展，但仍然需要采取一些方法來改善微生物對這些蛋白質的表達和 生產。
[0006] 基因編碼的產物的重組生產通過以下方式完成：構建適合在宿主細胞中使用的表 達載體，其中編碼所需產物的核酸被置于啟動子的表達控制之下。采用各種技術將表達載 體引入到宿主細胞中，例如轉化，然后將轉化后的宿主細胞在表達載體中所包括的啟動子 發(fā)揮作用所需的合適條件下進行培養(yǎng)，從而實現(xiàn)所需產物的生產。雖然本領域已知有很多 啟動子，但需要采用新的啟動子來改善異源基因和編碼序列的表達。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明提供了新型的啟動子、表達載體、微生物，以及用于生產編碼目的蛋白的核 酸的方法。具體來說，本發(fā)明提供了新型的啟動子、表達載體、微生物，以及用于生產編碼目 的蛋白的核酸的方法，所述核酸包含來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的核糖體 啟動子。核糖體啟動子包括（例如）核糖體RNA啟動子和核糖體蛋白啟動子。
[0008] 在一個實施例中，本發(fā)明提供了核酸，該核酸包含有效連接至編碼目的蛋白的核 酸的枯草芽孢桿菌核糖體啟動子。在具體實施例中，本發(fā)明提供了核酸，該核酸包含有效連 接至編碼目的蛋白的核酸的枯草芽孢桿菌核糖體RNA啟動子。在另一個實施例中，本發(fā)明 提供了核酸，該核酸包含有效連接至編碼目的蛋白的核酸的枯草芽孢桿菌核糖體蛋白啟動 子。
[0009] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了包含核酸的表達載體，該核酸包含有效連接至 編碼目的蛋白的核酸的枯草芽孢桿菌核糖體啟動子。在一個實施例中，該表達載體包含核 酸，該核酸包含有效連接至編碼目的蛋白的核酸的枯草芽孢桿菌核糖體RNA啟動子。在另 一個實施例中，該表達載體包含核酸，該核酸包含有效連接至編碼目的蛋白的核酸的枯草 芽孢桿菌核糖體蛋白啟動子。
[0010] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了包含核酸的微生物，該核酸包含枯草芽孢桿菌 核糖體啟動子。在一個實施例中，本發(fā)明提供了包含核酸的革蘭氏陽性微生物，該核酸包含 枯草芽孢桿菌核糖體啟動子。在一個實施例中，該核糖體啟動子是核糖體RNA啟動子。在 另一個實施例中，該核糖體啟動子是核糖體蛋白啟動子。
[0011] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于生產目的蛋白的方法，該方法包括在適合 微生物生產蛋白的條件下培養(yǎng)微生物，該微生物包含核酸，該核酸包含枯草芽孢桿菌核糖 體啟動子。在一個實施例中，該核糖體啟動子是核糖體RNA啟動子。在另一個實施例中，該 核糖體啟動子是核糖體蛋白啟動子。
[0012] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于在無需擴增表達構建體的情況下生產目的 蛋白的方法。在某些實施例中，該方法包括使用包含核糖體啟動子的核酸或載體來轉化微 生物，其中所述核酸或載體作為單個整合體整合到宿主細胞中，以及在適合微生物生產蛋 白的條件下培養(yǎng)該微生物。在一個實施例中，該核糖體啟動子是核糖體RNA啟動子。在另 一個實施例中，該核糖體啟動子是核糖體蛋白啟動子。
[0013] 在某些實施例中，本發(fā)明提供了通過如下方式生產目的蛋白的方法：將本文所述 的核酸或載體引入到宿主細胞中，使得其整合到該宿主細胞中，但不需要使用抗生素標記。
[0014] 在本文所述的某些實施例中，核糖體RNA啟動子是來源于枯草芽孢桿菌的rrn啟 動子。在某些實施例中，rrn啟動子是來源于枯草芽孢桿菌的rrnB、rrnl或rrnE核糖體 RNA啟動子。在具體的實施例中，核糖體RNA啟動子是來源于枯草芽孢桿菌的P2rrnl核糖 體RNA啟動子。
[0015] 在其他的實施例中，核糖體RNA啟動子包含SEQ ID N0:1-6中任一者的核苷酸序 列、SEQ ID N0:1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID N0:1-6中任一者具有至 少60 %同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID N0:1-6中任一者或其保留啟動子 活性的子序列雜交的核酸。在具體的實施例中，核糖體RNA啟動子包含SEQ ID N0:3的核苷 酸序列或其保留啟動子活性的子序列。在其他實施例中，可使用任意上述啟動子的組合。例 如，rrnl、rrnB和rrnE啟動子的一種或多種PI、P2或P3啟動子可一起使用。
[0016] 在本文所述的其他實施例中，核糖體蛋白啟動子來源于枯草芽孢桿菌。在一些實 施例中，核糖體蛋白啟動子是來源于枯草芽孢桿菌的rpsD或rpsj核糖體蛋白啟動子。
[0017] 在另一個實施例中，核糖體蛋白啟動子包含SEQ ID N0:13-14中任一者的核苷酸 序列、SEQ ID N0:13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID N0:13-14中任一者 具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID N0:13-14中任一者或其保 留啟動子活性的子序列雜交的核酸。在其他實施例中，可使用任意上述啟動子的組合。例 如，rpsD或rpsj啟動子的一種或多種啟動子可一起使用。在其他實施例中，核糖體蛋白啟 動子包含與SEQ ID N0:13-14中任一者或其保留啟動子活性的子序列具有至少70%、80%、 90%、93%、95%、97%或99%同源性的核酸。
[0018] 本文所述的核糖體啟動子有效連接至編碼目的蛋白的核酸。在一個實施例中，目 的蛋白選自激素、酶、生長因子、報告基因（如綠熒光蛋白）和細胞因子。在另一個實施例 中，目的蛋白為酶。本發(fā)明所使用的酶可為，例如，蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、植 酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、透性酶、支鏈淀粉酶、漆酶、月旨 肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和磷酸酶。在具體實施例中，目 的蛋白為蛋白酶。在另一個具體的實施例中，目的蛋白為枯草桿菌蛋白酶。在具體的實施 例中，目的蛋白由SEQ IDN0:9、11、18或20編碼。
[0019] 目的蛋白可能對于表達該蛋白的微生物而言是異源或同源的。在某些實施例中， 將核酸、載體或用于表達編碼目的蛋白的核酸的表達構建體整合到宿主細胞中。在某些實 施例中，并不將核酸、載體或用于表達編碼目的蛋白的核酸的表達構建體整合到宿主細胞 中。核酸、載體或用于表達編碼目的蛋白的核酸的表達構建體可在宿主細胞內擴增或可保 持單拷貝形式。
[0020] 能夠通過核糖體啟動子表達的任何細菌或真菌微生物在本文可用作宿主細胞。 在某些實施例中，所述微生物是革蘭氏陽性微生物。在一些實施例中，所述微生物是芽 孢桿菌屬的一員。可用于本發(fā)明的芽孢桿菌細胞的例子包括（例如）枯草芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌（B.lentus)、短芽孢桿菌（B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌（B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿 菌（B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌（B. circulans)、燦爛芽孢桿菌（B. lautus)和蘇云金芽孢 桿菌（B. thuringiensis)。在其他實施例中，所述微生物為大腸桿菌（E. coli)、假單胞菌屬 (Pseudomonas spp.)(如銅綠假單胞菌（P. aeruginoa)和產堿假單胞菌（P. alcaligenes)) 或鏈霉菌屬（Streptomyces spp.)(如變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans))。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1示出了本研究所用的枯草芽孢桿菌rrn操縱子的組織結構。表1-2列出了由 啟動子融合到靶基因而構建的不同菌株。
[0022] 圖 2 不出了 rrnE P2 與來自 rrnA、rrnB、rrnl、rrnD、rrnE、rrnj 和 rrnO 的 P1 啟 動子的比對結果。圖2還示出了每個啟動子的-35和-10區(qū)，以及位于每個啟動子的-35 序列上游的每個啟動子的上游"UP"元件。
[0023] 圖 3 不出了 rrnE P3 啟動子與來自 r;rnA、;miB、;miI、;miW、;miH、;miG、;miD、;miJ 和rrnO的P2啟動子的比對結果。圖3還示出每個啟動子的-35和-10區(qū)，以及位于每個 啟動子的-35序列上游的每個啟動子的上游"UP"元件。
[0024] 圖4是顯示通過不同Papre、PrrnI、PrrnE或PrrnB啟動子表達GFP的菌株的細胞 密度測量的曲線圖。
[0025] 圖5是顯示在菌株BG8000內通過Papre、PrrnI啟動子表達FNA的菌株的細胞密 度測量的曲線圖。
[0026] 圖6是顯不在菌株BG8010內通過Papre、PrrnI、PrrnE和PrrnB啟動子表達FNA 的菌株的細胞密度測量的曲線圖。
[0027] 圖7A和7B是顯示在菌株BG8000和BG8010內通過PaprE和PrrnI啟動子表達 ER11的菌株的細胞密度測量的曲線圖。
[0028] 圖8是顯示通過PaprE、PrrnI、PrrnE和PrrnB啟動子表達GFP的曲線圖。
[0029] 圖9是顯示通過PaprE和PrrnI啟動子表達FNA的曲線圖。
[0030] 圖10是顯示通過PaprE、PrrnI、PrrnE和PrrnB啟動子表達FNA的曲線圖。
[0031] 圖11是顯示通過PaprE和PrrnI啟動子表達ER11的曲線圖。
[0032] 圖12是顯示通過PaprE和PrrnI啟動子表達FNA的菌株的細胞密度測量的曲線 圖。
[0033] 圖13是顯示菌株通過PaprE和PrrnI啟動子表達FNA的曲線圖。
[0034] 圖14是顯示通過PaprE和PrrnI啟動子構建體的單拷貝整合體表達FNA的細胞 密度測量的曲線圖。
[0035] 圖15是顯示通過PaprE和PrrnI啟動子構建體的單拷貝整合體表達FNA所獲得 的FNA表達曲線圖。
[0036] 圖16是顯示通過不同Papre、PrpsJ和PrpsD啟動子表達GFP的菌株的細胞密度 測量的曲線圖。
[0037] 圖17是顯示在菌株BG8010內通過Papre、PrpsD和PrpsJ啟動子表達FNA的菌株 的細胞密度測量的曲線圖。
[0038] 圖18是顯示通過Papre、PrpsD和PrpsJ啟動子表達GFP的曲線圖。
[0039] 圖19是顯示通過Papre、PrpsD和PrpsJ啟動子表達FNA的曲線圖。
[0040] 圖20是顯示通過PaprE和PrpoD啟動子表達FNA的菌株的細胞密度測量的曲線 圖。
[0041] 圖21是顯示菌株通過PaprE和PrpoD啟動子表達FNA的曲線圖。

【具體實施方式】
[0042] 本發(fā)明提供了用于微生物中的表達系統(tǒng)的改善的方法和組合物。在某些實施例 中，所述方法和組合物包含來源于芽孢桿菌屬（Bacillus)菌種微生物的核糖體啟動子。核 糖體啟動子包括（例如）核糖體RNA啟動子和核糖體蛋白啟動子。在一些實施例中，提供 了生產目的蛋白的新型生產微生物和方法。
[0043] 本文提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，明 確地以引用方式并入。
[0044] A.定義
[0045] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域的 普通技術人員通常理解的相同含義（參見，例如，Singleton, et al·，DICTIONARY 0F MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.，John Wiley and Sons, New York[1994] (Singleton等人，《微生物學與分子生物學詞典》，第2版，約翰威立父子出版公司，紐 約，1994 年）以及 Hale&Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY[1991] (Hale和Marham，《哈珀柯林斯生物學詞典》，紐約哈珀永久出版社， 1991年））。雖然任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于實 施或測試本發(fā)明，但描述的是優(yōu)選的方法和材料。
[0046] 數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另外指明，否則分別地，核酸從左至右以5' 至3'取向寫出；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基取向寫出。
[0047] 本文提供的標題并不對本發(fā)明的各個方面或實施例構成限制。因此，通過整體參 考本說明書可更完全地限定下文定義的術語。
[0048] 如本文所用，術語"核酸序列"涵蓋單鏈或雙鏈的DNA、RNA及其修飾物。術語"核 酸序列"與"多核苷酸"可在本文中互換使用。
[0049] 如本文所用，"多肽"、"肽"和"蛋白質"可互換使用，并且包括指氨基酸殘基的聚合 物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學類似 物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。該術語也適用于包含保守氨基 酸置換而使得多肽仍保持功能的聚合物。
[0050] 如本文所用，術語"宿主細胞"是指能夠充當輸入序列（即，被引入到該細胞中的 序列）的宿主和表達載體的細胞，如本文所述。在一個實施例中，該宿主細胞是微生物。在 優(yōu)選的實施例中，該宿主細胞為芽孢桿菌屬菌種。
[0051] 如本文所用，"芽孢桿菌屬"是指芽孢桿菌屬內的所有種、亞種、菌株和其他分類 群，包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢 桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云 金芽孢桿菌。
[0052] 如本文所用，術語"DNA構建體"或"表達構建體"是指包含至少兩個DNA多核苷酸 片段的核酸序列。DNA或表達構建體可用于將核酸序列引入宿主細胞或生物體中。該DNA 可在體外產生（如通過PCR)或采用任何其他合適的技術產生。在一些優(yōu)選的實施例中，該 DNA構建體包含目的序列。目的序列的核酸有效連接至啟動子。在一些實施例中，該DNA構 建體還包含至少一個選擇性標記。在另外的實施例中，該DNA構建體包含與宿主細胞染色 體同源的序列。在其他實施例中，該DNA構建體包含非同源序列。
[0053] 如本文所用，術語"編碼目的蛋白的核酸"或"目的的編碼序列"可互換使用，是指 當翻譯為蛋白質時編碼目的蛋白的核酸序列。在一些實施例中，該編碼區(qū)以cDNA形式存 在，而在其他的實施例中，則以基因組DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，寡核苷酸 可為單鏈（即有義鏈）或雙鏈。在一些實施例中，如果需要使轉錄正確引發(fā)和/或初級RNA 轉錄本正確加工，則將合適的控制元件（如增強子、啟動子、剪接點、多腺苷酸化信號等）置 于緊密靠近基因編碼區(qū)的位置?；蛘?，在一些實施例中，本發(fā)明的表達載體所使用的編碼區(qū) 含有內源增強子、剪接點、間插序列、多腺苷酸化信號、或內源和外源控制元件的組合。
[0054] 如本文所用，術語"啟動子"、"啟動子元件"和"啟動子序列"是指啟動子位于寡核 苷酸序列的5'端（即之前）時能夠控制寡核苷酸序列轉錄為mRNA的DNA序列。因此，啟 動子通常位于寡核苷酸序列的5'端（即上游），其控制該寡核苷酸序列轉錄為mRNA，并且 提供與RNA聚合酶特異性結合和引發(fā)轉錄的部位。如本文所用，核糖體啟動子包括（例如） 核糖體RNA啟動子或核糖體蛋白啟動子。
[0055] 術語"有效連接"是指毗鄰關系，其中各元件處于能讓它們在功能上相關的布置關 系。例如，如果某啟動子控制目的的某編碼序列的轉錄，則它與該序列有效連接。
[0056] 如本文所用，當提及核酸序列時，術語"啟動子活性"是指該核酸序列引發(fā)寡核苷 酸序列轉錄為mRNA的能力。
[0057] 術語"載體"在本文被定義為這樣的多核苷酸，所述多核苷酸被設計成攜帶核酸序 列進入一種或多種細胞類型中。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體或病 毒顆粒、DNA構建體、表達盒等等。典型的表達載體也包括質粒，所述典型表達載體包括調 控序列，例如啟動子、信號序列、目的基因和轉錄終止子。
[0058] 如本文所定義，術語"分離的"是指從至少一種其他化合物、蛋白質、細胞、核酸序 列、氨基酸或與其天然來源通常相關聯(lián)的其他生物物質中分離的化合物、蛋白質、細胞、核 酸序列或氨基酸。
[0059] 如本文所用，術語"編碼區(qū)"在本文中被定義為當置于包括啟動子在內的適當控制 序列的控制下時轉錄為mRNA并且該mRNA又翻譯為多肽的核酸序列。編碼序列可包括cDNA、 基因組DNA、合成DNA和重組DNA。
[0060] 如本文所用，術語"野生型"基因、基因產物或細胞是指具有天然存在的來源中所 發(fā)現(xiàn)的基因、基因產物或細胞的特征的基因、基因產物或細胞。野生型基因、基因產物或細 胞是指群體中最常見的并因此被指定為"正常"或"野生型"形式的基因、基因產物或細胞。 如本文所用，術語"野生型序列"和"野生型基因"可互換使用，是指天然的或天然存在于宿 主細胞內的序列。
[0061] 相反，術語"修飾的"、"突變型"或"變體"基因、基因產物或細胞是指與野生型形 式相比，其顯示序列和/或功能性質的修飾（即改變的特征）的基因、基因產物或細胞。序 列修飾可通過以下方式發(fā)生，例如置換、插入、缺失或任何其他會導致序列或特征發(fā)生改變 的修飾。值得注意的是，可分離天然存在的突變體；這些突變體通過如下事實鑒別：與野生 型基因或基因產物相比時，它們具有改變的特征。
[0062] 如本文所用，術語"經(jīng)修飾的序列"和"經(jīng)修飾的基因"可互換使用，是指天然存在 的核酸序列的置換、插入、缺失、中斷或任何其他修飾。在一些實施例中，經(jīng)修飾的序列的表 達產物是截短的蛋白質（例如，如果該修飾為序列的缺失或中斷的話）。在一些實施例中， 截短的蛋白質保留生物活性。在其他實施例中，經(jīng)修飾的序列的表達產物是延長的蛋白質 (例如，如果修飾是向核酸序列中的插入的話）。在其他實施例中，插入導致產生截短的蛋 白質作為表達產物（例如，如果插入導致形成終止密碼子的話）。
[0063] 如本文所用，"輸入序列"是指引入宿主細胞染色體或基因組的DNA序列。該序列 可編碼一種或多種目的蛋白。該輸入序列可包含有效連接至編碼目的蛋白的序列的啟動 子。在一些實施例中，輸入序列包含已存在于待轉化細胞的基因組中的序列，而在其他實施 例中，該序列尚未存在于待轉化細胞的基因組中（即，在一些實施例中，它是同源序列，而 在其他實施例中，它是異源序列）。
[0064] 在一些實施例中，該輸入序列編碼至少一種同源或異源蛋白，包括但不限于激素、 酶、生長因子、或細胞因子。在一些優(yōu)選實施例中，該輸入序列編碼至少一種酶，包括但不 限于蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、 酯酶、氧化酶（例如酚氧化酶）、透性酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構 酶、互變異構酶、轉移酶、激酶或磷酸酶。
[0065] 在一些實施例中，該輸入序列編碼功能性野生型基因或操縱子、功能性突變基因 或操縱子，或非功能性基因或操縱子。
[0066] 如本文所用，術語"報告基因"是指能夠在細胞中表達的核苷酸序列，并且在所述 細胞中該報告基因的表達使得含有所表達基因的細胞能夠很容易被檢測和測量。
[0067] 如本文所用，術語"側翼序列"是指處于正討論的序列的上游或下游的任何序列 (如，對于序列A B C，序列B側接A和C序列）。在一些實施例中，該輸入序列的每側均側 接同源盒。
[0068] 如本文所用，術語"同源盒"是指與另一種核酸序列同源的序列。例如，同源盒可 與基因組DNA中的核酸序列同源。在這種情況下，該同源盒可用于引導新構建體整合到基 因組DNA的位置。
[0069] 如本文所用，術語"同源重組"是指兩個DNA分子或成對染色體（即交換期間）之 間的DNA片段在相同的核苷酸序列位點處的交換。在一個實施例中，染色體整合通過同源 重組來完成。
[0070] 如本文所用，術語"異源"通常是指并非天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或多 肽，或是指來源于與該宿主細胞相同的遺傳來源或物種的多核苷酸或多肽，但其所處位置 不是異源序列原本的位置。在一些實施例中，異源序列是非宿主序列，而在其他實施例中， 它是經(jīng)修飾的序列、來自不同宿主細胞株的序列，或來自該宿主細胞的不同染色體位置的 同源序列。
[0071] 如本文所用，術語"轉染"或"轉化"均指將DNA引入細胞的方法。
[0072] 如本文所用，術語"互補的"或"互補性"用來指與堿基配對原則相關的"多核苷 酸"或"寡核苷酸"（它們是可互換的術語，均是指核苷酸序列）。例如，序列"5' -CAGT-3' " 與序列"5'-ACTG-3' "互補。互補性可以是"部分的"或"全部的"。"部分的"互補性是指一 個或多個核酸堿基沒有按照堿基配對原則進行配對的情況。核酸之間的"全部的"或"完整 的"互補性是指各個和每個核酸堿基按照堿基配對原則與另一個堿基配對的情況。
[0073] 如本文所用，術語"染色體整合"是指將輸入序列引入宿主細胞的染色體（即基因 組）的過程。
[0074] 如本文所用，術語"選擇性標記"是指所使用的任何"標記"（即指示物），其指示 目的蛋白或基因的存在或不存在。在一些實施例中，該術語涵蓋了編碼酶活性的基因，該酶 活性使細胞能夠在缺乏本來必需的物質的培養(yǎng)基內生長。在其他實施例中，選擇性標記使 表達該選擇性標記的細胞具有對抗生素或藥物的抗性。
[0075] 如本文所用，術語"信號序列"或"信號肽"是指在蛋白質的N端部分的氨基酸序 列，其促進成熟形式的蛋白質分泌到細胞外部。細胞外蛋白質的成熟形式?jīng)]有信號序列，其 在分泌過程期間被切除。
[0076] "擴增"在本文被定義為產生核酸序列的額外拷貝。核酸擴增可通過例如聚合酶鏈 反應或本領域熟知的其他技術進行。如本文所用，術語"聚合酶鏈反應"（PCR)是指美國專 利No. 4, 683, 195、No. 4, 683, 202和No. 4, 965, 188的方法（所有這些專利據(jù)此以引用方式 并入），其描述在不進行克隆或純化的情況下增加靶序列的某個片段在DNA樣品（例如基因 組DNA)中的濃度的方法。
[0077] 采用PCR，可以將基因組DNA中的單拷貝的特異性靶序列擴增至一定水平，所述水 平可通過若干不同的方法（例如，與標記探針雜交；整合生物素酰化引物后進行親和素-酶 綴合物檢測；或將.sup. 32P標記的三磷酸脫氧核苷酸，例如dCTP或DATP，整合到擴增的片 段中）來檢測。除了基因組DNA外，任何寡核苷酸序列也可以使用一組合適的引物分子進 行擴增。具體地講，通過自身PCR過程產生的擴增片段本身就是有效的后續(xù)PCR擴增模板。
[0078] 如本文所用，術語"引物"指這樣的寡核苷酸，無論是如在純化的限制酶切消化物 (restriction digest)中天然存在的還是以合成方式產生的,其當被置于與某核酸鏈互補 的引物延伸產物的合成得以誘導的條件下時能夠充當合成起始點。為了使擴增效率最高， 引物優(yōu)選為單鏈的，但作為另一種選擇其也可以是雙鏈的。
[0079] 如本文所用，術語"探針"指這樣的寡核苷酸，無論是如在純化的限制酶切消化物 中的天然存在的還是以合成方式產生的，其能夠與目的的另一寡核苷酸雜交。探針可以是 單鏈的或雙鏈的。探針可用于特定基因序列的檢測、鑒別和分離。設想到，本發(fā)明中所用的 任何探針將用任何"報告分子"進行標記，從而其可在任何檢測系統(tǒng)中檢測，所述檢測系統(tǒng) 包括但不限于酶系統(tǒng)（如ELISA，以及基于酶的組織化學測定法）、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)和 發(fā)光系統(tǒng)。無意于將本發(fā)明限制于任何具體的檢測系統(tǒng)或標記。
[0080] 如本文所用，術語"限制性核酸內切酶"和"限制性酶"是指這樣的細菌酶，其中各 個酶都能夠在特異性核苷酸序列處或附近切割雙鏈或單鏈DNA。
[0081] B.核糖體啟動子
[0082] 核糖體RNA合成是大腸桿菌（Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌的核糖體合成 中的限速步驟。通過核糖體RNA啟動子調控核糖體RNA轉錄在之前有過研究（Samarrai et al.，2011，J Bacteriology, 193:723-733 (Samarrai 等人，2011 年，《細菌學雜志》，第 193 卷，第 723-733 頁）；Natori et al·，2009,J Bacteriology, 191:4555-4561(Natori 等人，2009 年，《細菌學雜志》，第 191 卷，第 4555-4561 頁）；Turnbough, 2008, Molecular Microbiology69:10-14 (Turnbough，2008 年，《分子微生物學》，第 69 卷，第 10-14 頁）； Krasny et al·，2008, Mol Microbiology69:42-54 (Krasny 等人，2008 年，《分子微生物學》， 第 69 卷，第 42-54 頁）；Krasny and Gourse, 2004, EMB023:4473_4483(Krasny 和 Gourse, 2004年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第23卷，第4473-4483頁））。通過營養(yǎng)條件嚴格調 控rRNA啟動子，從而在翻譯需求較低時核糖體RNA和核糖體不會過度生產。大腸桿菌中存 在七種rRNA(rrn)操縱子，每種操縱子都包含指定為P1和P2的兩種啟動子。大腸桿菌rrn P1啟動子的核心-10/-35區(qū)的前面是上游（UP)元件，該元件通過結合RNA聚合酶使啟動子 活性增加最多至20-50倍?？莶菅挎邨U菌含有10種rrn操縱子（Krasny和Gourse,出處同 上），這些操縱子的前面也有能夠幫助提高啟動子活性的上游（UP)元件。參見圖2和3。
[0083] 雖然目前已針對天然核糖體RNA的生產對核糖體RNA啟動子的調控進行了研究， 但仍未研究使用核糖體RNA啟動子時編碼目的的異源蛋白的核酸序列的表達水平。
[0084] 之前已在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中研究過編碼核糖體蛋白的基因的調控 (Grundy and Henkin，1991，J. Bacteriology, 173:4595-4602(Grundy 和 Henkin，1991 年， 《細菌學雜志》，第173卷，第4595-4602頁））。在許多情況下，已發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白充當自體 阻遏蛋白，控制編碼它們的操縱子的表達。
[0085] 本發(fā)明證實了核糖體啟動子，例如核糖體RNA啟動子和核糖體蛋白啟動子，在生 產目的的異源蛋白方面具有意想不到的效果。在與其他常用的啟動子相比及以每單位時間 生產的mRNA分子數(shù)量來衡量時，這兩種情況下得出的通過核糖體啟動子所轉錄的mRNA量 都高得驚人。參見例如實例3-5和9-10,其比較了核糖體啟動子與高表達的apre啟動子的 表達。在一個實施例中，本發(fā)明的核糖體啟動子提供增強的轉錄效率，如以每單位時間生產 的mRNA分子數(shù)量來衡量。
[0086] 使用核糖體啟動子時，編碼目的的異源蛋白的核酸序列獲得意想不到的高水平表 達，這具有若干有益效果。在一個實施例中，在與通過自身天然的啟動子來表達目的的編 碼序列相比時，使用核糖體啟動子來表達目的的編碼序列使得目的的編碼序列的表達量增 力口。增加的表達量尤其可用于不穩(wěn)定的轉錄本。
[0087] 在另一個實施例中，使用核糖體啟動子表達目的的編碼序列使得目的的編碼序列 的表達量增加，無需擴增包含核糖體啟動子的表達構建體。當使用本領域的其他表達構建 體時，為了使目的的編碼序列獲得高表達水平，通常需要擴增表達構建體。然而，使用本文 所述的核糖體啟動子所獲得的表達水平足夠高，以至于沒有必要擴增表達構建體。相反，使 用包含核糖體啟動子的表達構建體的單個整合體獲得高表達水平。參見實例4和5。這提 供若干有益效果。首先，宿主菌株更為穩(wěn)定，因為它們不會發(fā)生已擴增的表達構建體的丟 失。另外，如果不需要擴增表達構建體，則菌株的構建將更有效。由此節(jié)約了時間、金錢和 材料。
[0088] 在一些實施例中，該核糖體啟動子為核糖體RNA啟動子。本發(fā)明所用的核糖體RNA 啟動子是來自芽孢桿菌屬rrnI、rrnE或rrnB核糖體RNA啟動子的P1、P2或P3啟動子中的 任意一種。在一個實施例中，本發(fā)明使用的RNA啟動子為來自芽孢桿菌屬rrnl核糖體RNA 啟動子的P2啟動子。在一些實施例中，可使用來自芽孢桿菌屬rrnl、rrnE或rrnB核糖體 RNA啟動子的P1、P2或P3啟動子的組合。參見例如實例2-4和圖4、8、6和10。
[0089] 在具體的實施例中，位于本文所述的核糖體啟動子（如核糖體RNA啟動子或核糖 體蛋白啟動子）的+1轉錄起始位點的核苷酸由鳥嘌呤修飾為腺嘌呤。例如，本文所述的核 糖體RNA啟動子的轉錄起始位點在圖2和圖3中示出。+1轉錄起始位點的修飾允許通過本 文所述的啟動子恒定生產，因此通過該啟動子獲得更好的總體生產力。
[0090] 在一個實施例中，啟動子具有SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的核酸序列或其子 序列。該子序列將保留啟動子活性并且包含至少約10個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少 約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約70 個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約90個核苷酸或至少約100個核苷酸。SEQ ID N0:1-6 或13-14中任一者的子序列應最少包含親本啟動子的-35和-10區(qū)。例如，SEQ ID NO: 1-6 或13-14中任一者的子序列應最少包含親本啟動子的-35和-10區(qū)，如圖2和3或表1-1 和2-1所示。在某些實施例中，SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的子序列包含親本啟動子 的-35和-10區(qū)，并且還包含親本啟動子的上游UP元件，如圖2和3所示。
[0091] 在具體的實施例中，該啟動子具有SEQ ID N0:3的核酸序列或其子序列。該子序列 將保留啟動子活性并且包含至少約10個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、 至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約 80個核苷酸、至少約90個核苷酸和至少約100個核苷酸。
[0092] 該啟動子也可以是包含本發(fā)明的一種或多種啟動子的一部分或本發(fā)明的啟動子 的一部分和另一種啟動子的一部分的雜合啟動子。在一些實施例中，該雜合啟動子將包含 SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的子序列，該子序列具有SEQ ID N0:1-6或13-14中任一 者的至少約1〇個核苷酸、至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至 少約50個核苷酸、至少約60個核苷酸、至少約70個核苷酸、至少約80個核苷酸、至少約90 個核苷酸或至少約100個核苷酸。
[0093] 該雜合啟動子的另一啟動子可以是在宿主細胞中顯示啟動子活性的任何啟動子， 并且包括可能是或可能不是宿主細胞中天然存在的突變型啟動子、截短的啟動子等。可用 于本發(fā)明的雜合啟動子的其他啟動子的例子包括真菌和細菌啟動子。一些具體的非限制 性例子包括：aprE啟動子或突變型aprE啟動子（W001/51643)、弗氏鏈霉菌（Str印tomyces fradiae)氨基糖苷3'-磷酸轉移酶基因的aph啟動子、黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖 淀粉酶（glaA)啟動子、密蘇里游動放線菌（Actinoplanesmissouriensis)的葡糖異構酶 (GI)啟動子以及衍生的GI(GIT)啟動子（美國專利N O.6,562,612 和EPA351029)、來自變 鉛青鏈霉菌的葡糖異構酶（GI)啟動子、短的野生型GI啟動子、1. 5GI啟動子、1. 20GI啟動 子或W003/089621中所公開的任一種變體GI啟動子、來自絲狀真菌的cbhl、cbh2、egll和 egl2啟動子，特別是里氏木霉（Trichodermareesei)纖維二糖水解酶啟動子（GenBank登 錄號 D86235)、lacZ 和 tac 啟動子（Bagdasarion et al.，1983, Gene26:273-282 (Bagdasari on 等人，1983 年，《基因》，第 26 卷，第 273-282 頁））、ermE 啟動子（^1(16七31.，1986，]\1〇1· Gen. Genet. 203:468-478 (Ward等人，1986年，《分子遺傳學與普通遺傳學》，第203卷，第 468-478 頁）和 Schmitt-Johnet al·，1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:493-498( Schmitt-John等人，1992年，《應用微生物學和生物技術》，第36卷，第493-498頁）），以 及枯草芽抱桿菌噬菌體〇29啟動子（Pulido et al.，1986, Gene49:377-382 (Pulido等人， 1986年，《基因》，第49卷，第377-382頁））。鏈霉菌中有效的啟動子列于Hopwood等人 的文獻中(Hopwood et al. , Regulation of Gene Expression in Antibiotic-producing Streptomyces. In Booth, I.and Higgins,C. (Eds)SYMPOSIUM OF THE SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, REGULATION OF GENE EXPRESSION, Cambridge University Press, 1986pgs. 251-276 (Hopwood等人，《產抗生素的鏈霉菌的基因表達調控》，載于： Booth，I.和Higgins，C.編輯，《普通微生物學學會關于基因表達調控的專題研討會》，劍橋 大學出版社，1986年，第251-276頁））。鏈霉菌噬菌體啟動子也公開于Labes et al.，19 97, Microbiol. 143:1503-1512 (Labes 等人，1997 年，《微生物學》，第 143 卷，第 1503-1512 頁）?？捎行в糜诒疚乃鲭s合啟動子的其他啟動子是列于如下文獻中的啟動子：Deuschle et al.，1986EMB0 J. 5:2987-2994(Deuschle等人，1986年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第 5 卷，第 2987_2"4 頁）和 W〇96/0〇787。
[0094] 該啟動子也可以是包含兩個或更多個啟動子的串聯(lián)啟動子。在一些實施例中，該 串聯(lián)啟動子將包括SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的啟動子或其子序列，以及一種或多種 其他啟動子，例如以上針對雜合啟動子所討論的啟動子。
[0095] 雜合啟動子、串聯(lián)啟動子、為SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的子序列的啟動子 或與SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者雜交的核酸序列將具有其相應親本啟動子至少約 20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約80%和至少約100%的 啟動子活性。在一些實施例中，該啟動子活性將更大，例如大于約100%、大于約150%、大 于約200 %和大于約250%。
[0096] 在一些實施例中，該啟動子將包括在中等嚴格性條件、高嚴格性條件或極高嚴格 性條件下與SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者或其子序列雜交的核酸序列。在具體的實施例 中，該啟動子將包括在中等嚴格性條件、高嚴格性條件或極高嚴格性條件下與SEQ ID N0:3 或其子序列雜交的核酸序列。
[0097] 在具體的實施例中，利用雜交來分析給定的D NA片段是否對應本文所述的啟 動子DNA序列從而是否落在本發(fā)明的范圍內。Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (2. sup. nd Ed.，1989Cold Spring Harbor, Ν· Υ·) (Sambrook 等人，《分子 克?。簩嶒炇沂謨浴罚诙?，1989年，冷泉港實驗室出版社，紐約）描述了一般的雜交方法。
[0098] "雜交條件"是指測量雜交的條件的"嚴格性"程度。雜交條件可基于核酸結 合復合物的解鏈溫度（Tm)，如 Berger 和 Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, METHODS IN ENZYM0L0GY, Voll52, Academic Press, San Diego Calif. (1987 年， "分子克隆技術指南"，《酶學方法》，第152卷，學術出版社，加利福尼亞州圣地亞哥））中提 出。雜交條件也可基于本領域已知的雜交后采用的洗滌條件。
[0099] 僅出于說明目的，"低嚴格性"條件可指在20°C下使用0. 2x SSC/0. 1 % SDS溶液洗 滌15分鐘。"中等嚴格性"條件可指在37°C下使用0. 2x SSC/0. 1% SDS溶液洗滌30分鐘。 "高嚴格性"條件可指在37°C下使用0. 2x SSC/0. 1% SDS溶液洗滌45分鐘。"極高嚴格性" 條件可指在37°C下使用0. 2x SSC/0. 1% SDS溶液洗滌60分鐘。然而，與具體溶液成分、溫 度和洗滌時間有關的嚴格性可能會根據(jù)具體的核酸和其他相關條件而改變。技術人員將能 夠確定與所需的嚴格性程度相關的雜交條件。
[0100] 本發(fā)明的另一個方面是根據(jù)核酸結合復合物的解鏈溫度（Tm)來使用雜交條 件，如 Berger 和 Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, METHODS IN ENZYMOLOGY，V〇1152, Academic Press, San Diego Calif. (1987年，"分子克隆技術指南"，《酶 學方法》，第152卷，學術出版社，加利福尼亞州圣地亞哥））中提出。僅出于說明目的，"極 高嚴格性"通常發(fā)生在約Tm-5°C (比探針Tm低5°C );"高嚴格性"通常發(fā)生在Tm以下約 5°C至10°C;"中等嚴格性"發(fā)生在Tm以下約10°C至20°C;以及"低嚴格性"發(fā)生在Tm以下 約 20°C至 25°C。
[0101] 可按下列所述執(zhí)行雜交分析的一個例子：根據(jù)制造商的說明使用適當?shù)?限制性酶，例如 EcoR I、Hind III、Bam HI、Cla I、Κρη I、Mlu I、Spe I、Bgl II、Nco I、Xba I、Xho I和Xma I (由馬薩諸塞州貝弗利新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, Inc.，Beverly, Mass.)和寶靈曼公司（Boehringer Mannheim)提供），進行消化以 使特定目標來源的基因組DNA片段化。然后通過瓊脂糖凝膠（例如，0.8%瓊脂糖）電泳分 析樣品，從而可以根據(jù)大小觀察DNA片段的分離。一般是通過溴化乙錠染色來觀察DNA片 段。該凝膠可以先在蒸餾水中短暫沖洗，隨后在適當溶液（例如0.25MHC1)中輕輕振蕩以 進行脫嘌呤，接著輕輕振蕩變性30分鐘（在例如0. 4M NaOH中）?？砂◤托圆襟E，在該步 驟中，將凝膠放入到1. 5M NaCl，1M Tris，pH7. 0下輕輕搖蕩30分鐘。然后應使用轉移溶液 (例如6x SSC (900mM NaCl、90mM檸檬酸三鈉）將DNA轉移到適當?shù)膸д姷哪ど?，例如最?強度的Nytran Plus膜（Maximum Strength Nytran Plus membrane)(新罕布什爾州基恩的施 萊歇許爾公司（Schleicher&Schuell，Keene, Ν· Η·))。一旦完成轉移，通常約2個小時后，將 該膜在例如2\33(：(2\330 = 30〇1111似(：1，3〇1111檸檬酸三鈉）中沖洗，然后在室溫下風干。 隨后，應當將該膜在合適的預雜交溶液（例如，每100mL的水溶液含：20-50mL甲酰胺、25mL 的 20XSSPE(1XSSPE = 0· 18MNaCl, lmMEDTA, 10mMNaH2P04，pH7. 7)、2· 5mL 的 20% SDS 和 lmL的10mg/mL剪切的鯡魚精DNA)中預雜交（大約2個小時或更長時間）。正如本領域技 術人員所知道的，預雜交溶液中甲酰胺的量可能因根據(jù)常規(guī)方法所獲得的反應的性質的不 同而不同。因此，在識別雜交分子方面，較低量的甲酰胺可比使用較高量的甲酰胺的相同工 序獲得更完全的雜交。另一方面，使用較多的甲酰胺可更容易通過視覺識別強的雜交帶。
[0102] 通常長度在50和500個堿基之間的DNA探針應采用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，從 凝膠上切下該片段，然后從已切下的瓊脂糖中進行回收。如需了解更詳細的工序，請參見 Sambrook，出處同上。然后對該已純化的DNA片段進行標記（根據(jù)制造商的說明書，使用例 如Megaprime標記系統(tǒng)）以將P 32摻入DNA中。將標記探針加熱至95°C持續(xù)5分鐘進行變 性，然后立刻加入到膜以及預雜交溶液中。雜交反應應在合適的條件下進行合適的時間， 例如，在37°C下18個小時，同時輕輕振蕩或旋轉。先沖洗膜（例如，在2XSSC/0. 3% SDS 中），隨后在合適的洗滌溶液中洗滌，同時輕輕攪拌。所需的嚴格性將是膜（濾膜）被沖洗 的條件的反映。
[0103] 在一個實施例中，該核酸序列將是SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的序列，并且 雜交嚴格性條件將為高嚴格性條件。在另一個實施例中，該核酸序列將是SEQ ID N0:3的序 列，并且雜交嚴格性條件將為高嚴格性條件。
[0104] 在其他實施例中，根據(jù)本發(fā)明的啟動子將是與SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者具 有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，以及至少 99%序列同一性的子序列。在另一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的啟動子將是與SEQ ID N0:3具 有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，以及至少 99%序列同一性的子序列。SEQ ID N0:1-6或13-14中任一者的子序列應最少包含親本啟動 子的-35和-10區(qū)，如圖2和3或表1-1和2-1所示。在某些實施例中，SEQ ID N0:1-6中 任一者的子序列包含親本啟動子的-35和-10區(qū)，并且還包含親本啟動子的上游UP元件， 如圖2和3所示。
[0105] 在兩條核酸序列或多肽的語境中，術語"同一性"是指當比對以達到最大匹配程 度時兩條序列中相同的核苷酸或氨基酸殘基，如使用如下"序列比較算法"中的一種所測 定的。用于比較的序列的最佳比對可通過以下方式進行，例如，通過Smith&Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) (Smith 和 Waterman，《應用數(shù)學進展》，第 2 卷，第 482 頁，1981 年）的局部同源算法、通過 Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) (Needleman 和Wunsch，《分子生物學雜志》，第48卷，第443頁，1970年）的同源比對算法、通過 Pearson&Lipman, Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA85:2444 (1988) (Pearson 和 Lipman，《美國國家 科學院院刊》，第85卷，第2444頁，1988年）的尋找相似性方法、通過這些算法（威斯康星遺 傳學軟件包，遺傳學計算機組（Wisconsin Genetics Software，Package Genetics Computer Group)，575Science Dr.，Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)的計算機實現(xiàn) 或通過目測來進行。
[0106] 適用于確定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其描述于Altschul，et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) (Altschul 等人，《分子生物學雜志》，第 215 卷，第 403-410頁，1990年）。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是通過美國國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information)可公開獲得的，可登錄萬維網(wǎng)（www) ncbi. nlm. nih. gov獲取。BLAST算法對兩條序列之間的相似性進行統(tǒng)計分析（參見例如 Karlin&Altschul，Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA90:5873_5787(1993) (Karlin 和 Altschul， 《美國國家科學院院刊》，第90卷，第5873-5787頁，1993年））。
[0107] B.目的的編碼序列
[0108] 本發(fā)明涵蓋的啟動子有效連接至編碼目的蛋白的核酸（即，目的的編碼序列）。 由編碼序列編碼的多肽可以是酶、激素、生長因子、細胞因子、抗生素或其部分、受體或其部 分、報告基因（如綠熒光蛋白）或其他次生代謝物。
[0109] 在一些實施例中，該酶是來源于細菌或真菌的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、木 聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質酶、植酸酶、漆酶、脂肪酶、異構酶、酯酶、甘露聚糖酶、糖 酶、水解酶、氧化酶、透性酶、支鏈淀粉酶、還原酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶、磷 酸酶，或等等。
[0110] 在一些實施例中，該酶是纖維素酶。纖維素酶是水解纖維素中β-D-葡糖苷鍵 的酶。傳統(tǒng)上將纖維素分解酶分為三大類：內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解 酶以及 β-葡萄糖苷酶（Knowles, J.etal.，TIBTECH5:255-261 (1987) (Knowles, J.等人， TIBTECH，第5卷，第255-261頁，1987年））。許多纖維素酶在科學文獻中有所描述，其例 子包括：來自里氏木霉的纖維素酶：Shoemaker, S. et al.，Bio/Technology, 1:691-696, 198 3(Shoemaker，S.等人，《生物技術》，第1卷，第691-696頁，1983年），該文獻公開了 CBHI ; Teeri, Τ· et al.，Gene, 51:43-52, 1987(Teeri, Τ·等人，《基因》，第 51 卷，第 43-52 頁，1987 年），該文獻公開了 CBHII ;Penttila，M. et al.，Gene, 45:253-263, 1986 (Penttila，M.等人， 《基因》，第 45 卷，第 253-263 頁，1986 年），該文獻公開了 EGI ;Saloheimo, M. et al·，Gene, 6 3:11-22, 1988(Saloheimo，M.等人，《基因》，第63卷，第11-22頁，1988年），該文獻公開了 EGII ;0kada，M. et al·，Appl. Environ. Microbiol.，64:555-563, 1988 (Okada，M.等人，《應 用環(huán)境微生物學》，第64卷，第555-563頁，1988年），該文獻公開了 EGIII ;Saloheimo，M. et al·，Eur. J. Biochem.，249:584-591，1997 (Saloheimo, Μ·等人，《歐洲生物化學雜志》，第 249 卷，第 584-591 頁，1997 年），該文獻公開了 EGIV ;以及 Saloheimo, A. et al·，Molecular Mi crobiology, 13:219-228, 1994(Saloheimo, A.等人，《分子微生物學》，第 13 卷，第 219-228 頁，1994年），該文獻公開了 EGV外切纖維二糖水解酶，并且來自木霉屬之外的菌種的內 切葡聚糖酶也有描述，例如0〇i等人，1990,該文獻公開了編碼由棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus)產生的內切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，1996,該文獻 公開了編碼由棘孢曲霉產生的β -葡萄糖苷酶1的cDNA的克隆和測序；Sakamoto等人， 1995,該文獻公開了編碼來自白曲霉（Aspergillus kawachii) IF04308的內切葡聚糖酶 CMCase-Ι的cDNA序列；以及Saarilahti等人，1990,該文獻公開了來自歐文氏菌（Erwinia carotovara)的內切葡聚糖酶。
[0111] 在具體的實施例中，待由本發(fā)明的啟動子表達的纖維素酶是美國專利 No. 6, 2, 87, 839和美國專利No. 6, 562, 612中公開的纖維素酶。在某些實施例中，待表達的 纖維素酶是包含美國專利No. 6, 562, 612的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、其具有纖維素分解 活性并且與美國專利No. 6, 562, 612的SEQ ID NO: 1的活性部分具有大于70%序列同一性 的片段或衍生物的纖維素酶。
[0112] 在其他實施例中，該酶是蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、巰基蛋 白酶或酸性蛋白酶。在一些實施例中，該蛋白酶將是絲氨酸蛋白酶（如枯草桿菌蛋 白酶）。絲氨酸蛋白酶描述于 Markland, et al· (1983) Honne-Seyler's Z Physiol. Chem364:1537-1540 (Markland 等人，1983 年，Honne-Seyler's Z Physiol. Chem,第 364 卷，第 1537-1540 頁）；Drenth，J.et al· (1972) Eur.J.Biochem. 26:177-181 (Drenth，J. 等人，1972年，《歐洲生物化學雜志》，第26卷，第177-181頁）；美國專利 No. 4, 760, 025 (RE34, 606)、5, 182, 204 和 6, 312, 936 和 EP0323, 299。本發(fā)明可用的蛋白酶 也描述于，例如，美國專利公布No. 2010/0152088和國際公布No. W02010/056635。測量蛋白 分解活性的方法公開于 Κ· M. Kalisz, "Microbial Proteinases"ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, A. Fiecht Ed. 1988 (Κ· M. Kalisz，"微生物蛋白酶"，《生物 化學工程與生物技術進展》，A. Fiecht編輯，1988年）。
[0113] 在另一個實施例中，待由本發(fā)明的啟動子表達的蛋白酶是包含SEQ ID N0:10、12、 19或21的氨基酸序列、其具有蛋白分解活性并且與SEQ ID NO: 10、12、19或21的活性部分 具有大于70%序列同一性的片段或衍生物的蛋白酶。編碼SEQ ID N0:10、12、19或21的核 酸序列分別是SEQ ID N0:9、ll、18和20。
[0114] 在其他實施例中，該酶是淀粉酶，例如來源于木霉屬（例如里氏木霉）的淀粉酶、 木霉屬葡糖淀粉酶，來源于芽孢桿菌屬（例如枯草芽孢桿菌）的淀粉酶、或來源于地芽孢桿 菌屬（Geobacillus)(例如嗜熱脂肪地芽孢桿菌（(G.stearothermophilus))的淀粉酶。細 菌和真菌淀粉酶描述于，例如，美國專利No. 8, 058, 033、美國專利公布No. 2010/0015686、 美國專利公布No. 2009/0314286、英國申請No. 1011513. 7,以及國際申請No. PCT/ IB2011/053018。這些參考文獻的每一個的說明書據(jù)此全文以引用方式并入。
[0115] 在其他實施例中，該酶是木聚糖酶。在某些實施例中，木聚糖酶來源于木霉屬（例 如里氏木霉）。細菌和真菌木聚糖酶描述于，例如，國際公布No. W02001/027252和美國專利 No. 7, 718, 411。這些參考文獻的每一個的說明書據(jù)此全文以引用方式并入。
[0116] 在其他實施例中，該酶是植酸酶。在某些實施例中，植酸酶來源于檸檬酸桿菌 屬（Citrobacter)(例如弗氏朽 1檬酸桿菌（C. freundii))或大腸桿菌。在其他實施例 中，植酸酶可以是布丘氏菌Outtiauxella)植酸酶，例如鄉(xiāng)間布丘氏菌Outtiauxella agrestis)植酸酶。植酸酶描述于，例如，國際公布No. W02006/043178、W02006/038062、 W02008/097619、W02009/129489、W02006/038128、W02008/092901、W02009/129489 和 W02010/122532。這些參考文獻的每一個的說明書據(jù)此全文以引用方式并入。
[0117] 在一些實施例中，激素是促卵泡激素、促黃體生成激素、促腎上腺皮質激素釋放因 子、生長激素釋放抑制因子、促性腺激素、加壓素、催產素、促紅細胞生成素、胰島素等等。
[0118] 在一些實施例中，該生長因子是結合到細胞表面上的受體的蛋白質，主要結果是 激活細胞增殖和/或分化，該生長因子包括血小板衍生生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長 因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、轉化生長因子等等。
[0119] 在一些實施例中，該生長因子是細胞因子。細胞因子包括但不限于集落刺激因子、 白介素（IL-I ( α和β )、IL-2至IL-13)和干擾素（α、β和γ )。
[0120] 在一些實施例中，該抗體包括但不限于希望能從中大量生產的任何物種的免疫球 蛋白，特別優(yōu)選的是該抗體為人類抗體。免疫球蛋白可來自任何一類，即G、A、Μ、Ε或D。
[0121] 該編碼序列可以是宿主細胞天然存在的或異源的。此外，該編碼序列可以編碼全 長蛋白或全長蛋白的截短形式。本發(fā)明不限于具體的編碼序列，但涵蓋許多編碼序列，這些 序列有效連接至本發(fā)明的啟動子。
[0122] C.信號序列
[0123] 在一些實施例中，尤其是當目的的編碼序列編碼胞外酶時，例如纖維素酶、蛋白 酶或淀粉降解酶，信號序列可連接至該編碼序列的Ν端部分。該信號可用于促進DNA序 列的分泌。該信號序列可能對于宿主生物體是內源或外源的。該信號序列可為與編碼 的多肽通常相關的序列。在一些實施例中，該信號序列可發(fā)生改變或修飾，如國際專利 公布NO.W02011/014278和W02010/123754中所描述，這些文獻的說明書據(jù)此全文以引用 方式并入。在一些實施例中，該信號序列包含來自鏈霉菌纖維素酶基因的信號序列。在 一個實施例中，優(yōu)選的信號序列是變鉛青鏈霉菌纖維素酶celA(Bently et al.，（2002) Nature417:141-147 (Bently 等人，2002 年，《自然》，第 417 卷，第 141-147 頁））。然而，本領 域的技術人員知道許多可根據(jù)宿主生物體內待表達和分泌的蛋白進行使用的信號肽。
[0124] D. DNA構律體和載體
[0125] 本發(fā)明中包含目的編碼區(qū)的核酸構建體可采用已建立的標準方法通 過合成的方式進行制備，例如 Beaucage and Caruthers, (1981) Tetrahedron Letters22:1859_1869(Beaucage 和 Caruthers，1981 年，《四面體通訊》，第 22 卷，第1859-1869頁）描述的亞磷酰胺方法或Matthes et al.，（1984)EMB0 Journal3:801-805 (Matthes等人，1984年，《歐洲分子生物學組織雜志》，第3期，第801-805 頁）描述的方法。該核酸構建體可以是混合的合成和基因組來源，并且可以通過連接合成 或基因組DNA的片段來制備。該核酸構建體還可以使用特異性引物通過聚合酶鏈反應進行 制備，例如美國專利 No. 4, 683, 202 或 Saiki et al.，Science239 (1988)，487-491 (Saiki 等 人，《科學》，1988年，第239卷，第487-491頁）中所述。
[0126] 本發(fā)明的DNA構建體可插入到載體中，例如表達載體。適用于在真菌、酵母和細菌 中克隆、轉化和表達多肽的各種載體是本領域技術人員已知的。通常，該載體或表達盒將包 含本發(fā)明的啟動子，任選地信號序列、目的的編碼區(qū)和終止子序列。在優(yōu)選的實施例中，該 載體將包括位于該信號序列和終止子序列之間的一個或多個克隆位點。
[0127] E.轉化
[0128] 本發(fā)明的載體將轉化到宿主細胞中。通用轉化技術是本領域已知的（Ausubel et al.，1994, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel 等人，1994 年，《分子生物學 實驗室指南》）和 Campbell et al.，1989Curr. Genetl6:53-56 (Campbell 等人，1989 年，《當 代遺傳學》，第16卷，第53-56頁））。這些通用技術的一些包括但不限于使用粒子或基因 槍（生物彈道技術）、在轉化過程之前使絲狀真菌細胞壁透化（例如，通過使用高濃度堿， 例如，0. 05M至0. 4M CaCl2或乙酸鋰）、原生質體融合、電穿孔或農桿菌介導轉化（美國專 利No. 6, 255, 115)，以及使用聚乙二醇和CaCl. sub. 2對原生質體或原生質球的處理描述于 Campbell, et al·，（1989) Curr. Genet. 16:53-56, 1989 (Campbell 等人，1989 年，《當代遺傳 學》，第 16 卷，第 53-56 頁）和 Penttila，Μ· et al·，（1988) Gene, 63:11-22 (Penttila，Μ·等 人，1988年，《基因》，第63卷，第11-22頁）。
[0129] 細菌的轉化和表達方法公開于 Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, (1990)，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 55:135-138 (Brigidi、DeRossi、Bertarini、 Riccardi和Matteuzzi，1990年，《歐洲微生物學會聯(lián)合會微生物學通訊》，第55卷，第 135-138頁）。蛋白酶缺失的芽孢桿菌菌株的優(yōu)選通用轉化和表達方案在Ferrari等人的 美國專利No. 5, 264, 366中提供。
[0130] 鏈霉菌的轉化和表達可見于 Hopwood et al·，GENETIC MANIPULATION 0F STREPT0MYCES:A LABORATORY MANUAL, (1985) John Innis Foundation, Norwich UK(Hopwood 等人，《鏈霉菌的遺傳操作：實驗室指南》，1985年，英國諾里奇約翰英納斯基金）。
[0131] 在其他實施例中，曲霉和木霉的轉化和表達描述于例如美國專利No. 5, 364, 770、 美國專利 No. 6, 022, 725，以及 Nevalainen et al.，1992, The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes, in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds.Leon and Berka, Marcel Dekker, Inc. pp. 129-148 (Nevalainen等人，1992年，"木霉屬的分子生物學及其在表達同源 和異源基因中的應用"，載于《分子工業(yè)真菌學》，Leon和Berka編輯，馬塞爾德克爾有限公 司，第 129-148 頁）。
[0132] F.宿豐細朐
[0133] 可根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細胞包括細菌和真菌細胞。優(yōu)選的真菌宿主細胞包括絲 狀真菌細胞，例如曲霉和木霉細胞。優(yōu)選的細菌宿主細胞包括革蘭氏陽性細胞和革蘭氏陰 性細胞，包括芽孢桿菌細胞、分支桿菌（Mycobacterium)細胞、放線菌（Actinomyces)細胞 和鏈霉菌細胞。宿主細胞還包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌（如銅綠假單胞菌和產堿假 單胞菌）、鏈霉菌（如變鉛青鏈霉菌）、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢 桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、 燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
[0134] G.細朐培養(yǎng)
[0135] 宿主細胞和已轉化的細胞可以在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可視需要改良用于已 轉化的宿主細胞的培養(yǎng)基以激活啟動子和選擇轉化株。具體培養(yǎng)條件（例如溫度、pH等）可 以是用于使所選宿主細胞表達的那些條件，并且對于本領域的技術人員將顯而易見。此外， 優(yōu)選的培養(yǎng)條件可見于科學文獻中，例如Sambrook，1982,出處同上；Kieser，T，M J.Bibb，M J. Buttner,K F Chater, and D. A. Hopwood(2000)PRACTICAL STREPT0MYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich UK(Kieser, T、M J. Bibb、M J. Buttner、K F Chater 和 D. A. Hopwood, 2000年，《實用鏈霉菌遺傳學》，英國諾里奇約翰英納斯基金）；Harwood, et al. , (1990)M0LECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley and/or from the American Type Culture Collection(ATCC ;"http://www. atcc. org/，'）（Harwood 等人， 1990年，《芽孢桿菌的分子生物學方法》，約翰威立出版和/或得自美國典型培養(yǎng)物保藏中 心（ATCC;"http://www. atcc. org/"））。真菌宿主細胞（例如木霉細胞）的穩(wěn)定轉化株一 般可以此方式與不穩(wěn)定的轉化株加以區(qū)別：其生長速率較快，或者在固體培養(yǎng)基上形成具 有光滑而不是鋸齒狀輪廓的圓形菌落。
[0136] H. R表汰的多狀的回收
[0137] 通過常規(guī)工序可從培養(yǎng)基回收由已轉化的宿主細胞產生的多肽，所述常規(guī)程序包 括通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離出該宿主細胞，或如有必要，破壞該細胞并從細胞組分或 細胞碎片中取出上清液。通常在凈化后，上清液或濾液的蛋白質組分可使用鹽，如硫酸銨沉 淀。然后將沉淀的蛋白溶解，并且可通過多種色譜分離工序，例如離子交換層析、凝膠過濾 層析、親和層析和本領域公認的其他工序進行純化。
[0138] I.構律體纟目裝
[0139] 在一個一般的實施例中，本發(fā)明涉及體外組裝DNA構建體，然后直接將這種構建 體克隆到感受態(tài)宿主細胞（例如芽孢桿菌宿主細胞）中，使得該構建體整合到宿主基因組 中。例如，在一些實施例中，采用PCR融合和/或連接來體外組裝DNA構建體。在優(yōu)選的實 施例中，該DNA構建體是非質粒DNA構建體。在另一個實施例中，該DNA構建體包含已引入 突變的DNA。然后使用此構建體來轉化宿主細胞。就這一點而言，優(yōu)選地采用宿主細胞（例 如芽孢桿菌）的高感受態(tài)突變體來促進該構建體直接克隆到該細胞中。例如，攜帶受控于 木糖誘導型啟動子的comK基因（Pxyl-comK)的芽孢桿菌可以非常高的效率進行可靠轉化， 如本文所述。本領域已知的任何合適的方法可用于轉化該細胞?？稍谵D化前將該DNA構建 體插入到載體（即，質粒）中。在一些優(yōu)選的實施例中，使用適當?shù)南拗菩悦福?，不會?壞該DNA構建體的限制性酶）切斷該環(huán)狀質粒。因此，在一些實施例中，環(huán)狀質?？捎糜诒?發(fā)明。然而，在可供選擇的實施例中，使用了線性質粒。在一些實施例中，在不存在質粒DNA 的情況下使用該DNA構建體（即，PCR產物）。
[0140] 為進一步說明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列具體的實例，應當理解，提供這些實例 是為了說明本發(fā)明，而不應解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0141] 實Μ
[0142] 實例1 :通討核糖體RNA啟動子和核糖體蛋白啟動子表汰蛋白的枯草芽孢桿菌菌 株的構律
[0143] 綠熒光蛋白（GPF)以及兩種枯草桿菌蛋白酶即FNA(解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌 蛋白酶BPN' -Y217L)和ER11(描述于W02010/056635A1)的編碼序列被融合到枯草芽孢 桿菌核糖體RNA啟動子或核糖體蛋白啟動子，以測試枯草芽孢桿菌菌株BG8000(AnprE、 degU(Hy)32、AaprE、spoIIE312amyE::PxylRA-comK_eryR)和 BG8010(AnprE、 degU(Hy)32、AaprE、spoIIE312amyE::PxylRA-comK_eryRoppA:phleoR)中的蛋白表 達。.將通過核糖體RNA啟動子和核糖體蛋白啟動子的蛋白表達與用枯草桿菌蛋白 酶啟動子 aprE(Transcription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants.E Ferrari, D J Henner,M Perego, and J A Hoch, J Bacteriol. 1988January;170(l) :289-295( "枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的轉錄與孢子 形成突變體中枯草桿菌蛋白酶的表達"，E Ferrari、D J Henner、M Perego和J A Hoch,《細菌 學雜志》，1988年1月，第170卷第1期，第289-295頁））表達所獲得的量進行比較。
[0144] 通過PCR從枯草芽孢桿菌168染色體DNA擴增表1-1所示的啟動子并且通過轉錄 作用融合至靶分子（ER1UFNA或GFP)的基因中。BG8010或BG8000菌株利用包含啟動子、 目的基因和抗生素標記的表達盒進行轉化，然后在包含5 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上選 擇轉化株。BG8010或BG8000菌株還利用包含已融合至靶分子基因的aprE啟動子的構建體 進行轉化，然后在包含5 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上選擇轉化株。將攜帶具有枯草桿菌 蛋白酶啟動子的構建體的菌株在包含25 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上進行擴增，以增加 該表達盒的拷貝數(shù)，而攜帶核糖體啟動子的菌株則在包含5 μ g/ml氯霉素的平板上重新分 離。
[0145]

【權利要求】
1. 一種分離的核酸，所述核酸包含有效連接至編碼目的蛋白的核酸的枯草芽孢桿菌 (B. subtil is)核糖體啟動子。
2. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是核糖體RNA啟動子或核糖體蛋 白啟動子。
3. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是rrn核糖體RNA啟動子。
4. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是rrnB、rrnI或rrnE核糖體RNA 啟動子。
5. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是rrnl核糖體RNA啟動子。
6. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是rpsD或rpsj核糖體蛋白啟動 子。
7. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO: 1-6中任一者的 核苷酸序列、SEQ ID NO: 1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 1-6中任一 者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 1-6中任一者或其保 留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
8. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列 或其保留啟動子活性的子序列。
9. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO: 13-14中任一者 的核苷酸序列、SEQ ID NO: 13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 13-14 中任一者具有至少60 %同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 13-14中任一 者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
10. 根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸包含與SEQ ID NO: 13-14中任一 者具有至少60%、70%、80%、90%、93%、95%、97%或99%同源性的核酸。
11. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述目的蛋白選自激素、酶、 生長因子、報告基因和細胞因子。
12. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述目的蛋白為酶。
13. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述目的蛋白選自蛋白酶、纖 維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、 透性酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和 磷酸酶。
14. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述目的蛋白為蛋白酶。
15. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述蛋白酶為枯草桿菌蛋白 酶。
16. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的分離的核酸，其中所述蛋白酶由SEQ ID N0:9、 11、18或20編碼。
17. -種包含核酸的表達載體，所述核酸包含枯草芽孢桿菌核糖體啟動子。
18. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述表達載體包含核糖體RNA啟動子或核 糖體蛋白啟動子。
19. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子是rrnB、rrnI或rrnE核 糖體RNA啟動子。
20. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子是rrnl核糖體RNA啟動 子。
21. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子是rpsD或rpsj核糖體 蛋白啟動子。
22. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 1-6中任 一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 1-6 中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 1-6中任一者 或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
23. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO:3的核 苷酸序列或其保留啟動子活性的子序列。
24. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 13-14 中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 13-14中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 13-14中任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
25. 根據(jù)權利要求17所述的表達載體，其中所述核酸包含與SEQ ID NO: 13-14中任一 者具有至少60%、70%、80%、90%、93%、95%、97%或99%同源性的核酸。
26. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，還包含編碼目的蛋白的核酸，其中所 述核酸有效連接至所述核糖體RNA啟動子或蛋白啟動子。
27. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述目的蛋白是異源的。
28. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述目的蛋白選自激素、酶、生 長因子、報告基因和細胞因子。
29. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述目的蛋白是酶。
30. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述目的蛋白選自蛋白酶、纖維 素酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、透 性酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和磷 酸酶。
31. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述目的蛋白是蛋白酶。
32. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
33. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的表達載體，其中所述的蛋白酶由SEQ ID N0:9、 11、18或20編碼。
34. -種包含核酸的微生物，所述核酸包含枯草芽孢桿菌核糖體啟動子。
35. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子是核糖體RNA啟動子或核 糖體蛋白啟動子。
36. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子是rrnB、rrnl或rrnE核 糖體RNA啟動子。
37. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子是rrnl核糖體RNA啟動 子。
38. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 1-6中任 一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 1-6 中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 1-6中任一者 或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
39. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體RNA啟動子包含SEQ ID NO:3的 核苷酸序列或其保留啟動子活性的子序列。
40. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子是rpsD或rpsj核糖體蛋 白啟動子。
41. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 13-14 中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID N0:13-14中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 13-14中任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
42. 根據(jù)權利要求34所述的微生物，其中所述核糖體啟動子包含與SEQ IDN0:13-14中 任一者具有至少60%、70%、80%、90%、93%、95%、97%或99%同源性的核酸。
43. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，還包含編碼目的蛋白的核酸，其中所述 核酸有效連接至所述核糖體啟動子。
44. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述目的蛋白對于所述微生物是 異源的。
45. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述目的蛋白選自激素、酶、生長 因子、報告基因和細胞因子。
46. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述目的蛋白是酶。
47. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述目的蛋白選自蛋白酶、纖維素 酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、透性 酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和磷酸 酶。
48. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述目的蛋白是蛋白酶。
49. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
50. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述蛋白酶由SEQ ID N0:9、ll、18 或20編碼。
51. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述微生物是芽孢桿菌 (Bacillus)屬的成員。
52. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述微生物選自：枯草芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢 桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
53. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物，其中所述核酸整合到所述宿主細胞的 所述染色體中。
54. -種用于生產目的蛋白的方法，包括在適合所述微生物生產所述蛋白的條件下培 養(yǎng)根據(jù)前述權利要求中任一項所述的微生物。
55. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，還包括回收所述目的蛋白。
56. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rrnB、rrnl或 rrnE核糖體RNA啟動子。
57. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rrnl核糖體 RNA啟動子。
58. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 1-6中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與 SEQ ID NO: 1-6中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 1-6中任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
59. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體RNA啟動子包含SEQ ID N0:3的核苷酸序列或其保留啟動子活性的子序列。
60. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rpsD或rpsj核 糖體蛋白啟動子。
61. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 13-14中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、 與SEQ ID NO: 13-14中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 13-14中任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
62. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含與SEQ ID 勵：13-14中任一者具有至少60%、70%、80%、90%、93%、95%、97%或99%同源性的核 酸。
63. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白對于所述微生物是異 源的。
64. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物是芽孢桿菌屬的成員。
65. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物選自：枯草芽孢桿菌、地 衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿 菌、凝結芽孢桿菌（B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
66. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核酸整合到所述宿主細胞的所 述染色體中。
67. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白選自激素、酶、生長因 子、報告基因和細胞因子。
68. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是酶。
69. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白選自蛋白酶、纖維素 酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、透性 酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和磷酸 酶。
70. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是蛋白酶。
71. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
72. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述蛋白酶由SEQ ID N0:9、ll、18或 20編碼。
73. -種無需擴增表達構建體即可生產目的蛋白的方法，包括使用根據(jù)前述權利要求 中任一項所述的核酸或載體來轉化微生物，其中所述核酸或載體作為單個整合體整合到所 述宿主細胞中，以及在適合所述微生物生產所述蛋白的條件下培養(yǎng)所述微生物。
74. 根據(jù)權利要求73所述的方法，還包括回收所述目的蛋白。
75. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rrnB、rrnl或rrnE 核糖體RNA啟動子。
76. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rrnl核糖體RNA啟 動子。
77. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 1-6 中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1-6中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 1-6中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 1-6中 任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
78. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 3的核 苷酸序列或其保留啟動子活性的子序列。
79. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子是rpsD或rpsj核糖體 蛋白啟動子。
80. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體啟動子包含SEQ ID NO: 13-14 中任一者的核苷酸序列、SEQ ID NO: 13-14中保留啟動子活性的任一者的子序列、與SEQ ID NO: 13-14中任一者具有至少60%同源性的核酸、或在中等嚴格性條件下與SEQ ID NO: 13-14中任一者或其保留啟動子活性的子序列雜交的核酸，或以上任一者的組合。
81. 根據(jù)權利要求73或74所述的方法，其中所述核糖體蛋白啟動子包含與SEQ ID 勵：13-14中任一者具有至少60%、70%、80%、90%、93%、95%、97%或99%同源性的核 酸。
82. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白對于所述微生物是異 源的。
83. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物是芽孢桿菌屬的一員。
84. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物選自：枯草芽孢桿菌、地 衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿 菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
85. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述核酸整合到所述宿主細胞的所 述染色體中。
86. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白選自激素、酶、生長因 子、報告基因和細胞因子。
87. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是酶。
88. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白選自蛋白酶、纖維素 酶、淀粉酶、木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、糖酶、水解酶、酯酶、氧化酶、透性 酶、支鏈淀粉酶、漆酶、脂肪酶、還原酶、異構酶、表異構酶、互變異構酶、轉移酶、激酶和磷酸 酶。
89. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述目的蛋白是蛋白酶。
90. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。
91. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述蛋白酶由SEQ ID N0:9、ll、18或 20編碼。
【文檔編號】C12N15/75GK104053780SQ201280059922
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2012年12月6日 優(yōu)先權日:2011年12月9日
【發(fā)明者】C·邦焦爾尼, B·P·?？怂? A·范齊蒙耐德 申請人:丹尼斯科美國公司