表達(dá)載體組織、新的生產(chǎn)用細(xì)胞產(chǎn)生方法及其在重組產(chǎn)生多肽中的用途
【專利摘要】本文報(bào)道表達(dá)載體，其包含-抗體輕鏈表達(dá)盒，-抗體重鏈表達(dá)盒和-選擇標(biāo)記表達(dá)盒，其中該表達(dá)盒單向排列，且其中該表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5’至3’順序排列。本文還報(bào)道用于產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的細(xì)胞的方法，和這些細(xì)胞用于重組產(chǎn)生抗體的用途。
【專利說明】表達(dá)載體組織、新的生產(chǎn)用細(xì)胞產(chǎn)生方法及其在重組產(chǎn)生 多肽中的用途
[0001] 本文報(bào)道新的表達(dá)載體組織，用于產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系的新方法，如新的轉(zhuǎn)染或選擇 方法，以及這些表達(dá)載體和生產(chǎn)細(xì)胞系在重組產(chǎn)生目的多肽中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 基因的轉(zhuǎn)錄水平可以對(duì)其表達(dá)水平具有強(qiáng)烈影響，并因此決定了細(xì)胞的生產(chǎn)力。 它主要受三種載體元件影響：啟動(dòng)子、P〇lyA信號(hào)序列和（如果存在）轉(zhuǎn)錄終止子。
[0003] 編碼抗體重鏈的核酸通常包含在蛋白質(zhì)成熟時(shí)去除的前導(dǎo)序列（信號(hào)序列） (約 57bp/19aa)、可變區(qū) VH(約 350bp/115aa)和恒定區(qū) CH(約 990bp/330aa)。編碼抗體 輕鏈的核酸通常由在蛋白質(zhì)成熟時(shí)去除的前導(dǎo)序列（約66bp/22aa)、可變區(qū)VK或VL(約 350bp/115aa)和恒定區(qū) CK 或 CL(約 321bp/107aa)組成。
[0004] 在真核細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體涉及產(chǎn)生表達(dá)系統(tǒng)（見McCafferty，J.等，（編輯）， Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL Press (1997))。為了發(fā)展抗體表達(dá)系 統(tǒng)，產(chǎn)生包含輕鏈編碼核酸的表達(dá)盒，該輕鏈編碼核酸側(cè)翼是啟動(dòng)子和多腺苷酸化（P〇lyA) 區(qū)。同樣，產(chǎn)生包含重鏈編碼核酸的重鏈表達(dá)盒，該重鏈編碼核酸側(cè)翼是啟動(dòng)子和P〇lyA 區(qū)?？梢栽诎劓満洼p鏈表達(dá)盒二者的單個(gè)載體中將重鏈表達(dá)盒組合入輕鏈表達(dá)盒，或 者可以整合入兩個(gè)分開的載體。
[0005] US7, 053, 202中報(bào)道了免疫球蛋白DNA盒分子、單體（monobody)構(gòu)建體、產(chǎn)生方法 及其使用方法。在US5, 168, 062中，報(bào)道了含有人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子調(diào)節(jié)DNA序 列的轉(zhuǎn)移栽體和微生物。US5, 225, 348中報(bào)道了含有人多肽鏈延伸因子-la的啟動(dòng)子區(qū)的 DNA片段、其堿基序列及含有高度適用于具有高表達(dá)能力的廣范圍宿主細(xì)胞的DNA片段的 表達(dá)質(zhì)粒。在US5, 266, 491中，報(bào)道了含有SV40復(fù)制起點(diǎn)及具有人多肽鏈延伸因子-1 α基 因的啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的表達(dá)質(zhì)粒。US5, 122, 458中報(bào)道了重組DNA化合物和諸如tPA 的多肽的表達(dá)。在US7, 422, 874中，報(bào)道了用于動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體。
[0006] Kim，D.等報(bào)道了通過操作轉(zhuǎn)錄終止區(qū)改進(jìn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) (Biotechnol. Prog. 19 (2003) 1620-1622)。Chappell，S.A.等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 (2000) 1536-1541報(bào)道了細(xì)胞mRNA的9-nt區(qū)段可以作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)（IRES)發(fā)揮作用，且在存在于連接的多拷貝中時(shí)極大地增強(qiáng)IRES活性。Corish， P.和Tyler-Smith，C.報(bào)道了減弱綠色熒光蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期（Prot. Eng. 12 (1999) 1035-1040)。Primig，M.等（Gene215 (1998) 181-189)報(bào)道 了設(shè)計(jì)用于在 轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離和分析增強(qiáng)子元件的新的GFPneo載體。Ng，S.K.等報(bào)道了 將不穩(wěn)定序列應(yīng)用于選擇標(biāo)記來改進(jìn)CH0-DG44細(xì)胞中的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)力（Metabol. Eng. 9(2007)304-316)。
[0007] Sanna Pietro, P.報(bào)道了抗體Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中的表達(dá)（Meth.Mol.Biol. 178(2002)389-395)。Higuchi，K.等（J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204)報(bào)道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗體的可變區(qū)的基因 克隆的細(xì)胞展示文庫。Kim，D.報(bào)道了通過操作轉(zhuǎn)錄終止區(qū)改進(jìn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系 統(tǒng)（Biotechnol.Progressl9 (2003) 1620-1622)。Costa，R.A.等（Eur.J.Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138)報(bào)道了用于單克隆抗體產(chǎn)生的細(xì)胞工程的指 導(dǎo)。Kim，D.W.等報(bào)道了用人延伸因子Ια啟動(dòng)子作為通用和有效的表達(dá)系統(tǒng) (Gene91 (1990)217-223)。Buchman，A.R.等（Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405)報(bào) 道了依賴內(nèi)含子和不依賴內(nèi)含子的基因表達(dá)的比較。Wang，F(xiàn).等報(bào)道了哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中的抗體表達(dá)（在 Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic, Wiley(2009)557-572 頁中）。Li 等（J.Immunol.Meth.318(2007) 113-124)報(bào)道了 用于重組IgG抗體的哺乳動(dòng)物表達(dá)的不同載體設(shè)計(jì)的比較性研究。Ho, S.C.L.等 報(bào)道了用于增強(qiáng)高單克隆抗體表達(dá)CH0細(xì)胞系的產(chǎn)生的IRES介導(dǎo)的三順反子載體 (J.Biotechnol. 157 (2011) 130-139)。Hotta，A.等（J.Biosci.Bioeng. 98 (2004) 298-303) 報(bào)道了通過重組動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生抗-⑶2嵌合抗體。Lee，J-C.等報(bào)道了腸道病毒71內(nèi)部 內(nèi)糖體進(jìn)入位點(diǎn)介導(dǎo)的高效蛋白質(zhì)表達(dá)（Biotechnol.Bioeng. 90 (2005)656-662)。在 TO2008/142124中，報(bào)道了 Avian EBX?細(xì)胞中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于抗體的重組產(chǎn)生，與相反的順序（LC_HC(5' -3'））相比，重鏈表達(dá)盒 放置在輕鏈表達(dá)盒前面（HC-LC(5'-3'））提供更好的表達(dá)結(jié)果。此外，已發(fā)現(xiàn)，與第一抗體 鏈前面的雙向位置（SM(3' -5'）-HC-LC(5' -3'））相比，選擇標(biāo)記放置在兩個(gè)抗體鏈表達(dá)盒 后面提供更好的表達(dá)結(jié)果（HC-LC-SM(5' -3'））。
[0010] 已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，1)抗體重鏈、2)抗體輕鏈和3)選擇標(biāo)記的成行排列是最 佳的。雖然hEFla啟動(dòng)子在穩(wěn)定庫中明顯優(yōu)于hCMV啟動(dòng)子，但我們已看見對(duì)單克隆水平 的明顯相反的作用。在此，人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子（hCMV)產(chǎn)生了具有最高 的生產(chǎn)力克隆。此外，其性能可以進(jìn)一步通過將它與bGH polyA信號(hào)和人胃泌素基因（hGT) 的終止子序列組合來改善，其提高生產(chǎn)力和表達(dá)穩(wěn)定性二者。
[0011] 已發(fā)現(xiàn)，如果1)啟動(dòng)子是人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（hCMV)，polyA彳目號(hào)序列是牛生長 激素 polyA信號(hào)序列（bGH polyA)，且終止子序列是人胃泌素基因轉(zhuǎn)錄終止子序列（hGT)， 或2)啟動(dòng)子是人延伸因子1 α啟動(dòng)子（EF1 α )，p〇lyA信號(hào)序列是牛生長激素 polyA信號(hào) 序列（bGH polyA)，且終止子序列缺乏，則包含各含有啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和polyA信號(hào)序列 及可選的終止子序列的抗體重鏈表達(dá)盒和抗體輕鏈表達(dá)盒的表達(dá)載體的使用導(dǎo)致轉(zhuǎn)染后 更高數(shù)目的產(chǎn)生/分泌抗體的細(xì)胞克隆。
[0012] 通過使用上述表達(dá)載體，可以在轉(zhuǎn)染后獲得更高數(shù)目的產(chǎn)生/分泌抗體的細(xì)胞， 從而減少了鑒定適合用于大規(guī)模重組抗體產(chǎn)生的高產(chǎn)細(xì)胞所需的努力。
[0013] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是表達(dá)載體，其包含：
[0014] -抗體輕鏈表達(dá)盒，
[0015] -抗體重鏈表達(dá)盒，和
[0016] -選擇標(biāo)記表達(dá)盒，
[0017] 其中該表達(dá)盒單向排列，和
[0018] 其中該表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至3' 順序排列。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo) 記表達(dá)盒相互獨(dú)立地包含選自人延伸因子1 α啟動(dòng)子、人CMV啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子的啟動(dòng) 子。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含人延伸因子1 α啟動(dòng)子。在 一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo)記盒相互獨(dú) 立地包含人延伸因子Ια啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)盒不包含終止子序列，即該表 達(dá)盒不含終止子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該終止子序列是人胃泌素基因轉(zhuǎn)錄終止子序列 (hGT)。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含人CMV啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施 方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地包含 人CMV啟動(dòng)子。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含牛生長激素 polyA信號(hào)序 列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo)記盒 相互獨(dú)立地包含牛生長激素 polyA信號(hào)序列。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo) 記盒相互獨(dú)立地包含選自牛生長激素 polyA信號(hào)序列和SV40polyA信號(hào)序列的polyA信號(hào) 序列。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒在該polyA信號(hào)序列后面包含 人胃泌素終止子序列，條件是該表達(dá)盒不包含人延伸因子Ια啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地在該polyA信 號(hào)序列后面包含人胃泌素終止子序列。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒和/或該抗體重鏈表達(dá)盒和/或該選擇標(biāo) 記盒相互獨(dú)立地按5'至3'方向包含牛生長激素 polyA信號(hào)序列和人胃泌素終止子序列， 條件是該表達(dá)盒不包含人延伸因子Ια啟動(dòng)子。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒的啟動(dòng)子包含內(nèi)含子Α。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含SV40polyA信號(hào)序列。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含SV40啟動(dòng)子。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該編碼抗體輕鏈的核酸和/或該編碼抗體重鏈的核酸包含至 少一個(gè)內(nèi)含子。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該編碼抗體輕鏈的核酸和/或該編碼抗體重鏈的核酸是 cDNA。
[0031] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在重組產(chǎn)生抗體中的用途。
[0032] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途。
[0033] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途。
[0034] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途，所述表 達(dá)載體包含至少一個(gè)含有人延伸因子Ια啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0035] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途，所述表 達(dá)載體包含至少一個(gè)含有人延伸因子Ια啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0036] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在重組產(chǎn)生抗體中的用途，所述表達(dá) 載體包含至少一個(gè)含有人延伸因子Ια啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0037] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途，所述表 達(dá)載體包含至少一個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0038] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途，所述表 達(dá)載體包含至少一個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0039] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的表達(dá)載體在產(chǎn)生抗體中的用途，所述表達(dá)載體 包含至少一個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
[0040] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，其特征在于轉(zhuǎn)染之前， 通過在原核復(fù)制起點(diǎn)中切割來線性化表達(dá)載體。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，原核復(fù)制起點(diǎn)在一個(gè)抗體輕鏈表達(dá)盒和一個(gè)抗體重鏈表達(dá)盒 之間。
[0042] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的方法在產(chǎn)生用于重組生產(chǎn)抗體的真核細(xì)胞中 的用途。
[0043] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是選擇包含抗體編碼核酸的真核細(xì)胞的方法，其特征在于在 第一次轉(zhuǎn)染約24小時(shí)后向培養(yǎng)基中加入選擇劑。
[0044] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的方法在產(chǎn)生用于重組生產(chǎn)抗體的真核細(xì)胞中 的用途。
[0045] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是本文報(bào)道的方法選擇的細(xì)胞在產(chǎn)生用于重組生產(chǎn)抗體中 的用途。
[0046] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟：
[0047] -培養(yǎng)包含本文報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒的真核細(xì)胞，和 [0048]-從該真核細(xì)胞或培養(yǎng)基回收該抗體。
[0049] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟：
[0050] -培養(yǎng)真核細(xì)胞，所述真核細(xì)胞通過用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染獲得，所述表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染之 前，通過在原核復(fù)制起點(diǎn)中切割已線性化，和
[0051] -從該真核細(xì)胞或培養(yǎng)基回收該抗體。
[0052] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟：
[0053] -培養(yǎng)真核細(xì)胞，所述真核細(xì)胞通過在轉(zhuǎn)染約24小時(shí)后向培養(yǎng)基中加入選擇劑選 擇出來，和
[0054] -從該真核細(xì)胞或培養(yǎng)基回收該抗體。
[0055] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，所述真核細(xì)胞具有包含 原核核酸序列和真核核酸序列的表達(dá)載體，其特征在于在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞之前， 從該表達(dá)載體除去所述原核核酸序列。
[0056] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是不包含原核核酸序列的線性化表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的 用途。
[0057] 本文報(bào)道的一個(gè)方面是僅包含真核核酸序列的線性化表達(dá)載體在產(chǎn)生用于重組 生產(chǎn)抗體的真核細(xì)胞中的用途。
[0058] 在本文報(bào)道的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是雙特異性抗體。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性抗體具有特異性結(jié)合第一抗原或抗原上的第一表 位的第一結(jié)合特異性或結(jié)合部位，且該雙特異性抗體具有特異性結(jié)合第二抗原或抗原上的 第二表位的第二結(jié)合特異性或結(jié)合部位。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含：
[0061] -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第一表達(dá)盒，
[0062] -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第二表達(dá)盒，
[0063] -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第三表達(dá)盒，
[0064] -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第四表達(dá)盒，
[0065] 或
[0066]-按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第一表達(dá)盒，
[0067]-按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第二表達(dá)盒，和
[0068]-按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選 的終止子序列的第三表達(dá)盒，
[0069] 由此該抗體輕鏈?zhǔn)莾蓷l抗體重鏈的共同輕鏈。
[0070] 在本文報(bào)道的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含：
[0071] -抗體輕鏈表達(dá)盒，
[0072] -第一抗體重鏈表達(dá)盒，
[0073] -第二抗體重鏈表達(dá)盒，和
[0074] -選擇標(biāo)記表達(dá)盒，
[0075] 其中該抗體重鏈表達(dá)盒的至少一個(gè)、該抗體輕鏈表達(dá)盒和該選擇標(biāo)記表達(dá)盒單向 排列，且
[0076] 其中該單向表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至 3'順序排列。
[0077] 在本文報(bào)道的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包含：
[0078] -第一抗體輕鏈表達(dá)盒，
[0079] -第二抗體輕鏈表達(dá)盒，
[0080] -第一抗體重鏈表達(dá)盒，
[0081] -第二抗體重鏈表達(dá)盒，和
[0082] -選擇標(biāo)記表達(dá)盒，
[0083] 其中該抗體重鏈表達(dá)盒之一、該抗體輕鏈表達(dá)盒之一和該選擇標(biāo)記表達(dá)盒單向排 列，且
[0084] 其中該單向表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至 3'順序排列。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包含白突變的抗體重鏈。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包含杵突變的抗體重鏈。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體輕鏈表達(dá)盒之一編碼包含抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和作為 恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈，和/或該抗體輕鏈表達(dá)盒之一編碼包含抗 體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和作為恒定結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈CL結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包含抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CL) 作為第一恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈，和/或該抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包含抗體重鏈CH1結(jié) 構(gòu)域作為第一恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈。
[0089] 在一個(gè)實(shí)施方案中，hCMV啟動(dòng)子具有序列SEQ ID N0 :01。該hCMV啟動(dòng)子不舍內(nèi) 含子A和5' UTR。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施方案中，hCMV啟動(dòng)子具有序列SEQ ID N0 :02。該hCMV啟動(dòng)子不含內(nèi) 含子A和5' UTR。
[0091] 在一個(gè)實(shí)施方案中，hCMV啟動(dòng)子具有序列SEQ ID N0 :03。該全長hCMV啟動(dòng)子含 有內(nèi)含子A。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，人延生因子Ια具有序列SEQ ID N0:04。該hEFla啟動(dòng)子 不合內(nèi)含子A。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施方案中，人延生因子la具有序列SEQ ID NO :05。該hEFla啟動(dòng)子 含有內(nèi)含子A。
[0094] 在一個(gè)實(shí)施方案中，人延生因子1 a具有序列SEQ ID NO :06.該短hEFl a啟動(dòng)子 含有內(nèi)含子A和5' UTR。
[0095] 在一個(gè)實(shí)施方案中，大鼠 CMV啟動(dòng)子具有序列SEQ ID NO :07。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施方案中，SV40polyA信號(hào)序列具有序列SEQ ID N0 :08。
[0097] 在一個(gè)實(shí)施方案中，牛生長激素 polyA信號(hào)序列具有序列SEQ ID NO :09。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方案中，人胃泌素轉(zhuǎn)錄終止子具有序列SEQ ID NO :10。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方案中，SV40啟動(dòng)子具有序列SEQ ID NO :11。
[0100] 在一個(gè)實(shí)施方案中，鳥氨酸脫羧酶的TOST序列由序列SEQ ID NO :12編碼。
[0101] 在一個(gè)實(shí)施方案中，GF序列由序列SEQ ID NO :13編碼。
[0102] 在一個(gè)實(shí)施方案中，新霉素選擇標(biāo)記具有序列SEQ ID NO :14。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，GFP-PEST-NE0融合多肽由序列SEQ ID NO :15編碼。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施方案中，EMCV-IRES具有序列SEQ ID NO :16。
[0105] 在一個(gè)實(shí)施方案中，EV71-IRES具有序列SEQ ID NO :17。
[0106] 發(fā)明詳述
[0107] I. -般方面
[0108] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，重組DNA技術(shù)的使用使得能夠產(chǎn)生核酸和/或多肽的許 多衍生物。這類衍生物可以例如通過取代、改變、交換、缺失或插入來在單個(gè)或幾個(gè)位置中 修飾。該修飾或衍生化可以例如借助位點(diǎn)定向誘變來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地進(jìn) 行這類修飾（見例如 Sambrook，J.等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA(1999))。重組技術(shù)的使用使得本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠用一種或多種異源核酸轉(zhuǎn)化多種宿主細(xì)胞。雖然不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯（即表 達(dá)）機(jī)器使用相同的元件，但除了別的之外，隸屬于不同物種的細(xì)胞可以具有不同的所謂 密碼子選擇。由此相同的多肽（就氨基酸序列而言）可以由一種或多種不同的核酸編碼。 另外，由于遺傳密碼的簡并性，不同的核酸可以編碼相同的多肽。
[0109] 重組DNA技術(shù)的使用使得能夠產(chǎn)生核酸和/或多肽的許多衍生物。這類衍生物 可以例如通過取代、改變、交換、缺失或插入來在單個(gè)或幾個(gè)位置中修飾。該修飾或衍生 化可以例如借助位點(diǎn)定向誘變來進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行這類修飾（見例 如 Sambrook, J.等，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA(1999) ；Hames, B. D.和 Higgins, S. J. , Nucleic acid hybridization-a practical approach, IRL Press, Oxford, England(1985)) 〇 [oho] 重組技術(shù)的使用使得能夠用一種或多種異源核酸轉(zhuǎn)化多種宿主細(xì)胞。雖然不同細(xì) 胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯（即表達(dá)）機(jī)器使用相同的元件，但除了別的之外，隸屬于不同物種的細(xì)胞 可以具有不同的所謂密碼子選擇。由此相同的多肽（就氨基酸序列而言）可以由一種或多 種不同的核酸編碼。另外，由于遺傳密碼的簡并性，不同的核酸可以編碼相同的多肽。
[0111] 定義
[0112] "親和力成熟的"抗體指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)（HVR)中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗 體，與不具有這類改變的親本抗體相比，這類改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力的改善。
[0113] 本文的術(shù)語"抗體"以最廣泛的含義使用，且涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單 克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們顯示希 望的抗原結(jié)合活性。
[0114] "抗體片段"指完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的部分，該部分結(jié)合該完整 抗體所結(jié)合的抗原?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'_SH、F(ab' )2;雙 抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);及從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0115] 術(shù)語"嵌合"抗體指這樣的抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物 種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分衍生自不同來源或物種。
[0116] 抗體的"種類"指它的重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五個(gè)主要 種類的抗體 ：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類（同種型），例 如IgGp IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別 稱為α、δ、ε、γ和μ。
[0117] 本文所用的術(shù)語"表達(dá)"指發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯過程?？梢愿鶕?jù)存在于 細(xì)胞中的相應(yīng)mRNA的量來測(cè)定目的核酸序列在該細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。例如，從目的序列轉(zhuǎn) 錄的mRNA可以通過RT-PCR或通過Northern雜交來定量（見Sambrook等，1999,上文）。目 的核酸編碼的多肽可以通過多種方法來定量，例如通過ELISA，通過測(cè)定該多肽的生物學(xué)活 性，或通過利用獨(dú)立于這種活性的測(cè)定，如使用識(shí)別并結(jié)合該多肽的免疫球蛋白的Western 印跡或放射免疫測(cè)定（見Sambrook等，1999,上文）。
[0118] "表達(dá)盒"指包含在細(xì)胞中表達(dá)至少所含的核酸所必需的諸如啟動(dòng)子和聚腺苷酸 化位點(diǎn)的調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體。
[0119] "表達(dá)載體"是提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)所包含的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因所需的全部 元件的核酸。通常，表達(dá)質(zhì)粒包含：例如用于大腸桿菌（E. coli)的原核質(zhì)粒繁殖單位，其包 含復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記；真核選擇標(biāo)記；及用于表達(dá)一個(gè)或多個(gè)目的結(jié)構(gòu)基因的一個(gè)或多 個(gè)表達(dá)盒，其各包含啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和包括聚腺苷酸化信號(hào)的轉(zhuǎn)錄終止子。通常將基因表 達(dá)置于啟動(dòng)子的控制下，并將這種結(jié)構(gòu)基因稱為與該啟動(dòng)子"有效連接''。類似地，如果調(diào) 節(jié)元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，則該調(diào)節(jié)元件和該核心啟動(dòng)子有效連接。
[0120] 本文的術(shù)語"Fc區(qū)"用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域，其包含至少部分恒定 區(qū)。該術(shù)語包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226 或從Pr 〇230延伸至重鏈的羧基端。但是，F(xiàn)c區(qū)的C端賴氨酸（Lys447)可以存在或不存在。 除非本文另有說明，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號(hào)按照Kabat，E. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991), NIH Publication91_3242 中所述的 EU 編號(hào) 系統(tǒng)，也稱為EU指數(shù)。
[0121] "Fc區(qū)"是眾所周知的術(shù)語，根據(jù)抗體重鏈的木瓜蛋白酶切割定義。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本文報(bào)道的復(fù)合物可以包含人Fc區(qū)或衍生自人來源的Fc區(qū)作為抗體重鏈鉸鏈區(qū) 多肽。在另一實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是IgG4亞類的人抗體的Fc區(qū)，或IgGl、IgG2或IgG3 亞類的人抗體的Fc區(qū)，其以這樣的方式修飾，使得沒有Fcy受體（例如FcyRIIIa)結(jié)合 和/或沒有Clq結(jié)合可被檢測(cè)到。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是人Fc區(qū)，且尤其是來 自人IgG4亞類或來自人IgGl亞類的突變Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該Fc區(qū)來自具有 突變L234A和L235A的人IgGl亞類。IgG4顯示減少的Fcy受體（FcyRIIIa)結(jié)合，但 其他IgG亞類的抗體顯示強(qiáng)結(jié)合。但是，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖類的喪 失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gin311、 Asn434或/和His435是在改變時(shí)也提供減少的Fey受體結(jié)合的殘基（Shields，R. L.等， J.Biol.Chem. 276(2001)6591-6604 ;Lund，J.等，F(xiàn)ASEB J.9(1995) 115-119;Morgan，A.等， Immunology86 (1995) 319-324 ;EP0307434)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文報(bào)道的一個(gè)方面中待 表達(dá)的抗體是關(guān)于IgG4亞類或IgGl或IgG2亞類的Fey受體結(jié)合，在L234、L235和/或 D265中具有突變，和/或包含PVA236突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，該突變是S228P、L234A、 L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236表示用PVA取代IgGl的從氨基酸位置233至236的 氨基酸序列ELLG(以單字母氨基酸密碼給出）或IgG4的EFLG)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該突 變是IgG4的S228P及IgGl的L234A和L235A?？贵w的Fc區(qū)直接涉及ADCC (依賴抗體的細(xì) 胞毒性）和CDC(依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性）。不結(jié)合Fc γ受體和/或補(bǔ)體因子Clq的復(fù)合物 不引出抗體依賴性細(xì)胞毒作用（ADCC)和/或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性（CDC)。杵修飾表示抗 體CH3結(jié)構(gòu)域中的突變T366W (Kabat編號(hào)）。臼修飾表示抗體CH3結(jié)構(gòu)域中的突變T366S、 L368A和Y407V。除杵和臼修飾外，一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中可以存在突變S354C，另一個(gè)CH3結(jié)構(gòu) 域中可以存在突變Y349C。
[0122] "構(gòu)架區(qū)"或"FR"指高變區(qū)（HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。可變結(jié)構(gòu)域的FR 一般由四個(gè)FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下順序出 現(xiàn)在 VH (或 VL)中：FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。
[0123] 術(shù)語"全長抗體"、"完整抗體"和"全抗體"在本文中可互換使用，指具有基本上類 似于天然抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)或具有包含本文定義的Fc區(qū)的重鏈的抗體。
[0124] "基因"表示核酸，其是例如染色體上或質(zhì)粒上可以影響肽、多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá) 的區(qū)段。除編碼區(qū)（即結(jié)構(gòu)基因）外，基因包含其他功能性元件來例如信號(hào)序列、一個(gè)或多 個(gè)啟動(dòng)子、內(nèi)含子和/或終止子。
[0125] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"、"宿主細(xì)胞系"和"宿主細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用，指已將外源核 酸引入其中的細(xì)胞，包括這類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"，其包括 最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及從其衍生的后代，而不考慮傳代數(shù)。后代的核酸含量可以并非與親本細(xì) 胞完全相同，但可以包含突變。本文包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的功能或 生物學(xué)活性相同的功能和生物學(xué)活性的突變體后代。
[0126] "人抗體"是具有對(duì)應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生或衍生自利用人抗體庫或其他人抗體 編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除了包含非人抗 原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0127] "人源化"抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌 合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少一個(gè)且通常為兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本 上全部，其中全部或基本上全部HVR (例如CDR)對(duì)應(yīng)于非人抗體的那些，全部或基本上全部 FR對(duì)應(yīng)于人抗體的那些。人源化抗體可以可選地包含衍生自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一 部分。抗體（例如非人抗體）的"人源化形式"指已進(jìn)行了人源化的抗體。
[0128] 本文所用的術(shù)語"高變區(qū)"或"HVR"指抗體可變結(jié)構(gòu)域的在序列上高變和/或形成 結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)（"高變環(huán)"）的區(qū)域中的每一個(gè)。通常，天然四鏈抗體包含六個(gè)HVR ;三個(gè)在 ￥!1中〇11、!12、!13)，三個(gè)在￥1^中仏1、1^2、1^3)。爪^一般包含來自高變環(huán)和/或來自"互補(bǔ)決定 區(qū)"(CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高序列變異性和/或涉及抗原識(shí)別。示例性高變環(huán)存 在于氨基酸殘基 26-32 (LI)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (HI)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia，C.和 Lesk，A.M.，J. Mol. Biol. 196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、 ⑶R-L3、⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3)存在于LI的氨基酸殘基24-34、L2的氨基酸殘基50-56、 L3的氨基酸殘基89-97、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-65和H3的氨基酸 殘基 95-102 (Kabat, Ε· A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91-3242)。除VH中的CDR1外，CDR -般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還 包含"特異性決定殘基"或"SDR"，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在⑶R的稱為縮短的⑶R 或 a-CDR 的區(qū)域內(nèi)。示例性 a-CDR (a-CDR-L 1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-HI、a-CDR-H2 和 a-CDR-H3)存在于LI的氨基酸殘基31-34、L2的氨基酸殘基50-55、L3的氨基酸殘基89-96、 HI的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-58和H3的氨基酸殘基95-102 (Almagro， J.C.和 Fransson，J.，F(xiàn)ront. Biosci. 13(2008) 1619-1633)。除非另有說明，本文按照 Kabat 等，上文編號(hào)可變結(jié)構(gòu)域中的HVR殘基和其他殘基（例如FR殘基）。
[0129] "內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)"或"IRES"描述這樣的序列，其在功能上促進(jìn)獨(dú)立于 IRES的基因5'的翻譯起始，并允許在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)從單個(gè)轉(zhuǎn)錄物翻譯兩個(gè)順反子（可讀 框）。IRES提供獨(dú)立的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)用于翻譯剛好處于其下游（下游在本文中可與 3'互換使用）的可讀框。不像細(xì)菌mRNA(其可以是多順反子，即編碼從mRNA順次翻譯 的幾種不同多肽），動(dòng)物細(xì)胞的大多數(shù)mRNA是單順反子，僅編碼一種蛋白質(zhì)的合成。對(duì) 于真核細(xì)胞中的多順反子轉(zhuǎn)錄物，翻譯將從最靠近5'的翻譯起始位點(diǎn)起始，在第一終止 密碼子處終止，轉(zhuǎn)錄物將從核糖體釋放，導(dǎo)致僅翻譯mRNA中的第一編碼多肽。在真核細(xì) 胞中，具有與轉(zhuǎn)錄物中的第二或后續(xù)可讀框有效連接的IRES的多順反子轉(zhuǎn)錄物允許連順 次翻譯該下游可讀框來產(chǎn)生由同一轉(zhuǎn)錄物編碼的兩種或多種多肽。之前已描述了 IRES 元件在載體構(gòu)建中的用途，見例如Pelletier, J.等，Nature334(1988)320-325 ;Jang， S. Κ·等，J. Virol. 63 (1989) 1651-1660 ;Davies，Μ· V.等，J. Virol. 66 (1992) 1924-1932 ; Adam，M. A.等，J. Virol. 65(1991)4985-4990 ;Morgan，R. A.等 Nucl. Acids Res.20(1992)1293-1299 ;Sugimoto, Y 等，Biotechnologyl2(1994)694-698 ; Ramesh，N.等，Nucl. Acids Res. 24 (1996) 2697-2700;和 Mosser，D.D.等， BioTechniques22(1997) 150-152)。
[0130] 本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，即除了例如 包含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑期間出現(xiàn)的可能的變體抗體（這類變體通 常以較小的量存在）外，包含該群體的單種抗體相同和/或結(jié)合相同的表位。與通常包含 抗不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每種單克隆 抗體抗抗原上的單個(gè)決定簇。因此，修飾詞"單克隆"指抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的 特征，而不解釋為需要通過任意具體的方法來產(chǎn)生抗體。例如，待按照本發(fā)明使用的單克隆 抗體可以通過多種技術(shù)來制備，其包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬茵體展示法和利 用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文描述用于制備單克隆抗 體的這類方法和其他示例性方法。
[0131] 本文所用的"核酸"指由單核苷酸（也稱為堿基）a、c、g和t (或RNA中的u)組成 的聚合物分子，例如DNA、RNA或其修飾。此多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子 或合成的多核苷酸分子或一種或多種天然存在的多核苷酸分子與一種或多種合成的多核 苷酸分子的組合。此定義還涵蓋其中改變（例如通過誘變）、缺失或加入了一個(gè)或多個(gè)核苷 酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分離的，或整合入另一核酸（例如表達(dá)盒）、質(zhì) ?；蛩拗骷?xì)胞的染色體中。核酸同樣表征為其由單核苷酸組成的核酸序列。
[0132] 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，將例如多肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為編碼此氨基酸序列的相 應(yīng)核酸序列的流程和方法眾所周知。因此，核酸表征為其由單核苷酸組成的核酸序列，并同 樣表征為由此編碼的多肽的氨基酸序列。
[0133] 本文所用的"核酸"也指編碼可以重組產(chǎn)生的多肽的天然存在或部分或完全非天 然存在的核酸。核酸可以由分離的或通過化學(xué)手段合成的DNA片段建成。核酸可以整合入 另一核酸，例如表達(dá)質(zhì)?；蛘婧怂拗骷?xì)胞的基因組/染色體中。質(zhì)粒包括穿梭質(zhì)粒和表達(dá) 質(zhì)粒。通常，該質(zhì)粒還將包含原核繁殖單位，該原核繁殖單位含有原核生物中的質(zhì)粒的分別 用于復(fù)制和選擇的復(fù)制起點(diǎn)（例如ColEl復(fù)制起點(diǎn)）和選擇標(biāo)記（例如氨芐青霉素或四環(huán) 素抗性基因）。
[0134] "有效連接的"指兩種或多種成分的并列，其中所述成分處于允許它們以其預(yù)期方 式發(fā)揮作用的關(guān)系中。例如，如果啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子順式作用來控制或調(diào)節(jié)所連接的序 列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列有效連接。通常，但并非必然，"有效連接的"DNA序列是相鄰的， 且在有必要連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)（如分泌前導(dǎo)序列和多肽）時(shí)是相鄰和符合（可讀）框 的。但是，雖然有效連接的啟動(dòng)子通常位于編碼序列的上游，但它冰粉必然與該編碼序列相 鄰。增強(qiáng)子無需是相鄰的。如果增強(qiáng)子增加編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該增強(qiáng)子與該編碼序列有 效連接。有效連接的增強(qiáng)子可以位于編碼序列上游、編碼序列內(nèi)或編碼序列下游，且距啟動(dòng) 子相當(dāng)?shù)木嚯x。如果聚腺苷酸化位點(diǎn)位于編碼序列的下游端，使得轉(zhuǎn)錄通過該編碼序列進(jìn) 入該聚腺苷酸化序列，則它與該編碼序列有效連接。如果翻譯終止密碼子位于編碼序列的 下游端（3'端），使得翻譯通過該編碼序列行進(jìn)至該終止密碼子并在此處終止，則它與該外 顯子核酸序列有效連接。通過本領(lǐng)域已知重組方法來實(shí)現(xiàn)連接，例如，使用PCR方法和/或 通過方便的限制位點(diǎn)處的連接。如果不存在方便的限制位點(diǎn)，則按照常規(guī)實(shí)施使用合成的 寡核苷酸銜接子或接頭。
[0135] "多順反子轉(zhuǎn)錄單位"是其中一個(gè)以上的結(jié)構(gòu)基因處于同一啟動(dòng)子的控制下的轉(zhuǎn) 錄單位。
[0136] 本申請(qǐng)內(nèi)所用的術(shù)語"聚腺苷酸化信號(hào)（polyA信號(hào)）"指用來誘導(dǎo)特定核酸序列 區(qū)段的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信號(hào)的3'非翻譯區(qū) 可以選自含有衍生自SV40、牛生長激素（bGH)基因、免疫球蛋白基因和胸苷激酶基因（tk， 例如單純皰疹病毒胸苷激酶聚腺苷酸化信號(hào)）的聚腺苷酸化信號(hào)的3'非翻譯區(qū)。
[0137] "啟動(dòng)子"指控制與它有效連接的基因/結(jié)構(gòu)基因或核酸序列的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序 列。啟動(dòng)子包含用于RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)。所使用的啟動(dòng)子將在考慮在其中 表達(dá)所選擇的序列的宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中具有功能。包括來自多種不同來源的組成型、 誘導(dǎo)型和阻抑型啟動(dòng)子的大量啟動(dòng)子為本領(lǐng)域公知（并在諸如GenBank的數(shù)據(jù)庫中標(biāo)識(shí)）， 且可作為克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸內(nèi)獲得（例如從諸如ATCC的保藏機(jī)構(gòu)以及 其他商業(yè)或個(gè)人來源）。
[0138] "啟動(dòng)子"包含指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子定位在基因的5' 非編碼或非翻譯區(qū)中，靠近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。啟動(dòng)子內(nèi)在起始轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用的 序列元件常表征為共有核苷酸序列。這些啟動(dòng)子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、TATA序 列、CAAT 序列、分化特異性元件（DSE;McGehee，R.E.等，Mol. Endocrinol. 7(1993)551)、 環(huán) AMP 應(yīng)答兀件（CREs)、血清應(yīng)答兀件（SRE ;Treisman，R. , Seminars in Cancer Biol. 1(1990)47)、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件（GRE)及其他諸如CRE/ATF(o' Reilly，M. A.等， J. Biol. Chem. 267(1992) 19938)、AP2(Ye，J.等，J. Biol. Chem. 269(1994)25728)、SPl、cAMP 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB;Loeken，M.R·，Gene Expr.3(1993)253)和八核苷酸因子（一 般見 Watson 等，（編輯），Molecular Biology of the Gene，第 4版（The Benj amin/ Cummings Publishing Company,Inc. (1987))及Lemaigre,F. P.和 Rousseau,GG,Biochem. J. 303(1994) 1-14)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng) 誘導(dǎo)劑而提高。相反，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)。還已知阻 抑型啟動(dòng)子。例如，c-fos啟動(dòng)子在生長激素結(jié)合其在細(xì)胞表面上的受體時(shí)特異性激活?？?以通過由例如CMV啟動(dòng)子及隨后的兩個(gè)Tet操縱基因位點(diǎn)組成的人工雜合啟動(dòng)子來達(dá)到受 四環(huán)素（tet)調(diào)節(jié)的表達(dá)。Tet阻抑物與兩個(gè)Tet操縱基因位點(diǎn)結(jié)合，并阻斷轉(zhuǎn)錄。加入誘 導(dǎo)物四環(huán)素時(shí)，Tet阻抑物從Tet操縱基因位點(diǎn)釋放，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)（Gossen，M.和Bujard，H., PNAS89 (1992) 5547-5551)。對(duì)于包括金屬硫蛋白和熱休克啟動(dòng)子的其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，見 例如 Sambrook 等（上文）和 Gossen 等，Curr. Opin. Biotech. 5 (1"4) 516_52〇。在已鑒定為 用于高水平表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子的真核啟動(dòng)子有SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、小 鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列、中國倉鼠延伸因子1 a (CHEF-1， 見例如US5, 888, 809)、人EF-1 α、泛素和人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子（CMV IE)。
[0139] "啟動(dòng)子"可以是組成型或誘導(dǎo)型。增強(qiáng)子（即作用于啟動(dòng)子來增加轉(zhuǎn)錄的順式 作用DNA元件）可以有必要與啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮作用來提高單獨(dú)用啟動(dòng)子所獲得的表達(dá)水 平，且可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件包括。通常，含有啟動(dòng)子的多核苷酸區(qū)段也將包括增強(qiáng)子序列 (例如 CMV 或 SV40)。
[0140] 本申請(qǐng)內(nèi)所用的術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"或"穩(wěn)定的"指外源核酸可遺 傳地和穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組/染色體。在選擇性生長條件下（即在一種或多種選 擇標(biāo)記的存在下）細(xì)胞選擇過程之后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0141] "結(jié)構(gòu)基因"指不舍信號(hào)序列的基因區(qū)域，即編碼區(qū)。
[0142] 術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止子"指向RNA聚合酶發(fā)出終止mRNA合成的信號(hào)的長度為50-750個(gè) 堿基對(duì)的DNA序列。尤其是在使用強(qiáng)啟動(dòng)子時(shí)，在表達(dá)盒的3'端用非常有效（強(qiáng)）的終止 子來防止RNA聚合酶通讀是明智的。無效的轉(zhuǎn)錄終止子可以導(dǎo)致操縱子樣mRNA的形成，其 可以是不希望的（例如質(zhì)粒編碼的）基因表達(dá)的原因。
[0143] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以用基本上本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染方法中的任一種來獲得轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞。例如，可以借助電穿孔或顯微注射來將核酸引入細(xì)胞。備選地，可以使用諸如 FuGENE6(Roche Diagnostics GmbH，德國）、X_tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH，德國） 和LipofectAmine(Invitrogen Corp·，美國）的脂轉(zhuǎn)染試劑。還備選地，可以通過基于反轉(zhuǎn) 錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒的適當(dāng)?shù)牟《据d體系統(tǒng)來將核酸引入細(xì)胞（Singer， 0·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101 (2004) 5313-5314)。
[0144] 本申請(qǐng)內(nèi)所用的術(shù)語"瞬時(shí)轉(zhuǎn)染"指其中引入細(xì)胞的核酸不整合入該細(xì)胞的基因 組或染色體DNA的方法。它實(shí)際上作為染色體外元件（例如作為附加體）維持在細(xì)胞中。 附加體的核酸的轉(zhuǎn)錄過程不受影響，且例如產(chǎn)生由附加體的核酸編碼的蛋白質(zhì)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 產(chǎn)生"瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的"細(xì)胞。
[0145] 術(shù)語"可變區(qū)"或"可變結(jié)構(gòu)域"指抗體重鏈或輕鏈的涉及該抗體與抗原結(jié)合的結(jié) 構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域（分別為VH和VL)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每 個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守的構(gòu)架區(qū)（FR)和三個(gè)高變區(qū)（HVR)(見例如Kindt，T. J.等，Kuby Immunology，第 6版，W.H.Freeman and Co.，N.Y. (2007)，第 91 頁）。單個(gè)VH 或VL 結(jié)構(gòu)域 可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別用來自結(jié)合該抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域 篩選互補(bǔ)的VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫來分離結(jié)合特定抗原的抗體（見例如Portolano，S.等， J. Immunol. 150(1993)880-887 ;Clackson，T.等，Nature352 (1991) 624-628)。
[0146] 本文所用的術(shù)語"載體"指能夠繁殖與它連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包 括作為自主復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及摻入它所引入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些 載體能夠指導(dǎo)與它們有效連接的核酸的表達(dá)。這類載體在本文中稱為"表達(dá)載體"。
[0147] 抗體
[0148] 本文提供的方法和組合物用于產(chǎn)生重組單克隆抗體?？贵w可以具有多種結(jié)構(gòu)，如 但不限于單特異性抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、抗體片段、單價(jià)抗體、多價(jià)抗 體（例如二價(jià)抗體）。
[0149] 在某些實(shí)施方案中，該抗體是抗體片段?？贵w片段包括但不限于Fab、Fab'、 Fab' -SH、F(ab'）2、Fv和scFv片段即下文所述的其他片段。某些抗體片段的綜述見 Hudson，P. J.等，Nat. Med. 9 (2003) 129-134。scFv 片段的綜述見例如 Plueckthun，A., In ：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 卷，Rosenburg 和 Moore (編輯）， Springer-Verlag，NewYork(1994)，第 269-315 頁；還見 W01993/16185、US5, 571, 894 和 US5, 587, 458。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基且具有增加的體內(nèi)半衰期的Fab和F (ab' ) 2片 段的討論見美國專利號(hào)US5, 869, 046。
[0150] 雙抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體片段，其可以是二價(jià)的或雙特異性的（見 例如EP0404097;TO1993/01161;Hudson，P·J·等，Nat·Med·9(2003) 129-134;和Holliger， P.等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 (1993) 6444-6448)。三抗體和四抗體還描述于 Hudson, Ρ· J.等，Nat. Med. 9 (2003) 129-134 中。
[0151] 單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的 全部或部分的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體（Domantis， Inc.，Waltham，ΜΑ ;見例如 US6, 248, 516B1)。
[0152] 可以通過包括但不限于本文所述的完整抗體的蛋白酶解消化以及通過重組宿主 細(xì)胞（例如大腸桿菌或噬茵體）產(chǎn)生的多種技術(shù)來制備抗體片段。
[0153] 在某些實(shí)施方案中，該抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體描述于例如US4, 816, 567 ; 和 Morrison，S. L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 (1984) 6851-6855 中。在一個(gè)實(shí)例中，嵌 合抗體包含非人可變區(qū)（例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人靈長類（如猴）的可變 區(qū)）和人恒定區(qū)。在另一實(shí)例中，嵌合抗體是"種類轉(zhuǎn)換"抗體，其中種類或亞類已從親本 抗體的種類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。
[0154] 在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，人源化非人抗體來降低對(duì)人類 的免疫原性，同時(shí)保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含一個(gè)或多個(gè) 可變結(jié)構(gòu)域，其中HVR，例如CDR(或其部分）衍生自非人抗體，F(xiàn)R(或其部分）衍生自人抗 體序列。人源化抗體還將可選地包含至少部分人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，用對(duì)應(yīng)的來 自非人抗體（例如從其衍生HVR殘基的抗體）的殘基取代人源化抗體中的一些FR殘基，例 如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。
[0155] 人源化抗體和制備它們的方法綜述于例如Almagro，J. C.和Fransson, J.，F(xiàn)ront. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 中，并進(jìn)一步描述于例如 Riechmann， I. 等，Nature332 (1988) 323-329 ;Queen,C.等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA86 (1989) 10029-10033 ;US5, 821，337、US7, 527, 791、US6, 982, 321 和 US7, 087, 409 ; Kashmiri，S.V.等，Methods36(2005)25-34(描述 SDR(a-CDR)移植）；Padlan， E·A·，Mol·Immunol·28(1991)489-498(描述"重修表面"）；Dall'Acqua，W·F·等， Methods36 (2005)43-60(描述"FR 改組"）；0sbourn，J.等，Methods36 (2005)61-68 ;和 Klimka，A.等，Br. J. Cancer83 (2000) 252-260 (描述 FR 改組的"指導(dǎo)選擇"途徑）中。
[0156] 可以用來進(jìn)行人源化的人構(gòu)架區(qū)包括但不限于：用"最適"法選擇的構(gòu)架區(qū) (見例如Sims，M.J.等，J. Immunol. 151(1993)2296-2308);衍生自具體亞組的輕鏈或 重鏈可變區(qū)的人抗體的共有序列的構(gòu)架區(qū)（見例如Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 4285-4289 ;和 Presta，L.G·等，J. Immunol. 151 (1993)2623-2632); 人成熟（體細(xì)胞突變）構(gòu)架區(qū)或人種系構(gòu)架區(qū)（見例如Almagro, J.C.和Fransson, J. ，F(xiàn)ront. Biosci. 13 (2008) 1619-1633);和衍生自篩選FR文庫的構(gòu)架區(qū)（見例 如 Baca，Μ·等，J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 和 Rosok，Μ· J.等，丄81〇1· Chem. 271(1996922611-22618)。
[0157] 在某些實(shí)施方案中，該抗體是人抗體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)產(chǎn)生 人抗體。人抗體通常描述于 van Di jk，Μ· Α·和 van de Winkel，J. G，Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 及 Lonberg，N. , Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 中。
[0158] 可以通過對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物施用免疫原來制備人抗體，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已修飾為響應(yīng)抗 原攻擊而產(chǎn)生完整的人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。這類動(dòng)物通常包含全部或部分人 免疫球蛋白基因座，其取代內(nèi)源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色體外或隨機(jī)整合入動(dòng) 物的染色體。在這類轉(zhuǎn)基因小鼠中，內(nèi)源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 獲得人抗體的方法的綜述見Lonberg，N.，Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125,還見例如描述 XEN0M0USE?技術(shù)的 US6, 075, 181 和 US6, 150, 584 ;描述HuMab?技術(shù)的 US5, 770, 429 ;描 述 K-M MOUSE?技術(shù)的 US7,041，870 ;描述VdociMouse?技術(shù)的 US2007/0061900。 可以例如通過與不同的人恒定區(qū)組合來進(jìn)一步修飾來自這類動(dòng)物產(chǎn)生的完整抗體的人可 變區(qū)。
[0159] 還可以通過基于雜交瘤的方法來制備人抗體。已描述了用于產(chǎn)生 人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì)胞系（見例如Kozbor, D., J. Immunol. 133(1984)3001-3005 ;Brodeur, B. R.等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc. , New York (1987), 51-63 頁；及 Boerner, P.等，J. Immunol. 147(1991)86-95)。通過人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的人抗體也 描述于 Li，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)3557-3562 中。其他方法包括描述 于例如舊7，189,826(描述從雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆人181抗體）和附，1，乂丨 &11(1&1 Mianyixue26 (2006) 265-268 (描述人-人雜交瘤）中。人雜交瘤技術(shù)（三元雜交瘤技術(shù)）也 描述于Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology and Histopathology20(2005)927-937 及 Vollmers, Η. P.和 Brandlein, S. , Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology27 (2005) 185-191 中。
[0160] 還可以通過分離選自人衍生的噬菌體展示文庫的Fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列來產(chǎn)生 人抗體。然后可以將這類可變結(jié)構(gòu)域序列與希望的人恒定區(qū)組合。下文描述用于從抗體文 庫選擇人抗體的技術(shù)。
[0161] 可以針對(duì)具有一種或多種希望的活性的抗體篩選組合文庫來分離抗 體。例如，本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生噬茵體文庫并針對(duì)具有希望的結(jié)合特征的抗體篩 選這類文庫的多種方法。這類方法綜述于例如Hoogenboom，H.R.等，Methods in Molecular Biologyl78 (2001) 1-37 中，并進(jìn)一步描述于例如 McCafferty，J.等， Nature348 (1990) 552-554 ;Clackson，T.等，Nature352 (1991) 624-628 ;Marks，J.D.等， J. Mol. Biol. 222(1992)581-597 ;Marks, J.D.和 Bradbury, A. , Methods in Molecular Biology248 (2003) 161-175 ;Sidhu，S. S.等，J.Mol.Biol. 338(2004) 299-310 ;Lee， C. V.等，J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093 ;Fellouse，F(xiàn). A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101 (2004) 12467-12472 ;及 Lee, C.V.等，J. Immunol. Methods284 (2004) 119-132 中。
[0162] 在某些噬菌展示方法中，分別通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)克隆VH和VL基因的庫，并 在噬茵體文庫中隨機(jī)組合，然后按Winter, G.等，Ann. Rev. Immunol. 12(1994)433-455中所 述針對(duì)結(jié)合抗原的噬茵體篩選該文庫。噬茵體通常作為單鏈Fv(SCFv)片段或作為Fab片段 展示抗體片段。來自免疫的來源的文庫提供抗免疫原的高親和力抗體而無需構(gòu)建雜交瘤。 備選地，可以按Griffiths，A.D.等，ΕΜΒ0 J. 12 (1993) 725-734所述克?。ɡ鐝娜耍┦状?用于實(shí)驗(yàn)的庫來提供抗廣范圍的非自身以及自身抗原的抗體的單一來源而無需任何免疫。 最后，還可以按 Hoogenboom，H. R.和 Winter，G，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 所述，通過 從干細(xì)胞克隆未重排V基因區(qū)段，并用包含隨機(jī)序列的PCR引物來編碼高度可變的CDR3區(qū) 并實(shí)現(xiàn)體外重排來合成制備首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開包括 例如 US5, 750, 373、US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、 US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936 和 US2009/0002360。
[0163] 本文將分離自人抗體文庫的抗體或抗體片段視為人抗體或人抗體片段。
[0164] 在某些實(shí)施方案中，該抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是 對(duì)至少兩個(gè)不同部位具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合特異性中 的一種針對(duì)第一抗原，另一種針對(duì)不同的第二抗原。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以 與同一抗原的兩個(gè)不同表位結(jié)合。還可以用雙特異性抗體來將細(xì)胞毒性劑定位至表達(dá)該抗 原的細(xì)胞。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段制備。
[0165] 用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩個(gè)免疫球蛋白 重鏈-輕鏈對(duì)的重組共表達(dá)（見 Milstein，C.和 Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540 ; W093/08829 ;及 Traunecker，Α·等，EMBO J. 10(1991)3655-3659)和"杵入白"改造（見例 如US5, 731，168)。還可以通過以下來制備多特異性抗體：用于制備抗體Fc-異二聚體分子 的工程靜電引導(dǎo)作用（W02009/089004);交聯(lián)兩種或多種抗體或片段（見例如US4,676,980 和Brennan，Μ.等，Science229 (1985) 81-83);用亮氨酸拉鏈來產(chǎn)生雙特異性抗體（見例如 Kostelny，S.A.等，J. Immunol. 148(1992) 1547-1553);使用用于制備雙特異性抗體片段的 "雙抗體"技術(shù)（見例如 Holliger，P.等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA90 (1993) 6444-6448); 使用單鏈 Fv (scFv)二聚體（見例如 Gruber，M.等，J. Immunol. 152(1994)5368-5374);按 例如Tutt，A.等，J. Immunol. 147(1991)60-69中所述制備三特異性抗體。
[0166] 本文還包括具有三個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合部位的改造抗體，包括"章魚抗 體"（見例如 US2〇〇6/0〇25576)。
[0167] 該抗體可以是含有與第一抗原以及另一不同抗原結(jié)合的抗原結(jié)合部位的"雙重作 用 Fab" 或"DAF"（見例如 US2008/0069820)。
[0168] 該抗體或片段還可以是 W02009/080251、W02009/080252、W02009/080253、 W02009/080254、W02010/112193、W02010/115589、W02010/136172、W02010/145792 或 W02010/145793中所述的多特異性抗體。
[0169] 方法
[0170] 在某些實(shí)施方案中，用本文提供的方法來改變（即提高或降低）抗體糖基化的程 度。
[0171] 在抗體包含F(xiàn)c區(qū)時(shí)，可以改變附著于Fc區(qū)的糖類。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗 體通常包含分枝的雙觸角寡糖，其一般通過N連接附著于Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297 (見 例如 Wright，A.和 Morrison，S.L.，TIBTECH15 (1997) 26-32)。寡糖可以包括多種糖類，例 如甘露糖、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的"莖"中附 著于GlcNAc的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行本發(fā)明的抗體中的寡糖的修飾來產(chǎn)生 具有某些改善的特性的抗體變體。
[0172] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的方法導(dǎo)致產(chǎn)生具有缺乏附著（直接或間接）于Fc 區(qū)的巖藻糖的糖類結(jié)構(gòu)的抗體。例如，這種抗體中的巖藻糖的量可以是1%至80%、1%至 65 %、5 %至65 %或20 %至40 %。相對(duì)于通過例如W02008/077546中所述的MALDI-TOF質(zhì) 譜法測(cè)量的附著于Asn297的所有糖結(jié)構(gòu)（例如復(fù)合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu)）的總和，計(jì) 算Asn297處的糖鏈內(nèi)巖藻糖的平均量來測(cè)定巖藻糖的量。Asn297指定位在Fc區(qū)中的約 297位（Fc區(qū)殘基的Kabat EU編號(hào)）的天冬酰胺殘基；但是，由于抗體中小的序列變異， Asn297也可以定位在297位上游或下游約±3氨基酸，即在294位和300位之間。這類巖 藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能（見例如US2003/0157108 ;US2004/0093621)。涉 及"去巖藻糖基化"或"巖藻糖缺乏"的抗體變體的出版物的實(shí)例包括：US2003/0157108 ; W02000/61739 ；W02001/29246 ；US2003/0115614 ；US2002/0164328 ；US2004/0093621 ； US2004/0132140 ；US2004/0110704 ；US2004/0110282 ；US2004/0109865 ；W02003/085119 ； W02003/084570 ；W02005/035586 ；W02005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ； Okazaki, A.等，J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249 ;Yamane_Ohnuki, N.等，Biotech. Bioeng. 87(2004)614-622。能夠產(chǎn)生去巖藻糖基化的抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括蛋白質(zhì)巖藻 糖基化缺陷的 Lecl3CH0 細(xì)胞（Ripka，J.等，Arch. Biochem. Biophys. 249(1986)533-545 ; US2003/0157108 ;及W02004/056312,尤其是在實(shí)施例11中）和敲除細(xì)胞系，如α-1， 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 FUT8敲除的CH0細(xì)胞（見例如Yamane-Ohnuki，Ν.等，Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 ;Kanda，Υ·等，Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 ;and W02003/085107)。
[0173] 在某些實(shí)施方案中，所提供的方法可以用來產(chǎn)生具有二等分寡糖的抗體，例如 其中附著于抗體Fc區(qū)的雙觸角寡糖被GlcNAc二等分。這類抗體變體可以具有減少的 巖藻糖基化和/或改善的ADCC功能。這類抗體變體的實(shí)例描述于例如W02003/011878、 US6,602,684和US2005/0123546中。還可以產(chǎn)生在附著于Fc區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè) 半乳糖殘基的抗體變體。這類抗體變體可以具有改善的CDC功能。這類變體描述于例如 W01997/30087、W01998/58964 和 W01999/22764 中。
[0174] 可以用例如US4, 816, 567中所述的重組方法和組合物產(chǎn)生抗體。核酸可以編碼包 含抗體的VL的氨基酸序列和/或包含抗體的VH的氨基酸序列（例如抗體的輕鏈和/或重 鏈）。在另一實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的一個(gè)或多個(gè)載體（例如表達(dá)載體）。在另一 實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含以下 (或已用以下轉(zhuǎn)化）：（1)包含編碼含有抗體的VL的氨基酸序列和含有抗體的VH的氨基酸 序列的核酸的載體；或（2)包含編碼含有抗體的VL的氨基酸序列的核酸的第一載體和包含 編碼含有抗體的VH的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是真 核細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞（例如Y0、NS0、Sp2/0)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，提供制備抗體的方法，其中該方法包括在適于表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)上文提供的 含有編碼抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并可選地從該宿主細(xì)胞（或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基）回收抗體。
[0175] 為了重組產(chǎn)生抗體，分離編碼抗體的核酸，并插入一個(gè)或多個(gè)載體用于在宿主細(xì) 胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)?？梢杂贸Ｒ?guī)方法（例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的 重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針）容易地分離和測(cè)序這種核酸。
[0176] 適合用于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì) 胞。例如，尤其是在不需更糖基化和Fc效應(yīng)子功能時(shí)，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體?？贵w片段 和多肽在細(xì)菌中的表達(dá)見例如US5, 648, 237、US5, 789, 199和US5, 840, 523 ;還見Charlton， K.A., In :Methods in Molecular Biology，248 卷，Lo，B.K.C.(編輯），Humana Press， Totowa，NJ (2003)，245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達(dá)。表達(dá)后，可以從可溶 級(jí)分中的細(xì)菌糊分離抗體，并可以進(jìn)一步純化。
[0177] 除原核生物外，諸如絲狀真茵或酵母的真核微生物也是適合用于編碼抗體的載體 的克隆或表達(dá)宿主，包括糖基化途徑已"人源化"，導(dǎo)致產(chǎn)生具有部分或完全人糖基化模式 的抗體的真菌和酵母茵株（見 Gerngross，T. U.，Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 ;和 Li， Η·等，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)。
[0178] 適合用于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞也衍生自多細(xì)胞生物（無脊椎動(dòng)物和脊椎 動(dòng)物）。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了許多可以與昆蟲細(xì)胞結(jié)合 使用，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)細(xì)胞的桿狀病毒毒株。
[0179] 植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主（見例如US5, 959, 177、US6,040, 498、 US6,420, 548、US7, 125, 978和US6,417, 429 (描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的 PLANTIB0DIESTM 技術(shù)））。
[0180] 脊椎動(dòng)物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，可以使用馴化為懸浮生長的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞系。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他實(shí)例是SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系（C0S-7); 人胚腎細(xì)胞系（描述于例如Graham，F(xiàn). L.等，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中的293 或293細(xì)胞）；幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK);小鼠支持細(xì)胞（描述于例如Mather，J.P.，Biol. R印rod. 23(1980)243-252中的TM4細(xì)胞）；猴腎細(xì)胞（CV1);非洲綠猴腎細(xì)胞（VER0-76); 人宮頸癌細(xì)胞（HELA);犬腎細(xì)胞（MDCK) ;buffalo大鼠肝細(xì)胞（BRL3A);人肺細(xì)胞（W138); 人肝細(xì)胞〇fep G2);小鼠乳腺腫瘤（MMT060562);描述于例如Mather，J.P.等，Annals N. Y.Acad. Sci.383(1982)44-68中的TRI細(xì)胞；MRC5細(xì)胞；及FS4細(xì)胞。其他有用的哺乳 動(dòng)物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞，包括DHFR陰性（DHFR-)CHO細(xì)胞（Urlaub，G等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 (1980) 4216-4220);及骨髓瘤細(xì)胞系，如 Y0、NS0 和 Sp2/0。適合 用于抗體產(chǎn)生的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述見例如Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，248 卷，Lo，B.K.C.(編輯），Humana Press，Totowa，NJ (2004)，255_268 頁。
[0181] II.本發(fā)明的具體方面
[0182] 已發(fā)現(xiàn)，取決于載體組織，表達(dá)載體的性能因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中載體的設(shè)計(jì)而不同。
[0183] 已發(fā)現(xiàn)，不受限于此理論，為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體組織，幾點(diǎn)可以有用：1)宿主 基因組中整合的載體拷貝之間的轉(zhuǎn)錄干擾現(xiàn)象，其取決于各載體設(shè)計(jì)并對(duì)各載體設(shè)計(jì)特 異，且不存在于瞬時(shí)系統(tǒng)中；2)選擇方法和選擇嚴(yán)格性的影響，其取決于各載體組織，且在 穩(wěn)定系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；及3)最佳的LC與HC多肽的比值。
[0184] 但是，已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，LC和HC的雙向表達(dá)比成行組織HC-LC-SM更差。不 受限于此理論：1)LC、HC和SM的表達(dá)盒的趨同組織可減少整合的載體拷貝之間的轉(zhuǎn)錄干擾 現(xiàn)象；2)HC在LC的上游明顯便于對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言最佳（更佳）的LC :HC多肽比；及3)選 擇標(biāo)記的下游放置明顯提高了選擇的嚴(yán)格性。此外，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IgG的細(xì)胞的百分比和細(xì)胞 系的生產(chǎn)力提高。對(duì)于在抗體表達(dá)盒上游雙向包含選擇標(biāo)記的載體，雖然選擇的嚴(yán)格性明 顯提商，但提商選擇壓力的濃度未提商穩(wěn)定庫或克隆的生廣力（數(shù)據(jù)未顯不）。
[0185] 已發(fā)現(xiàn)，hEFla啟動(dòng)子產(chǎn)生大量產(chǎn)生良好的克隆及非常少量的非產(chǎn)生或低產(chǎn)生克 隆。但是，hEFl a啟動(dòng)子的最好的單克隆在補(bǔ)料分批分析中的產(chǎn)物效價(jià)低于hCMV啟動(dòng)子的 克隆。但hCMV啟動(dòng)子的排序靠前的克隆的總數(shù)相對(duì)低，它們的鑒定通常需要高篩選努力。
[0186] 已發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，對(duì)于含有hCMV啟動(dòng)子的載體，在與SV40或bGH polyA信號(hào) 組合時(shí)，hGT的使用顯著提高生產(chǎn)力。但是，對(duì)于含有hEfla啟動(dòng)子的載體，在與bGH polyA 信號(hào)組合時(shí)，它對(duì)產(chǎn)物效價(jià)的影響可忽略。因此，已發(fā)現(xiàn)，hGT對(duì)載體性能的影響依賴于所 使用的啟動(dòng)子。
[0187] 用于充分控制的大規(guī)模發(fā)酵中的最終評(píng)價(jià)的適當(dāng)克隆的選擇通?；趽u瓶中的 分批或補(bǔ)料分批分析。已發(fā)現(xiàn)，一些表達(dá)載體或元件的性能和排序在分批和補(bǔ)料分批分析 之間存在差異。在分批分析中而不是在補(bǔ)料分批分析中，對(duì)于含有hCMV啟動(dòng)子的載體，用 bGH polyA信號(hào)取代SV40提高了生產(chǎn)力。在分批分析中而不是在補(bǔ)料分批分析中，hGT對(duì) 克隆的產(chǎn)物效價(jià)無顯著影響。在分批和補(bǔ)料分批之間載體性能的絕對(duì)差異不完全不同。選 擇標(biāo)記的放置或啟動(dòng)子（hEfla或hCMV啟動(dòng)子）不同的載體之間的差異在分批分析中中 度顯著，但在補(bǔ)料分批分析中強(qiáng)烈顯現(xiàn)。表達(dá)水平和比產(chǎn)生速率在補(bǔ)料分批模式中比在分 批模式中高。
[0188] 已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)克隆的補(bǔ)料分批分析和2L發(fā)酵的性能的良好相關(guān)，不僅在絕對(duì)產(chǎn) 物效價(jià)的水平上，還在不同載體和克隆之間的.排序上。
[0189] 已發(fā)現(xiàn)，與在抗體表達(dá)盒上游雙向放置選擇標(biāo)記相比，選擇標(biāo)記的下游放置輕微 減少了生產(chǎn)力丟失。不受限于理論，這可能是由于提高的選擇嚴(yán)格性，因此更高的mRNA水 平或改善的LC:HC mRNA或多肽比。兩種因素都可導(dǎo)致對(duì)生產(chǎn)力變化的更高耐受性。
[0190] 與SV40polyA信號(hào)相比，bGH polyA信號(hào)顯著降低克隆中抗體表達(dá)的穩(wěn)定性。但 是，在bGH polyA信號(hào)下游插入hGT明顯提高了表達(dá)的穩(wěn)定性。hGT對(duì)穩(wěn)定性的積極作用在 缺乏選擇壓力的情況下最明顯。穩(wěn)定庫的穩(wěn)定性分析揭示，在用hCMV產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞快速喪 失生產(chǎn)力，但在用hEfla啟動(dòng)子產(chǎn)生時(shí)則不然。令人驚奇地，對(duì)于含有hEfla啟動(dòng)子的載 體，hGT降低克隆的生產(chǎn)力，但輕微提高它們的穩(wěn)定性。
[0191] 只有少部分克隆在選擇過程之后顯著產(chǎn)生抗體。但是，組織中的載體修飾和/或 元件的修飾顯著提高產(chǎn)生IgG的克隆與不產(chǎn)生IgG的克隆的比值。不同的載體組織及因此 決定選擇嚴(yán)格性的選擇標(biāo)記的不同表達(dá)水平也明顯影響產(chǎn)生IgG的細(xì)胞的百分比。基于 篩選過程的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)模擬證明，一些表達(dá)載體還具有顯著減少篩選過程中的工作量的潛 能。這一事實(shí)對(duì)生物制藥公司的成本具有主要影響。
[0192] 表達(dá)盒組織
[0193] 針對(duì)其生產(chǎn)力測(cè)試了抗體的輕鏈和重鏈和/或選擇標(biāo)記的位置不同的四種不同 載體（詳見圖1)。
[0194] 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中和穩(wěn)定庫的分批分析中測(cè)試了載體p5137、p5156、p5158和p5159。 還在穩(wěn)定單克隆的分批分析中測(cè)試了載體P5137和p5156。
[0195] 將載體p5137、p5156、p5158和p5159瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CH0-K1細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后第5天 通過ELISA測(cè)定生產(chǎn)力（圖2)。
[0196] 已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，與相反的順序相比，將重鏈放置在抗體輕鏈的前面提 供了更好的表達(dá)結(jié)果。因此，可以獲得更高的生產(chǎn)力：載體p5137-11.6yg/mi ;載體 ρ5156_7· 1 μ g/ml ;載體 ρ5159_8· Ο μ g/ml ;載體 ρ5158_4· 2 μ g/ml。
[0197] 已發(fā)現(xiàn)，與在第一抗體鏈前面雙向放置相比，選擇標(biāo)記放置在兩條抗體鏈之后提 供了更好的表達(dá)結(jié)果。因此，可以獲得更高的生產(chǎn)力。
[0198] 通過核轉(zhuǎn)染將載體p5137、p5156、p5158和p5159轉(zhuǎn)染入CH0-K1細(xì)胞，并選擇穩(wěn)定 庫。在分批分析中測(cè)定該穩(wěn)定庫的生產(chǎn)力。
[0199] 已發(fā)現(xiàn)，與在第一抗體鏈前面的雙向放置（3 ' -5 '方向）相比，選擇標(biāo)記放置 在兩條抗體鏈之后（按5 '-3 '方向）提供了更好的表達(dá)結(jié)果。因此，可以獲得更高的 生產(chǎn)力：載體 ρ5156_18· Ο μ g/ml ;載體 ρ5158_9· 1 μ g/ml ;載體 ρ5137_15· 6 μ g/ml ;載體 ρ5159-5· 7μ g/ml (圖 3)。
[0200] 通過核轉(zhuǎn)染將載體P5137和p5156轉(zhuǎn)染入CH0-K1細(xì)胞。選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并 在分批分析中分析了最好的15個(gè)克隆的生產(chǎn)力。
[0201] 分別用載體P5137和載體p5156產(chǎn)生的最好的15個(gè)克隆的平均生產(chǎn)力：載體 p5137為159 μ g/ml，載體p5156為141 μ g/ml。每種載體最好的15個(gè)克隆在分批分析中的 生產(chǎn)力分布非常相似?？寺≡诜峙治鲋械纳a(chǎn)力從約50 μ g/ml至300 μ g/ml變動(dòng)（一 個(gè)例外：用載體P5137產(chǎn)生的最好的克隆達(dá)到了 > 450 μ g/ml的生產(chǎn)力）。
[0202] 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定庫的分批分析二者中，選擇標(biāo)記放置在兩條抗體鏈之后（按 5 ' _3 1方向）產(chǎn)生顯著高于選擇標(biāo)記雙向3 1 -5 1文置在第一抗體鏈前面的生產(chǎn)力。
[0203] 已發(fā)現(xiàn)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，與相反的順序相比，抗體重鏈放置在抗體輕鏈前面（都按 5 1 _3 1方向）提供更好的表達(dá)。
[0204] 已發(fā)現(xiàn)，抗體輕鏈和重鏈的位置/順序?qū)τ诜€(wěn)定庫和單克隆的生產(chǎn)力沒有顯著影 響。已確保已表達(dá)稍微過量的輕鏈。因此，安排抗體鏈表達(dá)盒的順序來滿足這個(gè)需要。
[0205] 已發(fā)現(xiàn)，抗體鏈表達(dá)盒（任何順序）在選擇標(biāo)記表達(dá)盒之前/之后（均按5 '-3 ' 方向）是尤其適合的。
[0206] 如果兩個(gè)基因直接一個(gè)接著另一個(gè)表達(dá)，通常第二個(gè)基因以較低的速率表達(dá)。RNA 聚合酶在第二轉(zhuǎn)錄單位的通讀對(duì)于啟動(dòng)子在第二轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄起始具有不利影響。
[0207] 在載體px6068中，抗體輕鏈和重鏈的表達(dá)盒雙向排列（圖4)。
[0208] 為了防止啟動(dòng)子競(jìng)爭或干擾（由于兩個(gè)啟動(dòng)子過于接近的無效（inefficient)轉(zhuǎn) 錄起始，即，啟動(dòng)子接近轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶的空間位阻降低轉(zhuǎn)錄機(jī)器的資源可用性）， 驅(qū)動(dòng)抗體輕鏈和重鏈表達(dá)的兩個(gè)短hCMV啟動(dòng)子位置上分開（通過puc復(fù)制起點(diǎn)）。
[0209] 載體p5068和px6068通過核轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞。
[0210] 與表達(dá)載體p5068相比，載體px6068瞬時(shí)轉(zhuǎn)染顯示增加的生產(chǎn)力：載體px6068為 9· Ο μ g/ml，載體 p5068 為 4. 5 μ g/ml (圖 5)。
[0211] 已發(fā)現(xiàn)，與輕鏈和重鏈背靠背放置相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中抗體輕鏈和重鏈的雙向和分 開放置提供提高的抗體表達(dá)。
[0212] 載體p5068和px6068通過核轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)CH0-K1細(xì)胞，選擇穩(wěn)定庫。在分批 分析中測(cè)定穩(wěn)定庫的生產(chǎn)力。
[0213] 穩(wěn)定庫的分批分析顯示載體p5068和px6068在穩(wěn)定庫中的生產(chǎn)力類似：載體 p5068 為 12. 5 μ g/ml，載體 px6068 為 12. 5 μ g/ml (圖 5)。
[0214] 轉(zhuǎn)染方案
[0215] 為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過用酶在表達(dá)載體骨架上切割的限制性消化來線性化載體。對(duì) 于在于PX6068的情況，兩個(gè)可能的限制性位點(diǎn)是可能的 ：
[0216] 1.輕鏈轉(zhuǎn)錄單位和選擇標(biāo)記之間（SgrAI);
[0217] 2.輕鏈和重鏈的hCMV啟動(dòng)子之間的puc起點(diǎn)中（BssHII)。
[0218] 通過SgrAI或BssHII限制性消化來線性化的載體px6068通過核轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染進(jìn) CH0-K1細(xì)胞，選擇穩(wěn)定庫。穩(wěn)定庫的生產(chǎn)力在分批分析中測(cè)定。
[0219] 已發(fā)現(xiàn)，表達(dá)載體中線性化位點(diǎn)的位置明顯對(duì)于載體在穩(wěn)定庫的分批分析中的生 產(chǎn)力具有影響。
[0220] 與限制酶SgrAI線性化的載體px6068產(chǎn)生的穩(wěn)定庫相比，限制酶BssHII線性 化的載體px6068產(chǎn)生的庫顯示更高的生產(chǎn)力：第一次實(shí)驗(yàn)：限制酶BssHII線性化的載體 px6068為6. 4 μ g/ml，限制酶SgrAI線性化的載體px6068為2. 8 μ g/ml ;第二次實(shí)驗(yàn)：限 制酶BssHII線性化的載體px6068為12. 5 μ g/ml，限制酶SgrAI線性化的載體px6068為 9. 6 μ g/ml (見圖 6)。
[0221] 選擇壓力開始的時(shí)間點(diǎn)
[0222] 轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)施加選擇壓力，例如對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞克隆的產(chǎn)生，在0小時(shí)、4 小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。
[0223] 已發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入選擇壓力，選擇劑的濃度獨(dú)立導(dǎo)致培養(yǎng)物上清中最高 的抗體滴度（見圖7)。
[0224] 載體骨架對(duì)于細(xì)胞系性能的影響
[0225] 表達(dá)載體一般在轉(zhuǎn)染進(jìn)入真核細(xì)胞之前線性化。另外，表達(dá)載體包含在原核細(xì)胞 中擴(kuò)增表達(dá)載體所需的原核序列。
[0226] 已發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染進(jìn)真核細(xì)胞之前從線性化表達(dá)載體去掉原核元件導(dǎo)致：
[0227] -減少產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞克隆需要的選擇時(shí)間（圖8a)，
[0228] -增加庫（圖8b)和單克隆（圖8c)的生產(chǎn)力，
[0229] -加速恢復(fù)（圖8d)，和
[0230] -改善細(xì)胞生長（圖8e)。
[0231] 載體元件和表達(dá)盒方向
[0232] 已將幾種不同的轉(zhuǎn)錄相關(guān)遺傳元件及其組合與參考遺傳元件組合相比較。根 據(jù)比較性瞬時(shí)實(shí)驗(yàn)，獲得了以下結(jié)果（見下表，雙向載體組織，SM(3 ''-5' ')_LC_ HC(5, -3,）））。
[0233]

【權(quán)利要求】
1. 表達(dá)載體，其包含： -抗體輕鏈表達(dá)盒， -抗體重鏈表達(dá)盒，和 -選擇標(biāo)記表達(dá)盒， 其中該表達(dá)盒單向排列，和 其中該表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至3'順序 排列。
2. 權(quán)利要求1的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所述抗體重鏈表達(dá) 盒和/或所述選擇標(biāo)記表達(dá)盒相互獨(dú)立地包含選自人延伸因子1 ct啟動(dòng)子、人CMV啟動(dòng)子 和SV40啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
3. 權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含人延伸因 子1 α啟動(dòng)子。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所述抗體 重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地包含人延伸因子1α啟動(dòng)子。
5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)盒不包含終止子序列。
6. 權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其特征在于所述終止子序列是人胃泌素基因轉(zhuǎn)錄終止子序 列（hGT)。
7. 權(quán)利要求1或2的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含人CMV啟 動(dòng)子。
8. 權(quán)利要求1、2和7任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所述 抗體重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地包含人CMV啟動(dòng)子。
9. 權(quán)利要求1-4和7-8任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包 含牛生長激素 polyA信號(hào)序列。
10. 權(quán)利要求1-4和7-9任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所 述抗體重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地包含牛生長激素 polyA信號(hào)序列。
11. 權(quán)利要求1-4和7-10任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或 所述抗體重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地包含選自牛生長激素 polyA信號(hào)序 列和SV40polyA信號(hào)序列的polyA信號(hào)序列。
12. 權(quán)利要求1和7-11任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒在 所述polyA信號(hào)序列后面包含人胃泌素終止子序列。
13. 權(quán)利要求1和7-12任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所 述抗體重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地在polyA信號(hào)序列后面包含人胃泌素 終止子序列。
14. 權(quán)利要求1和7-13任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒和/或所 述抗體重鏈表達(dá)盒和/或所述選擇標(biāo)記盒相互獨(dú)立地按5 '至3 '方向包含牛生長激素 polyA 信號(hào)序列和人胃泌素終止子序列。
15. 權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒的啟 動(dòng)子包含內(nèi)含子A。
16. 權(quán)利要求1-8和12-13任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá) 盒包含SV40polyA信號(hào)序列。
17. 權(quán)利要求16的表達(dá)載體，其特征在于一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)表達(dá)盒包含SV40啟動(dòng) 子。
18. 權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于編碼抗體輕鏈的核酸和/或編碼抗 體重鏈的核酸包含至少一個(gè)內(nèi)含子。
19. 權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于編碼抗體輕鏈的核酸和/或編碼抗 體重鏈的核酸是cDNA。
20. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在重組產(chǎn)生抗體中的用途。
21. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途。
22. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途。
23. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途，所述表達(dá)載體包含 至少一個(gè)含有人延伸因子1α啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
24. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途，所述表達(dá)載體包含 至少一個(gè)含有人延伸因子1α啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
25. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在重組產(chǎn)生抗體中的用途，所述表達(dá)載體包含至 少一個(gè)含有人延伸因子1α啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
26. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞系中的用途，所述表達(dá)載體包含 至少一個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
27. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系中的用途，所述表達(dá)載體包含 至少一個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
28. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體在產(chǎn)生抗體中的用途，所述表達(dá)載體包含至少一 個(gè)含有人CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
29. 用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，其特征在于轉(zhuǎn)染之前，通過在原核復(fù)制起點(diǎn)中切 割來線性化表達(dá)載體。
30. 權(quán)利要求29的方法，其特征在于原核復(fù)制起點(diǎn)在抗體輕鏈表達(dá)盒和抗體重鏈表達(dá) 盒之間。
31. 權(quán)利要求29或30的方法，其特征在于所述表達(dá)載體是權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表 達(dá)載體。
32. 選擇包含抗體編碼核酸的真核細(xì)胞的方法，其特征在于在第一次轉(zhuǎn)染約24小時(shí)后 向培養(yǎng)基中加入選擇劑。
33. 權(quán)利要求32的方法，其特征在于抗體編碼核酸包含在權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá) 載體中。
34. 權(quán)利要求32或33的方法在產(chǎn)生用于重組生產(chǎn)抗體的真核細(xì)胞中的用途。
35. 權(quán)利要求32或33的方法選擇的細(xì)胞在重組生產(chǎn)抗體中的用途。
36. 用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟： -培養(yǎng)已用權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，和 -從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收抗體。
37. 用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟： -培養(yǎng)真核細(xì)胞，所述真核細(xì)胞通過用編碼抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染獲得，所述表達(dá)載體在 轉(zhuǎn)染之前，通過在原核復(fù)制起點(diǎn)中切割已線性化，和 -從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收抗體。
38. 用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括以下步驟： -培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染編碼抗體的表達(dá)載體的真核細(xì)胞，所述真核細(xì)胞已通過在轉(zhuǎn)染約24小時(shí) 后向培養(yǎng)基中加入選擇劑選擇出來，和 -從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收抗體。
39. 用編碼抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，由此表達(dá)載體包含原核核酸序列和 真核核酸序列，其特征在于在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞之前，從所述表達(dá)載體除去所述原 核核酸序列。
40. 權(quán)利要求37-39,其特征在于編碼抗體的表達(dá)載體是權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá) 載體。
41. 不包含原核核酸序列的線性化表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的用途。
42. 僅包含真核核酸序列的編碼抗體的表達(dá)載體在產(chǎn)生用于重組生產(chǎn)抗體的真核細(xì)胞 中的用途。
43. 權(quán)利要求35、41或42任一項(xiàng)的用途，其特征在于編碼抗體的表達(dá)載體是權(quán)利要求 卜19任一項(xiàng)的表達(dá)載體。
44. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體編碼雙特異性抗體。
45. 權(quán)利要求44的表達(dá)載體，其特征在于所述雙特異性抗體具有特異性結(jié)合第一抗原 或第一抗原上的第一表位的第一結(jié)合特異性或結(jié)合部位，且所述雙特異性抗體具有特異性 結(jié)合第二抗原或第二抗原上的第二表位的第二結(jié)合特異性或結(jié)合部位。
46. 權(quán)利要求1-19和44-45任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體包含： -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第一表達(dá)盒； -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第二表達(dá)盒； -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第三表達(dá)盒； -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第四表達(dá)盒； 或 -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼抗體輕鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終止子 序列的第一表達(dá)盒； -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第一抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第二表達(dá)盒；和 -按5'至3'方向包含啟動(dòng)子、編碼第二抗體重鏈的核酸、polyA信號(hào)序列和可選的終 止子序列的第三表達(dá)盒； 由此所述抗體輕鏈?zhǔn)莾蓷l抗體重鏈的共同輕鏈。
47. 權(quán)利要求1-19和44-46任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體包含： -抗體輕鏈表達(dá)盒； -第一抗體重鏈表達(dá)盒； -第二抗體重鏈表達(dá)盒；和 -選擇標(biāo)記表達(dá)盒， 其中所述抗體重鏈表達(dá)盒之一、所述抗體輕鏈表達(dá)盒和所述選擇標(biāo)記表達(dá)盒單向排 列，且 其中該單向表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至3' 順序排列。
48. 權(quán)利要求1-19和44-46任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體包含： -第一抗體輕鏈表達(dá)盒； -第二抗體輕鏈表達(dá)盒； -第一抗體重鏈表達(dá)盒； -第二抗體重鏈表達(dá)盒；和 -選擇標(biāo)記表達(dá)盒， 其中所述抗體重鏈表達(dá)盒之一、所述抗體輕鏈表達(dá)盒之一和所述選擇標(biāo)記表達(dá)盒單向 排列，且 其中該單向表達(dá)盒按抗體重鏈表達(dá)盒、抗體輕鏈表達(dá)盒和選擇標(biāo)記表達(dá)盒的5'至3' 順序排列。
49. 權(quán)利要求44-48任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包 含臼突變的抗體重鏈。
50. 權(quán)利要求44-49任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包 含杵突變的抗體重鏈。
51. 權(quán)利要求44-50任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體輕鏈表達(dá)盒之一編碼包 含抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和作為恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈變體，和/或 所述抗體輕鏈表達(dá)盒之一編碼包含抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和作為恒定結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈CL 結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈。
52. 權(quán)利要求44-51任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其特征在于所述抗體重鏈表達(dá)盒之一編碼包 含抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域（CL)作為第一恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈變體，和/或所述抗體重鏈表 達(dá)盒之一編碼包含抗體重鏈CH1結(jié)構(gòu)域作為第一恒定結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104114701SQ201280062794
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】P·M·許爾斯曼, H·克內(nèi)根 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司