碳酸酐酶ix相關(guān)標(biāo)記和其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開的內(nèi)容提供檢測(cè)癌干細(xì)胞的存在的方法和它們?cè)诎┌Y預(yù)后，評(píng)估癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，鑒定或證實(shí)藥物候選物，和確定治療效力中的用途。還提供用于檢測(cè)癌干細(xì)胞的存在的試劑盒以及使用CAIX抑制劑治療癌癥的方法。
【專利說明】碳酸酐酶IX相關(guān)標(biāo)記和其用途
【背景技術(shù)】

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于癌干細(xì)胞標(biāo)記和此種標(biāo)記在鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑，檢測(cè)癌干細(xì)胞，和治療癌癥中的用途的領(lǐng)域。
[0002]相關(guān)技術(shù)的描述
[0003]癌干細(xì)胞(CSC)是腫瘤內(nèi)的小的，明顯的癌細(xì)胞亞群。CSC具有類干細(xì)胞的性質(zhì)，包括自我更新和增加的克隆潛力，并偶爾分裂產(chǎn)生子干細(xì)胞和分化的腫瘤細(xì)胞。CSC擁有使腫瘤再生的能力，然而，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞是分化的并且缺乏這種再生能力。
[0004]CSC被認(rèn)為是造成患者舊病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因，因?yàn)樗鼈冊(cè)诔Ｒ?guī)治療中存活下來，介導(dǎo)化療抗性和腫瘤進(jìn)展。因此，僅當(dāng)CSC被根除時(shí)，惡性腫瘤才能被有效“治愈”。
[0005]在多種環(huán)境，包括乳腺中，組織氧水平在調(diào)節(jié)癌干細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。缺氧誘導(dǎo)缺氧-響應(yīng)基因(包括碳酸酐酶IX (CAIX))的表達(dá)。該金屬酶催化二氧化碳水合為碳酸氫鹽和質(zhì)子，因此在胞內(nèi)和胞外pH調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
[0006]CAIX在缺氧腫瘤，包括乳腺惡性腫瘤中上調(diào)，在其中，其被認(rèn)為是對(duì)于遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移和人乳腺癌的存活欠佳的預(yù)后標(biāo)記。在這些乳腺腫瘤的缺氧區(qū)域中，CAIX活性通過其腫瘤PH的調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞的存活中揮重要作用。CAIX可以通過讓侵略性的腫瘤細(xì)胞在通過缺氧強(qiáng)加的惡劣環(huán)境中存活，促進(jìn)增殖和存活細(xì)胞的侵襲增加轉(zhuǎn)移潛力。
[0007]為了鑒定給定的患者或腫瘤是否將對(duì)作為治療的CAIX抑制易感，和為了監(jiān)控治療進(jìn)程，評(píng)估CAIX通路參與的腫瘤的工具對(duì)治療腫瘤方面的醫(yī)療群體能夠有巨大的價(jià)值。
[0008]簡(jiǎn)要概述
[0009]本發(fā)明公開的內(nèi)容提供以下實(shí)施方案:
[0010]1.一種鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑的方法，所述方法包括:
[0011](a)將癌細(xì)胞暴露于推定的癌癥治療劑獲得治療的癌細(xì)胞，
[0012](b)測(cè)量所述治療的細(xì)胞的至少三種標(biāo)記的水平，其中至少三種標(biāo)記中的每種來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自:
[0013](I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，
[0014](2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記，
[0015](3)干性(sternness)標(biāo)記，
[0016](4) mTORCl 標(biāo)記，和
[0017](5)趨化因子標(biāo)記；
[0018](c)將至少在步驟(b)中測(cè)量的標(biāo)記中每個(gè)的水平與所述至少三種標(biāo)記中每個(gè)的參考水平進(jìn)行比較；
[0019]其中，如果在步驟(b)中測(cè)量，癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和趨化因子標(biāo)記的水平的降低，以及如果在步驟(b)中測(cè)量，上皮標(biāo)記水平的增加表明所述推定的癌癥治療劑在治療癌癥中有效。
[0020]2.如實(shí)施方案I所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM, ALDH1A3，CD44，ESA 或 CD133。
[0021]3.如實(shí)施方案I或2所述的方法，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
[0022]4.如實(shí)施方案I至3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白(E-Cadherin)或橋粒斑蛋白(Desmoplakin)。
[0023]5.如實(shí)施方案I至4任一項(xiàng)所述的方法,其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl。
[0024]6.如實(shí)施方案I至5任一項(xiàng)所述的方法,其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR, Raptor,4EBP1 或 TSC2。
[0025]7.如實(shí)施方案I至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF，G-CSF，CXCR3 或 CXCLlO。
[0026]8.如實(shí)施方案I至7任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中至少5種標(biāo)記的水平。
[0027]9.如實(shí)施方案I至8任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記的一種或更多種的表達(dá)水平。
[0028]10.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述表達(dá)水平是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的水平。
[0029]11.如實(shí)施方案9所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白表達(dá)的水平。
[0030]12.如實(shí)施方案I至8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少三種標(biāo)記包括趨化因子標(biāo)記，并且其中步驟(b)包括測(cè)量由治療的細(xì)胞分泌的趨化因子標(biāo)記的水平。
[0031]13.如實(shí)施方案I至8任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記的一種或更多種的磷酸化水平。
[0032]14.如實(shí)施方案I至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人癌細(xì)胞。
[0033]15.如實(shí)施方案I至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞，腦癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
[0034]16.如實(shí)施方案I至15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述推定的癌癥治療劑是CAIX抑制劑。
[0035]17.一種檢測(cè)細(xì)胞群體中癌干細(xì)胞的存在的方法，包括:
[0036](a)測(cè)量細(xì)胞群體的至少三種標(biāo)記水平，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自:
[0037](I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，
[0038](2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記，
[0039](3)干性標(biāo)記，
[0040](4) mTORCl 標(biāo)記，和
[0041](5)趨化因子標(biāo)記；
[0042](b)將步驟(a)中測(cè)量的至少三種標(biāo)記中每個(gè)的水平與對(duì)于至少三種標(biāo)記中每個(gè)測(cè)量的參考水平相比較；
[0043]其中，如果在步驟(a)中測(cè)量，癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和趨化因子標(biāo)記水平的增加，以及如果在步驟(a)中測(cè)量，上皮標(biāo)記水平的降低表明細(xì)胞群體中存在癌干細(xì)胞。
[0044]18.如實(shí)施方案17所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM, ALDH1A3，CD44，ESA 或 CD133。
[0045]19.如實(shí)施方案17或18所述的方法，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
[0046]20.如實(shí)施方案17至19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
[0047]21.如實(shí)施方案17至20任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl。
[0048]22.如實(shí)施方案17至21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor,4EBPI 或 TSC2。
[0049]23.如實(shí)施方案17至22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3 或 CXCL10。
[0050]24.如實(shí)施方案17至23任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中至少5種標(biāo)記的水平。
[0051]25.如實(shí)施方案17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記中的一種或更多種的表達(dá)水平。
[0052]26.如實(shí)施方案25所述的方法，其中所述表達(dá)水平是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
[0053]27.如實(shí)施方案25所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白表達(dá)水平。
[0054]28.如實(shí)施方案17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少三種標(biāo)記包括趨化因子標(biāo)記，并且其中步驟(a)包括測(cè)量由細(xì)胞群體分泌的趨化因子標(biāo)記水平。
[0055]29.如實(shí)施方案17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記中的一種或更多種的磷酸化水平。
[0056]30.如實(shí)施方案17至29任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞群體來自人生物樣品。
[0057]31.如實(shí)施方案17至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞是乳腺癌干細(xì)胞，腦癌干細(xì)胞，結(jié)腸癌干細(xì)胞，卵巢癌干細(xì)胞，胰腺癌干細(xì)胞，前列腺癌干細(xì)胞，黑色素瘤干細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞。
[0058]32.如實(shí)施方案17至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞群體來自癌癥治療后的癌癥患者。
[0059]33.一種治療癌癥的方法，所述方法包括:
[0060](a)檢測(cè)根據(jù)實(shí)施方案17至32任一項(xiàng)所述的癌癥樣品中癌干細(xì)胞的存在，其中所述細(xì)胞群體來自所述癌癥樣品，和
[0061](b)如果在所述癌癥樣品中檢測(cè)到癌干細(xì)胞，向患者施用有效量的CAIX抑制劑。
[0062]34.一種治療癌癥的方法，所述方法包括:向患者施用有效量的CAIX抑制劑，其中所述患者已被診斷含有根據(jù)實(shí)施方案17至32任一項(xiàng)所述的癌干細(xì)胞。
[0063]35.如實(shí)施方案33或?qū)嵤┓桨?4所述的方法，其中所述CAIX抑制劑是MST-104或 MST-205。
[0064]36.如實(shí)施方案33至35任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括向患者施用有效量的紫杉燒(taxane)。
[0065]37.如實(shí)施方案36所述的方法,其中所述紫杉燒(taxane)是紫杉醇。
[0066]38.一種試劑盒，其包含對(duì)至少三種標(biāo)記具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型標(biāo)記選自:
[0067](I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，
[0068](2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記，
[0069](3)干性標(biāo)記，
[0070](4) mTORCl 標(biāo)記，和
[0071](5)趨化因子標(biāo)記。
[0072]39.如實(shí)施方案38所述的試劑盒，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM,ALDH1A3, CD44, ESA 或 CD 133。
[0073]40.如實(shí)施方案38或39所述的試劑盒，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
[0074]41.如實(shí)施方案38至40任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
[0075]42.如實(shí)施方案38至41任一項(xiàng)所述的試劑盒,其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl。
[0076]43.如實(shí)施方案38至42任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor,4EBPI 或 TSC2。
[0077]44.如實(shí)施方案38至43任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3 或 CXCL10。
[0078]45.如實(shí)施方案38至44任一項(xiàng)所述的試劑盒，其包含對(duì)選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記,和趨化因子標(biāo)記中的至少5種標(biāo)記具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。
[0079]46.如實(shí)施方案38至45任一項(xiàng)所述的試劑盒,其中所述試劑盒包括陣列，蛋白結(jié)合分子附著于所述陣列。
[0080]47.一種試劑盒，其包含對(duì)至少三種標(biāo)記特異性的寡核苷酸引物或探針，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自:
[0081](I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，
[0082](2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記，
[0083](3)干性標(biāo)記，
[0084](4) mTORCl 標(biāo)記，和
[0085](5)趨化因子標(biāo)記。
[0086]48.實(shí)施方案47的試劑盒，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是04^4?0八140)!1認(rèn)3，^44，ESA 或 CD133。
[0087]49.實(shí)施方案47或48的試劑盒，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
[0088]50.如實(shí)施方案47至49任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
[0089]51.如實(shí)施方案47至50任一項(xiàng)所述的試劑盒,其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl0
[0090]52.如實(shí)施方案47至51任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor,4EBPI 或 TSC2。
[0091]53.如實(shí)施方案47至52任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3 或 CXCLlO。
[0092]54.如實(shí)施方案47至53任一項(xiàng)所述的試劑盒，包括對(duì)選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和趨化因子標(biāo)記中的至少5種標(biāo)記特異性的寡核苷酸探針或引物。
[0093]55.如實(shí)施方案47至54任一項(xiàng)所述的試劑盒,其中所述試劑盒包括陣列,所述寡核苷酸探針附著于該陣列。
[0094]在以下描述中，在本文提供的任何范圍包括在所述范圍中的所有值。還應(yīng)該注意，術(shù)語“或”通常以包括“和/或”(即，意為備選方案的一個(gè)，兩個(gè)都，或其任何組合)的其意義使用，除非內(nèi)容明確另有指示。術(shù)語“約”當(dāng)指數(shù)量或數(shù)量范圍時(shí)，意為指在實(shí)驗(yàn)的變化性內(nèi)(或統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi))的近似值的數(shù)量或數(shù)量范圍，并且因此數(shù)量或數(shù)量范圍可以在陳述的數(shù)量或數(shù)量范圍的1%和15%之間變化。另外，如在本說明書和所附的實(shí)施方案中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)(a)，” “一個(gè)(an)，”和“那個(gè)(the) ”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非內(nèi)容明確另有指不。
[0095]附圖簡(jiǎn)述
[0096]圖1顯示常氧或缺氧下以腫瘤球(tumorspheres, TS)培養(yǎng)的4Tl_shNS和4Tl-shCAIX細(xì)胞系中CAIX水平的蛋白質(zhì)印跡的再現(xiàn)。肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平顯示為上樣對(duì)照。
[0097]圖2顯示在Mammocult?培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后典型的4Tl_shNS，或4Tl_shCAIX TSs的相差顯微圖像(phase contrast micrograph images)。比例尺=100 μ m。
[0098]圖3顯示在不同條件下起始TS形成所需的細(xì)胞數(shù)量。將4TlshNS和shCAIX以二倍稀釋接種并在TS-形成條件下在常氧或缺氧情況下培養(yǎng)。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SEM。使用T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，*P < 0.03，#P < 0.006。
[0099]圖4顯示顯示％⑶44+⑶24-/低的細(xì)胞土SEM的變化的代表性FACS曲線。在常氧或缺氧條件下培養(yǎng)shNS和shCAIX4Tl細(xì)胞為TSs，解聚并且通過FACS分析評(píng)估⑶44+⑶24-/低的群體。
[0100]圖5顯示說明來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)％⑶44+⑶24-/低的細(xì)胞土SEM的平均改變的FACS數(shù)據(jù)的圖示。使用T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，*P < 0.004，林P < 0.025。
[0101]圖6是起始TS生長(zhǎng)所需細(xì)胞的數(shù)量的圖表。將親代4T1以雙倍稀釋接種并在常氧或缺氧條件下，在加入200 μ M CAI17或載體的TS-形成條件下培養(yǎng)。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SEM。使用T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，*Ρ < 0.001，#Ρ < 0.0060。
[0102]圖7是TS形成部分的圖解描述。將在缺氧條件下培養(yǎng)為TSs的4ΤI shNS和shCAIX進(jìn)行FACS。將源自兩種細(xì)胞系的⑶44+⑶24-/低或⑶44-⑶24+對(duì)照細(xì)胞在缺氧條件下以雙倍稀釋在TS-形成條件下接種并記錄形成所需的細(xì)胞數(shù)量(參見補(bǔ)充的作為原始數(shù)據(jù)的表1)。從4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)使用平均TS形成部分(土SEM)計(jì)算TS形成部分。
[0103]圖8顯示在常氧或缺氧條件下以腫瘤球在持續(xù)旋轉(zhuǎn)下培養(yǎng)，冷凍，并切片的親代4T1的免疫染色圖像。免疫染色用于評(píng)估癌干細(xì)胞標(biāo)記⑶133和CAIX的表達(dá)。比例尺=50 μ m0
[0104]圖9-12顯示免疫染色的親代4Τ1細(xì)胞(在常氧或缺氧條件下培養(yǎng)為TSs，解聚，對(duì)CD44，CD24染色并通過FACS收集)。酌情在常氧或缺氧條件下在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)⑶44+⑶24-/低或⑶44+⑶24+細(xì)胞，隨后固定并對(duì)CAIX(圖9) ;E_鈣黏著蛋白(圖10);間充質(zhì)標(biāo)記(例如平滑肌肌動(dòng)蛋白)(圖11);和EMT調(diào)節(jié)劑Snail (圖12)免疫染色。
[0105]圖13-15顯示在常氧或缺氧條件下以腫瘤球在持續(xù)旋轉(zhuǎn)下培養(yǎng)，冷凍，并切片的親代4T1的免疫染色圖像。免疫染色用于評(píng)估上皮標(biāo)記E-鈣黏著蛋白和CAIX(圖13);間充質(zhì)標(biāo)記平滑肌肌動(dòng)蛋白和CAIX(圖14);和EMT調(diào)節(jié)劑Snail和CAIX(圖15)的表達(dá)。比例尺=50 μ m。
[0106]圖16-18顯示免疫染色的4TlshNS和shCAIX細(xì)胞(在缺氧條件下培養(yǎng)為TSsJ^聚，對(duì)⑶44，⑶24染色并通過FACS收集)。收集能存活的⑶44+⑶24-/低或⑶44+⑶24+細(xì)胞并在缺氧條件下在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)3天，固定并通過免疫染色評(píng)估E-鈣黏著蛋白(圖16);平滑肌肌動(dòng)蛋白(圖17);和SnaiK 0 18)的表達(dá)。
[0107]圖19是顯示對(duì)于不同EMT標(biāo)記的mRNA水平的系列圖。將4TlshNS和shCAIX細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)為TSs，解聚，對(duì)⑶44，⑶24細(xì)胞染色并通過FACS收集。收集能存活的⑶44+⑶24-/低或⑶44+⑶24+細(xì)胞并在缺氧條件下在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)3天，裂解，提取RNA并且通過QPCR評(píng)估不同EMT標(biāo)記的相對(duì)mRNA水平。給出三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和SEM的倍數(shù)改變。
[0108]圖20是在常氧條件下培養(yǎng)為TSs，解聚，對(duì)⑶44，⑶24染色并通過FACS收集的親代4T1細(xì)胞的圖像。收集能存活的⑶44+⑶24-/低或⑶44-⑶24+細(xì)胞并在有和沒有50 μ MMST-104的情況下，在缺氧條件下在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)5天，固定并通過免疫染色評(píng)估E-鈣黏著蛋白的表達(dá)。
[0109]圖21是體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的圖示。將MDA-MB-231LM2-41uc+同位移植于N0D/SCID小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到200mm2的平均值時(shí)，動(dòng)物接受載體，38mg/kg MST-104或30mg/kg MST-205之一。監(jiān)控隨后的腫瘤生長(zhǎng)。η = 8/組。*Ρ < 0.02, **Ρ < 0.01。
[0110]圖22k和22B是顯示來自3只小鼠的EpCAM+細(xì)胞土 SEM的平均改變的代表性的FACS曲線(圖22A)和線條圖(圖22B)。將MDA_MB-231LM2_41uc+同位移植入N0D/SCID小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到200mm2的平均值，動(dòng)物接受載體或38mg/kg MST-104之一。27天后，將原發(fā)性腫瘤取出，分離并通過FACS分析評(píng)估EpCAM+細(xì)胞群。使用T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。***ρ < ο.0331，林P < 0.0224.
[0111]圖23A和23B是顯示同位移植入N0D/SCID小鼠的MDA_MB-231LM2_41uc+細(xì)胞的代表性的FACS曲線(圖23A)和線條圖(圖23B)。當(dāng)腫瘤達(dá)到200mm2的平均值時(shí)，動(dòng)物接受載體或30mg/kg MST-205之一。27天后，將原發(fā)性腫瘤取出，分離并通過FACS分析評(píng)估EpCAM+細(xì)胞群。顯示代表性的FACS曲線。線條圖顯示來自3只小鼠的EpCAM+細(xì)胞土SEM的平均改變。使用T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。< 0.0331，#P < 0.0224。
[0112]圖24顯示IHC-標(biāo)記的腫瘤的圖像。將MDA-MB-231LM2-41uc+細(xì)胞同位移植入N0D/SCID小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到200mm2的平均值時(shí)，動(dòng)物接受載體，38mg/kg MST-104之一。27天后，將原發(fā)性腫瘤固定，切片并進(jìn)行IHC以評(píng)估陽性癌干細(xì)胞標(biāo)記ALDH1A3的表達(dá)。
[0113]圖25顯示IHC標(biāo)記的腫瘤的圖像。將MDA-MB-231LM2-41UC+細(xì)胞同位移植入NOD/SCID小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到200mm2的平均值時(shí)，動(dòng)物接受載體或38mg/kg MST-104之一。27天后，將原發(fā)性腫瘤固定，切片并進(jìn)行IHC以評(píng)估CAIX的表達(dá)。
[0114]圖26顯示體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的圖示。將MDA-MB-231LM2-4Luc+細(xì)胞移植入N0D/SCID小鼠，建立腫瘤10天并隨后起始治療。根據(jù)圖中概述的給藥時(shí)間表(箭頭)通過靜脈注射施用紫杉醇并通過腹腔注射提供MST-104。η = 7-8/組。*Ρ < 0.02，#Ρ < 0.002。
[0115]圖27顯示從帶有人乳腺腫瘤的小鼠切除并通過IVIS離體(ex vivo)進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移分析的肺的圖像。指示轉(zhuǎn)移的熱量圖覆蓋在肺的灰度圖上。
[0116]圖28顯示定量從帶有人同位乳腺腫瘤并用與常規(guī)化療劑(紫杉醇)聯(lián)合的MST-104治療的小鼠自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的圖示。顯示對(duì)于各組的平均總光子通量土SEM。
[0117]圖29A-29E顯示代表性的FACS數(shù)據(jù)。將NOD-SCID小鼠乳腺脂肪墊用MDA-MB-231LM2-4乳腺癌細(xì)胞接種。以紫杉醇，或MST-104，或兩種藥物組合，或載體對(duì)小鼠IV給藥。在人道的終點(diǎn)，切除腫瘤并且通過FACS評(píng)估能存活的EpCAM陽性群體。
[0118]圖30顯示以紫杉醇，或MST-104，或兩種藥物組合，或載體靜脈內(nèi)給藥的，用MDA-MB-231LM2-4乳腺癌細(xì)胞接種的NOD-SCID小鼠乳腺脂肪墊的FACS分析的圖示。在人道的終點(diǎn)，切除腫瘤并且通過FACS評(píng)估能存活的EpCAM陽性群體。線條圖顯示來自每組的三個(gè)腫瘤的平均值土 SEM。
[0119]圖31顯示在常氧(N)或缺氧(H)條件下培養(yǎng)為TSs的4Tl_shNS和4Tl_shCAIX細(xì)胞表達(dá)的mTOR通路的一些組分的蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡。顯示在Raptor免疫印跡下的Raptor/肌動(dòng)蛋白密度測(cè)定值。肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平顯示為上樣對(duì)照。
[0120]圖32顯示證明通過在缺氧條件下培養(yǎng)為TSs并用CAIX抑制劑治療7天的親代4T1細(xì)胞表達(dá)的mTOR和Raptor的蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡。微管蛋白的表達(dá)顯示為上樣對(duì)照。
[0121]圖33顯示證明通過分離自用載體或MST-104治療的攜帶腫瘤小鼠的MDA-MB-231LM2-4Luc+人乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的一些mTOR通路組分的蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡。肌動(dòng)蛋白和GAPDH的表達(dá)水平顯示為上樣對(duì)照。
[0122]圖34顯示通過定量實(shí)時(shí)PCR證明CAIX消耗對(duì)一些趨化因子基因的mRNA水平的影響的圖表。將4Tl-shNS，4Tl-shCAIX(A)和4Tl_shCAIX(B)細(xì)胞在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)24h。收獲細(xì)胞，提取mRNA，并制備cDNA和通過qPCR分析。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值倍數(shù)變化土 SEM。通過T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，*P < 0.05。
[0123]圖35顯示定量存在于從在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在缺氧條件下孵育24h的4Tl-shNS和4Tl-shCAIX細(xì)胞回收的條件培養(yǎng)基中的小鼠CXCL10的量的ELISA數(shù)據(jù)的圖示。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值倍數(shù)變化土SEM。通過T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P =
0.003。
[0124]圖36顯示定量存在于從在無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在缺氧條件下孵育24h的4Tl-shNS和4Tl-shCAIX細(xì)胞回收的條件培養(yǎng)基中的小鼠G-CSF的水平的ELISA數(shù)據(jù)的圖示。顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均濃度土SEM。通過T-檢驗(yàn)驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P = 0.008。
[0125]詳細(xì)描述
[0126]本發(fā)明公開的內(nèi)容提供檢測(cè)癌干細(xì)胞的存在的方法和其在癌癥預(yù)后，評(píng)估癌癥轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，鑒定或證實(shí)藥物候選物，和確定治療效力的用途。其還提供用于檢測(cè)癌干細(xì)胞的存在的試劑盒以及使用CAIX抑制劑治療癌癥的方法。
[0127]本發(fā)明公開的內(nèi)容部分基于本發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn):(1)某些上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記和調(diào)節(jié)劑的表達(dá)，干性標(biāo)記的表達(dá)，和癌干細(xì)胞在缺氧條件下擴(kuò)張需要CAIX，
(2)mT0RCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)癌干細(xì)胞功能方面是CAIX的關(guān)鍵的通路下游，和(3)是在缺氧條件下由癌干細(xì)胞分泌趨化因子需要CAIX。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一些不同類型的標(biāo)記，其水平受CAIX影響。在本文此種標(biāo)記共同被稱為“CAIX相關(guān)生物標(biāo)記”或“CAIX相關(guān)標(biāo)記?！?br> [0128]生物標(biāo)記
[0129]如本文使用的“生物標(biāo)記(B1marker) ”或“標(biāo)記(marker) ”,指其存在,缺失,或量是特定細(xì)胞類型或細(xì)胞過程的特征或是特定細(xì)胞類型或細(xì)胞過程所需的分子(例如，基因，mRNAs，或蛋白)。如本文使用的“生物標(biāo)記，”還可以指具有類似功能的特定信號(hào)通路或蛋白的組和編碼所述蛋白的組的基因或mRNA的組分。
[0130]如本文使用的基因或蛋白名稱和符號(hào)，意在包括相關(guān)基因，mRNA，cDNA，蛋白，或其片段，除非另有說明。
[0131]“癌干細(xì)胞”(CSC)是在腫瘤或血液腫瘤中發(fā)現(xiàn)的，能夠產(chǎn)生在特定癌癥樣品中發(fā)現(xiàn)的所有細(xì)胞類型的癌細(xì)胞。CSC因此是致瘤的(腫瘤-形成)并且可以通過自我更新和分化為多種細(xì)胞類型的干細(xì)胞過程產(chǎn)生腫瘤。
[0132]“癌干細(xì)胞標(biāo)記”或“癌干細(xì)胞生物標(biāo)記”指與其它癌細(xì)胞相比區(qū)別存在于癌干細(xì)胞中的分子(例如，基因，mRNAs，或蛋白)。如果癌干細(xì)胞中標(biāo)記的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于(例如，少于或多于)其它細(xì)胞中(例如，非致瘤癌細(xì)胞或不是癌細(xì)胞的細(xì)胞)的水平，則分子區(qū)別存在于癌干細(xì)胞中。對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的普通檢測(cè)包括T-檢驗(yàn)，AN0VA,Kruska-Wallis,和 Wilcoxon0
[0133]不同類型的癌癥可以具有不同的癌干細(xì)胞標(biāo)記。例如，膀胱癌干細(xì)胞標(biāo)記包括CD44和CD47。乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記包括醛脫氫酶1-A1 (ALDH1A1)，ALDH1A3，BM1-1, CAIX，CD24，CD44，CD133，CXCR4，DLL4，EpCAM，ErbB2，ESA，GL1-l，GL1-2，IL-1 a，IL_6Ra , CXCRl,整聯(lián)蛋白a 6，和PTEN。結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)記包括ALDHlAl，CD44，CD166，DPPIV/CD26，EpCAM，GL1-1，和Musash1-1。胃癌干細(xì)胞標(biāo)記包括CD44和DLL4。膠質(zhì)瘤癌干細(xì)胞標(biāo)記包括A20，ABCG2, CX3CL1, CX3CR1, CXCR4, HIF-2 α，整聯(lián)蛋白 α 6，L1CAM, Musash1-1, c-Myc,巢蛋白(Nestin)，Podoplanin, IL6Ra。頭和頸癌干細(xì)胞標(biāo)記包括 ABCG2，ALDH1A1, BM1-1和 CD44。白血病癌干細(xì)胞標(biāo)記包括 BM1-1，CD34, CD38, CD44, CD47, CD96, GL1-1，GL1-2，IL-3Ra，MICL，Musash1-2，SCFR，和--Μ-3。肝癌干細(xì)胞標(biāo)記包括α -甲胎蛋白，氨基肽酶N，CD90，和NF2。肺癌干細(xì)胞標(biāo)記包括ABCG2，ALDHlAl，CD90，EpCAM，和SCF R0黑色素瘤癌干細(xì)胞標(biāo)記包括ABCB5，ABCG2，ALCAM，MS4A1，巢蛋白，和NGF R0骨髓瘤癌干細(xì)胞標(biāo)記包括CD19，CD27，CD38，MS4A1，和黏結(jié)蛋白聚糖(Syndecan)。骨肉瘤癌干細(xì)胞標(biāo)記包括ABCG2，巢蛋白，和STRO-1。卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記包括α -甲酰基-Cok消旋酶，⑶44，和SCFR。胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)記包括BM1-1⑶24，⑶44，CXCR4，和EpCAM。前列腺癌干細(xì)胞標(biāo)記包括ABCG2，α -甲酰基-Cok消旋酶，BM1-1,⑶44和c-Myc。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌干細(xì)胞標(biāo)記包括 CAIX，EpCAM, ALDH1A3, CD44，ESA 和 CD133。
[0134]“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變” (Epithelial-mesenchymal transit1n, EMT)是特征在于喪失細(xì)胞粘著，抑制E-鈣黏著蛋白表達(dá)，和增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的過程。EMT促進(jìn)CSC遷移和侵襲，使CSC能夠擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。
[0135]“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變生物標(biāo)記”(EMT生物標(biāo)記)或“EMT標(biāo)記”指其水平在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中變化的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。EMT標(biāo)記可以是間充質(zhì)標(biāo)記或上皮標(biāo)記。
[0136]“間充質(zhì)生物標(biāo)記”或“間充質(zhì)標(biāo)記”指與其它類型的細(xì)胞(例如，上皮細(xì)胞)相比區(qū)別存在于間充質(zhì)細(xì)胞中的，并且其水平在EMT過程中增加的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。優(yōu)選的間充質(zhì)標(biāo)記包括平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2 (slug) ,Wnt5B,Goosecoid,Zeb2, FoxC2,和p23。另外的間充質(zhì)標(biāo)記包括，twist, TGF-βΙ,骨橋蛋白(osteopontin),I型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2，MMP-3，MMP-9和SoxlO?！吧掀ど飿?biāo)記”或“上皮標(biāo)記”指與其它類型的細(xì)胞(例如，間充質(zhì)細(xì)胞)相比區(qū)別存在于上皮細(xì)胞中，并且其水平在EMT過程中減少的分子(例如，基因，mRNA，或蛋白)。優(yōu)選的上皮標(biāo)記包括E-鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白。另外的上皮標(biāo)記包括聯(lián)蛋白，細(xì)胞角蛋白，橋粒糖蛋白，橋粒核心糖蛋白，密蛋白和閉合蛋白。
[0137]“干性(Sternness) ”是未特化的細(xì)胞自我更新為未特化的細(xì)胞但仍然保留特化能力的能力。
[0138]“干性生物標(biāo)記”或“干性標(biāo)記”指對(duì)于維持未特化細(xì)胞的干性所需的分子(例如，基因，mRNA，和蛋白)。
[0139]優(yōu)選的干性標(biāo)記包括Notchl和Jaggedl。另外的干性標(biāo)記包括0ct4, Sox2和Nanog?！癿TOR復(fù)合物I” (mTORCl)是構(gòu)成雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶(mTOR)兩種明確的復(fù)合物中的一個(gè)。mTORCl由mT0R，Raptor，GP L(mLST8)，PRAS40和D印tor構(gòu)成，并且由雷帕霉素部分抑制。mTORCl整合反映生長(zhǎng)因子，營(yíng)養(yǎng)物，或能量的有效性的多個(gè)信號(hào)以促進(jìn)條件有利時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)或在應(yīng)激過程中或條件不利時(shí)的分解代謝過程。生長(zhǎng)因子和激素(例如，胰島素)通過Akt對(duì)mTORCl傳遞信號(hào)，其使TSC2失活以阻止mTORCl的抑制。備選地，低ATP水平導(dǎo)致TSC2的AMPK-依賴的激活以減少mTORCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。氨基酸有效性通過包括Rag蛋白的通路被信號(hào)傳遞到mTORCl?；罨膍TORCl具有很多下游生物效應(yīng)，包括通過磷酸化下游靶(4EBP1和p70S6激酶)的mRNA的翻譯，抑制自吞噬，核糖體生物發(fā)生，和激活轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致線粒體代謝或脂肪生成。
[0140]“mTORCl生物標(biāo)記”或“mTORCl標(biāo)記”是mTORCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組分或編碼所述組分的基因或mRNA。優(yōu)選的mTORCl標(biāo)記包括mTOR，Raptor，4EBP1，和TSC2。另外的mTORCl標(biāo)記包括PRAS40，ATG13，和p70S6激酶(p70S6K)?！摆吇蜃印敝改軌蛟卩徑捻憫?yīng)細(xì)胞中誘導(dǎo)定向趨化作用的小的細(xì)胞因子家族(由細(xì)胞分泌的和在細(xì)胞間通訊中使用的小的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)。它們尺寸小(約8-10KD)并在對(duì)于形成其3維形狀關(guān)鍵的保守位置具有2-6個(gè)半胱氨酸殘基。
[0141] “趨化因子生物標(biāo)記”或“趨化因子標(biāo)記”指趨化因子或編碼趨化因子基因或mRNA。優(yōu)選的趨化因子標(biāo)記包括RANTES (CCL5)，PIGF, G-CSF, CXCR3和CXCL10。另外的趨化因子標(biāo)記包括 CCRl，CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CCLl，CCL2, CCL3,CCL4, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9 (與 CCLlO 相同)，CCLlI，CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16,CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28,CXCRl， CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CXCLl， CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6,CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCRI, XCLI，XCL2, CX3CR1 和 CX3CL1。
[0142]檢測(cè)CSC的方法
[0143]在一個(gè)方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供使用不同類型標(biāo)記的組合檢測(cè)細(xì)胞群體中癌干細(xì)胞的存在的方法。所述方法包括(a)測(cè)量不同類型標(biāo)記的水平，和(b)將此種水平與參考水平比較，從而確定細(xì)胞群體中癌干細(xì)胞的存在或缺失。如果與那些標(biāo)記的對(duì)應(yīng)的參考水平相比，癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著增加，和/或上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著減少，則檢測(cè)出癌干細(xì)胞。
[0144]本文公開的可以用于所述方法的不同類型標(biāo)記包括:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，(2)EMT標(biāo)記，包括間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記，(3)干性標(biāo)記，(4)mT0RCl標(biāo)記，和(5)趨化因子標(biāo)記。
[0145]本發(fā)明公開的方法可以使用來自兩種或更多種不同類型的標(biāo)記的標(biāo)記。優(yōu)選地，所述方法使用來自三，四或五種本文提供的不同類型的標(biāo)記的標(biāo)記。
[0146]用于本發(fā)明公開的方法的標(biāo)記的總數(shù)量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種。
[0147]在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明公開的方法的標(biāo)記可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種選自由以下各項(xiàng)組成的組的標(biāo)記:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX，EpCAM, ALDHlA3,⑶44，ESA, CD 133 ； (2)間充質(zhì)標(biāo)記:平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Smai 1-2, Wnt5B, Goosecoid,Zeb2，F(xiàn)oxC2，和p23 ;和上皮標(biāo)記:E-鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；(3)干性標(biāo)記=Notchl和Jaggedl ； (4)mTORCl 標(biāo)記:mT0R, Raptor, 4EBPI,和 TSC2 ;和(5)趨化因子標(biāo)記=RANTES,PIGF, G-CSF, CXCR3，和 CXCL10。
[0148]例如，所述方法可以使用至少3種不同標(biāo)記，所述3種不同標(biāo)記中每個(gè)是與另外2種標(biāo)記類型不同的類型。所述方法可以使用至少4種不同標(biāo)記，所述4種不同標(biāo)記中每個(gè)是與另外3種標(biāo)記類型不同的類型。所述方法可以使用至少5種不同標(biāo)記，所述5種不同標(biāo)記中每個(gè)是與另外4種標(biāo)記類型不同的類型。優(yōu)選地，所述標(biāo)記選自由以下各項(xiàng)組成的組:(1)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX，EpCAM, ALDH1A3，CD44，ESAjP CD133 ; (2)間充質(zhì)標(biāo)記:平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1，Smai 1-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2，和 p23 ;和上皮標(biāo)記:E-鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；⑶干性標(biāo)記:Notchl和Jaggedl ； (4) mTORCl標(biāo)記:mT0R, Raptor,4EBP1，和 TSC2 ;和(5)趨化因子標(biāo)記:RANTES, PIGF，G-CSF, CXCR3，和 CXCL10
[0149]根據(jù)本文公開的方法測(cè)量的標(biāo)記水平可以是標(biāo)記的表達(dá)水平或標(biāo)記的修飾水平。所述表達(dá)水平可以是標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平或標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平。標(biāo)記(蛋白)的修飾水平可以以標(biāo)記(蛋白)的磷酸化，糖基化，亞硝基化，瓜氨酸化，或蛋白水解加工水平。
[0150]標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平是研究的細(xì)胞中編碼標(biāo)記(蛋白)的mRNA量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)測(cè)量此種量，所述技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)或?qū)崟r(shí)RT-PCR，基于cDNA的陣列，寡核苷酸陣列，或RNA印跡雜交。在本發(fā)明公開實(shí)施例中也提供用于測(cè)量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的示例性的技術(shù)。
[0151]標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平是研究的細(xì)胞中或由研究的細(xì)胞分泌的標(biāo)記(蛋白)的量?？梢酝ㄟ^測(cè)量受試者(研究的細(xì)胞獲自所述受試者)血清中標(biāo)記(蛋白)的量確定由研究的細(xì)胞分泌的標(biāo)記(蛋白)的量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)測(cè)量蛋白表達(dá)水平，所述技術(shù)包括蛋白質(zhì)印跡分析，ELISA，免疫組織化學(xué)分析，和質(zhì)譜分析。本發(fā)明公開的實(shí)施例中也提供用于測(cè)量蛋白表達(dá)水平的示例性技術(shù)。
[0152]標(biāo)記的磷酸化水平是研究的細(xì)胞中標(biāo)記(蛋白)被磷酸化的量，比率，或程度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)測(cè)量此種水平，所述技術(shù)包括蛋白質(zhì)印跡分析和電泳和P32標(biāo)記的蛋白的放射顯影。本發(fā)明公開的實(shí)施例中也提供用于測(cè)量蛋白磷酸化水平的示例性技術(shù)。
[0153]本文公開的方法可以用于在懷疑含有癌細(xì)胞的任何細(xì)胞群體中檢測(cè)CSC。此種細(xì)胞群可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞或可以來自從動(dòng)物(例如，非人哺乳動(dòng)物和人)取出或收集的生物樣品，包括組織活檢，穿刺活檢，血液，淋巴，骨髓，等。在某些實(shí)施方案中，不同于癌癥組織活檢的樣品(例如，血液或血清)可以獲得自患有或懷疑患有癌癥的受試者以確定一種或更多種分泌的趨化因子標(biāo)記的水平。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，研究的細(xì)胞群體來自缺氧的腫瘤或惡性腫瘤，其一個(gè)或更多個(gè)部分在氧濃度比健康組織顯著更低(例如，90-95%更低)的區(qū)域中。本文公開的方法可以用于檢測(cè)不同類型的CSC，包括乳腺，膀胱，腦，結(jié)腸，胃部，肝，頭和頸，肺，卵巢，骨肉瘤，胰腺，前列腺，腎，黑色素瘤和多發(fā)性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤CSC。因?yàn)椴煌愋偷腃SC可以具有不同CSC標(biāo)記,選擇合適的CSC標(biāo)記用于檢測(cè)特定類型的CSC在普通技術(shù)內(nèi)。上文提供了用于不同類型癌癥的示例性的CSC標(biāo)記。
[0154]測(cè)量研究的細(xì)胞的標(biāo)記水平后，將這些水平與測(cè)量的每種標(biāo)記的參考水平相比較。標(biāo)記的參考水平可以是參考細(xì)胞中標(biāo)記的水平，所述參考細(xì)胞比如正常細(xì)胞或致瘤癌細(xì)胞，優(yōu)選來自相同的組織來源。正常細(xì)胞或非致瘤癌細(xì)胞可以來自相同的研究的細(xì)胞群體獲自的受試者。備選地，這些細(xì)胞可以來自另一個(gè)受試者或受試者組。所述另一個(gè)受試者或受試者組優(yōu)選與測(cè)試受試者共享一種或更多種癌癥-相關(guān)的特征(例如，相同類型或亞型的癌癥，相同或相似的腫瘤分級(jí))。
[0155]細(xì)胞群體中CSC的存在可以通過確定各個(gè)測(cè)量的標(biāo)記水平和各個(gè)標(biāo)記的參考水平之間的差異檢測(cè)。如果與相應(yīng)的那些標(biāo)記的參考水平比較，存在癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)上的上皮標(biāo)記水平顯著減少，則在細(xì)胞群體中檢測(cè)出癌干細(xì)胞。例如，在某些實(shí)施方案中，選自以下不同類型標(biāo)記中的3種的3種標(biāo)記用于檢測(cè)CSC = (I)CSC標(biāo)記，(2)間充質(zhì)標(biāo)記，(3)干性標(biāo)記，(4)mT0RCl標(biāo)記，和(5)趨化因子標(biāo)記。在此種實(shí)施方案中，全部3種測(cè)量的標(biāo)記的水平如果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，則檢測(cè)出CSC。在某些其它實(shí)施方案中，上皮標(biāo)記和選自其它五種不同類型標(biāo)記的2種的2種標(biāo)記用于檢測(cè)CSC。在此種實(shí)施方案中，如果存在上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少和另2種標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，則檢測(cè)出CSC。
[0156]如果至少60%，70%，80%，或90%的測(cè)量的標(biāo)記滿足以下描述:(1)與其參考水平相比，CSC標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，(2)與其參考水平相比，間充質(zhì)標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，(3)與其參考水平相比，干性標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，(4)與其參考水平相比，mTORCl標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，(5)與其參考水平相比，趨化因子標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，和(6)與其參考水平相比，上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，則可以檢測(cè)出CSC。例如，在某些實(shí)施方案中，5種測(cè)量的標(biāo)記中的3或4種標(biāo)記滿足以上描述。
[0157]CSC的CSC標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記水平可以是參考細(xì)胞的那些標(biāo)記水平的至少2X，至少3X，至少4X，或至少5X。CSC的上皮標(biāo)記水平可以是參考細(xì)胞的該標(biāo)記水平的至多50%，至多40%，至多30%，至多20%，至多10%，至多5%，或至多1%。
[0158]本文公開的方法還可以用于基于與其相應(yīng)參考水平相比，CSC標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記,和/或趨化因子標(biāo)記水平增加的量，和/或上皮標(biāo)記水平減少的量，定量細(xì)胞群體中CSC量。
[0159]檢測(cè)CSC的方法可以用于評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。例如，可以將測(cè)試細(xì)胞群體的CSC標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記,和/或趨化因子標(biāo)記水平增加的量，和/或上皮標(biāo)記水平減少的量與已知具有高，中或低轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞群體的那些相比較。備選地，可以將測(cè)試細(xì)胞群體的CSC標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，趨化因子標(biāo)記，和/或上皮標(biāo)記的水平直接與已知具有高，中或低轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞群體的那些相比較。此種比較有助于確定測(cè)試細(xì)胞群體獲自的癌癥的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。例如，如果與已知具有中或低轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞群體相比，測(cè)試群體的標(biāo)記水平更接近于已知具有高轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞群體，則所述測(cè)試群體可能是高度轉(zhuǎn)移的。
[0160]“高轉(zhuǎn)移潛力”指形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移到多個(gè)位點(diǎn)或器官的傾向。示例性的具有高轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系是4T1細(xì)胞系。
[0161]“中轉(zhuǎn)移潛力”指形成局部的、組織特異的或器官特異的轉(zhuǎn)移的傾向。示例性的具有中轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系是66cl4細(xì)胞系。
[0162] “低轉(zhuǎn)移潛力”指低轉(zhuǎn)移傾向或無轉(zhuǎn)移傾向。示例性的具有低轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系是NR67細(xì)胞系。
[0163]檢測(cè)CSC的存在的方法還可以用于癌癥診斷或預(yù)后。例如，此種方法可以用于確定腫瘤分級(jí)或腫瘤亞型或預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。此外，通過使用本文公開的方法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)和/或定量獲自受試者的生物樣品中的CSC，可以監(jiān)控或預(yù)測(cè)受試者中癌癥的疾病進(jìn)程。
[0164]鑒定或證實(shí)藥物候選物的方法
[0165]在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑的方法。所述方法包括(a)將癌細(xì)胞暴露于推定的癌癥治療劑以獲得治療的癌細(xì)胞，(b)測(cè)量不同類型標(biāo)記的水平，和(C)將此種水平與參考水平相比，從而鑒定或證實(shí)所述推定的癌癥治療劑。如果在將癌細(xì)胞暴露于所述推定的癌癥治療劑之后，當(dāng)與那些標(biāo)記的相應(yīng)參考水平比較時(shí)，存在癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減少，和/或上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，則鑒定或證實(shí)了推定的癌癥治療劑。
[0166]暴露于推定的癌癥治療劑的癌細(xì)胞可以是體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞，比如源自癌細(xì)胞的細(xì)胞系的那些。優(yōu)選的體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞是能夠形成腫瘤球的那些，比如鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1的細(xì)胞。用于鑒定或證實(shí)癌癥藥物候選物的另外的癌癥細(xì)胞系將包括小鼠乳腺癌細(xì)胞系 66cl4，和人細(xì)胞系 MDA-MB-231，MDA-231LM2-4MDA-MB-468，HT29，HeLaJP A549。還可以使用過量表達(dá)CAIX的小鼠乳腺癌細(xì)胞(包括67NR/hCAIX細(xì)胞)。
[0167]可以通過任何用于將癌細(xì)胞與推定的癌癥治療劑接觸的方法(包括在存在推定的癌癥治療劑的情況下培養(yǎng)或孵育細(xì)胞)進(jìn)行將體外培養(yǎng)癌細(xì)胞暴露于推定的癌癥治療劑。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。如在本文使用的“缺氧，”指具有減少的氧含量(即，2%或更少的氧，比如1%的氧)的空氣。
[0168]暴露于推定的癌癥治療劑的癌細(xì)胞可以是患有癌癥的受試者(包括非人哺乳動(dòng)物和人)的癌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^向癌細(xì)胞局部施用推定的治療劑或向受試者全身施用推定的治療劑進(jìn)行將癌細(xì)胞暴露于推定的癌癥治療劑。
[0169]不同類型的標(biāo)記，各個(gè)類型的示例性標(biāo)記，標(biāo)記的不同組合，測(cè)量上文描述的標(biāo)記的不同水平的技術(shù)連同檢測(cè)CSC存在的方法也可應(yīng)用于鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑的方法。
[0170]測(cè)量用推定的癌癥治療劑治療的細(xì)胞的標(biāo)記水平之后，將這些水平與測(cè)量的各個(gè)標(biāo)記的參考水平相比較。對(duì)于體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞，標(biāo)記的參考水平可以是與治療的癌細(xì)胞相同細(xì)胞系的未治療的培養(yǎng)的癌細(xì)胞的標(biāo)記水平。例如，未用推定的癌癥治療劑治療的培養(yǎng)的4T1細(xì)胞的特定標(biāo)記(例如，EpCAM)的水平可以用作參考水平以與用推定的癌癥治療劑治療后的培養(yǎng)的4T1細(xì)胞的該特定標(biāo)記的水平相比較。
[0171]對(duì)于來自患有癌癥的受試者的癌細(xì)胞，標(biāo)記的參考水平可以是來自與治療的癌細(xì)胞相同的但在用推定的癌癥治療劑治療受試者之前獲得的癌癥組織的癌細(xì)胞的標(biāo)記水平。例如，來自用推定的癌癥治療劑治療之前的患者的乳腺癌細(xì)胞的特定標(biāo)記(例如，EpCAM)的水平可以用作參考水平以與來自在患者已經(jīng)用推定的癌癥治療劑治療之后的相同患者的乳腺癌細(xì)胞的該特定標(biāo)記的水平相比較。
[0172]備選地，標(biāo)記的參考水平可以是來自與治療的癌細(xì)胞相同的組織類型，但獲自未用推定的癌癥治療劑治療的另一個(gè)受試者或受試者組的癌細(xì)胞的標(biāo)記水平。優(yōu)選地，所述另一受試者或受試者組共享如用推定的癌癥治療劑治療的受試者的一種或更多種常見的癌癥相關(guān)特征(例如，相同類型或亞型的癌癥，相同或相似的腫瘤分級(jí))。
[0173]可以通過確定測(cè)量的各個(gè)標(biāo)記的水平和各個(gè)標(biāo)記的參考水平之間的差異鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑。當(dāng)與那些標(biāo)記的相應(yīng)參考水平(例如，未用推定的癌癥治療劑治療或用推定的癌癥治療劑治療前的癌細(xì)胞的水平)比較時(shí)，如果存在用推定的癌癥治療劑治療的細(xì)胞的癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減少，和/或上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，可以鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑。例如，在某些實(shí)施方案中，選自以下不同類型標(biāo)記中的3種的3種標(biāo)記:(I)CSC標(biāo)記，(2)間充質(zhì)標(biāo)記，(3)干性標(biāo)記，(4)mT0RCl標(biāo)記，和(5)趨化因子標(biāo)記用于檢測(cè)CSC0在此種實(shí)施方案中，用推定的癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞中/的測(cè)量的全部3種標(biāo)記的水平如果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加，可以鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑。在某些其它實(shí)施方案中，上皮標(biāo)記和選自其它五種不同類型的標(biāo)記中的2種的2種標(biāo)記用于鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑。在此種實(shí)施方案中，如果存在用推定的癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞中/的上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加和其它2種標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減少，則鑒定或證實(shí)了推定的癌癥治療劑。
[0174]如果測(cè)量的標(biāo)記中至少60%，70%，80%，或90%滿足一下描述:(1)與其參考水平相比，CSC標(biāo)記的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，(2)與其參考水平相比，間充質(zhì)標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，(3)與其參考水平相比，干性標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，(4)與其參考水平相比，mTORCl標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，(5)與其參考水平相比，趨化因子標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少，和(6)與其參考水平相比，上皮標(biāo)記水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，可以鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑。例如，在某些實(shí)施方案中，5種測(cè)量的標(biāo)記中的3或4種標(biāo)記滿足以上描述。
[0175]用鑒定或證實(shí)的癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞的CSC標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記，和/或趨化因子標(biāo)記的水平可以是相同組織來源的未用癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞的水平的至多50%，至多40%，至多30%，至多20%，至多10%，至多5%，或至多1%。用鑒定或證實(shí)的癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞的上皮標(biāo)記水平可以是相同組織來源的未用癌癥治療劑治療的癌細(xì)胞的水平的至少2X，至少3X，至少4X，或至少5X。
[0176]本文公開的方法可以用于鑒定或證實(shí)任何推定的癌癥治療劑。示例性的推定的癌癥治療劑包括小分子，抗體，其抗原-結(jié)合片段，多肽，肽，激素，和核酸(例如，反義多核苷酸和短干擾RNAs包括siRNA，miRNA，和shRNA)?？梢詮幕衔铮M合物，或分子文庫或集合中鑒定可能的治療劑。
[0177]如本文公開的，本發(fā)明公開的內(nèi)容部分基于本發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn):CAIX是表達(dá)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記和調(diào)節(jié)劑，表達(dá)干性標(biāo)記，和在缺氧條件下癌干細(xì)胞擴(kuò)張(expand)所需的，是mTORCl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，并且也是在缺氧條件下由癌干細(xì)胞分泌趨化因子必需的。因此，本文公開的標(biāo)記尤其用于鑒定或證實(shí)CAIX抑制劑為癌癥治療劑。
[0178]可以被鑒定為癌癥治療劑的CAIX抑制劑包括干擾，降低或消除CAIX基因表達(dá)的CAIX-特異抗體，CAIX- 特異抗體的抗原-結(jié)合片段，包括CAIX-特異抗體的抗原-結(jié)合片段的融合蛋白，小分子CAIX抑制劑，反義多核苷酸和短干擾RNAs(例如，siRNA，miRNA,和shRNA)。示例性的小分子CAIX抑制劑包括在WO 2012/021963和PCT申請(qǐng)PCT/IB2011/055312中公開的那些。
[0179]在一個(gè)相關(guān)的方面，鑒定或證實(shí)本文公開的推定的癌癥治療劑的方法還可以用于評(píng)價(jià)癌癥治療方案的效力。通過在治療方案過程中或治療后監(jiān)控來自如本文公開的患者的癌細(xì)胞的生物標(biāo)記水平的改變，人們可以確定所述癌癥治療方案在特定患者中是否有效。此種確定可以隨后指導(dǎo)對(duì)是否繼續(xù)所述治療方案或重復(fù)所述治療方案的決定。
[0180]治療癌癥的方法
[0181]在另一個(gè)方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供治療癌癥的方法，所述方法包括(a)使用本文公開的生物標(biāo)記和方法檢測(cè)來自患者的癌癥樣品中CSC的存在，和(b)如果在所述癌癥樣品中檢測(cè)出CSC，向患者施用有效量的CAIX抑制劑。
[0182]在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供治療癌癥的方法，所述方法包括向癌癥患者施用有效量的CAIX抑制劑，所述癌癥患者使用本文公開的生物標(biāo)記和方法診斷被診斷為含有CSC。
[0183]如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員理解的，術(shù)語，“治療(treat)”和“治療(treatment)，”指受試者(即，患者)的疾病，病癥，或病狀的醫(yī)學(xué)處理(參見，例如，StedmanJ s MedicalDict1nary).“治療癌癥”指降低癌癥癥狀的數(shù)量，減少一種或更多種癥狀的嚴(yán)重度，或延遲癌癥進(jìn)程。
[0184]可以使用本文公開的方法治療的癌癥患者可以是經(jīng)歷了除使用CAIX抑制劑的治療外的癌癥治療，但癌癥治療尚未消除患者中所有癌干細(xì)胞的患者。用特異定向到CSC的CAIX抑制劑治療此種患者，將更有效并阻止或減少癌癥復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
[0185]可以使用CAIX抑制劑治療的可使用本文公開的生物標(biāo)記和方法檢測(cè)其CSC的任何類型的癌癥，包括，乳腺癌，膀胱癌，腦癌，結(jié)腸癌，胃癌，肝癌，頭和頸癌癥，肺癌，卵巢癌癥，骨肉瘤，胰腺癌，前列腺癌，腎癌，黑色素瘤，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
[0186]可以被鑒定為癌癥治療劑的CAIX抑制劑包括CAIX-特異抗體，CAIX-特異抗體的抗原-結(jié)合片段，包括干擾，降低或消除CAIX基因表達(dá)的CAIX-特異抗體的抗原-結(jié)合片段的融合蛋白，小分子CAIX抑制劑，反義多核苷酸和短干擾RNAs (例如，siRNA，miRNA,和shRNA)。示例性的小分子CAIX抑制劑包括在WO 2012/021963和PCT申請(qǐng)PCT/IB2011/055312中公開的那些。美國(guó)專利7，378，091中公開了靶向CAIX的示例性的單克隆和多克隆抗體。另外的示例性CAIX抑制劑包括美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0146955和2008/0095707中公開的那些。在本發(fā)明公開實(shí)施例中也公開了某些示例性的CAIX抑制劑。
[0187]可以口服，局部，經(jīng)皮，腸胃外，通過吸入噴霧，陰道，直腸，或通過顱內(nèi)注射，或其任何組合施用CAIX抑制劑或包含CAIX抑制劑藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，包含CAIX抑制劑的CAIX抑制劑或藥物組合物腸胃外施用，比如通過皮下，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，或腦池內(nèi)注射，或通過融合技術(shù)。
[0188]將CAIX抑制劑或包含CAIX抑制劑的藥物組合物以治療有效劑量施用于根據(jù)本文公開的方法被診斷為含有CSC的患者。特定治療劑的“治療有效劑量”指所述藥劑足以以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式導(dǎo)致降低癌癥的一種或更多種癥狀，消除或延遲癌癥的一種或更多種癥狀的開始或復(fù)發(fā)的那個(gè)量?？梢愿鶕?jù)包括特定治療劑或藥物組合物，給藥途徑，受試者的狀況(即，疾病的階段，由所述疾病引起的癥狀的嚴(yán)重度，一般健康狀況以及年齡，性別，重量)的不同因素和其它對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯而易見的因素確定和調(diào)整此種劑量。相似地，可以根據(jù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知曉的參數(shù)確定用于治療疾病或病癥的治療劑的劑量。通?？梢允褂脤?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?或臨床試驗(yàn)確定最優(yōu)的劑量。CAIX抑制劑的最優(yōu)劑量可以依賴于受試者的體重，重量或血液量。例如，可以施用0.01mg/kg和1000mg/kg之間的量(例如，約 0.1 至 lmg/kg,約 I 至 10mg/kg,約 10 至 50mg/kg,約 50 至 100mg/kg,約 100 至500mg/kg,或約500至1000mg/kg)體重(可以以單個(gè)劑量每日，每周，每月或以任何合適的間隔施用)的CAIX抑制劑。
[0189]還考慮的是與用于治療癌癥的第二藥劑聯(lián)合施用CAIX抑制劑或包含CAIX抑制劑藥物組合物。示例性的第二藥劑包括生物劑(例如，抗-EGFR抗體)，化療劑(例如，紫杉烷(taxane)，鉬類藥物，氟嘧啶，環(huán)磷酰胺，烷化劑，有絲分裂抑制劑，抗生素，抗代謝物，和抗血管生成劑)，和放療劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二癌癥治療劑是紫杉醇。
[0190]在某些實(shí)施方案中，可以在相同的制劑中同時(shí)施用CAIX抑制劑和第二癌癥治療劑。備選地，可以以分開的制劑但同時(shí)施用第二癌癥治療劑(即，彼此間少于一小時(shí)內(nèi)給藥)。
[0191]在某些實(shí)施方案中，可以在施用CAIX抑制劑之前施用第二癌癥治療劑(即，用CAIX抑制劑治療前至少一小時(shí))。還考慮的是可以在施用CAIX抑制劑之后施用第二癌癥治療劑(即，施用CAIX抑制劑后至少一小時(shí))。
[0192]試劑盒
[0193]在一個(gè)方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)本文公開的生物標(biāo)記具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。
[0194]在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含對(duì)于以下不同類型標(biāo)記中的2，3，4，或5種具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，(2)EMT標(biāo)記，包括間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記，(3)干性標(biāo)記，(4)mT0RCl標(biāo)記，和(5)趨化因子標(biāo)記。優(yōu)選地，所述試劑盒包含對(duì)本文提供的標(biāo)記中的3，4，或5種不同類型具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。
[0195]具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子針對(duì)的，在本發(fā)明公開的試劑盒中包括的標(biāo)記的總數(shù)量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種。
[0196]在某些實(shí)施方案中，具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子針對(duì)的，本發(fā)明公開的試劑盒中包括的標(biāo)記可以是選自由以下各項(xiàng)組成的組的至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種標(biāo)記:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX，EpCAM, ALDH1A3，⑶44，ESAjP⑶133 ；⑵間充質(zhì)標(biāo)記:平滑肌肌動(dòng)蛋
S,Snail-1, Smail-2，Wnt5B，Goosecoid，Zeb2，F(xiàn)oxC2，和 p23 ;和上皮標(biāo)記:E_ 鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；⑶干性標(biāo)記:Notchl和Jaggedl ； (4)mTORCl標(biāo)記:mT0R, Raptor, 4EBP1,和TSC2 ;和(5)趨化因子標(biāo)記:RANTES, PIGF，G-CSF, CXCR3，和 CXCL10
[0197]例如，所述試劑盒可以包含對(duì)至少3種不同標(biāo)記(其中每種是與另外2種標(biāo)記類型不同的類型)具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。所述試劑盒可以包含對(duì)至少4種不同標(biāo)記(其中每種是與另外3種標(biāo)記類型不同的類型)具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。所述試劑盒可以包含對(duì)至少5種不同標(biāo)記(其中每種是與另外4種標(biāo)記類型不同的類型)具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述標(biāo)記是選自由以下各項(xiàng)組成的組:(1)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX, EpCAM, ALDH1A3，CD44，ESA, CD 133 ； (2)間充質(zhì)標(biāo)記:平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Smai 1-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2，和 p23 ;和上皮標(biāo)記:E-鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；(3)干性標(biāo)記:Notchl和Jaggedl ； (4)mTORCl標(biāo)記:mT0R,Raptor，4EBP1，和 TSC2 ;和(5)趨化因子標(biāo)記:RANTES, PIGF，G-CSF, CXCR3，和 CXCL10
[0198]“特異性結(jié)合”或“特異結(jié)合”指識(shí)別和結(jié)合研究的生物標(biāo)記蛋白但基本上不結(jié)合和識(shí)別含有研究的生物標(biāo)記蛋白的樣品中的其它分子的化合物，抗體，或抗體的抗原-結(jié)合片段。
[0199]在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括陣列或微陣列，所述蛋白結(jié)合分子附著于所述陣列或微陣列。
[0200] “陣列”指試劑(例如，蛋白，抗體，核酸，或寡核苷酸)以位置上清楚的定位在基底上的排列。在一些情況下，將陣列上的試劑在空間上編碼，從而從其在陣列上的定位可以確定試劑的特性?！拔㈥嚵小蓖ǔＶ钙渲袡z測(cè)需要使用顯微檢測(cè)以檢測(cè)在基底上以試劑形成的復(fù)合物的陣列。在陣列上的“定位”指包含試劑的陣列表面的局部區(qū)域，每個(gè)被限定從而能夠?qū)⑵渑c鄰近的定位相區(qū)分。典型地，各個(gè)定位包括單個(gè)類型的試劑，但這不是必需的。
[0201]在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明公開的內(nèi)容提供試劑盒，所述試劑盒包含對(duì)本文公開的生物標(biāo)記特異的寡核苷酸引物和/或探針。
[0202]如果其特異雜交于生物標(biāo)記核酸或其互補(bǔ)序列，而基本上不雜交含有生物標(biāo)記核酸的樣品中的其它核酸，則寡核苷酸引物或探針對(duì)生物標(biāo)記核酸特異。
[0203]在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含以下不同類型標(biāo)記中的2，3，4，或5種的寡核苷酸引物或探針:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，⑵EMT標(biāo)記，包括間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記，⑶干性標(biāo)記，(4)mT0RCl標(biāo)記，和(5)趨化因子標(biāo)記。優(yōu)選地，所述試劑盒包含對(duì)本文提供的標(biāo)記中的3，4，或5種不同類型具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。
[0204]寡核苷酸引物和/或探針針對(duì)的，在本發(fā)明公開的試劑盒中包含的標(biāo)記的總數(shù)量可以是至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種。
[0205]在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸引物和/或探針針對(duì)的，在本發(fā)明公開的試劑盒中包含的標(biāo)記可以是選自由以下各項(xiàng)組成的組的至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10,至少11,至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，或至少25種標(biāo)記:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX，EpCAM，ALDHlA3，CD44，ESAjPCD133;(2)間充質(zhì)標(biāo)記:平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1，Smai 1-2, Wnt5B, Goos ecoid, Zeb2, FoxC2,和p23 ;和上皮標(biāo)記:E_ 鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；(3)干性標(biāo)記=Notchl 和 Jaggedl ； (4)mTORCl 標(biāo)記:mT0R, Raptor,4EBPI,和 TSC2 ;和
(5)趨化因子標(biāo)記:RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3，和 CXCL10。
[0206]例如，所述試劑盒可以包含針對(duì)至少3種不同標(biāo)記(其中每種是與另外2種標(biāo)記類型不同的類型)的寡核苷酸引物和/或探針。所述試劑盒可以包含針對(duì)至少4種不同標(biāo)記(其中每種是與另外3種標(biāo)記類型不同的類型)的寡核苷酸引物和/或探針。所述試劑盒可以包含針對(duì)至少5種不同標(biāo)記(其中每種是與另外4種標(biāo)記類型不同的類型)的寡核苷酸引物和/或探針。優(yōu)選地，所述標(biāo)記選自由以下各項(xiàng)組成的組:(I)癌干細(xì)胞標(biāo)記:CAIX，EpCAM，ALDHlA3，CD44，ESAjPCD133 ； (2)間充質(zhì)標(biāo)記；平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1，Smail-2，Wnt5B, Goosecoid, Zeb2，F(xiàn)oxC2，和p23 ;和上皮標(biāo)記:E_鈣黏著蛋白和橋粒斑蛋白；(3)干性標(biāo)記:Notchl 和 Jaggedl ； (4)mTORCl 標(biāo)記:mT0R, Raptor，4EBP1，和 TSC2 ;和(5)趨化因子標(biāo)記:RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3，和 CXCL10。
[0207]在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括陣列或微陣列，寡核苷酸探針附著于該陣列或微陣列。
[0208]本文提供的試劑盒可以用于檢測(cè)或定量生物樣品中生物標(biāo)記的水平。例如，包含蛋白結(jié)合分子的試劑盒可以用于測(cè)量生物標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平。包含生物標(biāo)記-特異的引物或探針的試劑盒可以用于測(cè)量生物標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
[0209]以下實(shí)施例用于說明并不限制。
實(shí)施例
[0210]縮寫:
[0211]CA (碳酸酐酶);TS(腫瘤球);NS(非沉默);EMT (上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)變);FACS (熒光激活細(xì)胞淘選)；EpCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)；RNAi(RNA干擾)；shRNA(小發(fā)夾RNA)；shNS(小發(fā)夾非沉默序列)；shCAIX(小發(fā)夾CAIX特異序列)；IF(免疫熒光)
[0212]材料和方法
[0213]1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0214]已經(jīng)描述了表達(dá)熒光素酶的小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1的獲得，產(chǎn)生和培養(yǎng)(Lou，Preobrazhenska 等人 2008)。MDA_MB-231LM2_4Luc+ 細(xì)胞系由 Robert Kerbel 博士(多倫多大學(xué)，加拿大)慷慨提供并且如之前描述的培養(yǎng)細(xì)胞(Ebos，Lee等人2009)。將所有細(xì)胞在37°C以5% CO2在潮濕的溫箱中孵育(“常氧”)。
[0215]對(duì)于在缺氧條件下的培養(yǎng)，在密封的厭氧工作站中，將細(xì)胞在潮濕的溫箱中維持在用吧平衡的1%02和5%0)2，371:。如之前描述的(Lou，McDonald等人2011)進(jìn)行4T1細(xì)胞中鼠CAIX的穩(wěn)定消耗。
[0216]2.腫瘤球培養(yǎng)
[0217]將培養(yǎng)的4T1細(xì)胞在含有5%胎牛血清(FBS) (Sigma)DMEM(Gibco)中以每周兩次傳代培養(yǎng)為單層。隨后，將親代，shNS和shCAIX4Tl在Mammocult?培養(yǎng)基(StemCellTechnologies, Vancouver, B.C., Canada)中按照制造商的使用說明(Lock, McDonald 等人2012)培養(yǎng)為腫瘤球(TSs)。備選地，為了旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)TS生長(zhǎng)，如之前描述的，將單層細(xì)胞用胰蛋白酶消化并且將單細(xì)胞懸液以2X105至4X105細(xì)胞/ml在密封的玻璃旋轉(zhuǎn)(spinner)培養(yǎng)瓶(Bellco，Vineland，NJ)中在150RPM持續(xù)旋轉(zhuǎn)條件下，在預(yù)平衡于5% CO2的DMEM (5%FBS)中37°C孵育(Oloumi,MacPhaiI等人2000)。培養(yǎng)物生長(zhǎng)達(dá)3周。每3天補(bǔ)充培養(yǎng)基。對(duì)于缺氧條件，將旋轉(zhuǎn)瓶用以 N2平衡的5% O2和5% CO2持續(xù)通氣3天。
[0218]3.抗體
[0219]FACS 抗體:人 EpCAM(CD326)-AlexaFluor647?(B1legend，San Diego, CA)；小鼠-CD24-APC (B1legend);小鼠 / 人 _CD44_PeCy7 (eB1science, San Diego, CA)。
[0220]IHC 抗體:人 CAIX(R&D systems AF2I88) ;ALDH1A3(#LS_C97464，LifespanB1sciences).
[0221]IF 抗體:CD133-FITC(eB1science，San Diego, CA) ;E-鈣黏著蛋白(BDTransduct1n labs#610181),小鼠 CAIX (R&D systems AF2344);平滑肌肌動(dòng)蛋白(Sigma)；Snail (AbCam#ab17732)；
[0222]4.流式細(xì)胞術(shù)分析和分離
[0223]將4TlTSs與胰蛋白酶孵育，在HF緩沖液(含有2%胎牛血清的HBSS)中洗滌一次，隨后以抗-⑶24-APC和抗-⑶44-PECy7使用每10ul HF中的106細(xì)胞0.3 μ I抗體染色，并在冰上孵育10分鐘。孵育之后，用HF緩沖液洗滌細(xì)胞并重懸于含有4'，6- 二脒-2-苯基吲哚(DAPI ;終濃度，I μ g/ml)的300ul HF緩沖液中。在Aria?細(xì)胞分選儀(BD B1sciences,San Jose,CA,USA)上分離細(xì)胞。根據(jù)向前和側(cè)面的散布給活細(xì)胞設(shè)門(gate)，并且根據(jù)向前的散布和脈沖寬度給單個(gè)細(xì)胞設(shè)門。通過分析未染色的細(xì)胞，同型特異對(duì)照，和單染確定門。由于獲得細(xì)胞的低數(shù)量，未評(píng)估⑶44+⑶24-/低或⑶44+⑶24+細(xì)胞的純度。使用流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞收集在DMEM培養(yǎng)及或HF緩沖液中。
[0224]對(duì)于體內(nèi)小鼠腫瘤分析，用刀片精細(xì)地切碎切除的腫瘤，含有10%膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合物的DMEM中在37°C消化1.5h，接著繼續(xù)用胰蛋白酶-EDTA，分散酶和氯化銨處理(來自Stem Cell Technologies的試劑,根據(jù)制造商的使用說明)。在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)盤上，在DMEM+10% FBS中過夜培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于FACS分析，將鋪好細(xì)胞的孔與胰蛋白酶孵育并重懸于HBSS+2% FBS中。將細(xì)胞用小鼠Fe block(#553142, BD Pharmingen)封閉。如上文進(jìn)行抗體染色和細(xì)胞淘選。
[0225]5.免疫熒光
[0226]如之前描述的，固定，透化和免疫染色培養(yǎng)在玻璃蓋玻片上的4T1細(xì)胞(Turner，Broad等人2006)。收集親代4T1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物TSs，和并懸于干冰上的OCT冷凍培養(yǎng)基。一旦冷凍，使用 Cryostar? HM560 恒冷器(Microm Internat1nal, GmbH, Walldorf, Germany)制備5至7 μ m切片。將冷凍切片空氣干燥30秒并轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛固定20分鐘，在PBS中洗滌三次(5分鐘)并在0.2% triton-Χ-ΙΟΟ中透化(10分鐘)。隨后的免疫染色步驟在之前描述(Lock和Hotchin2009)。
[0227]6.RNA提取和定量PCR
[0228]將FACS淘選的細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)并在缺氧條件下裂解。使用QIAGEN RNAeasy?微量試劑盒(Toronto, Ontar1, Canada)根據(jù)制造商的使用說明進(jìn)行mRNA提取。使用PreAMPRT2小鼠上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT) PCR陣列(PAMM-090，Qiagen)，以5至1ng RNA起始物質(zhì)，在 Applied B1systems (Foster City, CA, USA) 7900HT 分析儀上進(jìn)行定量 PCR。使用標(biāo)準(zhǔn)2-Δ Δ ct方法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)變化(Livak和Schmittgen2001)。
[0229]7.藥理學(xué)抑制劑
[0230]對(duì)于體內(nèi)研究，將CAIX特異的抑制劑CA1017 (Supuran2008)，
[0231]

【權(quán)利要求】
1.一種鑒定或證實(shí)推定的癌癥治療劑的方法，所述方法包括: (a)將癌細(xì)胞暴露于推定的癌癥治療劑以獲得治療的癌細(xì)胞， (b)測(cè)量所述治療的細(xì)胞的至少三種標(biāo)記的水平，其中至少三種標(biāo)記中的每種來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自: (1)癌干細(xì)胞標(biāo)記， (2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記， (3)干性標(biāo)記， (4)mT0RCl標(biāo)記，和 (5)趨化因子標(biāo)記； (c)將至少在步驟(b)中測(cè)量的標(biāo)記中每個(gè)的水平與所述至少三種標(biāo)記中每個(gè)的參考水平進(jìn)行比較； 其中，如果在步驟(b)中測(cè)量，癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記水平的降低，以及如果在步驟(b)中測(cè)量，上皮標(biāo)記水平的增加表明所述推定的癌癥治療劑在治療癌癥中有效。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM,ALDH1A3，⑶44，ESA 或 CD133。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1，Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法,其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl。
6.如權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor，4EBPI或 TSC2。
7.如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF,G-CSF，CXCR3 或 CXCLlO。
8.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中至少5種標(biāo)記的水平。
9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記的一種或更多種的表達(dá)水平。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述表達(dá)水平是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的水平。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白表達(dá)的水平。
12.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少三種標(biāo)記包括趨化因子標(biāo)記，并且其中步驟(b)包括測(cè)量由治療的細(xì)胞分泌的趨化因子標(biāo)記的水平。
13.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)包括測(cè)量所述至少三種標(biāo)記的一種或更多種的磷酸化水平。
14.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人癌細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞，腦癌細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，胰腺癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述推定的癌癥治療劑是CAIX抑制劑。
17.一種檢測(cè)細(xì)胞群體中癌干細(xì)胞的存在的方法，包括: (a)測(cè)量細(xì)胞群體的至少三種標(biāo)記水平，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自: (1)癌干細(xì)胞標(biāo)記， (2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記， (3)干性標(biāo)記，
(4)mTORCl 標(biāo)記，和 (5)趨化因子標(biāo)記； (b)將步驟(a)中測(cè)量的至少三種標(biāo)記中每個(gè)的水平與所述至少三種標(biāo)記中每個(gè)測(cè)量的參考水平相比較； 其中，如果在步驟(a)中測(cè)量，癌 干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記水平的增加，以及如果在步驟(a)中測(cè)量，上皮標(biāo)記水平的降低表明細(xì)胞群體中存在癌干細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是04^4?0八140)!1認(rèn)3，^44，ESA 或 CD133。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
20.如權(quán)利要求17至19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
21.如權(quán)利要求17至20任一項(xiàng)所述的方法,其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl。
22.如權(quán)利要求17至21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor,4EBP1 或 TSC2。
23.如權(quán)利要求17至22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF,G-CSF，CXCR3 或 CXCLlO。
24.如權(quán)利要求17至23任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)量選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中至少5種標(biāo)記的水平。
25.如權(quán)利要求17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量所述至少三種標(biāo)記中的一種或更多種的表達(dá)水平。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表達(dá)水平是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表達(dá)水平是蛋白表達(dá)水平。
28.如權(quán)利要求17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少三種標(biāo)記包括趨化因子標(biāo)記，并且其中步驟(a)包括測(cè)量由細(xì)胞群體分泌的趨化因子標(biāo)記水平。
29.如權(quán)利要求17至24任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)包括測(cè)量至少三種標(biāo)記中的一種或更多種的磷酸化水平。
30.如權(quán)利要求17至29任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞群體來自人生物樣品。
31.如權(quán)利要求17至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌干細(xì)胞是乳腺癌干細(xì)胞，腦癌干細(xì)胞，結(jié)腸癌干細(xì)胞，卵巢癌干細(xì)胞，胰腺癌干細(xì)胞，前列腺癌干細(xì)胞，黑色素瘤干細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求17至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞群體來自癌癥治療后的癌癥患者。
33.一種治療癌癥的方法，所述方法包括: (a)檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求17至32任一項(xiàng)所述的癌癥樣品中癌干細(xì)胞的存在，其中所述細(xì)胞群體來自所述癌癥樣品，和 (b)如果在所述癌癥樣品中檢測(cè)到癌干細(xì)胞，向患者施用有效量的CAIX抑制劑。
34.一種治療癌癥的方法，所述方法包括:向患者施用有效量的CAIX抑制劑，其中所述患者已被診斷含有根據(jù)權(quán)利要求17至32任一項(xiàng)所述的癌干細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求33或權(quán)利要求34所述的方法，其中所述CAIX抑制劑是MST-104或MST-205。
36.如權(quán)利要求33至35任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括向患者施用有效量的紫杉烷。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。
38.一種試劑盒，其包含對(duì)至少三種標(biāo)記具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型標(biāo)記選自: (1)癌干細(xì)胞標(biāo)記， (2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記， (3)干性標(biāo)記，
(4)mTORCl 標(biāo)記，和 (5)趨化因子標(biāo)記。
39.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM,ALDH1A3，CD44，ESA 或 CD133。
40.如權(quán)利要求38或39所述的試劑盒，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1, Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
41.如權(quán)利要求38至40任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
42.如權(quán)利要求38至41任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl0
43.如權(quán)利要求38至42任一項(xiàng)所述的試劑盒,其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR,Raptor,4EBP1 或 TSC2。
44.如權(quán)利要求38至43任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3 或 CXCLlO。
45.如權(quán)利要求38至44任一項(xiàng)所述的試劑盒，其包含對(duì)選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中的至少5種標(biāo)記具有特異性結(jié)合親和力的蛋白結(jié)合分子。
46.如權(quán)利要求38至45任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括陣列，所述蛋白結(jié)合分子附著于該陣列。
47.一種試劑盒，其包含對(duì)至少三種標(biāo)記特異性的寡核苷酸引物或探針，其中至少三種標(biāo)記中每個(gè)來自不同類型的標(biāo)記，所述不同類型的標(biāo)記選自: (I)癌干細(xì)胞標(biāo)記，(2)選自間充質(zhì)標(biāo)記和上皮標(biāo)記的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)記， (3)干性標(biāo)記，
(4)mTORCl 標(biāo)記，和 (5)趨化因子標(biāo)記。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中所述癌干細(xì)胞標(biāo)記是CAIX，EpCAM,ALDH1A3，CD44，ESA或 CD133。
49.權(quán)利要求47或48的試劑盒，其中所述間充質(zhì)標(biāo)記是平滑肌肌動(dòng)蛋白，Snail-1，Snail-2, Wnt5B, Goosecoid, Zeb2, FoxC2 或 p23。
50.如權(quán)利要求47至49任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述上皮標(biāo)記是E-鈣黏著蛋白或橋粒斑蛋白。
51.如權(quán)利要求47至50任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述干性標(biāo)記是Notchl或Jaggedl0
52.如權(quán)利要求47至51任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述mTORCl標(biāo)記是mTOR，Raptor,4EBP1 或 TSC2。
53.如權(quán)利要求47至52任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述趨化因子標(biāo)記是RANTES，PIGF, G-CSF, CXCR3 或 CXCLlO。
54.如權(quán)利要求47至53任一項(xiàng)所述的試劑盒，其包括對(duì)選自癌干細(xì)胞標(biāo)記，間充質(zhì)標(biāo)記，上皮標(biāo)記，干性標(biāo)記，mTORCl標(biāo)記和趨化因子標(biāo)記中的至少5種標(biāo)記特異性的寡核苷酸探針或引物。
55.如權(quán)利要求47至54任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括陣列，所述寡核苷酸探針附著于該陣列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104136629SQ201280064274
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月24日
【發(fā)明者】保羅·C·麥克唐納, 弗朗西絲·E·洛克, 舒卡特·德哈爾 申請(qǐng)人:瑪特辛格納治療股份有限公司, 不列顛哥倫比亞癌癥研究所