重組固氮細(xì)菌菌株、含有所述菌株的接種物以及應(yīng)用方法
【專利摘要】重組細(xì)菌菌株，所述重組細(xì)菌菌株在其基因組中包含異源nif基因并且能夠固氮。所述菌株可以是例如在其基因組中包含異源nif基因的重組熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)菌株。還描述了用于提高植物生產(chǎn)力的接種物和方法。
【專利說(shuō)明】重組固氮細(xì)菌菌株、含有所述菌株的接種物以及應(yīng)用方法
[0001]本申請(qǐng)涉及重組固氮(nitrogen-fixing)細(xì)菌菌株、含有所述菌株的接種物(inoculum)和應(yīng)用方法。更具體地，其涉及包含異源nif基因并且能夠固氮的重組細(xì)菌菌株。

【背景技術(shù)】
[0002]已經(jīng)描述了兩種旨在改進(jìn)在氮缺乏土壤中生長(zhǎng)之植物的生產(chǎn)力的處理/技術(shù):(a)用含氮化合物(例如尿素)施肥以及(b)用固氮細(xì)菌接種。存在兩種類型的固氮細(xì)菌:(bl)共生細(xì)菌,其與豆科植物聯(lián)合固氮(例如根瘤菌屬(Rhizobium sp.)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium sp.))和(b2)獨(dú)立生存的固氮細(xì)菌(例如巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii))。使用第一種類型成功地改進(jìn)了在氮貧乏的土壤中生長(zhǎng)之農(nóng)作物的生產(chǎn)力，但其僅適用于豆科植物。第二種類型可以用于所有類型的植物(不僅針對(duì)豆科植物)。然而，還沒(méi)有表明由這些細(xì)菌固定的氮足以克服在氮貧乏的土壤中生長(zhǎng)之植物所遭受的氮缺乏。盡管這樣，目前在接種物的制備中使用例如巴西固氮螺菌(A.brasilense)和棕色固氮菌(A.vinelandii)的種，因?yàn)檫@樣的細(xì)菌產(chǎn)生能夠刺激根發(fā)育的植物激素。這是農(nóng)學(xué)上重要的特性，但其與這些細(xì)菌的固氮能力沒(méi)有關(guān)系O
[0003]專利申請(qǐng)EP0108508描述了用固氮相關(guān)基因修飾的大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株。然而，該大腸桿菌(E.coli)菌株不用于改進(jìn)在氮貧乏的土壤中生長(zhǎng)之植物的生產(chǎn)力，而是為了將固氮能力轉(zhuǎn)移到其他微生物(例如大豆根瘤菌(Rhizobiumjaponicum))。
[0004]發(fā)明概述
[0005]本發(fā)明的一個(gè)主題是提供細(xì)菌菌株，例如包含nif基因的重組熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。這樣的菌株將能夠固氮并且已經(jīng)用黏粒X940轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因；PST_1307至PST_1312基因已經(jīng)被缺失或替換，已經(jīng)插入了來(lái)自質(zhì)粒pUC4K(X06404)的卡那霉素抗性基因。對(duì)PST基因的描述可參見(jiàn)下列網(wǎng)址:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1 和 http://www.b1medcentral.com/1471-2164/11/110 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組熒光假單胞菌菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因以及卡那霉素抗性基因。對(duì)于從業(yè)人員(expert)而言明顯的是，在所提供的實(shí)例的基礎(chǔ)上，任何人可通過(guò)使用本文所述的微生物轉(zhuǎn)化和構(gòu)建技術(shù)從不固氮的菌株獲得不同的固氮細(xì)菌菌株和種。因此，用異源nif基因轉(zhuǎn)化的形成固氮能力的任何細(xì)菌菌株或種落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。nif基因可以是任何已知和公開(kāi)的那些，例如在下列網(wǎng)址上公開(kāi)的 PST_1302 至 PST_1306 和 PST_1313 至 PST_1359 基因:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/CP000304.1 和 http://www.b1medcentral.com/1471-2164/11/110 基于可從本申請(qǐng)學(xué)到的，可將這樣的基因引入不固氮的細(xì)菌并且將它們轉(zhuǎn)化成固氮細(xì)菌，此外這高效地改進(jìn)植物生產(chǎn)力。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)主題是提供旨在改進(jìn)植物生產(chǎn)力的接種物，其包含重組細(xì)菌(例如熒光假單胞菌)，伴隨這種菌株包含異源nif基因和載劑。所述接種物可以包含
8.108-2.1O9個(gè)細(xì)胞/ml?；趶乃峁┑膶?shí)例可得知的，從業(yè)人員可通過(guò)使用本發(fā)明的重組細(xì)菌制備不同的接種物，所有所述接種物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)主題是提供改進(jìn)植物中固氮的方法，其需要用含有異源nif基因的這種細(xì)菌向土壤施加包含1.6108至4108之量的重組細(xì)菌(例如熒光假單胞菌)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)菌菌株包含PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因；而PST_1307至PST_1312基因已經(jīng)被缺失或替換，已經(jīng)插入了卡那霉素抗性基因，例如來(lái)自質(zhì)粒pUC4K(X06404)的抗性基因。所述植物可以是已知的任何一種，例如單子葉植物或雙子葉植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括向土壤每升土壤體積施加包含
1.6108至4108之量的重組細(xì)菌(例如熒光假單胞菌)。如可觀察到的，所述方法可應(yīng)用至任何種類的植物和氮貧乏的土壤。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1:圖1示出用黏粒X940轉(zhuǎn)化假單胞菌(Pseudomonas)Pf-5的影響。有蓋的錐形瓶(Erlenmeyer flask)模擬微需氧生活(microaerob1sis)條件并且封口膜(Parafilm)密封的錐形瓶模擬需氧生活(aerob1sis)條件。采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為AN0VA，繼之進(jìn)行Tukey對(duì)比。字母指比較性處理。相同的字母指統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。a和b示出具有P < 0.01的顯著性差異。
[0009]圖2:圖2示出在存在或不存在氮的基質(zhì)中，接種Pf_5X940對(duì)苜蓿植株之生長(zhǎng)的影響。采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為AN0VA，繼之進(jìn)行Tukey對(duì)比。在不同氮條件下在基質(zhì)中接受相同接種處理的植物間進(jìn)行比較。* * P < 0.01且* * * P < 0.001。
[0010]圖3:圖3示出在存在或不存在氮的基質(zhì)中，接種Pf_5X940對(duì)擬南芥蓮座葉(Arabidopsis rosette)尺寸的影響。采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為AN0VA,繼之進(jìn)行Tukey對(duì)比。在不同氮條件下在基質(zhì)中接受相同接種處理的植物間進(jìn)行比較。**p<0.01且
P < 0.001, N.S.:不顯著。
[0011]圖4:圖4示出在存在或不存在氮的基質(zhì)中，接種Pf_5X940對(duì)高羊茅(TallFescue)之第一葉寬度的影響。采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為AN0VA,繼之進(jìn)行Tukey對(duì)比。在不同氮條件下在基質(zhì)中接受相同接種處理的植物間進(jìn)行比較。**p<0.01且***p<0.001,N.S.:不顯著。
[0012]圖5:圖5示出黏粒X940的示意圖。
[0013]圖6:圖6以圖解示出構(gòu)建黏粒X940的過(guò)程。B =BamHI, S =SalI和M =Mbo10
[0014]發(fā)明詳述
[0015]作為本發(fā)明目標(biāo)的重組固氮細(xì)菌菌株在技術(shù)上開(kāi)啟了質(zhì)的飛躍。本 申請(qǐng)人:未了解到旨在獲得通過(guò)可重復(fù)的、高效的技術(shù)(例如基因工程和轉(zhuǎn)化)獲得可形成固氮能力之微生物的任何技術(shù)。本發(fā)明接種物的可用性擴(kuò)大了旨在解決由土壤中氮可用性受限造成之問(wèn)題的接種物的范圍(field)，因?yàn)槠洳粌H采用天然細(xì)菌分離(非重組細(xì)菌)還采用用固定氮之nif基因轉(zhuǎn)化的重組細(xì)菌,例如用施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501的PST_1302 至 PST_1306 和 PST_1313 至 PST_1359 基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。
[0016]已經(jīng)制備細(xì)菌菌株，例如包含例如施氏假單胞菌A1501菌株之nif基因的重組熒光假單胞菌，這種重組菌株在被攜帶nif基因的黏粒X940轉(zhuǎn)化時(shí)能夠固氮。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述菌株包含施氏假單胞菌A1501的PST_1302至PST_1306和PST_1313至PST_1359基因。被轉(zhuǎn)化的菌株稱為Pf_5X940。
[0017]本發(fā)明陳述了重要的定量結(jié)果，因?yàn)橛肞f_5X940接種導(dǎo)致在氮貧乏之土壤中生長(zhǎng)的植物相關(guān)之生產(chǎn)力提高了超過(guò)200%，而用棕色固氮菌BMN0359(棕色固氮菌種的模式菌株，其固氮并且由 Agronomy School of the University of Buenos Aires 的 Nat1nalBank of Microorganisms提供)接種不產(chǎn)生顯著的變化，因此當(dāng)固定大量的氮時(shí)如獨(dú)立生存的細(xì)菌與天然細(xì)菌(未被轉(zhuǎn)化的那些)的零/低效率保持一致。
[0018]在不含氮(-(NH4)2SO4)的L培養(yǎng)基(半合成培養(yǎng)基)或補(bǔ)充氮的培養(yǎng)基(+(NH4)2SO4)中，在實(shí)驗(yàn)室條件下經(jīng)受需氧生活或微需氧生活48小時(shí)的一段時(shí)間評(píng)估野生細(xì)菌(Pf-5)和重組細(xì)菌(Pf-5X940)的生長(zhǎng)(圖1)。在第一個(gè)24小時(shí)過(guò)程中，僅補(bǔ)充氮的培養(yǎng)物生長(zhǎng)，而在48小時(shí)的階段后，在微需氧生活條件下在不含氮的L培養(yǎng)基中的Pf-5X940細(xì)菌也有相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)(圖1)。I).重組細(xì)菌在不含氮的L培養(yǎng)基中在需氧生活條件下沒(méi)有示出生長(zhǎng)的跡象，因此表明異源固氮酶復(fù)合物是對(duì)大氣氧敏感的。這不奇怪，因?yàn)橐阎泽w同源固氮酶復(fù)合物與氣態(tài)氧接觸被不可逆抑制(B1chemistryl994, 33:389-397)。
[0019]在不含氮的L培養(yǎng)基中在微需氧生活條件下Pf_5X940重組細(xì)菌的生長(zhǎng)通過(guò)集落形成單位計(jì)數(shù)定量(圖1)。可以觀察到，在不含氮的L培養(yǎng)基中在微需氧生活條件下，僅Pf-5培養(yǎng)物中的細(xì)菌數(shù)量加倍I代)，而Pf_5X940培養(yǎng)物表明細(xì)菌量的提高超過(guò)了三個(gè)等級(jí)12代)(圖1)。因此，圖1示出用黏粒X940轉(zhuǎn)化賦予Pf-5細(xì)菌固氮能力，并且因此賦予了無(wú)需有機(jī)和/或無(wú)機(jī)氮源生長(zhǎng)的本領(lǐng)。
[0020]進(jìn)行用Pf-5、Pf-5X940和棕色固氮菌BMN0359接種對(duì)三種植物生長(zhǎng)之影響的評(píng)估，所述三種植物屬于在農(nóng)學(xué)和經(jīng)濟(jì)層面上兩個(gè)最重要的植物群:雙子葉植物苜蓿(圖2)和擬南芥(圖3)以及單子葉植物羊茅(Fescue)(圖4)。種植這三種植物作為水栽培系統(tǒng)的一部分，并且用帶有Pf-5、Pf-5X940或棕色固氮菌BMN0359接種物或不帶有接種物(對(duì)照)的最小量的稱為“INTA13”之不含氮(-Ca(NO3)2)最低培養(yǎng)基或補(bǔ)充氮的培養(yǎng)基(+Ca(NO3)2)灌溉。生長(zhǎng)40天后，當(dāng)與補(bǔ)充了氮的相同培養(yǎng)基比較時(shí)，未接種或用Pf-5和BMN0359野生細(xì)菌接種的植物在不含氮的稱作INTA13的培養(yǎng)基中示出顯著更低的生產(chǎn)力(圖2、圖3和圖4)。通過(guò)用Pf-5X940重組細(xì)菌接種完全克服了無(wú)氮培養(yǎng)基中的這種生產(chǎn)力缺乏(圖2、圖3和圖4)。實(shí)際上，接種Pf_5X940的并在稱為INTA13的無(wú)氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的苜蓿植物之生產(chǎn)力顯著高于在補(bǔ)充氮的INTA13中生長(zhǎng)的沒(méi)有用野生細(xì)菌接種或用野生細(xì)菌接種的該植物中觀察到的生產(chǎn)力(圖2)。圖2、3和4示出用Pf-5X940接種構(gòu)成了改進(jìn)在氮受限條件下生長(zhǎng)之植物的生產(chǎn)力的有效方法。
[0021]還通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例不旨在限制其范圍。因此，必須清楚地理解，如果閱讀本說(shuō)明書(shū)后會(huì)提示本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可采用本發(fā)明的其他實(shí)施方案、修改和等同方案，只要它們不背離本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求書(shū)的范圍即可。
實(shí)施例
[0022]實(shí)施例1:本發(fā)明之重組細(xì)菌的構(gòu)建
[0023]通過(guò)使用以下引物的PCR獲得(CP000304)施氏假單胞菌A1501之PST_1306-PST_1307 和 PST_1312_PST_1313 基因間區(qū)的兩個(gè) 255bp 區(qū)段:
[0024]SEQ ID N。I:5 ; CGGGATCCCCGAATAGAGGTCTGTCCCCG3 ;
[0025]SEQ ID N° 2:5 ; CGGGATCCCCGGGGCGCTGGTGC3'
[0026]SEQ ID N。 3:5 ; CGGTCGACTCGGTGCGGCGCTCG3 ;-
[0027]SEQ ID N° 4:5 ' CGGTCGACGCCAAGGCCGCCCGC3 ;，
[0028]其中BamHI和Sal I限制位點(diǎn)分別用下劃線表示。用于這兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的PCR循環(huán)如下:在94 °C (201.2° F) 3分鐘；34個(gè)循環(huán)(在94 °C (201.2 ° F)45秒-在50 0C (I22。F)30 秒-在 72°C (161.6° F) 3O 秒)以及在 72°C (161.1° F) 10 分鐘。對(duì)應(yīng)于PST_1306-PST_1307基因間區(qū)的擴(kuò)增片段用BamHI消化并與從用BamHI消化的質(zhì)粒pUC4K(X06404)獲得的卡那霉素抗性基因相連接，產(chǎn)生質(zhì)粒A。對(duì)應(yīng)于PST_1312_PST_1313基因間區(qū)的擴(kuò)增區(qū)段用SalI消化并克隆到用SalI消化的質(zhì)粒A中，產(chǎn)生質(zhì)粒B。由于其基于在假單胞菌中不復(fù)制的質(zhì)粒pUC4K (Ayub等，Extremophiles200913 (I):59-66),質(zhì)粒B是屬于假單胞菌屬之細(xì)菌的自殺載體。根據(jù)下文中所述的方案通過(guò)電穿孔用質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化施氏假單胞菌A1510感受態(tài)細(xì)胞。所述細(xì)菌在125ml錐形瓶里的25ml LB中在28°C (82.4° F)培養(yǎng)，伴隨以250rpm 攪拌16小時(shí)。取1.5ml的該培養(yǎng)物并在25°C (77° F)以16，OOOg離心I分鐘。然后將細(xì)菌沉淀在Iml的310mM蔗糖溶液中清洗3次并重懸在100 μ I的300mM蔗糖溶液中。根據(jù)CFU/ml測(cè)量，這些100 μ I的重懸細(xì)菌具有19至1ltl個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。對(duì)于電穿孔，100 μ I的重懸細(xì)菌使用0.5 μ g的質(zhì)粒B,隨后施用以下脈沖(25AF，200V, 2.5kV)。然后向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞添加Iml的LB并且將其在2ml體積的輕微震蕩(以10rpm)的Eppendorf管中于25°C (77° F)孵育3小時(shí)。接著，在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂中選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。選擇卡那霉素抗性的菌落(克隆)并稱為A1501C。這種菌株在不含氮(即不添加(MM)2SO4)的L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)能夠固氮。
[0029]用Aval消化SuperCosl黏粒(M99566.1)(載體)并以消除其卡那霉素抗性區(qū)(neoR報(bào)道基因盒)為目的進(jìn)行重新連接，產(chǎn)生稱為C的重組載體。然后載體C用BamHI和XbaI消化，并與用MboI消化的A1501C細(xì)菌之基因組DNA的區(qū)段相連接，所述區(qū)段通過(guò)大腸桿菌中A1501C的基因組文庫(kù)獲得。接著，在這種文庫(kù)中尋找并發(fā)現(xiàn)50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml氨芐青霉素抗性的克隆。這種菌株的經(jīng)分離的重組黏粒被稱為X940 (圖5)并且其序列通過(guò)引物步移(primer walking)確認(rèn)A1501細(xì)菌nif基因的存在。使用與之前段落中描述A1501施氏假單胞菌的相同電穿孔方案，通過(guò)轉(zhuǎn)化將黏粒X940引入由Pf-5熒光假單胞菌構(gòu)成的細(xì)胞中。在具有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂中選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。含有黏粒X940的Pf-5熒光假單胞菌重組細(xì)菌稱為“Pf_5X940”。圖6示出整個(gè)黏粒X940構(gòu)建過(guò)程和本發(fā)明稱作“Pf-5X940”的經(jīng)轉(zhuǎn)化菌株之獲得(procurement)的示意圖。
[0030]實(shí)施例2:細(xì)菌生長(zhǎng)條件
[0031]在28°C(82.4° F)，以300rpm震蕩的含有25ml經(jīng)孵育L培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中制備培養(yǎng)物。根據(jù)下式制備L培養(yǎng)基:lg KH2PO4,3g Κ2ΗΡ04、0.Ig NaCl,0.5g(ΝΗ4)2S04、0.25gMgS047H20、lmg FeCl36H20、0.017mg CuC122H20、0.029mg ZnS047H20、0.144mg MnCl2H2O,0.147mg CaCl22H20、0.005mg NaMo04、Ig 檸檬酸、5g 葡萄糖、10mg 酵母提取物，1L，pH = 7。使用稱為需氧生活(錐形瓶用封口膜覆蓋)和微需氧生活(錐形瓶用螺紋蓋覆蓋)的兩種通氣條件。為了評(píng)估在受限氮條件中的生長(zhǎng)，使用不添加氮(即不添加(MM)2SO4)的L培養(yǎng)基。培養(yǎng)從0.05-580nm的光密度開(kāi)始。使用預(yù)培養(yǎng)以使得培養(yǎng)在相同條件下進(jìn)行，如具有持續(xù)時(shí)間為24小時(shí)之孵育的培養(yǎng)(125ml錐形瓶中25ml的L培養(yǎng)基，在28°C (82.4° F)，以300rpm)。預(yù)培養(yǎng)物自LB瓊脂板遞送。在接種培養(yǎng)物前，在不含氮的L培養(yǎng)基中洗滌預(yù)培養(yǎng)物兩次(速度:16，000g，持續(xù)時(shí)間:1分鐘)以消除從預(yù)培養(yǎng)到培養(yǎng)的氮供應(yīng)。48小時(shí)的持續(xù)時(shí)間中使用580nm的光密度測(cè)量并通過(guò)每毫升培養(yǎng)物的集落形成單位計(jì)數(shù)(CFU/ml)評(píng)估細(xì)菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)。
[0032]實(shí)施例3:接種物的制備
[0033]從LB瓊脂板，在含有25ml的經(jīng)孵育L培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中，于28V (82.4° F)伴隨300rpm持續(xù)震蕩24小時(shí)制造培養(yǎng)物。在10，OOOg離心培養(yǎng)物5分鐘，并且在25ml的生理鹽水(FS:9g NaCl/1)中重懸。然后評(píng)估這些重懸的培養(yǎng)物中存在的細(xì)菌量，其導(dǎo)致以下范圍值:8.108-2.109CFU/ml。每個(gè)I升體積的罐(pot)接種0.2ml的重懸培養(yǎng)物。
[0034]實(shí)施例4:接種測(cè)定
[0035]為進(jìn)行接種測(cè)定，將哥倫比亞-O擬南芥(Arabidopsis thaliana)、Schenodorusarundinaceus (Festuca Alta Gentos)和紫花苜猜(Medicago sativa)(苜猜 GAPP969)種子滅菌并在黑暗中于4°C持續(xù)春化(vernalize#天時(shí)間。然后，植物在以下條件下于23°C室內(nèi)孵育:16小時(shí)亮/8小時(shí)暗的光周期，光強(qiáng)度為150μπιΟ1 !!^秒―1，分別地在特征為泥炭(peat)、珍珠石(perlite)和蛭石(vermiculite)混合物(1:1:1體積/體積)、珍珠石和蛭石混合物(I: I體積/體積)或100%蛭石的水栽培條件下。植物在含有或不含有
0.24g/L 〇&(勵(lì)3)24!120作為氮源的1見(jiàn)7\13培養(yǎng)基(0.13g CaCl22H20、0.25g MgS047H20、0.14gNa2HPO4、0.Ig KH2PO4λ Img Na2Mo042H20、0.6mg MnSO4H2OΛ Img CuS045H20、Img ZnS047H20、ImgH3B03、4mg FeCl36H20,1L, pH = 6.5)中生長(zhǎng) 40 天時(shí)間。
[0036]罐和罐盤都用70%乙醇滅菌。用作支持物的基質(zhì)(泥炭、珍珠石和蛭石)被加熱滅菌(在350°C持續(xù)30分鐘)，然后用無(wú)菌蒸餾水清洗兩次以除去殘余的鹽。如下文中所述，春化后立即進(jìn)行細(xì)菌(Pf-5、Pf-5X940和棕色固氮菌BMN0359)接種。取在L培養(yǎng)基中在28V (82.4° F)生長(zhǎng)過(guò)夜的細(xì)菌培養(yǎng)物25ml然后離心；沉淀在25ml的生理鹽水中重懸。然后，用200 μ I的這種細(xì)菌懸浮液(1.6108至4108細(xì)菌)接種每個(gè)I升體積的罐。
[0037]

【權(quán)利要求】
1.因而，已經(jīng)描述和確定的本發(fā)明之本質(zhì)及其應(yīng)當(dāng)付諸實(shí)踐的方式，其排他權(quán)和所有權(quán)在此主張和要求如下:重組細(xì)菌菌株，其特征在于這樣的菌株包含異源nif基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于這樣的菌株能夠固氮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述異源nif基因來(lái)自施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于這樣的菌株經(jīng)黏粒X940轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述菌株是包含異源nif基因的重組熒光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)菌株。
6.提高植物生產(chǎn)力的接種物，其特征在于這樣的接種物包含至少一種轉(zhuǎn)化入異源nif基因的重組細(xì)菌菌株；以及載劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的接種物，其中所述重組菌株是熒光假單胞菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的接種物，其中所述異源nif基因來(lái)自施氏假單胞菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的接種物，其特征在于這樣的接種物包含8.1O8至2.1O9的CFU/
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的接種物，其特征在于這樣的接種物包含選自包含以下之組的載劑:生理鹽水、水和培養(yǎng)基。
11.用于提高植物中固氮作用的方法，其特征在于這樣的方法包括向土壤施加每升.1.6108至4108量的重組細(xì)菌菌株，其中所述重組菌株包含異源nif基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述重組細(xì)菌菌株是熒光假單胞菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述重組細(xì)菌菌株包含來(lái)自施氏假單胞菌的異源nif基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物選自擬南芥和苜蓿。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述植物為羊茅。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104136599SQ201280064329
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月24日
【發(fā)明者】加布里埃拉·辛蒂亞·索托, 尼古拉斯·丹尼爾·阿尤卜, 洛雷娜·馬里亞·塞滕 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)和技術(shù)研究委員會(huì)(Conicet), 國(guó)家農(nóng)業(yè)技術(shù)研究院（Inta）, Inis生物技術(shù)有限責(zé)任公司