以生物鐘為指標(biāo)的低品質(zhì)ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞簡單判別方法的開發(fā)，和以生物鐘為指標(biāo)的細(xì) ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括：分析從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞中時(shí)鐘基因的表達(dá)，和基于表達(dá)程度評(píng)價(jià)所述多能干細(xì)胞。
【專利說明】以生物鐘為指標(biāo)的低品質(zhì)ES細(xì)胞和i PS細(xì)胞簡單判別方法的開發(fā)，和以生物鐘為指標(biāo)的細(xì)胞評(píng)價(jià)方法的開發(fā)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以生物鐘作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]使用ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞提供再生醫(yī)學(xué)的最大問題，是從移植的細(xì)胞衍生的疾病如癌癥的發(fā)作，其最大的原因據(jù)稱是未分化細(xì)胞的污染。另外，一些由ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞的低品質(zhì)引起的問題也被指出。因而，在通過使用細(xì)胞移植實(shí)現(xiàn)再生醫(yī)學(xué)中，ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的品質(zhì)控制非常重要。因此，日本和海外的研究者已經(jīng)開發(fā)了各種方法并一直在致力于建立iPS細(xì)胞的品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]非專利文獻(xiàn)I公開了 ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞不具有生物鐘，并且生物鐘由試管內(nèi)分化誘導(dǎo)形成。然而，文中不包含關(guān)于ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞的品質(zhì)評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)。
[0004]在先技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]非專利文獻(xiàn)
[0006]非專利文獻(xiàn)1:K.Yagita等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.NATL.AcadSc1.USA),2010 年 2 月 23 H ；107 (8) 3846-3851 ο
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明所要解決的課題
[0008]本發(fā)明的目的是提供用于評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞的方法和試劑盒。
[0009]解決問題的手段
[0010]地球上大多數(shù)活生物體具有約24小時(shí)周期的生物鐘(即晝夜節(jié)律鐘)以便知道每天的時(shí)間。哺乳動(dòng)物在幾乎其整個(gè)身體的細(xì)胞中具有生物鐘，并且它是參與細(xì)胞功能的控制。在以往的研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，多能干細(xì)胞(“多功能細(xì)胞”)諸如ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞沒有生物鐘，并且當(dāng)這些細(xì)胞進(jìn)行分化時(shí)發(fā)育生物鐘。
[0011]當(dāng)基于上述發(fā)現(xiàn)研究細(xì)胞分化過程中生物鐘的發(fā)育機(jī)理時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，生物鐘在具有異常表達(dá)諸如癌癥基因的多能干細(xì)胞(例如ES細(xì)胞)中不正常發(fā)育，即使細(xì)胞是分化的。本發(fā)明人認(rèn)為，通過使用該性質(zhì)并檢查用于再生醫(yī)學(xué)的多能干細(xì)胞如iPS細(xì)胞或ES細(xì)胞由于細(xì)胞分化而發(fā)育生物鐘的能力，將可以排除不能發(fā)育至少體細(xì)胞具有的生物鐘的細(xì)胞。發(fā)明人從而確定了這樣一種方法的建立。
[0012]在這種情況下，本發(fā)明人開發(fā)了通過使用生物鐘作為指標(biāo)，用于簡單和定量地評(píng)價(jià)包括iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞的多能干細(xì)胞的品質(zhì)的方法。
[0013]本發(fā)明提供用于評(píng)價(jià)的下列方法和試劑盒。
[0014]項(xiàng)目1.用于評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括:分析從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞中時(shí)鐘基因的表達(dá)；和基于所述表達(dá)程度評(píng)價(jià)所述多能干細(xì)胞。
[0015]項(xiàng)目2.根據(jù)項(xiàng)目I的方法，其中所述時(shí)鐘基因是Per2和/或Bmall和/或Dbp。[0016]項(xiàng)目3.根據(jù)項(xiàng)目I的方法，其中所述多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
[0017]項(xiàng)目4.根據(jù)項(xiàng)目I的方法，所述方法還包括將基因構(gòu)建體引入到要評(píng)價(jià)的多能干細(xì)胞中，所述基因構(gòu)建體包括連接到所述時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其中所述分析包括基于所述報(bào)告基因的表達(dá)分析時(shí)鐘基因的表達(dá)模式。
[0018]項(xiàng)目5.根據(jù)項(xiàng)目4的方法，其中所述報(bào)告基因是熒光蛋白基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
[0019]項(xiàng)目6.—種用于評(píng)價(jià)包含基因構(gòu)建體的多能干細(xì)胞的試劑盒，所述基因構(gòu)建體包括連接到時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因。
[0020]項(xiàng)目7.根據(jù)項(xiàng)目6的試劑盒，其中所述時(shí)鐘基因是Per2和/或Bmall和/或Dbp。
[0021]項(xiàng)目8.根據(jù)項(xiàng)目6的試劑盒，其中所述多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
[0022]項(xiàng)目9.根據(jù)項(xiàng)目6的試劑盒，其中所述報(bào)告基因是熒光蛋白基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
[0023]發(fā)明的效果 [0024]根據(jù)本發(fā)明，由于生物鐘在具有異常表達(dá)諸如癌癥基因的多能性干細(xì)胞中不正常發(fā)育，所以這樣的多能干細(xì)胞可以從正常的多能干細(xì)胞排除。因而，沒有成癌風(fēng)險(xiǎn)的多能干細(xì)胞的早期選擇和使用已成為可能。雖然已經(jīng)使用多能干細(xì)胞進(jìn)行了多種研究，但是期望通過選擇沒有成癌風(fēng)險(xiǎn)的多能干細(xì)胞進(jìn)行更適當(dāng)?shù)难芯俊?br> [0025]根據(jù)本發(fā)明，通過檢查由于再生醫(yī)學(xué)中使用的多能干細(xì)胞諸如iPS細(xì)胞和EP細(xì)胞的細(xì)胞分化而發(fā)育生物鐘的能力，可以排除不能發(fā)育至少體細(xì)胞具有的生物時(shí)鐘的細(xì)胞。因而，建立了簡單且定量的評(píng)價(jià)包括iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞的多能干細(xì)胞的品質(zhì)的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1:圖1顯示當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)正常小鼠ES細(xì)胞(高品質(zhì)iPS細(xì)胞的模型)分化時(shí)，出現(xiàn)的生物時(shí)鐘振蕩。
[0027]圖2:圖2顯示當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)特征在于癌基因c-Myc (低品質(zhì)ES/iPS細(xì)胞的模型)的弱表達(dá)的ES細(xì)胞分化時(shí)，出現(xiàn)的生物鐘振蕩，并顯示用快速傅立葉變換的頻率分析。
[0028]圖3:圖3顯示正常ES細(xì)胞由于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)而發(fā)育生物鐘的能力的定量評(píng)價(jià)。
(A)關(guān)于分化誘導(dǎo)以后第7天、第14天、第21天、第28天和第35天的相對(duì)生物發(fā)光強(qiáng)度。
(B)在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天的相對(duì)功率。更高的相對(duì)功率表示生物鐘的更清晰振蕩。
[0029]圖4:圖4顯示分化之前和體外分化誘導(dǎo)后4周的人iPS細(xì)胞(hiPS)的生物發(fā)光強(qiáng)度。晝夜節(jié)律鐘的形成是通過分化誘導(dǎo)再生的。
【具體實(shí)施方式】
[0030]在說明書中，時(shí)鐘基因包括Clock、BmalU Period (Perl、Per2、Per3)、隱花色素(CRY1、CRY2)、大鼠白蛋白啟動(dòng)子D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(Dbp)，諸如此類。優(yōu)選的時(shí)鐘基因是Bmal 1、Per2 和 Dbp。
[0031]本發(fā)明的方法能夠分析至少一個(gè)時(shí)鐘基因的表達(dá)。分析表達(dá)包括測量時(shí)鐘基因的表達(dá)量。測量時(shí)鐘基因的表達(dá)量可通過測量可表達(dá)地連接到時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因的表達(dá)量而進(jìn)行。
[0032]多能干細(xì)胞是指能夠分化成至少兩種類型細(xì)胞并具有停止的或者幾乎停止的時(shí)鐘基因的細(xì)胞。優(yōu)選的多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞，但不限于這些細(xì)胞，任何可以分成至少兩種類型的細(xì)胞并具有停止或幾乎停止的時(shí)鐘基因的細(xì)胞包括在本發(fā)明中要評(píng)價(jià)的多能干細(xì)胞中。因?yàn)闀r(shí)鐘基因在被稱為成體干細(xì)胞的細(xì)胞中起作用，因此這些細(xì)胞不包括在本發(fā)明的多能干細(xì)胞中。如果細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有更大性質(zhì)差異的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)育(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)變化時(shí)，并且如果細(xì)胞的時(shí)鐘基因停止或幾乎停止，在直接重編程期間的細(xì)胞可以包括在本發(fā)明中要評(píng)價(jià)的多能干細(xì)胞中。
[0033]多能干細(xì)胞可以源自哺乳動(dòng)物，如人、猴、黑猩猩、小鼠、大鼠、兔、山羊、狗、貓、牛、
馬、豬，諸如此類。
[0034]用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞，例如ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中，存在為細(xì)胞群。由于這樣的細(xì)胞群具有均一的性質(zhì)(即，品質(zhì))，因此根據(jù)本發(fā)明的方法，通過評(píng)價(jià)它們中的一些評(píng)價(jià)全部多能干細(xì)胞成為可能。
[0035]可以通過用RNA印跡法或使用抗體的方法，諸如蛋白質(zhì)印跡法或酶聯(lián)免疫吸附測定法，測量mRNA的表達(dá)而測量時(shí)鐘基因的表達(dá)。優(yōu)選地，將報(bào)告基因連接到時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的任一個(gè)的下游，并且測量報(bào)告基因的表達(dá)量來評(píng)價(jià)時(shí)鐘基因的表達(dá)。報(bào)告基因包括基因諸如熒光蛋白基因(例如，GFP、CFP、BFP、YFP和DsRED)、熒光素酶基因(螢火蟲熒光素酶，Vargulahilgend orfii熒光素酶、香草熒光素酶，諸如此類)、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。熒光素酶基因優(yōu)選作為報(bào)告基因。
[0036]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明能夠通過將包括連接到時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因的基因構(gòu)建體，引入到要評(píng)價(jià)的多能干細(xì)胞或其分化細(xì)胞中，并且通過分析分化的多能干細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量來評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞。
[0037]本發(fā)明的試劑盒包括基因構(gòu)建體。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括以下的至少一個(gè):多能干細(xì)胞如ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、用于多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器如培養(yǎng)皿。
[0038]在本說明書中，多能干細(xì)胞的“評(píng)價(jià)”是指對(duì)多能干細(xì)胞分化成預(yù)期細(xì)胞而不是分化成不同于預(yù)期細(xì)胞諸如癌細(xì)胞的能力(即，潛力)的評(píng)價(jià)。從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞中時(shí)鐘基因的表達(dá)率越高，則分化成預(yù)期細(xì)胞以后的多能干細(xì)胞的功能變得越大。例如，如實(shí)施例中所示，當(dāng)92%以上，特別是當(dāng)100%的多能干細(xì)胞在分化以后約4周表達(dá)時(shí)鐘基因時(shí)，可以評(píng)價(jià)為多能干細(xì)胞在分化誘導(dǎo)以后變成功能細(xì)胞(即評(píng)估為高)。當(dāng)12%的多能干細(xì)胞在分化以后4周表達(dá)時(shí)鐘基因時(shí)，可以確定多能干細(xì)胞不太可能在分化誘導(dǎo)以后變成功能細(xì)胞(即評(píng)價(jià)為低)。從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞中的時(shí)鐘基因的表達(dá)率越高，原始多能性干細(xì)胞的評(píng)價(jià)越高。
[0039]對(duì)于在分化以后被觀察到生物鐘紊亂的低品質(zhì)iPS細(xì)胞，受到關(guān)注的是這樣的細(xì)胞在移植到哺乳動(dòng)物包括人類中時(shí)在分化以后引起各種疾病，如癌癥。
[0040]最近，生物鐘和癌癥之間的關(guān)系已引起關(guān)注。2007年，世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)可“涉及晝夜節(jié)律擾亂的輪班工作”作為“第2A組”的風(fēng)險(xiǎn)因素，其可能是致癌的。目前，關(guān)于癌癥和生物鐘的研究正在世界各地集中地進(jìn)行，一些而非全部癌細(xì)胞內(nèi)生物鐘被擾亂的事實(shí)，開始被報(bào)道(Shou-Jen Kuo 等，Virchows Arch(2009)454:467-474)。癌細(xì)胞中可以觀察到生物鐘的擾亂的報(bào)告是支持本發(fā)明理論的發(fā)現(xiàn)，即生物鐘的發(fā)育在低品質(zhì)iPS細(xì)胞中被擾亂。根據(jù)本發(fā)明，被證明分化細(xì)胞生物鐘不紊亂的多能干細(xì)胞，沒有成癌風(fēng)險(xiǎn)，并且得到的分化細(xì)胞中具有優(yōu)異的功能性。因此，這樣的多能干細(xì)胞可以優(yōu)選用作在分化以后移植到身體中的移植材料。
[0041]對(duì)于本發(fā)明的方法，多能干細(xì)胞包含在容器如培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，并在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)周。培養(yǎng)可以進(jìn)行三周以上，優(yōu)選約三至五周，并且特別為約四周。然后，評(píng)價(jià)時(shí)鐘基因的表達(dá)。如果分化誘導(dǎo)以后的培養(yǎng)周期是五至六周或更長時(shí)間，則細(xì)胞逐漸變?nèi)醪⑶視r(shí)鐘基因的表達(dá)開始降低。因而，太長的培養(yǎng)周期是不可取的。培養(yǎng)周期優(yōu)選短于5周。當(dāng)分化誘導(dǎo)以后的培養(yǎng)周期約為3至4周時(shí)，細(xì)胞變?nèi)诤?。分化誘導(dǎo)以后的培養(yǎng)可以在更換培養(yǎng)基時(shí)進(jìn)行。培養(yǎng)基更換頻率為，例如，但不限于，每兩天一次。培養(yǎng)基可以每天更換一次或以另一頻率更換。
[0042]當(dāng)熒光蛋白如GFP用于報(bào)告基因時(shí)，光可以照射到從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞上以檢測熒光。當(dāng)使用熒光素酶時(shí)，熒光素可以用來測量從熒光素酶發(fā)射的光量。當(dāng)使用另一種報(bào)告基因時(shí)，可以通過使用報(bào)告基因的產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)方法，根據(jù)報(bào)告基因評(píng)價(jià)時(shí)鐘基因的表達(dá)，。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)方案中用于發(fā)育生物鐘的實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性是85%或更聞，95%或更聞，98%或更聞，99%或更聞，或100 %。因而，可以以良好的再現(xiàn)性評(píng)價(jià)低品質(zhì)多能干細(xì)胞和高品質(zhì)多能干細(xì)胞。
[0044]實(shí)施例使用結(jié)合用于 監(jiān)控時(shí)鐘基因(Per2，Bmall)表達(dá)的報(bào)告基因(熒光素酶基因)的ES細(xì)胞作為高品質(zhì)多能干細(xì)胞；實(shí)施例使用除用于監(jiān)控時(shí)鐘基因(Per2、Bmall)表達(dá)的報(bào)告基因(熒光素酶基因)以外還引入c-Myc基因的ES細(xì)胞作為低品質(zhì)多能干細(xì)胞，并且其中ES細(xì)胞顯示野生型ES細(xì)胞的約1.3倍至約4倍的內(nèi)源c-Myc基因表達(dá)量。在這些中，在用通常用于評(píng)價(jià)細(xì)胞品質(zhì)的定量PCR測量c-Myc基因表達(dá)量時(shí)，與野生型ES細(xì)胞相比，顯示1.3倍野生型ES細(xì)胞的低品質(zhì)ES細(xì)胞不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，并且在使用基因表達(dá)分析的篩選研究中不能區(qū)別于野生型ES細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，結(jié)果是，通過使用其中癌基因c-Myc表達(dá)略有保持且癌變風(fēng)險(xiǎn)高的ES細(xì)胞在低品質(zhì)ES細(xì)胞上重復(fù)進(jìn)行測定試驗(yàn)，成功地在全部測試中測定了低品質(zhì)ES細(xì)胞。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法，甚至可以正確地評(píng)價(jià)使用常規(guī)方法不能篩選的低品質(zhì)多能干細(xì)胞的品質(zhì)。因此，本發(fā)明的特征在于，它可以實(shí)現(xiàn)不能用常規(guī)方法篩選的多能干細(xì)胞的品質(zhì)評(píng)價(jià)。
[0046]實(shí)施例
[0047]本發(fā)明將通過實(shí)施例詳細(xì)地說明如下。
[0048]實(shí)施例1
[0049](I)胚狀體形成
[0050]將除去飼養(yǎng)細(xì)胞的小鼠ES細(xì)胞以2 X IO4細(xì)胞/mL稀釋在用于成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中，并且將100 μ L覆蓋在低粘附性圓底96孔板的每個(gè)孔中。將細(xì)胞在37°C用5% CO2培養(yǎng)48小時(shí)。
[0051](2)胚狀體的分化培養(yǎng)[0052]在懸滴培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體轉(zhuǎn)移到24孔板，并在37°C用5% CO2在用于成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天。在該培養(yǎng)期間不進(jìn)行繼代培養(yǎng)。每天或每兩天更換一次培養(yǎng)基，同時(shí)改變時(shí)間間隔，以便它不是恒定的。在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25天以后測量生物鐘。
[0053]用于成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基的組成如下。
[0054]DMEM(Nakarai Tesque)/10 % FBS, ImM 丙酮酸鈉(GibcoBRL)，0.1mM MEM 非必需氨基酸(Gibco BRL), 0.lmM2_巰基乙醇(Sigma), 50單位/mL青霉素-鏈霉素(NakaraiTesque)
[0055]所使用的低品質(zhì)小鼠ES細(xì)胞和高品質(zhì)小鼠ES細(xì)胞中，均將螢火蟲熒光素酶基因連接到時(shí)鐘基因(Per2，Bmall)的啟動(dòng)子的后部的基因構(gòu)建體(報(bào)告載體)導(dǎo)入到小鼠ES細(xì)胞中。通過使用常規(guī)方法產(chǎn)生的報(bào)告載體，和從Clontech Laboratories公司銷售的載體切出的基因，用作熒光素酶基因。
[0056]將野生型高品質(zhì)小鼠ES細(xì)胞和低品質(zhì)小鼠細(xì)胞用作ES細(xì)胞。使用如上所述的高品質(zhì)ES細(xì)胞和低品質(zhì)ES細(xì)胞。
[0057]當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法評(píng)價(jià)野生型小鼠ES細(xì)胞(高品質(zhì)iPS細(xì)胞的模型)時(shí)，生物鐘正常發(fā)育并且在100%的情況(196個(gè)結(jié)果的實(shí)驗(yàn))下確認(rèn)振蕩。
[0058]圖1顯示其中實(shí)際進(jìn)行測量的實(shí)驗(yàn)(20次)的原始數(shù)據(jù)。 [0059]圖2是當(dāng)ES細(xì)胞弱且連續(xù)表達(dá)癌基因c-Myc時(shí)ES細(xì)胞的生物鐘的發(fā)育數(shù)據(jù)，這被稱為4個(gè)Yamanaka因素之一并用于生產(chǎn)iPS細(xì)胞，其被建立為iPS細(xì)胞的模型并且根據(jù)如圖1中的本發(fā)明方法進(jìn)行分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。不同于作為高品質(zhì)iPs細(xì)胞的模型的野生型ES細(xì)胞的情況，只有約12%觀察到生物鐘發(fā)育(在圖2中用紅色陰影指示)。
[0060]作為用于評(píng)價(jià)生物鐘發(fā)育存在的定量方法，快速傅立葉變換(FFT)分析用于以約24小時(shí)的周期頻率評(píng)價(jià)振蕩的強(qiáng)度(圖3)。通過以這種方式在分化誘導(dǎo)以后的時(shí)鐘基因的表達(dá)，變得清楚的是，可以評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞(ES細(xì)胞，iPS細(xì)胞等)的品質(zhì)。
[0061]實(shí)施例2
[0062]為了評(píng)價(jià)人iPS細(xì)胞的品質(zhì)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表明，作為本發(fā)明人開發(fā)的方法的使用生物時(shí)鐘作為指標(biāo)的體外細(xì)胞評(píng)價(jià)方法，也可以實(shí)際應(yīng)用到人iPS細(xì)胞。當(dāng)在京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究中心構(gòu)建的人iPS細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，在分化誘導(dǎo)后四周正常形成生物鐘(圖4)。這結(jié)果有力地表明，該方法也可以用作評(píng)價(jià)人iPS細(xì)胞品質(zhì)的方法。
【權(quán)利要求】
1.用于評(píng)價(jià)多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括: 分析從多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞中時(shí)鐘基因的表達(dá)；和 基于所述表達(dá)的程度評(píng)價(jià)所述多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述時(shí)鐘基因是Per2和/或Bmall和/或Dbp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述方法還包括將基因構(gòu)建體引入到要評(píng)價(jià)的多能干細(xì)胞中，所述基因構(gòu)建體包括連接到所述時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其中所述分析包括基于所述報(bào)告基因的表達(dá)分析時(shí)鐘基因的表達(dá)模式。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，所述報(bào)告基因是熒光蛋白基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
6.一種用于評(píng)價(jià)包含基因構(gòu)建體的多能干細(xì)胞的試劑盒，所述基因構(gòu)建體包括連接到時(shí)鐘基因的啟動(dòng)子的報(bào)告基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中，所述時(shí)鐘基因是Per2和/或Bmall和/或Dbp。
8.根據(jù)權(quán) 利要求6的試劑盒，其中，所述多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中，所述報(bào)告基因是熒光蛋白基因、熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK104024424SQ201280064472
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月6日
【發(fā)明者】八木田和弘, 梅村康浩 申請人:京都府公立大學(xué)法人