Acf檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于通過在分子水平分析大腸組織的待測區(qū)域來檢測ACF的方法。即，一種ACF檢測方法，其是檢測ACF(畸變隱窩灶)的方法，使用選自由Met、Cdh1、Ctnnb1、及GSTp組成的組中的1種以上的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子作為ACF檢測用標(biāo)記物，檢測大腸組織的待測區(qū)域中的上述ACF檢測用標(biāo)記物；一種ACF檢測用標(biāo)記物，其是用于檢測來自人的大腸組織中的ACF的標(biāo)記物，其是Met、Cdh1、Ctnnb1、或GSTp；以及提供一種人的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險評價方法，其使用上述ACF檢測方法，基于待測者的大腸組織的待測區(qū)域中的ACF的檢測結(jié)果，評價該待測者的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險。
【專利說明】ACF檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以ACF (畸變隱窩灶)特異性高表達(dá)的分子作為指標(biāo)來檢測ACF的方法。
[0002]本申請要求基于2011年12月27日在日本提交的日本專利申請2011-285214號的優(yōu)先權(quán)，并將其內(nèi)容援引于此。
【背景技術(shù)】
[0003]結(jié)腸直腸癌是日本的死亡原因第一位，在美國是因癌而導(dǎo)致的死亡原因的第二位。在美國每年約15萬人被新發(fā)現(xiàn)患結(jié)腸直腸癌，每年5萬人以上死亡(由美國癌癥協(xié)會評估)。另一方面，由于結(jié)腸直腸癌從良性腫瘤向惡性腫瘤的發(fā)展需要幾十年的例子也多，所以早期的風(fēng)險評價.發(fā)現(xiàn)被期待有助于良好的預(yù)后及預(yù)防。
[0004]作為目前通常進(jìn)行的結(jié)腸直腸腺瘤.腫瘤篩查檢查方法，存在便潛血檢查、灌腸X射線造影檢查、全大腸內(nèi)窺鏡檢查、S狀結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查等。然而，例如在便潛血檢查的情況下，由于存在因除腺瘤、腫瘤以外的因子也會檢測到血液的情況，所以對結(jié)腸直腸腺瘤.腫瘤的特異性不能說高，在以早期檢測作為目的的情況下容易變成假陽性。另一方面，灌腸X射線造影檢查雖然可以 檢測形態(tài)大的進(jìn)行性癌(advanced cancer),但存在難以檢測小的病變的缺點。
[0005]此外，由于利用內(nèi)窺鏡的檢查直接識別病變部位，所以檢查結(jié)果的可靠性高，顯示有助于結(jié)腸直腸癌死亡率及發(fā)生率的降低。然而，由于就早期癌而言病變部位微小，所以存在難以通過利用內(nèi)窺鏡的檢查來檢測的問題。
[0006]這樣，結(jié)腸直腸癌由于有效地抽取高風(fēng)險組或早期癌的檢測技術(shù)依然不成熟，所以在疾病已發(fā)展到一定程度的階段首次被診斷到的情況較多。因此，期望能夠在早期、且低損或無損地進(jìn)行結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險評價.發(fā)現(xiàn)的靈敏度.特異性高的檢查方法。
[0007]作為從早期病變的階段檢測結(jié)腸直腸癌的方法，使用核酸或蛋白質(zhì)的分析技術(shù)在分子水平進(jìn)行分析的方法受到注目。例如，結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險因子包括以家族性腺瘤性息肉(familial adenomatous polyposis, FAP)為代表的遺傳背景,可以通過分析待測者的基因來進(jìn)行結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險評價。此外，近年來，已知在具有FAP那樣的特征性遺傳背景的群體和不具有這樣的遺傳背景的群體中的任一者中，年齡(50歲以上)、肥胖.飲酒.吸煙的生活習(xí)慣因素均會提高將來的結(jié)腸直腸癌風(fēng)險。因此，作為預(yù)測將來的結(jié)腸直腸癌的方法，由生活習(xí)慣引起的分子異常(表觀遺傳學(xué)、表達(dá)異常)受到注目。實際上，由GWAS(全基因組關(guān)聯(lián)分析)研究成果等發(fā)現(xiàn)許多暗示與結(jié)腸直腸癌有關(guān)的分子。
[0008]作為捕捉大腸中的分子異常的技術(shù)，已開發(fā)了糞便或血液中的核酸分析技術(shù)。然而，來自微小病變的核酸非常微量，難以檢測早期的分子異常。特別是，從分析裝置的靈敏度的方面來看，由50個以下隱窩構(gòu)成的或大小為直徑1_以下的微小病變內(nèi)的變化反映在血液中是困難的。此外，由于糞便中除了大量的腸內(nèi)細(xì)菌以外，還包含了從病變以外的區(qū)域剝離的上皮細(xì)胞，所以干擾變多。因此，為了以糞便作為樣本來檢測早期的結(jié)腸直腸癌?結(jié)腸直腸腺瘤，需要在癌化?腺瘤化的早期與正常組織相比表達(dá)量增大的優(yōu)異的分子標(biāo)記物。這樣，通過檢測大腸中的早期的分子異常在早期評價結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的技術(shù)開發(fā)尚未實現(xiàn)。
[0009]另一方面，1987年Bird等報道指出，在投與了致癌物質(zhì)(氧化偶氮甲烷)的大鼠的大腸中畸變隱窩灶(ACF)為被亞甲基藍(lán)濃染的微小病變。ACF是形態(tài)學(xué)上可以檢測的最初的異常形態(tài)(例如，參照非專利文獻(xiàn)I。)，可見到細(xì)胞增殖活性的亢進(jìn)、K-ras突變，所以暗示了與結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸直腸腺瘤的發(fā)病有關(guān)。報道了在人大腸摘出標(biāo)本中，同樣地也在癌患者、息肉患者中見到被亞甲基藍(lán)濃染的病變，該病變的數(shù)目按照健康人、息肉患者、癌患者的順序變多(例如，參照非專利文獻(xiàn)2。)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，使用ACF作為結(jié)腸直腸癌預(yù)防研究的指標(biāo)的情況逐漸增加。
[0010]Imm以下的微小ACF難以通過通常的內(nèi)窺鏡檢查來檢測，通常采用放大內(nèi)窺鏡來檢測。然而，放大內(nèi)窺鏡檢查在操作上需要長時間，所以使用機(jī)會受到限制，難以用于早期的結(jié)腸直腸癌的一次篩查。這樣，以顯微鏡.內(nèi)窺鏡來檢測微小ACF并評價結(jié)腸直腸癌風(fēng)險的技術(shù)開發(fā)還沒有實現(xiàn)。
[0011]此外，為了在分子水平分析ACF，正在進(jìn)行有用的標(biāo)記物分子的探索。具體而言，作為在ACF中表達(dá)量發(fā)生變動的分子，報道了細(xì)胞周期蛋白(cyclin)Dl、C0X2(環(huán)氧化酶2)、β聯(lián)蛋白(catenin, betal)、iN0S(誘導(dǎo)型氧化氮合成酶2)、EGFR(表皮生長因子受體)、及CD44(CD44分子)等。但是，均是來自小規(guī)模試驗的報道，與結(jié)腸直腸癌不同，還沒有涉及關(guān)于ACF病變中的分子變動的大規(guī)模試驗評價的報道。 [0012]例如，在C0X2現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)3。)的例子中，由于使用大腸整體的樣品來分析分子變動，所以對ACF的特異性低，沒有分析與周邊組織相比較時的僅ACF中的分子變動。此外，在細(xì)胞周期蛋白Dl的現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)4。)、iN0S的現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)5。)、CD44的現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)6。)中，由于是僅免疫染色數(shù)據(jù)的分析，所以定量性、特異性不足，沒有達(dá)到醫(yī)療應(yīng)用。進(jìn)而在iNOS的現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)7。) ,EGFR的現(xiàn)有研究(參照非專利文獻(xiàn)8。)中，以50個左右隱窩的大小的ACF作為分析對象，沒有進(jìn)行更早期階段的微小ACF分子變動的分析。這樣，雖然已知有若干暗示了可以作為ACF的標(biāo)記物分子使用的可能性的分子，但均不是可靠至臨床上可利用的程度。
[0013]即，對于在以由50個以下隱窩構(gòu)成的ACF、直徑為1mm以下的微小ACF為代表的微小病變階段(即，早期)表達(dá)量發(fā)生變動的分子進(jìn)行分析，在分子生物學(xué)上捕捉將來的結(jié)腸直腸癌風(fēng)險并簡便地進(jìn)行評價，這一點尚未實現(xiàn)。
[0014]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0015]專利文獻(xiàn)
[0016]專利文獻(xiàn)1:日本特開2007-229054號公報
[0017]非專利文獻(xiàn)
[0018]非專利文獻(xiàn)I:Kelloff 等 39 人，2006 年，Clinical Cancer Research,第 12 卷，第12號，第3661~3697頁。
[0019]非專利文獻(xiàn)2:Takayama 等 9 人，The New England Journal of Medicine, 1998 年，第339卷，第18號，第1277~1284頁。[0020]非專利文獻(xiàn)3:Fichera 等 12 人，Journal of Surgical Research, 2007 年，第 142卷，第239~245頁。
[0021]非專利文獻(xiàn)4:Paulsen 等 5 人，Cancer Research, 2005 年，第 65 卷,第 121 ~129頁。
[0022]非專利文獻(xiàn)5:Xu 等 3 人，World Journal of Gastroenterology, 2003 年，第 9 卷，第6號，第1246~1250頁。
[0023]非專利文獻(xiàn)6:Boon 等 4 人，Cancer Research, 2002 年，第 62 卷，第 5126 ~5128頁。
[0024]非專利文獻(xiàn)7:Carcinogenesis 等 4 人，carcinogenesis, 2000 年，第 21 卷，第 7號，第1319~1327頁。
[0025]非專利文獻(xiàn)8:Cohen 等 19 人，Cancer Research, 2006 年，第 66 卷，第 5126 ~5128頁。
[0026]非專利文獻(xiàn)9:Fujikawa等 7 人，Journal of the American Chemical Society, 2008年，第130卷，第1453 3~14543頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027]發(fā)明要解決的問題
[0028]本發(fā)明的目的在于提供一種用于通過在分子水平分析大腸組織的待測區(qū)域來檢測ACF的方法。
[0029]用于解決問題的方案
[0030]本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在來自人的大腸組織中，與正常組織相比，Met (met proto-oncogene,MET原癌基因)、Cdhl (Cadherinl, 鈣黏蛋白 I)、Ctnnbl (Catenin beta, β -連環(huán)蛋白)、及 GSTp (glutathione S-transferase pi，谷胱甘月太S-轉(zhuǎn)移酶-π )在直徑為1mm以下或由50個以下隱窩構(gòu)成的微小的ACF中表達(dá)量增大，從而完成本發(fā)明。
[0031](I)本發(fā)明的第一方案是一種ACF檢測方法，其是檢測ACF (畸變隱窩灶)的方法，其使用選自由Met、Cdhl、Ctnnbl、及GSTp組成的組中的I種以上的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子作為ACF檢測用標(biāo)記物，檢測大腸組織的待測區(qū)域中的上述ACF檢測用標(biāo)記物。
[0032](2)在上述(I)的ACF檢測方法中，上述待測區(qū)域優(yōu)選包括疑似為ACF的區(qū)域。
[0033](3)在上述(2)的ACF檢測方法中，優(yōu)選將上述待測區(qū)域中的上述ACF檢測用標(biāo)記物的量與和上述待測區(qū)域位于同一大腸組織內(nèi)的正常組織區(qū)域中的該ACF檢測用標(biāo)記物的量進(jìn)行比較。
[0034](4)在上述(I)~(3)中任一項的ACF檢測方法中，上述待測區(qū)域優(yōu)選為從生物體中采集的樣本。
[0035](5)在上述⑴~⑶中任一項的ACF檢測方法中，優(yōu)選在生物體內(nèi)進(jìn)行上述ACF檢測用標(biāo)記物的檢測。
[0036](6)在上述⑴~(5)中任一項的ACF檢測方法中，上述ACF檢測用標(biāo)記物優(yōu)選通過對該ACF檢測用標(biāo)記物進(jìn)行熒光標(biāo)記來檢測。
[0037](7)在上述(I)~(6)中任一項的ACF檢測方法中，上述ACF檢測用標(biāo)記物優(yōu)選為mRNA或蛋白質(zhì)。
[0038](8)在上述(I)~(7)中任一項的ACF檢測方法中，優(yōu)選使用被熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針或特異性抗體將上述待測區(qū)域中的上述ACF檢測用標(biāo)記物進(jìn)行熒光標(biāo)記后，使用能夠進(jìn)行分光檢測的內(nèi)窺鏡或消化道視頻示波器進(jìn)行檢測。
[0039](9)本發(fā)明的第二方案為一種ACF檢測用標(biāo)記物，其是用于檢測來自人的大腸組織中的ACF的標(biāo)記物，其是Met、Cdh1、Ctnnb 1、或GSTp。
[0040](10)本發(fā)明的第三方案為一種人的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險評價方法，其使用上述(I)~(8)中任一項的ACF檢測方法，基于待測者的大腸組織的待測區(qū)域中的ACF的檢測結(jié)果來評價該待測者的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險。
[0041]發(fā)明的效果
[0042]根據(jù)本發(fā)明的ACF檢測方法，可以使用分子生物學(xué)的方法來檢測人的ACF。特別是本發(fā)明的ACF檢測方法連直徑為1mm以下或由50個以下隱窩構(gòu)成的微小ACF也能夠以良好的精度進(jìn)行檢測。
[0043]由于ACF被視為結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸腺瘤的指標(biāo)，所以本發(fā)明的ACF檢測方法在結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸直腸腺瘤的早期檢測、或發(fā)病風(fēng)險評價等中也是有用的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是表示實施例1中對照樣品(正常組織的樣品)及ACF樣品(ACF部位的樣品)中的Met的表達(dá)量相對值的分布圖。
[0045]圖2是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的Cdhl基因表達(dá)量的分布圖。
[0046]圖3是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的Ctnnbl基因表達(dá)量的分布圖。
[0047]圖4是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的GSTpl基因表達(dá)量的分布圖。
[0048]圖5是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的EGFR基因表達(dá)量的分布圖。
[0049]圖6是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的N0S2基因表達(dá)量的分布圖。
[0050]圖7是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的⑶44基因表達(dá)量的分布圖。
[0051]圖8是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的Ctsb基因表達(dá)量的分布圖。
[0052]圖9是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的PCNA基因表達(dá)量的分布圖。
[0053]圖10是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的Fzdl基因表達(dá)量的分布圖。
[0054]圖11是表示實施例1中各樣品的以18SrRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后的C0X2基因表達(dá)量的分布圖。[0055]圖12是實施例1中樣品的ACF病變部的HE染色及免疫組織化學(xué)(GSTpl)染色的圖像。
[0056]圖13A是實施例2中通過GSTpl熒光探針對人大腸外科切除標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，使用顯微鏡拍攝的ACF病變的熒光觀察圖像。
[0057]圖13B是實施例2中通過GSTpl熒光探針對人大腸外科切除標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，使用內(nèi)窺鏡拍攝的ACF病變的熒光觀察圖像。 [0058]圖14A是實施例2中通過GSTpl熒光探針對人大腸外科切除標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，使用顯微鏡拍攝的大腸癌病變的熒光觀察圖像。
[0059]圖14B是實施例2中通過GSTpl熒光探針對人大腸外科切除標(biāo)本進(jìn)行熒光染色，使用內(nèi)窺鏡拍攝的大腸癌病變的熒光觀察圖像。
[0060]圖15是表示實施例2中由通過GSTpl熒光探針對人大腸外科切除標(biāo)本進(jìn)行熒光染色后的熒光觀察圖像比較ACF病變部與正常區(qū)域中的熒光強(qiáng)度的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0061]在本發(fā)明及本申請說明書中，ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子是指在同一個體中的大腸組織中，與周邊的正常組織相比在ACF中基因表達(dá)水平上調(diào)的分子。
[0062]此外，在本發(fā)明及本申請說明書中，大腸表示包括盲腸、結(jié)腸、直腸、及肛門管的區(qū)域，大腸組織表示包括大腸粘膜及大腸上皮的組織。
[0063]在本發(fā)明及本申請說明書中，在該區(qū)域為圓形或橢圓形的情況下，區(qū)域的直徑是指直徑(橢圓形的情況下為長徑)，在該區(qū)域為圓形或橢圓形以外的情況下，區(qū)域的直徑是指將該區(qū)域近似為圓形時的近似圓的直徑、或?qū)⒃搮^(qū)域近似為橢圓形時的近似橢圓的長徑。
[0064]本發(fā)明的ACF檢測方法的特征在于,使用選自由Met、CdhU Ctnnbl、及GSTp組成的組中的I種以上的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子作為ACF檢測用標(biāo)記物，檢測來自人的大腸組織的待測區(qū)域中的上述ACF檢測用標(biāo)記物。GSTp有時存在多個同工型，但只要是在大腸組織中表達(dá)的同工型即可，可以只檢測I種同工型，也可以檢測多種同工型。上述4種ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子均為在微小ACF、具體而言在直徑為1mm以下的ACF或由50個以下隱窩構(gòu)成的ACF中，與周邊正常組織相比表達(dá)量增大的分子。因此，上述4種ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子均為用于ACF檢測、特別是微小ACF檢測的臨床上有用的標(biāo)記物分子，通過將這些ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量作為指標(biāo)(作為ACF檢測用標(biāo)記物使用)，不僅可以以良好的精度檢測比較大的ACF (即，形態(tài)異常發(fā)展的ACF)，也可以以良好的精度檢測早期的微小的ACF。
[0065]在本發(fā)明的ACF檢測方法中，只要檢測上述4種ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子中的至少I種分子即可，也可以對一個待測區(qū)域檢測2種以上的分子。
[0066]檢測ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量(ACF檢測用標(biāo)記物)的待測區(qū)域只要是來自人的大腸組織中的區(qū)域就沒有特別限定，但優(yōu)選為包括疑似為ACF的區(qū)域(可疑ACF區(qū)域)的區(qū)域。作為可疑ACF區(qū)域，例如，有大腸組織中的被亞甲基藍(lán)濃染的區(qū)域。在亞甲基藍(lán)染色中，ACF以外的區(qū)域也被染色，但在本發(fā)明的ACF檢測方法中，通過將ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量作為指標(biāo)，與亞甲基藍(lán)染色相比能夠以良好的精度檢測ACF。作為可疑ACF區(qū)域，除此以外，可列舉出通過內(nèi)窺鏡觀察、顯微鏡觀察或圖像分析等觀察到形態(tài)異常的區(qū)域等。
[0067]本發(fā)明的ACF檢測方法中的待測區(qū)域的大小沒有特別限定，例如，可以考慮可疑ACF區(qū)域的大小等來適當(dāng)決定，但優(yōu)選可疑ACF區(qū)域在待測區(qū)域中所占的比例較高。正常組織區(qū)域在待測區(qū)域中所占的比例過高的情況下，即使在該可疑ACF區(qū)域?qū)嶋H上為ACF的情況下，該待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子量與正常組織中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子量的差異也變得難以檢測。例如，包括直徑為1mm以下的可疑ACF區(qū)域時，待測區(qū)域的直徑優(yōu)選為1mm以下，更優(yōu)選為低于1mm，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5mm以下。此外，包括由50個以下隱窩構(gòu)成的可疑ACF區(qū)域時，待測區(qū)域的大小優(yōu)選為50個以下隱窩，更優(yōu)選為低于50個隱窩，進(jìn)一步優(yōu)選為25個以下隱窩。
[0068]另外，本發(fā)明中作為檢測對象的4種ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子均為在ACF中與正常組織相比基因表達(dá)水平上調(diào)的分子，與直徑為1mm以下的微小ACF同樣地，比較大的ACF、例如由100~150個隱窩構(gòu)成的ACF也可以良好地進(jìn)行檢測。
[0069]本發(fā)明的ACF檢測方法中被檢測的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子只要是反映基因表達(dá)量的分子即可，可以是mRNA，也可以是蛋白質(zhì)。即，本發(fā)明的ACF檢測方法通過在RNA水平或蛋白質(zhì)水平獲取待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的信息，能夠檢測該待測區(qū)域的ACF。
[0070]各ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測方法只要是檢測結(jié)果依賴于待測區(qū)域中的各分子的量、濃度的方法即可，可以從用于樣本中的mRNA或蛋白質(zhì)的檢測的公知的方法中適當(dāng)選擇使用。其中，優(yōu)選通過表達(dá)分析中使用的方法來進(jìn)行。各方法可以通過常規(guī)方法來進(jìn)行。 [0071]在待測區(qū)域中包含ACF的情況下，待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量與大腸組織內(nèi)的正常組織中相比變多。因此，通過將待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量與大腸組織內(nèi)的正常組織中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量進(jìn)行比較，能夠檢測待測區(qū)域中的ACF。即，在待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量與正常組織中相比較多的情況下，可以判斷該待測區(qū)域中包含ACF，在與正常組織中大致相同或為其以下的情況下，可以判斷該待測區(qū)域中不包含ACF。待測區(qū)域與正常組織區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量的比較可以以各區(qū)域的每單位表面面積或單位體積來進(jìn)行，也可以以各區(qū)域中包含的每單位核酸量或單位蛋白質(zhì)量來進(jìn)行。
[0072]在本發(fā)明中，優(yōu)選在同一個體的大腸組織中，將待測區(qū)域與其周邊的正常組織進(jìn)行比較。各ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量雖然存在個體差異，但通過在同一個體中進(jìn)行比較，能夠抑制因個體差異而產(chǎn)生的影響。
[0073]根據(jù)所使用的檢測方法的種類或靈敏度，有時在正常組織中沒有檢測到ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子，僅在ACF中檢測到。這種情況下，在待測區(qū)域中檢測到該ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的情況下，判斷該待測區(qū)域中包含ACF，在沒有檢測到該ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的情況下，判斷該待測區(qū)域中不包含ACF。
[0074]當(dāng)ACF檢測用標(biāo)記物為mRNA時，即，在RNA水平求出ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量時，作為各ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測方法，可列舉出利用使用了對各分子特異性的引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法、或利用使用了對各分子特異性的探針的雜交的方法等。作為利用核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法，可列舉出例如通過由待測區(qū)域中包含的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后，以所得到的cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR等核酸擴(kuò)增反應(yīng)，來檢測待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子，或在可以與正常組織區(qū)域中的量比較的程度下定量地進(jìn)行測定的方法。從待測區(qū)域中的RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、RT-PCR等核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以從該【技術(shù)領(lǐng)域】中公知的方法中適當(dāng)選擇來進(jìn)行。
[0075]在利用核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法中，可以通過使用被熒光性嵌入劑、或熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物等，對所擴(kuò)增的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記來定量地進(jìn)行檢測。另一方面，在利用雜交的方法中，通過使用被熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針、或按照在雜交的情況下才發(fā)出熒光的方式修飾的探針，對待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記來定量地進(jìn)行檢測。
[0076]當(dāng)ACF檢測用標(biāo)記物為蛋白質(zhì)時，即，在蛋白質(zhì)水平求出ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的表達(dá)量時，各ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子可以通過例如使用了特異性地識別各分子的抗體(特異性抗體)的免疫學(xué)方法來檢測。具體而言，可以使通過標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的各分子的特異性抗體與待測區(qū)域中的該分子結(jié)合后，通過測定來自該標(biāo)記物質(zhì)的信號，從而對待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記來定量地進(jìn)行檢測。利用標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記可以使標(biāo)記物質(zhì)直接與各分子的特異性抗體結(jié)合，也可以結(jié)合到與該特異性抗體特異性地結(jié)合的第二抗體上。作為標(biāo)記物質(zhì)，可以從在抗原抗體反應(yīng)、或檢測2個分子的結(jié)合的有無時通常使用的標(biāo)記物質(zhì)中適當(dāng)選擇使用。作為這樣的標(biāo)記物質(zhì)，可列舉出例如熒光物質(zhì)、磁性體、放射性同位素等。從高靈敏度、且安全性高的方面出發(fā)，優(yōu)選使用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物質(zhì)。抗原抗體反應(yīng)可以通過常規(guī)方法來進(jìn)行。除了免疫學(xué)方法以外，例如也可以通過使用顯示ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的活性的特異性的探針并檢測該探針，從而檢測作為蛋白質(zhì)的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子。 [0077]ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測可以針對從生物體中采集的樣本進(jìn)行。例如，可以在顯微鏡下從將生物體的大腸組織的部分區(qū)域外科切除而采集的大腸組織切除樣品采集包含可疑ACF區(qū)域的待測區(qū)域的樣品。此時，根據(jù)需要，從同一大腸組織切除樣品中采集正常組織區(qū)域、優(yōu)選待測區(qū)域的周邊的正常組織的樣品。此外，通過預(yù)先將生物體內(nèi)的大腸組織進(jìn)行亞甲基藍(lán)染色，并外科切除包括被濃染的區(qū)域的待測區(qū)域，由此可以從生物體中直接采集待測區(qū)域的樣品(活組織檢查樣品)。與大腸組織切除樣品的情況同樣地，待測區(qū)域的周邊的正常組織的樣品也可以從生物體中采集。將這樣操作所采集的待測區(qū)域或正常組織區(qū)域的樣品供于ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測。生物體內(nèi)的大腸組織的亞甲基藍(lán)染色可以通過常規(guī)方法來進(jìn)行。
[0078]ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測也可以在生物體內(nèi)進(jìn)行。例如，通過將對ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子為特異性的帶有標(biāo)記的探針、帶有直接或間接的標(biāo)記的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的特異性抗體、顯示ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子活性的帶有特異性標(biāo)記的探針涂布或噴霧到生物體的大腸內(nèi)的包括待測區(qū)域的區(qū)域中，使存在于該區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子與該探針或特異性抗體結(jié)合而對其進(jìn)行標(biāo)記后，檢測該標(biāo)記，由此可以檢測ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子。
[0079]在生物體內(nèi)進(jìn)行ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測的情況下，優(yōu)選對ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記來檢測。具體而言，首先，使用被熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針或特異性抗體對待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子進(jìn)行熒光標(biāo)記。之后，使用能夠進(jìn)行分光檢測的能夠?qū)Υ竽c內(nèi)進(jìn)行可視檢測的裝置(內(nèi)窺鏡或消化道視頻示波器等)在光學(xué)上檢測由該標(biāo)記發(fā)出的熒光，得到熒光圖像。通過分析所得到的熒光圖像，可以高靈敏度且定量地檢測ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子。
[0080]生物體內(nèi)的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測可以通過使用熒光內(nèi)窺鏡更簡便且有效地進(jìn)行。更具體而言，可以使用例如內(nèi)窺鏡系統(tǒng)來進(jìn)行，所述內(nèi)窺鏡系統(tǒng)為至少部分插入生物體的體腔內(nèi)從而獲取該體腔內(nèi)的拍攝對象的圖像的內(nèi)窺鏡系統(tǒng)，并且該內(nèi)窺鏡系統(tǒng)具備將與上述拍攝對象內(nèi)部的特定的物質(zhì)結(jié)合或反應(yīng)的感受性熒光試劑或蓄積在該拍攝對象內(nèi)部的熒光試劑向上述拍攝對象噴出的試劑噴出單元、控制該試劑噴出單元的噴出控制單元、發(fā)出用于激發(fā)上述熒光試劑的激發(fā)光及分光特性與該激發(fā)光不同的照射光的光源部、將來自該光源部的上述激發(fā)光及照射光向上述拍攝對象傳播的光學(xué)系統(tǒng)、和設(shè)置在插入上述體腔內(nèi)的部位并且能夠拍攝因上述激發(fā)光而從上述拍攝對象輻射的熒光及因上述照射光而從上述拍攝對象輻射的與該熒光不同的波長頻段的光的拍攝單元(參照日本特開2007-229054號公報。)。作為熒光試劑，使用將對ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子特異性的探針或特異性抗體用熒光物質(zhì)標(biāo)記而得到的物質(zhì)即可。
[0081]在本發(fā)明的ACF檢測方法中，供于ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的檢測的試樣只要是來自人的大腸即可。例如，可以是從人直接通過外科切除而采集的大腸組織，也可以是從生物體采集的大腸組織或在生物體外培養(yǎng)構(gòu)成其的細(xì)胞而得到的試樣。另外，對于與人同樣地Met、CdhU Ctnnbl 、或GSTp在ACF中與正常組織相比表達(dá)上調(diào)的動物種類，也可以通過檢測來自該動物的大腸組織的待測區(qū)域中的選自由Met、Cdhl、Ctnnbl、及GSTp組成的組中的I種以上的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子來檢測ACF。
[0082]待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量是否比正常組織中的量多的信息在判斷待測區(qū)域中是否存在ACF時是有用的。因而，通過本發(fā)明的ACF檢測方法而得到的檢測結(jié)果作為用于提供給ACF診斷的信息是有用的。
[0083]此外，由于ACF將來向結(jié)腸直腸癌發(fā)展的可能性高，所以通過本發(fā)明的ACF檢測方法而得到的檢測結(jié)果是在結(jié)腸直腸癌的存在風(fēng)險的判斷、或在早期低損地評價將來的結(jié)腸直腸癌發(fā)病風(fēng)險時非常有效的信息。例如，根據(jù)本發(fā)明的ACF檢測方法，在待測者的大腸組織中，在待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量比周邊的正常組織區(qū)域中多、且在該待測區(qū)域中檢測到ACF的情況下，可以評價為該待測者將來發(fā)生結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險高。相反，在待測區(qū)域中的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子的量與周邊的正常組織區(qū)域中相同或少、且在該待測區(qū)域中未檢測到ACF的情況下，可以評價為該待測者將來發(fā)生結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險低。
[0084]實施例
[0085]接著示出實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于以下的實施例。
[0086][實施例1]
[0087]對Met、CdhU Ctnnbl、GSTpU EGFR、iNOS (N0S2)、CD44、FzdU Ctsb (組織蛋白酶B)、PCNA (增殖細(xì)胞核抗原)、及C0X2這全部11種候選分子，比較同一個體中的周邊正常組織和可疑ACF區(qū)域中的基因表達(dá)水平，鑒定這些候選分子組中基因表達(dá)水平在ACF中特異性上調(diào)的分子。
[0088]具體而言，制備由從接受下部內(nèi)窺鏡檢查的患者中采集的大腸活檢樣品僅采集在顯微鏡下確認(rèn)為ACF部位的區(qū)域的樣品、和從該患者制備在下部內(nèi)窺鏡下采集的正常組織樣品，測定各樣品中的各分子的表達(dá)量并進(jìn)行比較。下面更詳細(xì)地示出。
[0089]在顯微鏡下觀察所采集的直腸部的大腸粘膜組織，僅將確認(rèn)為ACF部位的部位切除作為ACF樣品。此時，使用市售的最小尺寸的活檢器具(直徑:1mm)，選擇直徑為1mm以下的大小的微小ACF進(jìn)行采集。另一方面，采集在放大內(nèi)窺鏡觀察下認(rèn)為正常的部位作為對照樣品。ACF樣品及對照樣品均從一個患者中多次采集。
[0090]為了防止核酸分解，將ACF樣品及對照樣品活檢后立即浸潰到RNAlater (QIAGEN公司制)中。然后，使用 MagnaLyser (Roche 公司制)及 QIAGEN RNase mini kit (QIAGEN 公司制)提取總RNA后，通過DNase (Invitrogen公司制)處理消化殘存的DNA。在添加了使用生物分析儀(Agilent公司制)確認(rèn)RIN為6以上的RNA的反應(yīng)溶液中，在37°C下進(jìn)行60分鐘的RT反應(yīng)，合成cDNA。作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，以所得到的cDNA作為模板，使用用于擴(kuò)增各候選分子的引物組，進(jìn)行循環(huán)數(shù)少的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。引物組分別使用表1中記載的市售的物質(zhì)(Applied B1systems Inc.制)。具體而言,分別添加7 μ L的RT反應(yīng)后的反應(yīng)溶液、事先混合了各引物組的溶液12.5 μ L、25 μ L的核酸擴(kuò)增試劑(Taqman Gene Express1nMaster Mix、Applied B1systems Inc.制)、5.5 μ L 的超純水，調(diào)制最終體積為 50 μ L 的反應(yīng)溶液。將各反應(yīng)溶液安放到PCR裝置(Eppendorf Corp.制)中，在95°C下進(jìn)行10分鐘的熱處理后，將95°C下15秒鐘、60°C下4分鐘的熱反應(yīng)進(jìn)行14次循環(huán)。反應(yīng)后，將反應(yīng)液稀釋至20倍，將得到的溶液作為樣品供于實時PCR。
[0091]表1
[0092]
【權(quán)利要求】
1.一種ACF檢測方法，其是檢測ACF (畸變隱窩灶)的方法， 使用選自由Met、Cdhl、Ctnnbl、及GSTp組成的組中的I種以上的ACF特異性表達(dá)上調(diào)分子作為ACF檢測用標(biāo)記物， 檢測大腸組織的待測區(qū)域中的所述ACF檢測用標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ACF檢測方法，其中，所述待測區(qū)域包括疑似為ACF的區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ACF檢測方法，其中，將所述待測區(qū)域中的所述ACF檢測用標(biāo)記物的量與和所述待測區(qū)域位于同一大腸組織內(nèi)的正常組織區(qū)域中的該ACF檢測用標(biāo)記物的量進(jìn)行比較。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的ACF檢測方法，其中，所述待測區(qū)域為從生物體中采集的樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的ACF檢測方法，其中，在生物體內(nèi)進(jìn)行所述ACF檢測用標(biāo)記物的檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的ACF檢測方法，其中，通過對所述ACF檢測用標(biāo)記物進(jìn)行突光標(biāo)記來檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項所述的ACF檢測方法，其中，所述ACF檢測用標(biāo)記物為mRNA或蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中 任一項所述的ACF檢測方法，其中，使用被熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針或特異性抗體將所述待測區(qū)域中的所述ACF檢測用標(biāo)記物進(jìn)行熒光標(biāo)記后，使用能夠進(jìn)行分光檢測的內(nèi)窺鏡或消化道視頻示波器進(jìn)行檢測。
9.一種ACF檢測用標(biāo)記物，其是用于檢測來自人的大腸組織中的ACF的標(biāo)記物，其是Met、Cdh1、Ctnnbl、或 GSTp。
10.一種人的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險評價方法，其使用權(quán)利要求1~8中任一項所述的ACF檢測方法，基于待測者的大腸組織的待測區(qū)域中的ACF的檢測結(jié)果來評價該待測者的結(jié)腸直腸癌及結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險。
【文檔編號】C12Q1/02GK104024425SQ201280064493
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月27日
【發(fā)明者】堀野葉子 申請人:奧林巴斯株式會社