有關(guān)胚胎移植延遲和使用外周血單核細胞的體外受精方法
【專利摘要】一種體外受精的方法，其中在從患者擷取卵子之后至少2個月，并且優(yōu)選3個月到12個月，將胚胎植入到雌性患者的子宮中，以降低患者的自身免疫系統(tǒng)對胚胎的自身免疫排斥反應(yīng)的影響，并且增加妊娠的可能性和成功率，并且其中在胚胎植入前，通過將外周血單核細胞(PBMC)引入到子宮中來對子宮中的子宮內(nèi)膜進行準備以用于胚胎植入。將所述程序與冷凍保存技術(shù)相結(jié)合以保存患者的卵母細胞或IVF產(chǎn)生的胚胎。
【專利說明】有關(guān)胚胎移植延遲和使用外周血單核細胞的體外受精方法
[0001] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明的開發(fā)沒有使用任何聯(lián)邦資金，并且是由下列發(fā)明人獨自開發(fā)的。
[0003] 在先申請
[0004] 本申請要求于2012年10月18日提交的在先提交的美國專利申請?zhí)?3/655, 257 的權(quán)益，所述專利申請要求于2011年11月23日提交的在先提交的美國臨時專利申請?zhí)?61/629,651的權(quán)益，所述申請的主題以全文引用的方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及體外受精領(lǐng)域，特別是對于由于自身免疫反應(yīng)而使生育力降低的婦 女。本發(fā)明公開了一種通過將體外授精技術(shù)任選地與延長她們的卵母細胞或IVF-產(chǎn)生的 胚胎的冷凍保存相結(jié)合、并且與在胚胎移植前借助于外周血單核細胞（PBMC)對子宮中的 子宮內(nèi)膜進行受控準備相結(jié)合來提高妊娠植入的植入率和穩(wěn)定性的方法。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全世界每年有超過15%的婦女經(jīng)歷妊娠困難并且尋求醫(yī)學(xué) 幫助（WH01997)，估計十年前全世界范圍內(nèi)有六千萬到八千萬的婦女。世界衛(wèi)生組織把任意 的十二個月期間之后沒有懷孕作為對不孕的一般定義。然而，許多夫妻在多年嘗試自然受 孕未果之后才尋求醫(yī)學(xué)幫助以試圖懷孕。生育率的降低與醫(yī)學(xué)和非醫(yī)學(xué)因素有關(guān)。例如， 已表明婦女的年齡是懷孕所需要的平均時間的主要直接決定因素。已表明有1:1000的婦 女在30歲前發(fā)生卵巢功能早衰，1:250的婦女在35歲時發(fā)生卵巢功能早衰以及1:100的 婦女在40歲時發(fā)生卵巢功能早衰。因而，最高的出生率是在25歲到30歲的年齡組并且在 35歲之后迅速下降。不孕是當前年齡在25歲到45歲的人群所面對的最常見的健康問題。 因此，對能夠延長健康婦女的生育力從而可能避開生育的年齡相關(guān)障礙的方法以及對于通 過自然方法不能受孕的婦女來說延長生育力的方法存在著極大的關(guān)注和需要。盡管不孕本 身可能不會威脅身體健康，但是它經(jīng)常對婦女和夫妻的情感、心理以及精神健康產(chǎn)生嚴重 的影響。
[0008] 輔助生殖技術(shù)是涉及以在雌性受試者體內(nèi)建立妊娠為目的對人卵子（卵母細胞 或卵細胞）和精子（精細胞）兩者以及對胚胎進行體外處理的程序。這些程序包括但不限 于包括胚胎移植的體外受精（"IVF")、輸卵管內(nèi)配子移植、輸卵管內(nèi)受精卵移植、輸卵管胚 胎移植、配子和胚胎冷凍保存和卵母細胞及胚胎捐獻以及妊娠代孕。當其它輔助生殖技術(shù) 方法已經(jīng)失敗時，體外受精（"IVF"）已經(jīng)發(fā)展成為不孕或低生育力的主要治療方法。在 最基本的意義上，所述過程涉及從婦女體內(nèi)取出雌性卵子和在體外用精子使所述卵子受精 ("體外")。所述過程涉及監(jiān)測婦女的排卵過程、從所述婦女卵巢內(nèi)移出多個卵子以及在實 驗室內(nèi)的流動介質(zhì)中讓精子使所述卵子受精。所述卵子一般是通過包括在超聲指導(dǎo)下以針 穿刺陰道壁以達到卵巢的經(jīng)陰道卵母細胞擷取從患者擷取的。通過這個針，可以對卵泡進 行抽吸，并且將卵泡液送到IVF實驗室以鑒定和診斷卵細胞。通常從每個患者取出10到30 個卵子。隨后將受精卵、（胚胎）、或一般多個胚胎移植到患者的子宮內(nèi)以試圖建立成功的 妊娠。例如：參見美國專利號7, 781，207。
[0009] 體外受精的首次開發(fā)是在20世紀70年代，迄今為止已經(jīng)為很大一部分婦女提供 了有效形式的幫助。當前據(jù)報道，IVF占了歐洲所有活產(chǎn)的1.3% [Nygren等，2001]以及 澳大利亞所有活產(chǎn)的1. 7% [Hurst等，2001]。在美國，輔助生殖技術(shù)IVF周期從2006年開 始，已經(jīng)有41，343例出生（54, 656名嬰兒），稍多于那一年美國出生總數(shù)的1. 0 %。在2010 年，Robert Edwards因為體外受精的開發(fā)而被授予諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。接下來的步驟 是Carl Wood首創(chuàng)的，能夠冷凍以及依次解凍和移植胚胎，這顯著地提高了 IVF治療的可行 性。
[0010] 根據(jù)大量的報道研究，先前的體外受精技術(shù)所獲得的典型的成功妊娠率仍然相對 較低，在15%到25%的范圍內(nèi)。健康護理專業(yè)人員廣泛公認，受精最重要的限制因素是胚 胎不能植入到子宮的內(nèi)襯子宮內(nèi)膜中。Blake等報道80%到85%的胚胎在移植到IVF患者 體內(nèi)之后不能引起懷孕，導(dǎo)致胚胎巨大浪費。Simon等證明在正經(jīng)歷IVF周期的婦女中，在 60%的周期中檢測到植入，因此在IVF的所有移植胚胎中，40%植入失敗。
[0011] 在IVF中較低植入率的一個可能的原因是胚胎是在受精后兩天4到8個細胞的階 段移植到子宮內(nèi)的。一個觀點是使用培養(yǎng)5天到7天到達囊胚期的胚胎可能更好。所提到 的優(yōu)勢包括胚胎和子宮之間的同步性提高以及在較長培養(yǎng)期間能夠選擇更優(yōu)質(zhì)的胚胎。囊 胚移植還可以通過每次轉(zhuǎn)移時允許選擇更少數(shù)的高勝任性胚胎來幫助減少由IVF引起的 多個出生的數(shù)量。在IVF程序中，典型的是移植2個到5個胚胎到子宮中以增加植入的機 會，從而造成多胎妊娠的危險。因此，在美國，IVF治療后出生的所有嬰兒中有多于一半的 是由多胎妊娠引起。在一些情況下，在子宮內(nèi)發(fā)生多個植入，并且隨著胚胎在子宮內(nèi)繼續(xù)生 長和發(fā)育，患者沒有能力承載多于一個胎兒或兩個胎兒到足月。這時，需要做一個困難的 決定來終止這些妊娠并且從子宮中取出多余的一個或多個胎兒，這一過稱為胚胎或胎兒減 少，這個程序是用來減少在多胎妊娠中存活胚胎或胎兒的數(shù)量。這種決定將使她們承受道 德上并且通常還有身體創(chuàng)傷兩者的影響。由于前述的多個原因，仍然需要開發(fā)能夠增加每 個胚胎的植入的可能性和確定性的實驗室技術(shù)。
[0012] 在體外受精中稱為自然周期的過程中，受精是在沒有使用任何藥物的情況下，通 過從處于婦女的自然月經(jīng)周期的患者收集一個或多個自然選擇的卵子來執(zhí)行的。在改進的 自然周期IVF中，在婦女的自然周期中，使用2天到4天的生育藥物以避免自發(fā)性排卵并且 使治療更成功。"輕度IVF"（Mild IVF)是一種在婦女的自然周期中，在一個短的持續(xù)時間 內(nèi)使用小劑量的卵巢刺激藥物以意圖產(chǎn)生2個到7個卵子并且產(chǎn)生健康胚胎的方法。這種 方法看起來可以減少婦女的并發(fā)癥和副作用并且它是以優(yōu)質(zhì)為目的而不是以卵子和胚胎 的數(shù)量為目的。然而，這種方法得到是非常低的妊娠成功率。
[0013] 因此，通常也使用其它技術(shù)來增加妊娠機會。最常見的是使用卵巢過度刺激或超 數(shù)排卵以刺激卵巢產(chǎn)生多個卵子，隨后從患者擷取。長期方案典型地包括通過延長使用促 性腺激素釋放激素（GnRH)拮抗劑來下調(diào)（抑制或衰竭）垂體卵巢軸。一旦下調(diào)過程完成 (通常是在10天到14天之后），隨后就開始進行卵巢過度刺激，典型地是使用促卵泡激素 (FSH)。使用這個方案的IVF周期在體外受精中被認為是常規(guī)的。短期方案跳過了下調(diào)程 序，并且由用來刺激卵巢發(fā)育多個卵泡的生育藥物治療方案組成。其它程序使用促性腺激 素釋放激素促效劑（GnRHA)，其通過防止提前排卵來降低監(jiān)測的需要，并且最近以來在使用 具有相似功能的促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH Ant)。在大多數(shù)的患者中，可注射的促 性腺激素（一般是FSH類似物）是在密切監(jiān)測下使用的。這樣的監(jiān)測通常是檢查患者的雌 二醇水平和借助于婦產(chǎn)科超聲檢查法來檢查卵泡生長。典型地，需要約10天的注射。卵巢 刺激帶來了過度刺激的危險，從而導(dǎo)致卵巢過度刺激綜合癥（OHSS)、腹脹、卵巢腫大以及呼 吸道、血液動力學(xué)和新陳代謝并發(fā)癥等有可能威脅生命的并發(fā)癥。此外，最近也已證明用于 刺激進行IVF治療的患者排卵的生育藥物造成子宮內(nèi)所述胚胎植入接受度的降低并且導(dǎo) 致妊娠植入率降低[Ertzeid等2001]。
[0014] 雌性生育會受到生殖道功能障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙或免疫系統(tǒng)功能障礙 的影響。之所以一些雌性癌癥患者冒著失去她們生育力的危險，是因為某些種類的化學(xué)療 法治療和某些類型的放射治療可以使她們過早絕經(jīng)，從而使她們絕育。在西歐和北美，在患 有不孕癥的婦女中有10 %到20 %確定了內(nèi)分泌功能障礙[Crosignani等2000]，而且，在 約10%到20%的病例中，不孕的原因仍然未知。據(jù)推測，身體的自身免疫反應(yīng)可能是許多 這樣的婦女不孕的原因。生殖自身免疫功能衰竭和缺陷可能與免疫系統(tǒng)的總體激活或特異 性針對卵巢抗原的免疫系統(tǒng)反應(yīng)有關(guān)。
[0015] Haller-Kikkatalo解釋了在人體內(nèi)為了防止對在身體粘膜表面遭遇到的許多外 源性空氣傳播和食物抗原的自身保護性炎性反應(yīng)，需要主動耐受機制。然而，耐受的最重 要方面是自身耐受，自身耐受防止身體對自身的組織發(fā)起免疫攻擊-這是防止自身免疫反 應(yīng)。自身免疫與免疫反應(yīng)多個組分的不平衡和針對正常宿主抗原的自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。 雌性生育受到下丘腦-垂體-卵巢軸的一系列高度協(xié)調(diào)同步的相互作用調(diào)節(jié)。Gleicher 等最初描述了患有子宮內(nèi)膜異位、不孕和自身抗體增加的婦女體內(nèi)的生殖自身免疫功能衰 竭。盡管特定自身抗體對不孕致病機理的影響還沒有一致的理解，但是自身免疫機制以及 多種自身抗體產(chǎn)生的增加與如卵巢功能早衰（P0F)、臨床癥狀不明顯的卵巢衰竭、復(fù)發(fā)性妊 娠失敗、子宮內(nèi)膜異位、多囊卵巢綜合癥（PC0S)、原因不明的不孕、IVF嘗試反復(fù)失敗以及 自發(fā)性流產(chǎn)等不孕癥相關(guān)。一些研究已表明的生殖力降低中，特異性抗體并不是很重要并 且強調(diào)了免疫系統(tǒng)的總體活化的重要作用[N.Gleicher，2001 ;Dmowski等1995]。
[0016] 已有一組研究致力于開發(fā)用于解決免疫相關(guān)不孕的方法。第一個并且是最常使用 的方法是使用旨在抑制患者的自身免疫反應(yīng)以允許妊娠植入的藥物。例如，提出低劑量口 服強的松龍療法用于提高復(fù)發(fā)性IVF失敗的患者的妊娠率。然而，存在自相矛盾的數(shù)據(jù)， 指示某些抗體傷害胚胎，干擾植入過程或干擾胎盤的形成。這使得難以預(yù)測使用這些特定 免疫抑制性藥物的療法的成功。已經(jīng)開發(fā)出使用乙酰水楊酸或肝素進行更溫和的預(yù)處理 的方法。然而，盡管這一治療已經(jīng)普遍使用，但是使用這一方法的妊娠率仍保持相對較低 [Maghraby 等，2007]。
[0017] 最近引入了第二種方法。程序涉及借助于外周血單核細胞（PBMC)來對子宮內(nèi)膜 和它的周圍環(huán)境二者進行準備[Fujiwara等，Kosaka等，Yoshioka等]。外周血單核細胞 (PBMC)允許子宮的子宮內(nèi)膜在胚胎植入前長到足夠尺寸，并且還作為胚胎植入婦女的子宮 之后身體用來生長胚胎的基礎(chǔ)材料。根據(jù)提倡者所言，PBMC已被確定為多能細胞。多能細 胞產(chǎn)生屬于特定譜系或密切相關(guān)家族的細胞。它們顯示出具有自然轉(zhuǎn)化成任何種類的人組 織的能力。多能細胞是用于研究和治療性處理的寶貴資源。最近在生物工程方面的進展十 分有望用于修復(fù)、建造、工程改造、再生、產(chǎn)生和生長組織。
[0018] 歐洲專利申請EP1581637公開了從哺乳動物外周血分離的單核細胞來源的成熟 干細胞以及制備、繁殖和使用這些干細胞的方法。美國專利7, 795, 018的發(fā)明人M. Kuwana 和H. Kodamo公開了單核細胞來源的多能細胞（M0MC)，所述多能細胞在誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮的 條件下可以通過培養(yǎng)基培養(yǎng)分化成內(nèi)皮細胞。還公開了 一種用于制備M0MC的方法，所述方 法包括在纖連蛋白上體外培養(yǎng)PBMC和收集成纖維細胞樣細胞。結(jié)果表明通過在內(nèi)皮細胞 的維持培養(yǎng)基EBM-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，M0MC分化成內(nèi)皮細胞，使細胞形態(tài)從紡錘形變成 具有多個突起的形態(tài)（參見美國專利號7, 795, 018)。因此本發(fā)明的研究者假設(shè)，PBMC的使 用在生殖過程中是有幫助的并且已將PBMC的使用并入本文所提供的體外受精的新穎技術(shù) 中。
[0019] 已經(jīng)開發(fā)出一組多種植入藥劑，其可以在IVF治療中單獨或組合應(yīng)用，用于促進 婦女免疫系統(tǒng)對胚胎的接受。在這些藥劑中，可溶性人白細胞抗原G(sHLA-G)看上去是有 希望的。已經(jīng)認識到，s-HLA型分子在妊娠期間參與免疫反應(yīng)和母體-胎兒免疫關(guān)系的調(diào) 節(jié)。Sher等在美國專利申請?zhí)?0/829,081中公開了已經(jīng)從匯集到一起的正發(fā)育的胚胎和 囊胚周圍的培養(yǎng)基中分離出了 sHLA-G。他們觀察到在培養(yǎng)物中各組胚胎周圍的上清液中 sHLA-G的缺乏與IVF植入和妊娠率的明顯降低有關(guān)。他們提出向用于培養(yǎng)胚胎和/或用于 通過胚胎移植將胚胎遞送到子宮環(huán)境中的培養(yǎng)基中添加 sHLA-G將會提高那些胚胎的植入 和妊娠的可能性。盡管這種技術(shù)是有用的，但是這種方法和任何其它方法都不能單獨解決 自身免疫性不孕的問題。本文提出將這些植入藥劑與本文中本發(fā)明的方法結(jié)合使用來提高 妊娠植入的可能性和成功率。
[0020] 最后，工程改造的糖脂樣分子構(gòu)建體已顯示能夠修飾胚胎以及增強胚胎和靶組織 子宮內(nèi)膜間的相互作用。在胚胎外表面上建立大分子基質(zhì)和對所述基質(zhì)裝載用于刺激妊娠 植入的某些藥劑就是根據(jù)提倡者所言將在將來的IVF治療中具有非常廣泛的應(yīng)用的技術(shù)。 不僅通過這種建設(shè)性方法對胚胎進行修飾在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中證明是成功的，而且動物還可 以產(chǎn)出由這些修飾胚胎得到的健康后代。然而，這種方法還沒有在臨床試驗中進行測試并 且在當前的醫(yī)療工具中被認為仍然不夠成熟。
[0021] 很多研究是針對用于提高成功妊娠和孩子出生的可能性的程序。盡管進行了相當 多的研究、技術(shù)改進和程序變化，但是利用IVF治療的成功妊娠率仍然保持平均每周期約 15%到25%。本文的研究者已嘗試通過提出一種關(guān)注于使婦女免疫系統(tǒng)和胚胎之間的相互 作用穩(wěn)定的解決方案來應(yīng)對胚胎植入的挑戰(zhàn)和降低自身免疫系統(tǒng)反應(yīng)的危險。
[0022] 發(fā)明概述
[0023] 在本發(fā)明最廣泛的意義上，提供了一種用于雌性患者的體外受精的方法，所述方 法包括將有效量的包含外周血單核細胞的組合物引入到子宮中、以及在起始所述患者的體 外受精后的預(yù)定延遲之后移植至少一個胚胎到所述患者的子宮內(nèi)的步驟；并且其中當與缺 少這些步驟的體外受精相比較時，所述方法使得成功植入妊娠的子宮中胚胎植入的可能性 增加。預(yù)定時間延遲是足以降低胚胎的自身免疫排斥反應(yīng)或患者的自身免疫反應(yīng)的危險的 時期。在胚胎移植前的預(yù)定時間延遲是患者的至少兩個月經(jīng)周期或兩個排卵周期，不過所 述延遲將在患者與患者之間、動物物種、雜交體和變種之間發(fā)生變化。在人類患者中，優(yōu)選 的預(yù)定時間延遲是3個月到12個月。
[0024] 本發(fā)明的另一個方面是，在時間延遲期快結(jié)束時，以使得子宮腔對胚胎的接受度 得到優(yōu)化的方式對婦女的子宮內(nèi)膜進行準備。根據(jù)本發(fā)明，這是通過子宮內(nèi)注射外周血單 核細胞（PBMC)來完成的，最優(yōu)選所述外周血單核細胞是獲自所述患者。在本文中已觀察 至IJ，這種方法使得成功妊娠植入和早期妊娠發(fā)育的可能性增加。將與胚胎的冷凍保存相結(jié) 合的植入時間延遲與婦女子宮內(nèi)膜的PBMC準備二者進行組合是本發(fā)明的基礎(chǔ)。
[0025] 更具體而言，公開了一種用于雌性患者的體外受精方法，所述方法包括以下步驟： (a)獲得至少一個卵母細胞并且用精子使所述卵母細胞受精以形成受精卵；(b)在體外，使 所述受精卵發(fā)育到胚胎階段；（c)冷凍保存所述胚胎；(d)等待足以降低所述患者的自身免 疫反應(yīng)危險的預(yù)定時期；（e)在等待期結(jié)束之前2天到4天從所述患者的血液中提取第一 部分外周血單核細胞（PBMC) ; (f)在合適的培養(yǎng)基c中培養(yǎng)所述第一部分PBMC ; (g)在所述 等待期的最后一天從所述患者的血液中提取第二部分新鮮的PBMC ; (h)將所培養(yǎng)的第一部 分PBMC與第二部分新鮮的PBMC組合以獲得包含新鮮的和培養(yǎng)的PBMC的組合物；（i)將所 述PBMC組合物引入到所述患者的子宮中；（j)將所述胚胎從冷凍保存狀態(tài)解凍；以及（k) 將至少一個解凍的胚胎移植到所述患者的子宮中以實現(xiàn)妊娠。
[0026] 本發(fā)明的另外一個方面是包含PBMC的組合物、產(chǎn)生所述組合物的方法和所述 PBMC組合物在IVF治療中以及用于生長和工程改造某些生物體靶組織（最優(yōu)選雌性子宮的 子宮內(nèi)膜）的應(yīng)用。這種方法包括從患者的血液中提取PBMC;在4. 8%到6.0%二氧化碳 (C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下，在含有⑴具有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI1640 培養(yǎng)基、（ii)人重組白蛋白以及（iii)能夠提高PBMC增強組織生長的能力的促進劑（如 人絨毛膜促性腺激素（hCG))的培養(yǎng)基中繁殖一部分所提取的PBMC;以及將新鮮的和培養(yǎng) 的部分PBMC組合以得到所述組合物。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 通過定義整篇說明書中所使用和依賴的術(shù)語，將使本發(fā)明得到更清楚的理解。
[0029] "囊胚"是受精后5天或6天的胚胎，其具有內(nèi)部細胞團、稱為滋養(yǎng)外胚層的外部細 胞層、以及容納胚胎整體所來源的內(nèi)部細胞團的充滿液體的囊胚腔。滋養(yǎng)外胚層是胎盤的 前體。囊胚被透明帶環(huán)繞，透明帶隨后在囊胚"孵化"時脫落。由糖蛋白衣組成的透明帶環(huán) 繞單細胞期到發(fā)育囊胚期的卵母細胞。在胚胎附著和植入之前，透明帶通過包括蛋白水解 降解在內(nèi)的多種機制從胚胎脫落。透明帶最初的功能是防止多于一個精子進入卵母細胞， 接著是在胚胎到達子宮中之前防止胚胎過早粘附。
[0030] "低溫IVF"指的是一種體外受精過程，在這個過程中，將胚胎冷凍保存，接著在胚 胎移植之前解凍，或者是先將用于受精的卵母細胞冷凍接著解凍的過程。"新鮮IVF"指的 是一種體外受精過程，其中胚胎在移植到子宮腔之前不進行冷凍，并且其中用于準備胚胎 的卵母細胞沒有預(yù)先冷凍。
[0031] "胚胎"是在受精后八（8)周，胚胎期結(jié)束之前受精卵分裂的產(chǎn)物。胚胎的裂解期 存在于培養(yǎng)的前三天。"胚胎移植"是將一個或多個胚胎和/或囊胚放入子宮或輸卵管的程 序。因此，術(shù)語"囊胚"和"胚胎"在本文中可以互換使用，用于定義術(shù)語"胚胎移植"的目 的，并且術(shù)語"胚胎移植"的應(yīng)用如所描述和要求在本發(fā)明的范圍和應(yīng)用內(nèi)。
[0032] "子宮內(nèi)膜"指的是襯在子宮內(nèi)表面的組織，是由一層上皮細胞組成。植入時，胚胎 首先與子宮內(nèi)膜和細胞外基質(zhì)（"粘液"）接觸。上皮和下層基質(zhì)細胞層在月經(jīng)周期的激素 影響下周期性增厚，分泌粘液，并且從身體脫落。本文中術(shù)語"植入"指的是囊胚（在它的 透明帶脫落之后）附著和隨后穿透，一般是進入子宮內(nèi)膜中。對子宮內(nèi)膜內(nèi)襯的附著可以 通過附著分子與子宮內(nèi)膜的一種或多種組分（包括上皮細胞膜、粘液、粘液的粘液素組分 或外源引入子宮的組分）之間的相互作用而發(fā)生。
[0033] "受精"指的是通過精子穿透卵子并且它們的遺傳物質(zhì)組合，從而導(dǎo)致形成受精 卵。本文所用的"起始體外受精"指的是起始對雌性患者的受控排卵刺激，包括對婦女進行 刺激以誘導(dǎo)多個卵巢卵泡的發(fā)育以便在卵泡抽吸時獲得多個卵母細胞的藥物治療。
[0034] "子宮"通常稱之為娘胎，是包括人在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動物的主要雌性激素反應(yīng)性 生殖性器官，其包括在一端的子宮頸，而另一端連接至一個或兩個輸卵管（取決于物種）。 子宮的生殖功能是接受從輸卵管穿過子宮輸卵管結(jié)合部的受精的卵子。它植入到子宮內(nèi)膜 中，并且從專門出于營養(yǎng)目的而發(fā)育的血管中獲取營養(yǎng)。受精的卵子變成胚胎，附著到子宮 壁，產(chǎn)生胎盤，并且在懷胎期間發(fā)育成胎兒直到分娩。如本文所用的術(shù)語"子宮"包括用于胚 胎移植目的的輸卵管。在本文中術(shù)語"子宮"還可以和作為子宮體的腔體的術(shù)語"子宮腔" 互換使用。
[0035] 在IVF治療中，婦女的免疫系統(tǒng)經(jīng)歷卵母細胞的刺激產(chǎn)生和遞送。如果在卵母細 胞提取之后不久就將IVF產(chǎn)生的胚胎移植到子宮腔中，那么免疫系統(tǒng)可能會產(chǎn)生過度反 應(yīng)。免疫系統(tǒng)的這種過度反應(yīng)可能是身體不能植入胚胎并且導(dǎo)致自身免疫性不孕的原因。 在第一個方面，本發(fā)明提出延遲胚胎到子宮的引入以允許調(diào)整婦女的免疫系統(tǒng)并且重獲它 的適當激素平衡。在時間延遲期間，雌性患者的卵母細胞或胚胎任選地通過冷凍保存加以 保存。
[0036] 適用于本發(fā)明的方法的時間延遲是針對各特定患者預(yù)定的時間量。對于人患者， 時間延遲可能是任意至少兩個月或兩個排卵期的時間長度。在優(yōu)選的實施方案中，預(yù)定的 延遲是3個排卵周期，這典型地對應(yīng)于3個月。大多數(shù)婦女經(jīng)歷每28天一個排卵周期。然 而應(yīng)理解的是，因為排卵周期會隨著婦女的不同而變化，所以在本發(fā)明IVF程序的治療過 程中，延遲的實際天數(shù)將會隨著各患者而變化。有可能雌性患者在3個月周期中將經(jīng)歷僅2 個排卵周期，或同樣地，婦女在3個月周期中可能經(jīng)歷多于3個排卵周期。在一些情況下， 有可能患者在IVF治療起始后的第一次排卵之后將不會經(jīng)歷任何另外的排卵。時間延遲還 可以持續(xù)多于3個月，但是優(yōu)選在3個月到一年之內(nèi)。本文已證明，預(yù)定時間延遲顯著降低 了自身免疫性不孕的危險，并且因此顯著地增加了成功妊娠的可能性。
[0037] 妊娠植入是使用由患者以外的一個雌性或多個雌性獲得的卵母細胞或胚胎的實 施方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述卵母細胞或胚胎分別被稱為"供體卵子"或"供體胚胎"。這 將在以下情況下發(fā)生：雌性患者不能排卵或不能產(chǎn)生可用的卵細胞、或通過使患者自己的 卵子受精而獲得的胚胎被確定為對于胚胎移植來說具有過多缺陷、或基于形態(tài)學(xué)或遺傳學(xué) 測試具有低存活可能性。
[0038] 在常用技術(shù)中，進行IVF的婦女需要注射激素以刺激卵泡發(fā)育和產(chǎn)生多個卵子。 這個刺激過程一般需要最初使用促性腺激素釋放激素（GnRH)促效劑以抑制卵巢功能，從 而防止在所要的時間前排卵。最常使用的藥物是檸檬酸克羅米芬CCIomid?),它是通過抑 制雌激素對下丘腦的負反饋來增加促性腺激素產(chǎn)生的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。卵母細胞 的最終成熟和釋放的這種誘導(dǎo)經(jīng)常是通過施用促黃體素來誘導(dǎo)的。用于這些注射的方案在 本領(lǐng)域是熟知的和確定的，并且用于本發(fā)明方法的任何實施方案。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的方法，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)從雌性患者收集或擷取未受精的卵 子。這些技術(shù)包括在卵巢卵泡中放入特殊設(shè)計的針頭并且移出包含卵子的液體。一旦卵泡 液體從卵泡中移出，就可以對卵子進行顯微鏡檢查和診斷以觀察它們的形態(tài)學(xué)特征。美國 專利號4, 725, 579公開了一種用于獲得用于IVF的卵母細胞的方法。在本文的方法中，從 患者中收集了 6個卵母細胞，但是優(yōu)選獲得4個。卵子接著放入培養(yǎng)箱中。使用常規(guī)受精 或胞漿內(nèi)精子注射（ICSI)使卵子受精。所使用的受精的類型通常是基于雄性的精子參數(shù) 或其它因素如胚胎所需要的分析的類型。在常規(guī)受精中，將精子和卵子在培養(yǎng)碟中混合，并 且培養(yǎng)過夜以進行受精過程。在胞漿內(nèi)精子注射中，將一個精子直接注射到卵子中。不管 是哪種技術(shù)，都在第二天觀察卵子以評估細胞分裂。接著將現(xiàn)在稱為胚胎的受精的卵子放 入到能促進生長和發(fā)育的特殊培養(yǎng)基中。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明，在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)IVF來源的卵母細胞或胚胎?？捎玫呐囵B(yǎng)基 嘗試提供細胞生長和發(fā)育的所需要的營養(yǎng)，并且尋求盡可能復(fù)制在正常情況下雌性生殖系 統(tǒng)中所存在的條件。在本文中使用在實驗室程序中適用于體外支持細胞發(fā)育和生長的本 領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基。實例包括但不限于人輸卵管液（HTF) (Irvine Scientific)、N-2-羥 乙基哌嗪-Ν' -2-乙燒（HEPES)培養(yǎng)基（Irvine Scientific)、IVF_50(Scandanavian IVF Science)、 S2(Scandanavian IVF Science)、 G1 和 G2(Scandanavian IVF Science)、 UniIVF、ISM-l、BlastAssist、UTM 培養(yǎng)基（由 Origio A/S 以MEDICULT?培養(yǎng)基名義銷 售）、改進的Whittens培養(yǎng)基、Wittinghams T6培養(yǎng)基、Ham' s F-10培養(yǎng)基、Earle' s溶 液。典型地提供如4-嗎啉丙磺酸（MOPS)等緩沖系統(tǒng)。程序詳細闡述于Trouson等（1980 和 1982)和 Quinn 等（1985)中。
[0041] 組織培養(yǎng)基通常是復(fù)雜的系統(tǒng)，包含一系列氨基酸、維生素和其它組分。一些培養(yǎng) 基由補充有碳水化合物能源如葡萄糖、丙酮酸鹽和乳酸鹽的平衡鹽溶液組成。培養(yǎng)基還可 以補充有非必需氨基酸。培養(yǎng)基中的組分通常來源于非人和非動物來源，如重組微生物。希 望采取一定步驟來降低污染的可能性，如合適的純化和本領(lǐng)域中實施的制備技術(shù)。除此之 夕卜，培養(yǎng)基可以包括抗生素，如青霉素或鏈霉素，以破壞在卵母細胞收集過程中可能引入到 培養(yǎng)基中的細菌。
[0042] 在雌性生殖系統(tǒng)內(nèi)的體內(nèi)發(fā)育中，在排卵過程中，卵母細胞在卵巢中產(chǎn)生并從卵 巢釋放，并且經(jīng)由輸卵管向子宮行進。輸卵管的液體包含多種能夠向卵母細胞和它周圍的 卵丘細胞提供營養(yǎng)的組分。一旦發(fā)生受精，則所產(chǎn)生的受精卵就沿輸卵管前進并且在約3 天后進入子宮，從而進行內(nèi)部轉(zhuǎn)化并且經(jīng)歷改變的環(huán)境。隨著受精卵/胚胎/囊胚的發(fā)育， 發(fā)生顯著的發(fā)育變化。在子宮中圍繞正在發(fā)育的胚胎的液體的組成適于那些變化的需要。 [0043] 和雌性生殖系統(tǒng)的自然環(huán)境相比較，沒有單一的培養(yǎng)基被優(yōu)化用于支持配子、受 精、受精卵成熟和胚胎發(fā)育。因此，已有多種特殊培養(yǎng)基可用于應(yīng)付胚胎發(fā)育的不同階段。 舉例來說，特別配制了 G1和G2培養(yǎng)基以滿足裂解期胚胎和8細胞至囊胚期發(fā)育的胚胎的 生理需求。Robertson等的美國專利號6, 605, 468公開了一種用于將早期階段胚胎繁殖到 囊胚期的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基包含有效量的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)，以 增加發(fā)育成準備移植的囊胚的前囊胚胚胎的百分比。還公開了一種使早期階段人胚胎生長 成準備移植的囊胚的方法。結(jié)果是更多比例的胚胎可以生長到囊胚期并且在IVF項目中用 于植入。已經(jīng)使用培養(yǎng)技術(shù)進行了很多研究，其中將胚胎與飼養(yǎng)細胞共同培養(yǎng)[Menezo等， 1990 ;Planchot等，1995]?？梢蕴砑尤缂毎蜃拥绕渌碳ひ蜃拥脚囵B(yǎng)基中以促進胚胎生 長，如白血病抑制因子（LIF)，參見例如Gough等的美國專利號5, 418, 159。白血病抑制因 子是在體外胚胎學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的有效激素，如用于維持胚胎干細胞系和增加胚胎移植 的效率。
[0044] 在美國專利號6, 838, 235中，Gardner等提出在整個IVF過程中，不是將人生殖細 胞浸入單一培養(yǎng)基，而是隨著不同IVF程序的執(zhí)行，生殖細胞可以移動穿過一系列不同的 培養(yǎng)基。在一種制劑中，培養(yǎng)基經(jīng)過特別配制以提供與雌性生殖道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的實體環(huán)境類似 并且有利于胚胎生長和發(fā)育的實體環(huán)境。本發(fā)明提出可以針對卵母細胞擷取和處理；卵母 細胞成熟；普通受精；卵母細胞、受精卵和胚胎檢查以及活組織檢查；胚胎發(fā)育到8細胞階 段；胚胎發(fā)育到囊胚期；胚胎移植；以及冷凍保存提供特殊的培養(yǎng)基。
[0045] 除了使用通?？捎糜谂咛ブ苽涞呐囵B(yǎng)基外，本發(fā)明方法還可以和其它技 術(shù)相結(jié)合以增加妊娠植入的可能性和成功率。已經(jīng)開發(fā)出多種方法，在所述方法 中，先以一定方法對胚胎進行修飾，隨后移植到子宮腔中。舉例來說，歐洲專利申請 EP1765987(W02005121322A1)公開了通過添加一個或多個產(chǎn)生在血清學(xué)上等效于A或B抗 原紅血球的細胞的單糖單元對細胞表面Η抗原進行酶促修飾。研究表明，在胚胎上存在透 明質(zhì)酸受體，并且在母親子宮的子宮內(nèi)膜上也有透明質(zhì)酸受體。透明質(zhì)酸被認為所起的作 用類似于生物膠，其協(xié)助胚胎結(jié)合到子宮內(nèi)膜并且因此支持植入。Carter等的美國專利號 8, 183, 214公開了一種將透明質(zhì)酸定位到在IVF程序中使用的細胞或多細胞結(jié)構(gòu)（胚胎） 表面的方法。本發(fā)明提供了穩(wěn)定地并入細胞或胚胎的脂質(zhì)雙層或細胞膜從而改變它的生物 活性以改進某些特征（如生長特征、儲存特征以及胚胎的存活和移植到子宮之后胚胎實施 的可能性）的碳水化合物-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。同樣，Blake等的美國專利號7, 819, 796公開了用 來增強胚胎附著和植入的又一外源制備的構(gòu)建體。利用具有插入到胚胎的細胞膜或透明帶 中的脂質(zhì)尾巴的糖脂對胚胎進行修飾，其中糖脂經(jīng)過修飾以包含結(jié)合部分，其中結(jié)合部分 經(jīng)過改適以使得能夠結(jié)合附著分子。胚胎對子宮內(nèi)膜的附著可以通過結(jié)合部分直接進行 或通過橋接分子進行。另一方法蛋白質(zhì)涂抹是一種用于在沒有基因轉(zhuǎn)移的情況下修飾細 胞膜的外部抗原的方法。國際申請PCT/US98/15124(公布W099/05255)的說明書描述了 通過使胚胎與脂質(zhì)修飾的粘附分子接觸來增強實施，以改良胚胎的發(fā)育。美國專利申請?zhí)?13/067, 021描述了另一種有效定性和/或定量地改變細胞所表達的表面抗原的非轉(zhuǎn)基因 方法。研究者公開的合成分子構(gòu)建體并入細胞的脂質(zhì)雙層中，并且提出這樣的插入在熱力 學(xué)上是有利的。前述胚胎制備方法以及本領(lǐng)域中實施的其它方法涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0046] 在傳統(tǒng)的IVF過程中，胚胎在受精后兩天每個胚胎處于四（4)細胞期時或在受精 后三天胚胎處于八（8)細胞期時移植到子宮腔。已認識使用培養(yǎng)達到5天到7天處于囊胚 期的胚胎可能是合乎需要的。本發(fā)明的IVF方法允許在胚胎/囊胚發(fā)育范圍內(nèi)的任何時間 進行胚胎移植。通過目視觀察（如通過使用顯微鏡），當囊胚腔清楚可見并且所占體積大于 胚胎的50%時，認為囊胚和胚胎可以移植到子宮中。在體內(nèi)環(huán)境中，這個階段通常在受精之 后4天到5天達到，不久之后胚胎就穿過輸卵管并且到達子宮。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本文發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在IVF治療期間在胚胎移植之前，將包 含外周血單核細胞（PBMC)的組合物引入到雌性患者的子宮中明顯地增加了胚胎在子宮的 子宮內(nèi)膜中成功植入的可能性，由此產(chǎn)生可存活的妊娠。不欲受到科學(xué)理論束縛，認為PBMC 促進婦女子宮內(nèi)膜和所移植胚胎的健康和活力。
[0048] PBMC是多能祖細胞，其具有從多種但是有限數(shù)量的譜系產(chǎn)生細胞的潛力。在一 系列長期細胞分裂結(jié)束時，形成胚胎的細胞終末分化并且被認為永久地限定于一種特定功 能。干細胞實驗已經(jīng)能夠引導(dǎo)血液干細胞表現(xiàn)的像神經(jīng)細胞或腦細胞-一種稱為轉(zhuǎn)分化的 過程。使用來自于胎兒、臍帶或來源于體外受精卵子的胚胎組織在人材料的情況下產(chǎn)生了 道德的和法律的問題，引起了交叉感染的危險和/或可能因為它們可能被接受者的免疫系 統(tǒng)排斥而無效。可以說，使用PBMC產(chǎn)生較少的道德的和法律的問題，因為PBMC是從血液獲 得并且不構(gòu)成干細胞，然而仍然能夠分化的細胞。
[0049] 如本文所用，外周血單核細胞（PBMC)是從受試者血液中提取的、收集的、得到的、 分離的或以其它方式獲得的多能細胞。PBMC是血液細胞并且具有圓形細胞核。PBMC種類 包括但不限于淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞。這些血液細胞是生物體的免疫系統(tǒng)在抵抗 感染和運行涉及免疫系統(tǒng)的其它功能時所使用的關(guān)鍵組分。淋巴細胞群體由T細胞（CD4 和⑶8陽性，約75% )、B細胞以及NK細胞（總計約25% )組成。PBMC群體還包括嗜堿性 粒細胞和樹突細胞。
[0050] PBMC可以通過本領(lǐng)域已知的常用方法從人外周血中分離。這些細胞可以使用 FICOLL? (瑞典 GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC)從全血中提取，F(xiàn)ICOLL? 是分離血液各層的親水性多糖，它將把血液分成血清頂層，接著是PBMC層以及白細胞、 紅細胞和多形核細胞（如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞）的底部部分。多形核細胞可 以通過溶解紅血球而進一步分離。Ficoll?處F.ic〇U-Paque? (瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB LLC)的一部分。通常將Ficoll-Paque?放在錐形管的底部，并且血液 接著在Ficoll-Paque?.上方慢慢分層。在離心之后，在錐形管中可見若干層，從上到下為： 血漿和其它組分、含有PBMC的單核細胞層、Ficoll-Paque?，以及以球粒形式存在的紅細 胞和粒細胞。這一分離允許容易地收集PBMC。一些紅血球截留（存在紅細胞和粒細胞） 可能存在于PBMC層或Ficoll-Paque?層中。在PBMC層中有時可能會發(fā)生大量血凝固。 通常將乙二胺四乙酸鹽（EDTA))和肝素與FicoM-Paque?結(jié)合使用，以防止凝固。因為 Ficoll-Paque?分層是非常緩慢的過程，所以開發(fā)了有助于覆蓋（這是最耗時的步驟）的 裝置。一個這種產(chǎn)品是SepMate?-50 (加拿大StemCell Technology Inc.)，這是一種包含 在Ficoll-Paque'?和血液樣本之間形成物理屏障的多孔插入物的專用管。這樣允許將血液 樣本快速吸移到插入物上，從而避免將它直接覆蓋到Ficoll-Paque?上的需要。S印Mate? 插入物也減少了離心步驟的持續(xù)時間，并且在離心之后，包含血漿和PBMC的頂層可以倒入 單獨的容器中。其它裝置包括含有多孔高密度聚乙烯屏障或"玻璃料"的柱。這些產(chǎn)品允 許在不混合多糖和血液的情況下更快速地使血液分層。這種產(chǎn)品的一個實例是由Sigma Aldrich 銷售的 "Accuspin System Histopaque-1077"。也有可能使 Ficoll-Paque?分離 系統(tǒng)包括在真空采血管血液采集管中。這些真空采血管增加了采集血液產(chǎn)品的便利性和 安全性，但成本比基礎(chǔ)的真空采血管高得多。另一個這種產(chǎn)品Floaties?已證實可使用聚 合物珠?；蛄Ａ系奶厥饣旌衔镉行У貙⒀夯蚣毎麘腋∫焊采w在Ficoll?.上。這個產(chǎn)品便 宜，降低了研究人員對技術(shù)的依賴，并且實際上加速了覆蓋過程。任何前述技術(shù)，包括在收 集、離析、提取、采集、分離、移出等領(lǐng)域?qū)嵤┗驅(qū)嵤┑钠渌夹g(shù)、或從生物體、人或動物 的血液中獲得PBMC的任何其它方式均涵蓋在本發(fā)明的實施方案的范圍內(nèi)。
[0051] 在本發(fā)明的一個方面，本文提供一種培養(yǎng)PBMC細胞的方法。所述方法包括在纖 連蛋白涂布的平板上、在含有4. 8%至6. 0%二氧化碳（C02)的加濕氛圍中、在36. 7°C到 37. 3°C范圍內(nèi)的溫度下、以104/mL-107/mL的密度培養(yǎng)細胞。在所述方法的一個優(yōu)選實施 方案中，PBMC的培養(yǎng)持續(xù)46小時到72小時范圍內(nèi)的時期。在最優(yōu)選的實施方案中，PBMC 在纖連蛋白涂布的平板上在5. 0% C02的氛圍中、在37. 1°C的溫度下培養(yǎng)48小時。
[0052] 本文用于繁殖提取的PBMC的培養(yǎng)基是Rosewll Park Memorial Institue培養(yǎng) 基，通常稱為RPMI培養(yǎng)基，可從多種來源得到。RPMI培養(yǎng)基通常用于細胞和組織培養(yǎng)。 RPMI1640培養(yǎng)基已常規(guī)用于無血清人淋巴細胞、骨髓細胞和雜交瘤細胞的生長。RPMI1640 培養(yǎng)基使用碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)，并且在它的PH8制劑中，與大多數(shù)哺乳動物細胞培養(yǎng)基不 同。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選培養(yǎng)基使用包含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，將人重組白蛋白（HRA)添加到培養(yǎng)基中。HRA是以高濃 度存在于血漿中的眾所周知的載體蛋白質(zhì)，具有大約19天的循環(huán)半衰期。它的作用是將脂 肪酸運輸?shù)浇M織中、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)合金屬離子到表面以及在血漿中的抗氧化作用。HRA可 以從很多供應(yīng)商廣泛獲得，例如從Novozymes，Inc.或Sigma-Aldrich，LLC。在本發(fā)明的方 法中添加 HRA到培養(yǎng)基中充當改良PBMC生長的食品補充劑。
[0054] 在本發(fā)明的又一方面，將人絨毛膜促性腺激素（hCG)添加到本文的RPMI1640培養(yǎng) 基中。人絨毛膜促性腺激素（hCG)在人體內(nèi)在妊娠期間由胎盤合胞體滋養(yǎng)層釋放到母體循 環(huán)中。已表明hCG是免疫調(diào)節(jié)激素并且據(jù)報道施用hCG會增加妊娠成功率，并且hCG抗血 清抑制胎兒植入。hCG與某些受體（LHCG受體）相互作用，并且促進妊娠開始時黃體的維 持，使得它能夠分泌激素黃體酮。黃體酮使子宮富含血管和毛細管內(nèi)襯，以便它可以維持胚 胎和胎兒的生長。由于它的高負電荷，hCG可以排斥母親的免疫細胞，從而在前三個月期間 保護胎兒。已假設(shè)，hCG可能是發(fā)展局部母親免疫耐受的胎盤聯(lián)系物。舉例來說，hCG處理 的子宮內(nèi)膜細胞誘導(dǎo)T細胞凋零增加（T細胞溶解）。這些結(jié)果表明，hCG是發(fā)展滋養(yǎng)層周 圍免疫耐受的聯(lián)系物，并且可以促進滋養(yǎng)層的侵入，已知這會促進子宮內(nèi)膜中的胎兒發(fā)育。 [Kayisli等，2003]。還表明，hCG水平與妊娠婦女的晨吐嚴重性相關(guān)。本發(fā)明培養(yǎng)基中hCG 的最小濃度不少于5IU/mL。為了清楚起見，本文還發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明方法制備的培養(yǎng)基中的 hCG充當提高PBMC增強組織生長（特別是在本發(fā)明的IVF過程中子宮內(nèi)膜的生長）的能力 的促進劑。當用本發(fā)明的PBMC組合物處理時，培養(yǎng)的PBMC和/或培養(yǎng)的和新鮮的PBMC組 合物的組合具有改變患者子宮內(nèi)膜組織的尺寸和接受性的能力。這將引起尺寸的增加，特 別是子宮內(nèi)膜的厚度增加，以及植入時子宮內(nèi)膜結(jié)合胚胎的能力增強。
[0055] 本發(fā)明的體外受精方法提供了通過上述培養(yǎng)技術(shù)獲得的PBMC用于提高妊娠植入 的用途。從雌性患者獲得卵母細胞之后，從患者的血液中提取一部分PBMC。這一部分PBMC 接著根據(jù)上文公開的方法，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以獲得所要量和品質(zhì)的PBMC。在本文討 論的預(yù)定等待或延遲時期之后，再從所述患者獲得一部分血液并且從所述血液中提取一部 分新鮮的PBMC。或者，可以將首次從患者獲得的血液批次分成含有PBMC的不同部分，對 其中的一部分或一些部分進行培養(yǎng)，并且一部分或一些部分保持新鮮。新鮮部分優(yōu)選是在 預(yù)定等待時期的最后一天獲得的。接著將一些或全部新鮮PCMB與一些或全部培養(yǎng)的部分 PBMC組合以獲得包含新鮮的和培養(yǎng)的PBMC的組合物。在本發(fā)明的優(yōu)選PBMC組合物中PBMC 的濃度在每一毫升組合物4百萬個到5百萬個細胞范圍內(nèi)；然而高達每毫升組合物8百萬 個細胞的濃度在本發(fā)明的范圍內(nèi)是可行的。組合物可以以任何合意的方法混合或進一步摻 混或處理，以便在不損傷細胞的情況下組合PBMC。接著，典型地通過導(dǎo)管注射，將PBMC組合 物引入到患者的子宮腔中。根據(jù)本發(fā)明，在20小時到72小時之后，最優(yōu)選24小時，將一個 或多個胚胎移植到子宮中用于植入，以實現(xiàn)妊娠。本文的研究者已證明，這種技術(shù)使身體能 夠使用PBMC作為基礎(chǔ)物質(zhì)，以增加子宮內(nèi)子宮內(nèi)膜層的厚度，并且因此降低妊娠植入失敗 的危險。
[0056] 重要的是，在本發(fā)明的IVF治療的過程中，PBMC是從患者本身提取的。然而，在本 發(fā)明范圍內(nèi)設(shè)想，培養(yǎng)的部分PBMC可以來源于除正在進行體外胚胎移植的患者以外的個 體。在這種情況下，新鮮部分的PBMC優(yōu)選是獲自正在進行胚胎移植的患者，以應(yīng)對患者的 自身免疫反應(yīng)。
[0057] 對胚胎和患者生殖系統(tǒng)兩者進行植入前診斷是本發(fā)明的又一方面。診斷患者時， 子宮內(nèi)膜的厚度在胚胎移植時優(yōu)選在9_到11_的范圍內(nèi)，子宮內(nèi)膜厚度典型地可以用超 聲測量。
[0058] 典型地也執(zhí)行植入后診斷。在移植后兩周使用例如血液b-hCG(人絨毛膜促性腺 激素）測試和本領(lǐng)域中通常已知的其它技術(shù)來進行確定一個或多個胚胎是否已植入到子 宮內(nèi)膜中，即程序是否已得到成功的妊娠植入的測試。hCG在妊娠診斷和妊娠相關(guān)的條件 (如異位妊娠、自發(fā)性流產(chǎn)、21號染色體三體、葡萄胎妊娠和絨毛膜癌）中是必需的。在通過 檢測血清或子宮中的hCG來診斷妊娠時存在"生化妊娠"事件，其不會發(fā)展成臨床妊娠 。Zer 等的美國專利號4, 315, 908闡述了一種通過放射免疫測定來檢測hCG的方法。0' Connor 等的美國專利號8, 163, 508提供一種用于通過檢測樣本中hCG的早期妊娠相關(guān)同種型的量 利用hCG方法來預(yù)測受試者妊娠的方法和試劑盒。這些診斷方法和其它的方法適用于本發(fā) 明的范圍。
[0059] 臨床醫(yī)生力圖鑒定出那些最有可能達成存活妊娠的胚胎用于移植。在某些實施方 案中，本發(fā)明提供對從患者擷取或體外制備的卵母細胞、囊胚或胚胎進行的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué) 和動力學(xué)測試。診斷方法包括胚胎的顯微鏡物理分析，以鑒定那些根據(jù)胚胎的形態(tài)特征觀 察和胚胎的遺傳學(xué)測試看起來正常發(fā)育的胚胎。"植入前遺傳學(xué)診斷"通過分析極體、卵裂 球或滋養(yǎng)外胚層來鑒定胚胎是否包含遺傳的、結(jié)構(gòu)的、和/或染色體的改變或異常。"植入 前遺傳學(xué)篩檢"涉及分析胚胎的極體、卵裂球或滋養(yǎng)外胚層以便檢測非整倍體、突變和/或 DNA重排。用于診斷胚胎的至少3種基礎(chǔ)輔助性孵化和活組織檢查技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知 的。這些技術(shù)包括使用特殊的顯微手術(shù)刀或玻璃針在胚胎的透明帶上以機械方式產(chǎn)生切 口；用如臺式液等酸對一部分透明帶進行化學(xué)消化；或使用激光去除透明帶以輔助分離胚 胎。
[0060] 在優(yōu)選的實施方案中，通過使用顯微鏡（例如，Nikon Eclipse TE2000-S顯微鏡） 對胚胎進行目視觀察，胚胎在它被植入到子宮中之前，將同時顯示某些確定的實體或形態(tài) 特征。根據(jù)以引用方式并入本文的Gardner等，1994的分類，囊胚成熟的狀態(tài)確定為范圍 II AB-VI AA，在Gardner等，1994的分類中，對滋養(yǎng)外胚層的細胞內(nèi)物質(zhì)和厚度進行分類。 水平VI AB表示囊胚成熟的最高狀態(tài)，與從透明帶孵化形成的囊胚一致。
[0061] 胚胎的遺傳學(xué)診斷可以利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)來進行，如傳統(tǒng)的細菌人工染 色體（BAC)陣列CGH以及與其類似其它技術(shù)。也稱為微芯片陣列、陣列或生物芯片的微陣 列已廣泛用于基因表達和其它基因組研究，并且提供了優(yōu)于BAC的技術(shù)優(yōu)勢。微陣列通常 是通過在表面上印刷或合成與基因組中的已知序列互補的核酸來制造的。生物體的全部基 因組或其部分可以通過使熒光標記的擴增DNA(脫氧核糖核酸）與陣列雜交來評估。以全 文引用方式并入本文的美國專利申請?zhí)?2/587, 406公開了一種體外受精的方法，其中通 過全基因組擴增和多態(tài)性微陣列分析對IVF胚胎的全部24條染色體進行植入前遺傳學(xué)診 斷。所述方法涉及對IVF胚胎進行活組織檢查以去除一個或多個細胞并且從細胞中提取核 酸。接著執(zhí)行基因組擴增允許收集胚胎的遺傳學(xué)信息，以便基于獲得的遺傳學(xué)信息，預(yù)測胚 胎的遺傳學(xué)常態(tài)。這種技術(shù)也使得確定胚胎的核型成為可能。在分析了胚胎之后，針對植 入子宮中的可能性對它們進行分級。在對胚胎進行遺傳學(xué)分析的實施方案中，基于遺傳學(xué) 預(yù)測，選擇用于植入到子宮中的一個或多個合意胚胎。
[0062] 胚胎的動力學(xué)診斷是可用于選擇用于胚胎移植的最合意、最健康胚胎的另一重要 程序。一個可用的工具是Primo Vision時間延遲胚胎監(jiān)測系統(tǒng)（Vitrolife AB, G0teb〇rg, Sweden)。Prima Vision是當胚胎在培養(yǎng)箱中生長時，設(shè)計用來捕捉胚胎影像，在體外受精 周期中使用的照相機和計算機系統(tǒng)。胚胎在培養(yǎng)碟中發(fā)育時照相機獲取的影像在實驗室的 計算機屏幕上顯示。計算機系統(tǒng)不僅提供胚胎影像，還提供有關(guān)它們的生長型態(tài)的信息。 這一信息允許胚胎學(xué)家和臨床醫(yī)師觀察胚胎的健康發(fā)育，并且允許檢測在生長早期階段可 能發(fā)生的細胞分裂時序的任何問題。Primo Vison的另一個益處是它允許胚胎不從它們的 培養(yǎng)箱移除的情況下進行這些觀察。這允許將胚胎保留在它們趨于更快生長的受控環(huán)境 中。根據(jù)本發(fā)明，選用于胚胎移植的最合意胚胎應(yīng)顯示以下動力學(xué)標準：從2細胞期到3細 胞期分裂的時間因子為5小時到12小時；在受精卵階段之后35小時到40小時時應(yīng)具有3 個細胞；在受精卵階段之后48小時到56小時時具有5個細胞；到發(fā)育第三天開始時具有8 個細胞。所有細胞應(yīng)優(yōu)選具有相同的尺寸，或盡可能接近，并且破碎水平應(yīng)該不多于5%到 10%。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，將由患者得到的卵母細胞或已發(fā)育到準備移植胚胎期的受精卵母細 胞保存一段時間，即抑制患者的自身免疫反應(yīng)所需要的必需時期，直到患者的免疫系統(tǒng)充 分準備好以接受胚胎用于受孕。大多數(shù)患者希望在可能的情況下懷有她們自己的后代，并 且因此希望使用她們自己的卵母細胞或胚胎。因此，在大多數(shù)常見情況下，患者的卵母細胞 或胚胎需要保存。
[0064] 在某一部分患有不孕癥的婦女中，婦女不能產(chǎn)生卵子或排卵，或經(jīng)歷排卵停止或 少排卵，因此提供從另一雌性個體中獲得的供體卵母細胞或供體胚胎用于體外程序。因此 在本發(fā)明的某些實施方案的范圍內(nèi)預(yù)期，向患者植入不是來源于患者本身，而是來源于不 同個體的胚胎，因此，將供體卵母細胞或供體胚胎移植到患者用于植入。
[0065] 將來自一個物種的卵子或胚胎移植到不同于所述卵子或胚胎所來源的物種的實 施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。舉例來說，將來自于驢的胚胎移植到馬的子宮。
[0066] 然而，最常見的情況仍然是需要保存卵母細胞或胚胎，（一般是患者來源的那些， 但有可能來自另一來源）?？梢酝ㄟ^使卵母細胞或胚胎經(jīng)受低溫條件，如緩慢冷卻、快速冷 凍以及玻璃化來提供保存。不像精子，精子可以成功地冷凍并且使用多年，卵子含有大量的 水分，這使得冷凍更困難。當卵子被冷凍時，在卵子內(nèi)可以形成冰晶。這些冰晶可以破壞細 胞的結(jié)構(gòu)。為了幫助使冰晶的量減至最少，科學(xué)家在緩慢冷凍卵子時去除一些水分。美國 專利申請?zhí)?0/777, 149描述了一種方法，包括離心卵母細胞或胚胎（例如狗、貓、豬、家畜、 小鼠、大鼠和猴的胚胎）以極化卵母細胞或胚胎外部的細胞質(zhì)脂質(zhì)，在脂質(zhì)去極化之前引 起卵母細胞或胚胎的冷凍的低溫保護劑存在下使卵母細胞或胚胎經(jīng)受低溫條件，接著低溫 儲存冷凍的卵母細胞或胚胎。然而，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)不可能去除所有水分，并且因此不能 通過緩慢冷凍來防止細胞內(nèi)和細胞外冰晶的形成。因此，一旦解凍，這些緩慢冷凍卵子的卵 母細胞受精、胚胎活力以及妊娠植入較低。
[0067] 已嘗試使用低溫保護劑來進行快速冷凍。低溫保護劑是一種用于保護生物組織不 受因冰形成造成的冷凍破壞的物質(zhì)。低溫保護劑通過增加細胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度來起作用。為 了在生物學(xué)上可用，低溫保護劑必須容易穿透細胞并且對細胞無毒。常規(guī)低溫保護劑是二 醇，如乙二醇、丙二醇和甘油；2-甲基-2, 4-戊二醇（MPD);二甲亞砜（DMS0)和蔗糖。甘油和 DMS0已被低溫生物學(xué)家使用數(shù)十年，以減少在液氮中冷凍保存的精子和卵子的冰形成。已 發(fā)現(xiàn)，低溫保護劑的混合物比單一藥劑低溫保護劑的毒性更低并且更有效。甲酰胺與DMS0、 丙二醇和膠體的混合物是多年來所有人工產(chǎn)生的低溫保護劑中最有效的。許多低溫保護劑 還通過在移走水分子時與生物分子形成氫鍵來起作用。在水溶液中，氫鍵合對于合適的蛋 白質(zhì)和DNA功能來說是重要的。因此，當?shù)蜏乇Ｗo劑置換水分子時，生物材料保持它的天然 物理結(jié)構(gòu)和功能，盡管它們不再浸入到含水環(huán)境中。
[0068] 最近，已應(yīng)用玻璃化方法來保存卵母細胞和胚胎、生物組織、用于移植和人體冷凍 的器官，玻璃化方法是一種在沒有冰晶形成的情況下冷凍和固化的方法。一些低溫保護劑 通過降低溶液或材料的玻璃轉(zhuǎn)變溫度來起作用。以這樣的方式，低溫保護劑防止實際冷凍， 并且溶液在玻璃相中保持一定的柔性。盡管緩慢和快速冷凍都是可行的，但是根據(jù)本發(fā)明 的方法，玻璃化是優(yōu)選的保存卵母細胞和胚胎的方法。在玻璃化期間，卵母細胞或胚胎冷凍 的速度足夠快以至于冰晶沒有時間形成。任何已知的玻璃化技術(shù)都可以在本發(fā)明的方法中 使用，用于保存和儲存。通常，將卵母細胞或胚胎首先放置在具有較低濃度防凍劑的浴槽 中，同時還具有蔗糖以汲出卵母細胞或胚胎的水。接著，將卵母細胞放入到高濃度防凍劑浴 槽中少于1分鐘，同時立即冷凍。在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)可行的玻璃化方法的一個實例包 括將維持的胚胎放入37°c的MEDICULT?培養(yǎng)基中，接著將胚胎放入22°c到24°C的培 養(yǎng)基中，接著將所述培養(yǎng)基在專門的cryotop或cryoleaf載體中放入液氮中。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明的IVF方法，當已確定患者的自身免疫系統(tǒng)重獲激素平衡時，雌性患 者準備繼續(xù)胚胎移植。在這時，終止卵子或IVF來源的胚胎的冷凍保存。將卵母細胞或胚胎 從防凍溶液中移出，并且解凍。一旦解凍，就通過上面描述的任何技術(shù)，通過將精子直接注 射到卵子中的輔助生殖技使未受精的卵子受精。胚胎的解凍通過以下方式進行：將胚胎從 液氮溶液中取出，放入到溫度為約37°C的溶液中，在室溫下洗滌，再次放入37°C的溶液中， 放入培養(yǎng)基中，接著放入保持在與雌性子宮腔內(nèi)部溫度相似的溫度（36. 8°C到37. 2°C )下 的培養(yǎng)箱中5小時到24小時的時期，最優(yōu)選在37. 1°C的溫度下5小時到7小時。
[0070] 本發(fā)明方法的最后階段是將一個或多個胚胎引入到患者體內(nèi)以試圖產(chǎn)生妊娠的 程序。這個程序稱為"胚胎移植"并且包括將胚胎移植到子宮、子宮腔或輸卵管中。胚胎移 植典型地包括使用小而軟的導(dǎo)管并且在超聲探針引導(dǎo)下，將所選胚胎穿過子宮頸放入到雌 性患者的子宮腔中。如以上所提供，根據(jù)本發(fā)明方法，優(yōu)選在胚胎移植前至少24小時，通過 使用適用于遞送的導(dǎo)管將PBMC組合物注射到子宮腔中來準備患者子宮的子宮內(nèi)膜。胚胎 典型地維持在胚胎移植培養(yǎng)基中，例如Medicu丨t? UTM培養(yǎng)基，并且可以包含HAS、重組人 胰島素、慶大霉素。
[0071] 本發(fā)明的另一方面是通過將組織相容性抗原如可溶性人白細胞抗原G(sHLA-G) 引入充當"敵友通訊器（friend-or-foe communicator) "以允許婦女的免疫系統(tǒng)對胚胎的 正面識別和接受的系統(tǒng)中來進一步促進妊娠植入。研究已在植入前胚胎上和在IVF研究期 間獲得的周圍培養(yǎng)基中檢測出可溶性形式sHLA-G的前體HLA-G。這些結(jié)果表明，sHLA-G在 妊娠的早期階段便已牽涉其中。還提出sHLA-G起胚胎品質(zhì)指標作用的潛力[Menicucci等 1999]。一項研究表明，可以對植入前胚胎上清液中的sHLA-G水平進行定量，并且通過充當 可以在胚胎選擇準則中與形態(tài)學(xué)測試結(jié)合使用，以增加成功植入可能性的適用胚胎品質(zhì)指 標來表明妊娠可能性的陽性結(jié)果。在一個實施方案中，將s-HLA-G添加到胚胎移植培養(yǎng)基 中，其中在胚胎移植培養(yǎng)基中的優(yōu)選濃度測量值在0. 175光學(xué)密度（0D)到0.350光學(xué)密度 范圍內(nèi)，其中0D指的是在400nm到450nm范圍內(nèi)的波長，更具體來說在405nm的波長下測 得的光學(xué)密度。通過測量光學(xué)密度來測定sHLA濃度的程序綜述于很多出版物中。[參見例 如S. Marti等，2007]。將s-HLA-G添加到胚胎移植培養(yǎng)基中，并且接著將胚胎在所述培養(yǎng) 基中培養(yǎng)5分鐘到20分鐘，并且更優(yōu)選約10分鐘，隨后立即將胚胎移植到子宮中。
[0072] 本發(fā)明的一個相關(guān)方面提供一種根據(jù)本發(fā)明中闡述的方案，通過使患者的靶組織 在PBMC組合物存在下生長來生長、修復(fù)、工程改造、恢復(fù)或以其它方式處理所述靶組織的 方法。通過在培養(yǎng)的PBMC存在下引入組織或通過使用培養(yǎng)的和新鮮的PBMC的組合PBMC 組合物進行培養(yǎng)來生長組織。體內(nèi)和體外2種方法都涵蓋在內(nèi)。這種方法的一個實施方案 在于祀組織是雌性患者子宮的子宮內(nèi)膜。然而，如Kuwana等的美國專利號7, 795, 018和 8, 216, 838所公開，PBMC被視為多能細胞，其非常適用于細胞移植，以供器官再生，包括骨、 軟骨、骨骼肌、脂肪、心肌、血管、內(nèi)皮和神經(jīng)元。因此，包括本發(fā)明的培養(yǎng)的和新鮮的PBMC 二者組合的本發(fā)明的方法、培養(yǎng)基和組合物完全可以擴展超出IVF治療和子宮內(nèi)膜治療的 邊界，擴展到涉及能夠用PBMC治療的其它組織的生長、修復(fù)和工程改造的應(yīng)用。
[0073] 本文中應(yīng)當注意，本發(fā)明的概念和實踐與人最相關(guān)，但是也適用于廣泛多種動物 的胚胎植入。本發(fā)明不限于人的體外受精或使用通過采用PBMC組合物實現(xiàn)自身免疫系統(tǒng) 延遲的胚胎植入。舉例來說，所述技術(shù)可以用于動物，如鼠類動物，包括褐鼠和家鼠；用于伴 侶動物，包括狗和貓；以及用于馴養(yǎng)家畜動物，如豬、馬、驢、山羊、綿羊、美洲駝和羊駝，以及 其它動物，以增加這些動物活產(chǎn)率。這種增加將在家畜行業(yè)具有顯著的經(jīng)濟效益并且在科 學(xué)和醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)領(lǐng)域具有社會效益。
[0074] 雖然本發(fā)明在上文進行了大體定義，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明不限 于此并且包括下列實施例提供進一步說明的實施方案。應(yīng)理解的是，在不背離本發(fā)明的范 圍的情況下，可在本領(lǐng)域范圍內(nèi)進行其它特定功能性修改。本發(fā)明的優(yōu)勢由以下實施例說 明，闡述所述實施例以說明本發(fā)明的方法和組合物，并且意欲所述實施例純粹是本發(fā)明的 原則和應(yīng)用的舉例說明且不應(yīng)認為對其范圍構(gòu)成限制。 實施例
[0075] 本發(fā)明由以下實施例說明。進行研究以檢查和比較兩種IVF程序。第一種程序稱 為"新鮮IVF"（Fresh-IVF)方法，并且第二種程序稱為"低溫IVF"（Cryo-IVF)方法。進行 臨床結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)比較，以檢查卵母細胞擷取后延遲婦女子宮腔的胚胎或囊胚植入對患有 不孕癥的婦女的妊娠率的影響。術(shù)語"妊娠率"、"臨床妊娠率"和"植入率"在本文中可以 互換使用，并且指的是每1〇〇個胚胎移植周期所表示的臨床妊娠的數(shù)量。進一步研究在"新 鮮IVF"和"低溫IVF"兩個程序中子宮內(nèi)外周血單核細胞（PMBC)施用對妊娠率的影響。
[0076] 受試者：總計檢查一百八十（180)位患有不孕癥的婦女。在本研究之前，每一個患 者先前已進行了 2次或者更多次的不成功"新鮮IVF"治療，并且在參與文本的研究之前，至 少一次"低溫IVF"治療失敗。將婦女分成兩組，每組90位婦女。組1中婦女的平均年齡是 35. 5歲±3. 4歲。組2中患者的平均年齡是36. 5歲±5. 5歲。受試者準備如下：
[0077] IVF程序：對兩個組中的患者應(yīng)用采用GnRH (促性腺激素釋放素）的標準IVF方案 以進行受控卵巢刺激。每位患者的卵巢刺激期在10天到12天之間。在經(jīng)陰道穿刺時，測 得卵泡的平均尺寸是約18mm。對兩組患者應(yīng)用Gonal、Menopur、Choragon以維持黃體期。 一般來說，從每一位患者擷取10個到12個卵子。不少于80%的所得卵母細胞的成熟度足 以受精（如Gardner所測定，成熟MII階段）。
[0078] 擷取卵母細胞后，將卵母細胞在C02濃度在5. 5%到5. 7%范圍內(nèi)的Universal IVF培養(yǎng)基（可從丹麥Origio A/S公司獲得的MEDICULT? )中在36. 8°C到37. 1°C 的溫度下培養(yǎng)。接著通過ICSI和標準IVF兩種程序使卵母細胞受精。在考慮到精子指 數(shù)、患者年齡、先前經(jīng)歷陰性結(jié)果的IVF嘗試的情況下選擇所述技術(shù)。在標準IVF程序的 情況下，將精子添加到UnilVF培養(yǎng)基中的卵母細胞中。將發(fā)育到第二天的受精卵放入 ISM-1培養(yǎng)基中。在卵母細胞是通過經(jīng)陰道穿刺獲得的情況下，將卵母細胞放入UnilVF培 養(yǎng)基中。在通過ICSI程序受精后，將卵子立即放入ISM-1中。在裂生胚發(fā)育的前3天， 胚胎在MEDICULT? Universal IVF培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)的第4天和第5天在 MEDICULT? BlastAssist培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到囊胚形成。使用MEDICULT? UTM培 養(yǎng)基進行胚胎移植。
[0079] 玻璃化：使用標準MEDICULT?方法，對發(fā)育第5天的囊胚或胚胎應(yīng)用玻璃化。 將胚胎放入特殊溶液中以去除盡可能多的水。將胚胎在cryotop載體上放入液氮中。一個 載體上放置不多于2個胚胎。冷凍胚胎儲存三（3)個月到1年的等待期。
[0080] PBMC制備：從每個患者提取外周血單核細胞（PBMC)。在"新鮮IVF"方案中在卵 母細胞擷取的當天或者在"低溫IVF"方案中在胚胎移植到子宮中之前三天從患者獲取第一 部分PBMC。最初，從每位患者獲取10mL外周血。將全部量（10mL)的外周血與10mL具有 L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的MEDICULT? RPMI1640培養(yǎng)基混合，形成總體積20mL的稀釋 血液。之后使用淋巴細胞分離介質(zhì)（密度梯度介質(zhì)）從血液中分離PBMC。使7mL體積的 稀釋血液在3mL密度梯度介質(zhì)上分層。分層之后，在每分鐘1500轉(zhuǎn)的速度下進行分層血液 的離心持續(xù)30分鐘到35分鐘以得到PBMC。通過在4°C下以每分鐘1600轉(zhuǎn)的速度離心10 分鐘，將如此獲得的PBMC在RPMI中洗滌2次。經(jīng)過洗滌的PBMC轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基 由含L谷氨酰胺和碳酸氫鈉并且添加了人絨毛膜促性腺激素（hCG)和人重組白蛋白（來自 Sigma-Aldrich Co.，LLC)的RPMI1640培養(yǎng)基混合物組成。培養(yǎng)條件維持在5. 0% C02和 37°C。PBMC培養(yǎng)期是48小時到52小時。在48小時到52小時之后，從同一患者再獲取一 部分全血。再用相同的方法提取PBMC。將第二批PBMC與培養(yǎng)的PBMC組合，并且將混合物 通過導(dǎo)管轉(zhuǎn)移到患者的子宮腔中。所述程序在總計10分鐘到15分鐘內(nèi)快速完成。每個患 者子宮內(nèi)應(yīng)用的總PCMB混合物的體積是在0. 2mL到0. 3mL范圍內(nèi)。
[0081] 胚胎解凍和移植：對于每個患者，選擇2個囊胚用于胚胎移植。使用標準 MEDICULT? ^?案執(zhí)行解凍。將胚胎從液氮中移出，并且放入37°C的溶液中，之后在室 溫下用若干種溶液洗滌，再次放入37°C的溶液中，之后放入在溫度為37. 1°C的溫度下放入 培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)基中6小時。在解凍之后，將胚胎在BlastAssist MEDICULT?.培養(yǎng)基 中培養(yǎng)3小時到4小時。之后將胚胎放入MEDICULT?UTM培養(yǎng)基中約15分鐘。通過 Cook?醫(yī)學(xué)超聲控制導(dǎo)管，使用MEDICULT? UTM培養(yǎng)基執(zhí)行胚胎移植。
[0082] IVF程序：2組婦女都進行IVF治療。對組1進行的IVF程序不涉及使用PCMB ;而 組2的IVF程序的進行使用了 PBMC。每組婦女的治療過程包括2個階段：一個"新鮮IVF" 周期和一個"低溫IVF"周期，如本文所描述。在胚胎移植當天，在兩組患者中，測得子宮內(nèi) 膜尺寸是9mm到11mm。在胚胎移植之后，與IVF治療中的標準一樣對所有患者施用黃體酮， 以便準備子宮內(nèi)膜用于胚胎植入。通過在胚胎移植后兩周進行血液b-hCG測試來確定胚胎 的植入。在胚胎移植后三周，通過超聲檢查來確定臨床妊娠。
[0083] 兩組婦女都經(jīng)歷一個移植2個囊胚的"新鮮IVF"周期。對每個患者進行妊娠測 試。當測試顯示沒有臨床或生化妊娠時，表明失敗。在"新鮮IVF"周期未能引起胚胎成功 植入的那些情況下，進行"低溫IVF"周期，其中在陰性"新鮮IVF"周期（這是在從患者的 卵巢擷取卵母細胞的那天之后約三（3)個月測得的）之后2個月經(jīng)周期到3個月經(jīng)周期之 間的時間延遲期之后，將冷凍胚胎引入到患者的子宮腔中。
[0084] 組1婦女沒有接受任何PCMB應(yīng)用；組2婦女在等待期結(jié)束之后立即接受PBMC治 療。在"新鮮IVF"周期中，在卵子擷取后48小時到52小時胚胎培養(yǎng)第二天時，將PBMC施 用到每個患者的子宮中。在"低溫IVF"周期中，在胚胎移植之前約24小時，將PBMC施用到 子宮中。
[0085] 結(jié)果：進行沒有PBMC的新鮮IVF治療的那組患者得到22. 2%的植入率（在90例 ET之后，20例臨床妊娠）。在"新鮮IVF"方法中使用PMBC使得植入率增加到31. 1 % (在 90例ET之后，28例臨床妊娠）。在通過"低溫IVF"治療進行嘗試（組1和組2均持續(xù)至 少3個月的時間延遲）的那組婦女中，沒有子宮內(nèi)應(yīng)用PBMC的植入率是21. 4% (在70例 ET之后，15例臨床妊娠），然而在應(yīng)用PBMC之后，植入率幾乎兩倍高，為41.9% (在62例 ET之后，26例臨床妊娠）。組1 (沒有應(yīng)用PBMC的90位患者）的總成功率是38. 9% (35 例臨床妊娠）。組2 (應(yīng)用了 PBMC的90位患者）的總成功率是60. 0% (54例臨床妊娠）。 研究的臨床結(jié)果呈示于下表1中?？s寫"ET"表示"胚胎移植"。
[0086] 表1 :在有或沒有對患者施用PBMC的情況下，"新鮮IVF"周期和"低淵IVF"周期 的棺入率。
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于雌性患者的體外受精方法，所述方法包括以下步驟： (a) 將有效量的包含外周血單核細胞的組合物引入到子宮中，以及 (b) 在起始所述患者的所述體外受精后的預(yù)定延遲之后移植至少一個胚胎到所述患者 的所述子宮中；并且 其中當與缺少這些步驟的體外受精方法相比較時，所述方法使得成功起始妊娠的所述 子宮中所述胚胎植入的可能性增加。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述預(yù)定延遲是足以降低所述患者的自身免疫反應(yīng) 危險的量的時間。
3. 根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其中在胚胎移植前的所述預(yù)定延遲至少是所述患者的兩 個月經(jīng)周期或兩個排卵周期。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述外周血單核細胞是從所述患者的血液中獲得。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎是在胚胎移植培養(yǎng)基內(nèi)移植到所述子宮中 并且所述胚胎移植培養(yǎng)基包含起始促進劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述患者是人，所述起始促進劑是可溶性人白細胞 抗原G(sHLA-G)并且所述胚胎移植培養(yǎng)基中所述sHLA-G的濃度在0. 1750D到0. 3500D的 范圍內(nèi)，其中OD指的是在400nm到450nm范圍內(nèi)的波長下測量到的光學(xué)密度。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其進一步包括臨胚胎移植到所述子宮之前，將所述胚胎 在所述胚胎移植培養(yǎng)基中培養(yǎng)5分鐘到20分鐘范圍內(nèi)的時期。
8. -種用于雌性患者的體外受精方法，所述方法包括以下步驟： (a) 在所述患者中起始排卵以獲得至少一個卵母細胞， (b) 從所述患者獲得外周血單核細胞（PBMC)， (c) 在步驟（a)之后的預(yù)定延遲之后，將所述患者的PBMC引入到所述患者的子宮中，以 及 (d) 在步驟（c)之后，將所述胚胎引入所述雌性患者的所述子宮中以實現(xiàn)所述胚胎在 所述子宮中的植入。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述患者是人，所述胚胎是通過使在步驟（a)中從所 述患者獲得的卵母細胞受精而獲得的；步驟（c)的所述預(yù)定延遲等于所述患者的至少兩個 月經(jīng)周期或兩個排卵周期；并且在步驟（d)中，在步驟（c)之后20小時到24小時，將所述 胚胎引入到所述患者的所述子宮中。
10. -種用于雌性患者的體外受精方法，所述方法包括以下步驟： (a) 起始體外受精， (b) 從所述患者的血液中獲得第一部分外周血單核細胞（PBMC)， (c) 在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述第一部分PBMC, (d) 從所述患者的血液中獲得第二部分新鮮的PBMC， (e) 將所述第一部分培養(yǎng)的PBMC與所述第二部分新鮮的PBMC組合， (f) 在胚胎移植前，將所述組合的PBMC引入到所述患者的所述子宮中，以及 (g) 將至少一個胚胎移植到所述患者的所述子宮中以實現(xiàn)妊娠。
11. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟（c)的所述合適的培養(yǎng)基包含具有L-谷氨酰 胺、碳酸氫鈉、人重組白蛋白和人絨毛膜促性腺激素（hCG)的RPMI1640培養(yǎng)基；并且其中所 述hCG的濃度是每一毫升所述培養(yǎng)基不少于5IU。
12. -種用于雌性患者的體外受精方法，所述方法包括以下步驟： (a) 從所述患者中獲得至少一個卵母細胞， (b) 用精子使所述卵母細胞受精以形成受精卵并且使所述受精卵在體外發(fā)育到胚胎 期， (c) 冷凍保存所述胚胎， (d) 從所述患者的血液中提取第一部分外周血單核細胞（PBMC)， (e) 在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述第一部分PBMC， (f) 等待足夠降低所述患者的自身免疫反應(yīng)危險的預(yù)定時期， (g) 在步驟（f)的所述等待期的最后一天，從所述患者的血液中提取第二部分新鮮的 PBMC, (h) 將所述培養(yǎng)的第一部分PBMC與所述新鮮的第二部分PBMC組合以獲得包含新鮮的 和培養(yǎng)的PBMC的組合物， (i) 將所述PBMC組合物引入到所述患者的所述子宮中， (j) 將所述胚胎從冷凍保存狀態(tài)解凍，以及 (k) 將至少一個解凍的胚胎移植到所述患者的所述子宮中以實現(xiàn)妊娠。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述預(yù)定時期是在步驟（a)開始時測得的，并且所 述時期是所述患者的至少兩個月經(jīng)周期或兩個排卵周期。
14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述胚胎是通過玻璃化進行冷凍保存的。
15. 如權(quán)利要求12所述的方法，其進一步包括在胚胎移植前執(zhí)行所述胚胎的遺傳學(xué)測 試的步驟。
16. 如權(quán)利要求12所述的方法，其進一步包括在所述胚胎的體外發(fā)育的至少部分中， 診斷所述胚胎的動力學(xué)的步驟。
17. 如權(quán)利要求12所述的方法，其進一步包括在胚胎移植前，診斷所述胚胎的形態(tài)學(xué) 特征的步驟。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中當根據(jù)Gardner分類所確定，所述胚胎具有II AB-V AA范圍內(nèi)的囊胚成熟狀態(tài)時，執(zhí)行所述胚胎移植。
19. 如權(quán)利要求12所述的方法，其進一步包括測量所述患者的所述子宮的子宮內(nèi)膜的 步驟，并且其中在胚胎移植時，所述子宮內(nèi)膜的厚度是在9mm到11mm的范圍內(nèi)。
20. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一部分PBMC是在4. 8%到6. 0%二氧化碳 (C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下培養(yǎng)的，所述合適的培養(yǎng)基包含：（i) RPMI1640培養(yǎng)基、 L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉，（ii)人重組白蛋白以及（iii)人絨毛膜促性腺激素（hCG);并且其 中在所述培養(yǎng)基中所述hCG的最小濃度不少于5IU/mL。
21. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中將所述第一部分PBMC培養(yǎng)48小時到72小時范圍 內(nèi)的時期。
22. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟（i)的所述組合物中PBMC的濃度是在每毫升 所述組合物中4百萬到8百萬個細胞的范圍內(nèi)。
23. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中在步驟（i)中引入到所述子宮中的所述組合物的 體積是在〇. lmL到0. 3mL的范圍內(nèi)。
24. -種培養(yǎng)外周血單核細胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供一部分從患者血液中獲得的PBMC，以及 (b) 在4. 8 %到6.0 %二氧化碳（C02)存在下，在36.7°C到37.3 °C下，使所述部分的 PBMC在培養(yǎng)基中繁殖，所述培養(yǎng)基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI1640培養(yǎng) 基，（ii)人重組白蛋白以及（iii)能夠提高PBMC增強組織生長的能力的促進劑。
25. -種培養(yǎng)外周血單核細胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 從患者的血液中提取PBMC， (b) 在4. 8 %到6. 0 %二氧化碳（C02)存在下，在36. 7°C到37. 3°C下，使將一部分所提 取的PBMC在培養(yǎng)基中繁殖，所述培養(yǎng)基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI1640 培養(yǎng)基，（ii)人重組白蛋白以及（iii)能夠提高PBMC增強組織生長的能力的促進劑， (c) 將步驟（a)中獲得的新鮮PBMC與步驟（b)中獲得的培養(yǎng)的部分PBMC組合以得到 包含新鮮的和培養(yǎng)的PBMC的組合物。
26. -種培養(yǎng)外周血單核細胞（PBMC)的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供一部分從患者的血液中獲得的PBMC， (b) 在4. 8 %到6.0 %二氧化碳（C02)存在下，在36.7 °C到37.3°C下，使所述部分的 PBMC在培養(yǎng)基中繁殖，所述培養(yǎng)基包含：（i)具有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI1640培養(yǎng) 基，（ii)人重組白蛋白以及（iii)能夠提高PBMC增強組織生長的能力的促進劑， (c) 從患者的血液中提取至少另外一部分新鮮的PBMC， (d) 將所述培養(yǎng)部分的PBMC與所述新鮮部分的PBMC組合以產(chǎn)生包含新鮮的和培養(yǎng)的 PBMC的組合物， (e) 任選地，重復(fù)步驟（b)持續(xù)足夠獲得所要量的培養(yǎng)PBMC的時期，以及 (f) 任選地，重復(fù)步驟（c)和步驟（d)。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中步驟（a)的所述患者不同于步驟（c)的所述患者。
28. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述促進劑是在所述PBMC培養(yǎng)基中最小濃度為 5IU/mL的人絨毛膜促性腺激素。
29. -種修復(fù)、工程改造、恢復(fù)或治療患者組織的方法，所述方法包括使所述組織在如 權(quán)利要求26所述的組合物存在下生長。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述組織是所述患者的子宮的子宮內(nèi)膜。
31. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者具有人、鼠類或家畜動物來源。
32. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述胚胎是通過對從不同于雌性患者的動物的物 種、雜交體或變種的動物患者、物種、雜交體或變種獲得的卵母細胞進行受精得到的。
【文檔編號】C12N5/00GK104126004SQ201280067823
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月23日
【發(fā)明者】A·費斯科沃, I·費斯科瓦, I·茲楊科瓦, S·茲爾科沃 申請人:邁渣德塔醫(yī)學(xué)知識產(chǎn)權(quán)控股公司