包含進入細胞內(nèi)以形成免疫復合體的搬運體(載體)的藥物的制作方法
【專利摘要】通過形成包含含有兩個以上抗原結合單元(表位)的抗原和兩分子以上的抗原結合分子(例如抗體)的大的免疫復合體，可以加速含有兩個以上抗原結合單元的抗原從血漿中消失，還發(fā)現(xiàn)通過利用該特征，并使用還具備離子依賴性抗原結合活性的抗原結合分子，由此進一步加速該抗原的消失，從而可以解決上述課題。
【專利說明】包含進入細胞內(nèi)以形成免疫復合體的搬運體(載體)的藥物

【技術領域】
[0001]本發(fā)明提供:用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的應用；使抗原從血漿中消失的方法，該方法包括給予抗原結合分子；藥物組合物，該組合物包含可以使抗原從血漿中消失的抗原結合分子；用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的篩選方法；以及用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的制備方法。

【背景技術】
[0002]抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關注。其中，有多種IgG型抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開發(fā)中(非專利文獻I和非專利文獻2)。另一方面，作為可適用于第二代抗體藥物的技術，人們開發(fā)了各種技術，有人報道了提高效應子功能、抗原結合能力、藥物動力學、穩(wěn)定性的技術、或者降低免疫原性風險的技術等(非專利文獻3)。認為課題在于:由于抗體藥物的給藥量通常非常大，所以難以制備皮下給藥制劑；以及制造成本高等。作為減少抗體藥物的給藥量的方法，人們在考慮提高抗體的藥物動力學的方法和提高抗體與抗原的親和力的方法。
[0003]作為提高抗體的藥物動力學的方法，有人報道了恒定區(qū)的人工氨基酸取代(非專利文獻4和5)。作為增強抗原結合能力、抗原中和能力的技術，有人報道了親和力成熟技術(非專利文獻6)，通過向可變區(qū)的CDR區(qū)等的氨基酸中導入突變，可以增強與抗原的結合活性。通過增強抗原結合能力，可以提高在體外的生物活性、或者可以減少給藥量，還可以進一步提高在體內(nèi)(生物體內(nèi))的藥效(非專利文獻7)。
[0004]另一方面，每I分子的抗體所能中和的抗原量取決于親和力，通過增強親和力，可以用少量的抗體中和抗原，可以通過各種方法增強抗體的親和力(非專利文獻6)。而且，只要與抗原進行共價鍵結合、并使親和力達到無限大，就可以用I分子的抗體中和I分子的抗原(抗體為二價時，中和兩分子的抗原)。但是，在現(xiàn)有方法中，I分子的抗體與I分子的抗原(抗體為二價時，與兩分子的抗原結合)結合成為界限。另一方面，最近據(jù)報道，通過使用與抗原進行PH依賴性結合的抗原結合分子，可以實現(xiàn)一分子的抗原結合分子與多個分子的抗原結合(專利文獻1、非專利文獻8)。pH依賴性抗原結合分子在血漿中的中性條件下與抗原強力結合，而在核內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下解離抗原。而且，在解離抗原后，該抗原結合分子通過FcRn再循環(huán)到血漿中時可以再次與抗原結合，因此可以利用一個pH依賴性抗原結合分子與多個抗原反復結合。
[0005]而且，有報道稱:改變成增強中性條件下(pH7.4)的FcRn結合的pH依賴性抗原結合分子具有可以與抗原反復結合的效果、以及使抗原從血漿中消失的效果，因此通過給予這樣的抗原結合分子，可以從血漿中除去抗原(專利文獻2)。普通的包含IgG抗體Fe區(qū)的PH依賴性抗原結合分子，在中性條件下幾乎看不到其與FcRn結合。因此，認為該抗原結合分子與抗原的復合體被攝入細胞內(nèi)主要是非特異性攝入。根據(jù)該報告，與普通的包含IgG抗體Fe區(qū)的pH依賴性抗原結合分子相比，改變成增強中性條件下(pH7.4)的FcRn結合的pH依賴性抗原結合分子可以進一步加速該抗原的消失(專利文獻2)。
[0006]與具有由FcRn介導的循環(huán)機制的抗體相比，抗原的血漿中滯留性非常短，所以抗原通過在血漿中與具有該循環(huán)機制(該結合是PH非依賴性的)的抗體結合，其血漿中滯留性通常會變長，血漿中抗原濃度上升。例如還認為:當血漿中抗原具有多種生理功能時，即使假設一種生理活性被抗體的結合所阻斷，該抗原的血漿中濃度也會因抗體的結合而加重以其他生理功能作為病因的癥狀。從這樣的觀點考慮，在存在優(yōu)選使血漿中的抗原消失的情形時，為了加速抗原的消失，有人報道了對增強如上所述的與FcRn的結合的Fe區(qū)進行改變的方法，但利用除此以外的方法來加速抗原消失的方法迄今未見報道。
[0007]需要說明的是，本發(fā)明中的現(xiàn)有技術文獻如下所示。
[0008]現(xiàn)有技術文獻
[0009]專利文獻
[0010]專利文獻1:國際公開第W02009/125825號；
[0011]專利文獻2:國際公開第TO2011/122011號；
[0012]非專利文獻
[0013]非專利文獻 1:Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice MReichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew CDewitz, Nat.B1technol.(2005)23,1073-1078 ；
[0014]非專利文獻2:Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to2008.,Eur.J.Pharm.B1pharm.(2005)59 (3), 389-396 ；
[0015]非專利文獻3:Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.，Mol.Cells.(2005) 20 (I)，17-29 ;非專利文獻 4:Hinton PR, X1ng JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N, J.1mmunol.(2006)176(1)，346-356 ；
[0016]非專利文獻5:Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, OberRJ, Ward ES.，Nat.B1technol.(1997) 15 (7)，637-640 ；
[0017]非專利文獻6:Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, YeeH, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Cr eaR., Pr o c.Natl.Acad.Sc 1.USA.(2005) 102(24)，8466-8471 ；
[0018]非專利文獻7:ffu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, WhiteWI, Young JF, Kiener PA.，J.Mol.B1l.(2007) 368，652-665 ；
[0019]非專利文獻8:Igawa T 等人，Nat.B1technol.(2010)28, 1203-1207。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明所要解決的課題
[0021]本發(fā)明鑒于上述狀況而設，其目的在于提供:用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的應用；使抗原從血漿中消失的方法，該方法包括給予抗原結合分子；藥物組合物，其包含可以使抗原從血漿中消失的抗原結合分子；用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的篩選方法；以及用于使抗原從血漿中消失的抗原結合分子的制備方法。
[0022]用于解決課題的方法
[0023]本發(fā)明人為了達到上述目的而進行深入研究時，研制出一種可形成免疫復合體的抗原結合分子，該抗原結合分子包含(i)Fc區(qū)和(ii)兩個以上的抗原結合結構域，所述抗原結合結構域中的至少一個對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化，所述免疫復合體包含(a)兩分子以上的所述抗原結合分子和(b)兩分子以上的抗原，該抗原包含兩個以上的抗原結合單元。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)該抗原結合分子可用于使抗原從血漿中消失。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該抗原結合分子作為藥物組合物有效，同時還研制了使該抗原從血漿中消失的方法，該方法包括給予該抗原結合分子。另外，本
【發(fā)明者】人還發(fā)現(xiàn)了具有上述性質(zhì)的抗原結合分子的篩選方法，同時研發(fā)了它的制備方法，完成了本發(fā)明。
[0024]SP，本發(fā)明提供以下的[I]~[29]。
[0025][I]可形成免疫復合體的抗原結合分子在使該抗原從血漿中消失中的應用，是指包含(i)Fc區(qū)和(ii)兩個以上的抗原結合結構域的抗原結合分子的應用，所述抗原結合結構域中的至少一個對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化；
[0026]所述免疫復合體包含(a)兩分子以上的該抗原結合分子和(b)兩分子以上的抗原，所述抗原包含兩個以上的抗原結合單元。
[0027][2] [I]所述的應用，其中，離子濃度條件為鈣離子濃度條件。
[0028][3] [2]所述的應用，其中，所述抗原結合結構域是在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低于在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性的抗原結合結構域。
[0029][4] [I]~[3]中任一項所述的應用，其中，離子濃度條件為pH條件。
[0030][5] [4]所述的應用，其中，所述抗原結合結構域是在pH酸性范圍內(nèi)對抗原的結合活性低于在PH中性范圍條件下對抗原的結合活性的抗原結合結構域。
[0031][6] [I]~[5]中任一項所述的應用，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為多聚體。
[0032][7] [6]所述的應用，其中，所述抗原為⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5(BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生成抑制素)、⑶ F-9、⑶ F-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-a β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAIL Αρο-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6) ,TNFSFIA (TNF-a肌聯(lián)蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC,p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體CD153)、TNFSF9(4-1BB 配體 CD 137 配體)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF_ α ,TGF-β、泛特異性的TGF-β或IL-8中的任一種。
[0033][8] [I]~[5]中任一項所述的應用，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為單體。
[0034][9] [I]~[8]中任一項所述的應用，其中，抗原結合分子為多特異性或多互補位的抗原結合分子、或者抗原結合分子混合物。
[0035][10] [I]~[9]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)分別為SEQ ID N0:13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)。
[0036][11] [I]~[9]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在pH酸性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0037][12] [11]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。
[0038][13] [12]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0039]238位氨基酸為Leu ；
[0040]244位氨基酸為Leu ；
[0041 ] 245位氨基酸為Arg ；
[0042]249位氨基酸為Pro ；
[0043]250位氨基酸為Gln或Glu中的任一個；或者
[0044]251位氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個；
[0045]252位氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個；
[0046]254位氨基酸為Ser或Thr中的任一個；
[0047]255位氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個；
[0048]256 位氛基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0049]257 位氨基酸為 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一個；
[0050]258位氨基酸為Asp ；
[0051]260位氨基酸為Ser;
[0052]262位氨基酸為Leu ；
[0053]270位氨基酸為Lys ；
[0054]272位氨基酸為Leu或Arg中的任一個；
[0055]279 位氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0056]283 位氛基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一個；
[0057]285位氨基酸為Asn ；
[0058]286位氨基酸為Phe ；
[0059]288位氨基酸為Asn或Pro中的任一個；
[0060]293位氨基酸為Val ；
[0061]307位氨基酸為Ala、Glu、Gln或Met中的任一個；
[0062]311 位氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一個；
[0063]309位氨基酸為Pro ；
[0064]312位氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個；
[0065]314位氨基酸為Ala或Leu中的任一個；
[0066]316位氨基酸為Lys;
[0067]317位氨基酸為Pro;
[0068]318位氨基酸為Asn或Thr中的任一個；
[0069]332 位氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個；
[0070]339位氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個；
[0071]341位氨基酸為Pro;
[0072]343 位氨基酸為 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0073]375位氨基酸為Arg ；
[0074]376 位氨基酸為 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一個；
[0075]377位氨基酸為Lys ；
[0076]378位氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個；
[0077]380位氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個；
[0078]382 位氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0079]385 位氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0080]386 位氛基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0081]387 位氨基酸為 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0082]389位氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個；
[0083]423位氨基酸為Asn ；
[0084]427位氨基酸為Asn ；
[0085]428位氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個；
[0086]430 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一個；
[0087]431位氨基酸為Hi s或Asn中的任一個；
[0088]433 位氨基酸為 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一個；
[0089]434 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0090]436 位氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個；
[0091]438位氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個；
[0092]440位氨基酸為Lys ;或者
[0093]442位氨基酸為Lys、308位氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個。
[0094][14] [I]~[9]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在pH中性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0095] [15] [14]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0096][16] [15]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 13、14、15、或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0097]237位氨基酸為Met ；
[0098]248位氨基酸為lie;
[0099]250 位氨基酸為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0100]252位氨基酸為Phe、Trp或Tyr中的任一個；
[0101]254位氨基酸為Thr;
[0102]255位氨基酸為Glu;
[0103]256位氨基酸為Asp、Asn、Glu或Gln中的任一個；
[0104]257 位氛基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一個；
[0105]258位氨基酸為His;
[0106]265位氨基酸為Ala;
[0107]286位氨基酸為Ala或Glu中的任一個；
[0108]289位氨基酸為His;
[0109]297位氨基酸為Ala;
[0110]303位氨基酸為Ala;
[0111]305位氨基酸為Ala;
[0112]307 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0113]308 位氨基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0114]309位氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一個；
[0115]311位氨基酸為Ala、His或Ile中的任一個；
[0116]312位氨基酸為Ala或His中的任一個；
[0117]314位氨基酸為Lys或Arg中的任一個；
[0118]315位氨基酸為Ala、Asp或His中的任一個；
[0119]317位氨基酸為Ala;
[0120]332位氨基酸為Val;
[0121]334位氨基酸為Leu;
[0122]360位氨基酸為His;
[0123]376位氨基酸為Ala;
[0124]380位氨基酸為Ala;
[0125]382位氨基酸為Ala;
[0126]384位氨基酸為Ala;
[0127]385位氨基酸為Asp或Hi s中的任一個；
[0128]386位氨基酸為Pro;
[0129]387位氨基酸為Glu;
[0130]389位氨基酸為Ala或Ser中的任一個；
[0131]424位氨基酸為Ala;
[0132]428 位氛基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0133]433位氨基酸為Lys;
[0134]434位氨基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一個；或者
[0135]436 位氛基酸為 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0136][17] [I]~[13]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)包含對Fe Y受體的結合活性比天然型人IgG的Fe區(qū)對Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0137][18] [17]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸包含與天然型人IgG 的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸:以EU編號表示的221位、
222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、
280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位或440位。
[0138][19] [18]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0139]221位氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
[0140]222位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0141]223位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0142]224位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0143]225位氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0144]227位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0145]228位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0146]230位氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0147]231位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0148]232位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0149]233 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0150]234 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0151]235 位氛基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0152]236 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0153]237 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0154]238 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0155]239 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0156]240位氨基酸為Ala、Ile、Met或Thr中的任一個；
[0157]241 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0158]243 位氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0159]244位氨基酸為His ；
[0160]245位氨基酸為Ala;
[0161]246位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0162]247 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0163]249位氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0164]250位氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0165]251位氨基酸為Phe ；
[0166]254位氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0167]255位氨基酸為G lu、Leu或Tyr中的任一個；
[0168]256位氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0169]258位氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0170]260位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0171]262位氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0172]263位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0173]264 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0174]265 位氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0175]266位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0176]267 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0177]268 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一個；
[0178]269 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0179]270 位氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一個；
[0180]271 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0181]272 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0182]273位氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0183]274 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0184]275位氨基酸為Leu或Trp 中的任一個；
[0185]276 位氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0186]278 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0187]279位氨基酸為Ala;
[0188]280 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0189]281位氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0190]282位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0191]283 位氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0192]284 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0193]285 位氨基酸為 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0194]286位氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0195]288位氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0196]290 位氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0197]291 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0198]292 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0199]293 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0200]294 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0201]295 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0202]296 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0203]297 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0204]298 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0205]299 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0206]300 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一個；
[0207]301位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0208]302位氨基酸為Ile ；
[0209]303位氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0210]304位氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0211]305位氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0212]311 位氨基酸為 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0213]313位氨基酸為Phe;
[0214]315位氨基酸為Leu ；
[0215]317位氨基酸為Glu或Gln ；
[0216]318 位氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0217]320 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0218]322 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0219]323位氨基酸為Ile ；
[0220]324 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0221]325 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0222]326 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0223]327 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0224]328 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0225]329 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0226]330 位氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0227]331 位氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0228]332 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0229]333 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個；
[0230]334 位氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0231]335 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0232]336位氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0233]337位氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0234]339 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0235]376位氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0236]377位氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0237]378位氨基酸為Asp ；
[0238]379位氨基酸為Asn ；
[0239]380位氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0240]382位氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0241]385位氨基酸為Glu;
[0242]392位氨基酸為Thr ；
[0243]396位氨基酸為Leu ；
[0244]421位氨基酸為Lys ；
[0245]427位氨基酸為Asn ；
[0246]428位氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0247]429位氨基酸為Met ；
[0248]434位氨基酸為Trp ；
[0249]436位氨基酸為Ile ;或者
[0250]440位氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0251][20] [I]~[16]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為對抑制型Fe Y受體的結合活性比對活性型Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0252][21] [20]所述的應用，其中，所述抑制型Fe Y受體為人FcyRIIb。
[0253][22] [20]或[21]中任一項所述的應用，其中，所述活性型Fe Y受體為人Fe Y RIa、人 Fe YRIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
[0254][23] [20]~[22]中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位或328位的氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
[0255][24] [23]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位氨基酸為Asp、或者328位氨基酸為Glu。
[0256][25] [23]或[24]所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0257]233位氨基酸為Asp ；
[0258]234位氨基酸為Trp或Tyr中的任一個；
[0259]237 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0260]239位氨基酸為Asp ；
[0261 ] 267位氨基酸為Ala、Gln或Val中的任一個；
[0262]268位氨基酸為Asn、Asp或Glu中的任一個；
[0263]271位氨基酸為Gly ；
[0264]326 位氨基酸為 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0265]330位氨基酸為Arg、Lys或Met中的任一個；
[0266]323位氨基酸為lie、Leu或Met中的任一個；或者
[0267]296位氨基酸為Asp。
[0268][26]具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的篩選方法，該方法包括以下的步驟(a)~⑴:
[0269]步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0270]步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因；
[0271]步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接；
[0272]步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因;
[0273]步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子；
[0274]步驟(f)，使上述步驟(e)中得到的抗原結合分子與抗原接觸；
[0275]步驟(g)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成。
[0276][27]具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~⑷:
[0277]步驟(a)，使包含F(xiàn)e區(qū)和兩個以上的抗原結合結構域的抗原結合分子與抗原接觸，所述抗原結合結構域中的至少一個是對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0278]步驟(b)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成；
[0279]步驟(C)，培養(yǎng)包含載體的宿主細胞，所述載體包含編碼在上述步驟(b)中確認到免疫復合體的形成的抗原結合分子的基因；
[0280]步驟(d)，從上述步驟(C)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
[0281][28]具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~⑴:
[0282]步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0283]步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因；
[0284]步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接；
[0285]步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因;
[0286]步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子；
[0287]步驟(f)，使上述步驟(e)中得到的抗原結合分子與抗原接觸；
[0288]步驟(g)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成；
[0289]步驟(h)，培養(yǎng)包含載體的宿主細胞，所述載體包含編碼在上述步驟(g)中確認到免疫復合體的形成的抗原結合分子的基因；
[0290]步驟(i)，從上述步驟(h)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
[0291][29]具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~(e)，還包括如下步驟:使通過該制備方法得到的抗原結合分子與抗原接觸，以評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成；
[0292]步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0293]步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因；
[0294]步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接；
[0295]步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因;
[0296]步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
[0297]需要說明的是，上述的[I]~[25]可以換成以下的另一種表達方式:
[0298][I’]包含可形成免疫復合體的抗原結合分子的、用于使該抗原從血漿中消失的藥物組合物，該藥物組合物是包含(i)Fc區(qū)和(ii)兩個以上的抗原結合結構域的抗原結合分子的應用，所述抗原結合結構域中的至少一個是對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0299]所述免疫復合體包含(a)兩分子以上的該抗原結合分子和(b)兩分子以上的抗原，所述抗原包含兩個以上的抗原結合單元。
[0300][2’ ] [1 ]所述的藥物組合物，其中，離子濃度條件為鈣離子濃度條件。
[0301][3’ ] [2’ ]所述的藥物組合物，其中，所述抗原結合結構域是在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低的抗原結合結構域。
[0302][4’ ] [1 ]~[3’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，離子濃度條件為pH條件。
[0303][5’] [4’]所述的藥物組合物，其中，所述抗原結合結構域是在pH酸性范圍對抗原的結合活性比在PH中性范圍條件下對抗原的結合活性低的抗原結合結構域。
[0304][6’ ] [1 ]~[5’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為多聚體。
[0305][7 ’] [6 ’]所述的藥物組合物，其中，所述抗原為⑶F、GDF-1、GDF-3 (Vgr_2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-a β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌聯(lián)蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL, TGF- α、TGF- β、泛特異性的TGF- β或IL-8中的任一種。
[0306][8’ ] [1 ]~[5’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為單體。
[0307][9’ ] [1 ]~[8’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，抗原結合分子為多特異性或多互補位的抗原結合分子、或者抗原結合分子混合物。
[0308][10’ ] [1 ]~[9’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)分別為SEQ IDNO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)。
[0309][11’ ] [1 ]~[9’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為在pH酸性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0310][12，] [11，]所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254 位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438位、439位、440位、442位或447位。
[0311][13，] [12，]所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0312]238位氨基酸為Leu;
[0313]244位氨基酸為Leu ；
[0314]245位氨基酸為Arg ；
[0315]249位氨基酸為Pro ；
[0316]250位氨基酸為Gln或Glu中的任一個；或者
[0317]251位氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個；
[0318]252位氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個；
[0319]254位氨基酸為Ser或Thr中的任一個；
[0320]255位氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個；
[0321]256 位氨基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0322]257 位氨基酸為 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一個；
[0323]258位氨基酸為Asp ；
[0324]260位氨基酸為Ser ；
[0325]262位氨基酸為Leu ；
[0326]270位氨基酸為Lys ；
[0327]272位氨基酸為Leu或Arg中的任一個；
[0328]279 位氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0329]283 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一個；
[0330]285位氨基酸為Asn ；
[0331]286位氨基酸為Phe;
[0332]288位氨基酸為Asn或Pro中的任一個；
[0333]293位氨基酸為Val ；
[0334]307位氨基酸為Ala、Glu、Gln或Met中的任一個；
[0335] 311 位氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一個；
[0336]309位氨基酸為Pro ；
[0337]312位氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個；
[0338]314位氨基酸為Ala或Leu中的任一個；
[0339]316位氨基酸為Lys;
[0340]317位氨基酸為Pro ；
[0341]318位氨基酸為Asn或Thr中的任一個；
[0342]332 位氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個；
[0343]339位氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個；
[0344]341位氨基酸為Pro ；
[0345]343 位氨基酸為 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0346]375位氨基酸為Arg ；
[0347]376 位氨基酸為 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一個；
[0348]377位氨基酸為Lys ；
[0349]378位氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個；
[0350]380位氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個；
[0351]382 位氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0352]385 位氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0353]386 位氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0354]387 位氨基酸為 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0355]389位氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個；
[0356]423位氨基酸為Asn ；
[0357]427位氨基酸為Asn ；
[0358]428位氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個；
[0359]430 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一個；
[0360]431位氨基酸為Hi s或Asn中的任一個；
[0361]433 位氨基酸為 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一個；
[0362]434 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0363]436 位氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個；
[0364]438位氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個；
[0365]440位氨基酸為Lys ;或者
[0366]442位氨基酸為Lys、308位氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個。
[0367][14’ ] [1' ]~[9’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為在pH中性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0368][15’] [14’]所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)是下述Fe區(qū):在SEQ ID NO: 13、
14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258 位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311位、312 位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385位、386 位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0369][16，] [15，]所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0370]237位氨基酸為Met ；
[0371]248位氨基酸為lie;
[0372]250 位氨基酸為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0373]252位氨基酸為Phe、Trp或Tyr中的任一個；
[0374]254位氨基酸為Thr ；
[0375]255位氨基酸為Glu ；
[0376]256位氨基酸為Asp、Asn、Glu或Gln中的任一個；
[0377]257 位氛基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一個；
[0378]258位氨基酸為His;
[0379]265位氨基酸為Ala ；
[0380]286位氨基酸為Ala或Glu中的任一個；
[0381]289位氨基酸為His;
[0382]297位氨基酸為Ala ；
[0383]303位氨基酸為Ala ；
[0384]305位氨基酸為Ala ；
[0385]307 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0386]308 位氛基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0387]309位氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一個；
[0388]311位氨基酸為Ala、His或Ile中的任一個；
[0389]312位氨基酸為Ala或His中的任一個；
[0390]314位氨基酸為Lys或Arg中的任一個；
[0391]315位氨基酸為Ala、Asp或His中的任一個；
[0392]317位氨基酸為Ala;
[0393]332位氨基酸為Val ；
[0394]334位氨基酸為Leu ；
[0395]360位氨基酸為His ；
[0396]376位氨基酸為Ala ；
[0397]380位氨基酸為Ala ；
[0398]382位氨基酸為Ala ；
[0399]384位氨基酸為Ala ；
[0400]385位氨基酸為Asp或Hi s中的任一個；
[0401 ]386位氨基酸為Pro ；
[0402]387位氨基酸為Glu ；
[0403]389位氨基酸為Ala或Ser中的任一個；
[0404]424位氨基酸為Ala ；
[0405]428 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0406]433位氨基酸為Lys ；
[0407]434位氨基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一個；或者
[0408]436 位氛基酸為 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0409][17’ ] [1' ]~[13’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)包含對Fe Y受體的結合活性比天然型人IgG的Fe區(qū)對Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0410][18’ ] [17’ ]所述的藥物組合物，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸:以EU編號表示的 221 位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234位、235 位、236 位、23 7 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278位、279 位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428位、429位、434位、436位或440位。
[0411][19’] [18’]所述的藥物組合物，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0412]221位氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
[0413]222位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0414]223位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0415]224位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0416]225位氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0417]227位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0418]228位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0419]230位氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0420]231位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0421]232位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0422]233 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0423]234 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0424]235 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0425]236 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0426]237 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0427]238 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0428]239 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0429]240位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0430]241 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0431]243 位氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0432]244位氨基酸為His ；
[0433]245位氨基酸為Ala ；
[0434]246位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0435]247 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0436]249位氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0437]250位氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0438]251位氨基酸為Phe ；
[0439]254位氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0440]255位氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0441 ] 256位氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0442]258位氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0443]260位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0444]262位氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0445]263位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0446]264 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0447]265 位氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0448]266位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0449]267 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0450]268 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一個；
[0451]269 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0452]270 位氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一個；
[0453]271 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0454]272 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0455]273位氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0456]274 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0457]275位氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0458]276 位氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0459]278 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0460]279位氨基酸為Ala ；
[0461]280 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0462]281位氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0463]282位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0464]283 位氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0465]284 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0466]285 位氨基酸為 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0467]286位氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0468]288位氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0469]290 位氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0470]291 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0471]292 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0472]293 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0473]294 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0474]295 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0475]296 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0476]297 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0477]298 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0478]299 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0479] 300 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val 或 Trp 中的任一個；
[0480]301位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0481]302位氨基酸為Ile ；
[0482]303位氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0483]304位氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0484]305位氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0485]311 位氨基酸為 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0486]313位氨基酸為Phe ；
[0487]315位氨基酸為Leu ；
[0488]317位氨基酸為Glu或Gln ；
[0489]318 位氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0490]320 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、VaK Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0491]322 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0492]323位氨基酸為Ile ；
[0493]324 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0494]325 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0495]326 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0496]327 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0497]328 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0498]329 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0499]330 位氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、SerΛThr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0500]331 位氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0501]332 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0502]333 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個；
[0503]334 位氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0504]335 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0505]336位氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0506]337位氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0507]339 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0508]376位氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0509]377位氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0510]378位氨基酸為Asp;
[0511]379位氨基酸為Asn;
[0512]380位氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0513]382位氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0514]385位氨基酸為Glu;
[0515]392位氨基酸為Thr;
[0516]396位氨基酸為Leu;
[0517]421位氨基酸為Lys;
[0518]427位氨基酸為Asn;
[0519]428位氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0520]429位氨基酸為Met ；
[0521 ]434位氨基酸為Trp ；
[0522]436位氨基酸為Ile ;或者
[0523]440位氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0524][20’] [I]~[16’]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)為對抑制型Fe Y受體的結合活性比對活性型Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0525][21’ ] [20’ ]所述的藥物組合物，其中，所述抑制型Fe Y受體為人Fe YRIIb。
[0526][22’ ] [20’ ]或[21’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述活性型Fe Y受體為人 Fe Y RIa, A Fe y RIIa(R)、人 Fe Y RIIa(H)、人 Fe Y RIIIa(V)或人 Fe y RIIIa(F)。
[0527][23’ ] [20’ ]~[22’ ]中任一項所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位或328位氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
[0528][24’ ] [23’ ]所述的藥物組合物，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位氨基酸為Asp、或者328位氨基酸為Glu。
[0529][25’ ] [23’ ]或[24’ ]所述的藥物組合物，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，為以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0530]233位氨基酸為Asp ；
[0531 ]234位氨基酸為Trp或Tyr中的任一個；
[0532]237 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0533]239位氨基酸為Asp ；
[0534]267位氨基酸為Ala、Gln或Val中的任一個；
[0535]268位氨基酸為Asn、Asp或Glu中的任一個；
[0536]271位氨基酸為Gly ；
[0537] 326 位氨基酸為 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0538]330位氨基酸為Arg、Lys或Met中的任一個；
[0539]323位氨基酸為lie、Leu或Met中的任一個；或者
[0540]296位氨基酸為Asp。
[0541]上述的[I]~[25]還可以換成以下的另外一種表達形式:
[0542][1〃]用于使抗原從對象的血漿中消失的方法，該方法是包含⑴Fe區(qū)和(ii)兩個以上的抗原結合結構域的該抗原結合分子的應用，所述抗原結合結構域中的至少一個是對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域；
[0543]該方法包括向對象給予可形成免疫復合體的抗原結合分子，所述免疫復合體包含(a)兩分子以上的該抗原結合分子和(b)兩分子以上的抗原，所述抗原包含兩個以上的抗原結合單元。
[0544][2"] [1"]所述的方法，其中，所述離子濃度條件為鈣離子濃度條件。
[0545][3"] [2"]所述的方法，其中，所述抗原結合結構域是在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性比在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低的抗原結合結構域。
[0546][4"][1”]~[3"]中任一項所述的方法，其中，所述離子濃度條件為pH條件。
[0547][5"] [4"]所述的方法，其中，所述抗原結合結構域是在pH酸性范圍條件下對抗原的結合活性比在PH中性范圍條件下對抗原的結合活性低的抗原結合結構域。
[0548][6〃] [1〃]~[5〃]中任一項所述的方法，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為多聚體。
[0549][7〃] [6〃]所述的方法，其中，所述抗原為⑶F、⑶F-1、⑶F_3 (Vgr_2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-a、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌聯(lián)蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、VEGF、IgE, IgA、IgG, IgM,RANKL, TGF- a、TGF- β、泛特異性的TGF- β或IL-8中的任一種。
[0550][8〃] [1〃]~[5〃]中任一項所述的方法，其中，包含兩個以上的抗原結合單元的所述抗原為單體。
[0551][9〃] [1〃]~[9〃]中任一項所述的方法，其中，抗原結合分子為多特異性或多互補位的抗原結合分子、或者抗原結合分子混合物。
[0552][10"] [I"]~[9〃]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)分別為SEQ ID NO: 13,14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)。
[0553][11"] [1"]~[9"]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為在pH酸性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0554][12〃] [11〃]所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位。
[0555][13〃] [12〃]所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0556]238位氨基酸為Leu ；
[0557]244位氨基酸為Leu ；
[0558]245位氨基酸為Arg ；
[0559]249位氨基酸為Pro ；
[0560]250位氨基酸為Gln或Glu中的任一個；或者
[0561]251位氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個；
[0562]252位氨基酸為Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一個；
[0563]254位氨基酸為Ser或Thr中的任一個；
[0564]255位氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個；
[0565]256 位氛基酸為 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0566]257 位氨基酸為 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一個；
[0567]258位氨基酸為Asp ；
[0568]260位氨基酸為Ser ；
[0569]262位氨基酸為Leu ；
[0570]270位氨基酸為Lys ；
[0571 ] 272位氨基酸為Leu或Arg中的任一個；
[0572]279 位氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0573]283 位氛基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一個；
[0574]285位氨基酸為Asn ；
[0575]286位氨基酸為Phe ；
[0576]288位氨基酸為Asn或Pro中的任一個；
[0577]293位氨基酸為Val ；
[0578]307位氨基酸為Ala、Glu、Gln或Met中的任一個；
[0579]311 位氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一個；
[0580]309位氨基酸為Pro ；
[0581]312位氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個；
[0582]314位氨基酸為Ala或Leu中的任一個；
[0583]316位氨基酸為Lys;
[0584]317位氨基酸為Pro;
[0585]318位氨基酸為Asn或Thr中的任一個；
[0586]332 位氨基酸為 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個；
[0587]339位氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個；
[0588]341位氨基酸為Pro ；
[0589]343 位氨基酸為 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0590]375位氨基酸為Arg ；
[0591]376 位氨基酸為 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一個；
[0592]377位氨基酸為Lys ；
[0593]378位氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一個；
[0594]380位氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個；
[0595]382 位氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0596]385 位氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0597]386 位氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0598]387 位氨基酸為 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0599]389位氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個；
[0600]423位氨基酸為Asn ；
[0601]427位氨基酸為Asn;
[0602]428位氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個；
[0603]430 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一個；
[0604]431位氨基酸為Hi s或Asn中的任一個；
[0605]433 位氨基酸為 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一個；
[0606]434 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0607]436 位氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一個；
[0608]438位氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個；
[0609]440位氨基酸為Lys ;或者
[0610]442位氨基酸為Lys、308位氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個。
[0611][14"] [1'']~[9"]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為在pH中性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
[0612][15〃] [14〃]所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0613][16〃] [15〃]所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0614]237位氨基酸為Met;
[0615]248位氨基酸為lie;
[0616]250 位氛基酸為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0617]252位氨基酸為Phe、Trp或Tyr中的任一個；
[0618]254位氨基酸為Thr;
[0619]255位氨基酸為Glu;
[0620]256位氨基酸為Asp、Asn、Glu或Gln中的任一個；
[0621]257 位氛基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一個；
[0622]258位氨基酸為His;
[0623]265位氨基酸為Ala ；
[0624]286位氨基酸為Ala或Glu中的任一個；
[0625]289位氨基酸為His ；
[0626]297位氨基酸為Ala ；
[0627]303位氨基酸為Ala ；
[0628]305位氨基酸為Ala ；
[0629]307 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0630]308 位氛基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0631]309位氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一個；
[0632]311位氨基酸為Ala、His或Ile中的任一個；
[0633]312位氨基酸為Ala或His中的任一個；
[0634]314位氨基酸為Lys或Arg中的任一個；
[0635]315位氨基酸為Ala、Asp或His中的任一個；
[0636]317位氨基酸為Ala;
[0637]332位氨基酸為Val ；
[0638]334位氨基酸為Leu ；
[0639]360位氨基酸為His;
[0640]376位氨基酸為Ala ；
[0641]380位氨基酸為Ala;
[0642]382位氨基酸為Ala ；
[0643]384位氨基酸為Ala ；
[0644]385位氨基酸為Asp或Hi s中的任一個；
[0645]386位氨基酸為Pro ；
[0646]387位氨基酸為Glu ；
[0647]389位氨基酸為Ala或Ser中的任一個；
[0648]424位氨基酸為Ala ；
[0649] 428 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0650]433位氨基酸為Lys ；
[0651]434位氨基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一個；或者
[0652]436 位氨基酸為 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0653][17〃] [1〃]~[13〃]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)包含對Fe Y受體的結合活性比天然型人IgG的Fe區(qū)對Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0654][18〃] [17〃]所述的方法，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸:以EU編號表示的221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、 296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位或440位。
[0655][19〃] [18〃]所述的方法，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0656]221位氨基酸為Lys或Tyr中的任一個；
[0657]222位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0658]223位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個；
[0659]224位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個；
[0660]225位氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個；
[0661]227位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0662]228位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0663]230位氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個；
[0664]231位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0665]232位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個；
[0666]233 位氛基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0667]234 位氛基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0668]235 位氛基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0669]236 位氛基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0670]237 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0671]238 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0672]239 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0673]240位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0674]241 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0675]243 位氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0676]244位氨基酸為His ；
[0677]245位氨基酸為Ala ；
[0678]246位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0679]247 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0680]249位氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個；
[0681 ] 250位氨基酸為Glu或Gln中的任一個；
[0682]251位氨基酸為Phe ；
[0683]254位氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個；
[0684]255位氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個；
[0685]256位氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個；
[0686]258位氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個；
[0687]260位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0688]262位氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個；
[0689]263位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0690]264 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0691]265 位氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0692]266位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；
[0693]267 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0694]268 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一個；
[0695]269 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0696]270 位氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一個；
[0697]271 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0698] 272 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0699]273位氨基酸為Phe或Ile中的任一個；
[0700]274 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0701 ] 275位氨基酸為Leu或Trp中的任一個；
[0702]276 位氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0703]278 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個；
[0704]279位氨基酸為Ala ；
[0705]280 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0706]281位氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0707]282位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個；
[0708]283 位氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個；
[0709]284 位氨基酸為 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0710]285 位氨基酸為 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0711]286位氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個；
[0712]288位氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個；
[0713]290 位氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0714]291 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個；
[0715]292 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一個；
[0716]293 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0717]294 位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0718]295 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0719]296 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一個；
[0720]297 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0721]298 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0722]299 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0723]300 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一個；
[0724]301位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個；
[0725]302位氨基酸為Ile ；
[0726]303位氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個；
[0727]304位氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個；
[0728]305位氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個；
[0729]311 位氨基酸為 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0730]313位氨基酸為Phe;
[0731]315位氨基酸為Leu ；
[0732]317位氨基酸為Glu或Gln ；
[0733]318 位氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；
[0734]320 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0735]322 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0736]323位氨基酸為Ile ；
[0737]324 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個；
[0738]325 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0739]326 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；
[0740]327 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0741]328 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0742]329 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0743]330 位氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0744]331 位氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0745]332 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0746]333 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個；
[0747]334 位氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個；
[0748]335 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一個；
[0749]336位氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個；
[0750]337位氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個；
[0751]339 位氨基酸為 Aspλ Pheλ Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0752]376位氨基酸為Ala或Val中的任一個；
[0753]377位氨基酸為Gly或Lys中的任一個；
[0754]378位氨基酸為Asp ；
[0755]379位氨基酸為Asn ；
[0756]380位氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個；
[0757]382位氨基酸為Ala或Ile中的任一個；
[0758]385位氨基酸為Glu ；
[0759]392位氨基酸為Thr ；
[0760]396位氨基酸為Leu ；
[0761]421位氨基酸為Lys;
[0762]427位氨基酸為Asn ；
[0763]428位氨基酸為Phe或Leu中的任一個；
[0764]429位氨基酸為Met ；
[0765]434位氨基酸為Trp ；
[0766]436位氨基酸為Ile ;或者
[0767]440位氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
[0768][20"] [I]~[16"]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)為對抑制型Fe Y受體的結合活性比對活性型Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
[0769][21〃] [20〃]所述的方法，其中，所述抑制型Fe Y受體為人Fe yRIIb。
[0770][22〃] [20〃]或[21〃]中任一項所述的方法，其中，所述活性型Fe Y受體為人Fe Y RIa、人 Fe YRIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
[0771][23"][20"]~[22"]中任一項所述的方法，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位或328位氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
[0772][24〃] [23〃]所述的方法，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位氨基酸為Asp、或者328位氨基酸為Glu。
[0773][25〃] [23〃]或[24〃]所述的方法，其中，在所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，為以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸:
[0774]233位氨基酸為Asp ；
[0775]234位氨基酸為Trp或Tyr中的任一個；
[0776]237 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一個；
[0777]239位氨基酸為Asp ；
[0778]267位氨基酸為Ala、Gln或Val中的任一個；
[0779]268位氨基酸為Asn、Asp、或Glu中的任一個；
[0780]271位氨基酸為Gly ；
[0781]326 位氨基酸為 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一個；
[0782]330位氨基酸為Arg、Lys或Met中的任一個；
[0783]323位氨基酸為lie、Leu或Met中的任一個；或者
[0784]296位氨基酸為Asp。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0785]圖1是顯示pH依賴性結合抗體反復與可溶型抗原結合的圖。(i)抗體與可溶型抗原結合；(ii)通過胞飲作用非特異性地攝入細胞內(nèi)；(iii)在核內(nèi)體內(nèi)，抗體與FcRn結合，可溶型抗原從抗體上解離；(iv)可溶型抗原轉移到溶酶體中被分解；(V)可溶型抗原解離后的抗體通過FcRn再循環(huán)到血漿中；(vi)再循環(huán)的抗體可以再次與可溶型抗原結合。
[0786]圖2是顯示通過在中性條件下增強與FcRn的結合，來進一步提高pH依賴性結合抗體可以與抗原反復結合的效果的圖。(i)抗體與可溶型抗原結合；(ii)經(jīng)由FcRn，通過胞飲作用攝入細胞內(nèi)在核內(nèi)體內(nèi)可溶型抗原從抗體上解離；(iv)可溶型抗原轉移到溶酶體中被分解；(V)可溶型抗原解離后的抗體通過FcRn再循環(huán)到血漿中；(vi)再循環(huán)的抗體可以再次與可溶型抗原結合。
[0787]圖3是顯示使用了 Biacore的顯示抗人IgA抗體在1.2mM的Ca2+和3 μ M的Ca2+下與人IgA的相互作用的傳感圖的圖。
[0788]圖4是顯示人IgA+GAl-1gGl抗體給藥組、人IgA+GA2_IgGl抗體給藥組、人IgA+GA2-Fc Y R㈠和GA2-N434W抗體給藥組的正常小鼠血漿中抗體濃度變化的圖。
[0789]圖5是顯示人IgA單獨給藥組、人IgA+GAl-1gGl抗體給藥組、人IgA+GA2_IgGl抗體給藥組、人IgA+GA2-Fc yR(-)抗體給藥組和人IgA+GA2-N434W抗體給藥組的正常小鼠血漿中人IgA的濃度變化的圖。
[0790]圖6是顯示人IgA+GAl-1gGl抗體給藥組、人IgA+GA2_IgGl抗體給藥組、人IgA+GA2-Fc yR(-)抗體給藥組和人IgA+GA2-N434W抗體給藥組的正常小鼠血漿中非結合型人IgA的濃度變化的圖。
[0791]圖7是例示與多聚體抗原形成大的免疫復合體的、包含天然IgGl恒定區(qū)pH/Ca依賴性抗體的每I分子抗體的抗原消失效率的圖。
[0792]圖8是例示識別單體抗原中存在的兩個以上表位并適合形成大的免疫復合體的多特異性PH/Ca依賴性抗體的每I分子抗體的抗原消失效率的圖。
[0793]圖9是顯示確認到人IgE和作為pH依賴性抗IgE抗體的克隆278pH依賴性地形成大的免疫復合體的凝膠過濾層析分析結果的圖。
[0794]圖10是顯示人IgE+克隆278給藥組和人IgE+Xolair抗體給藥組的正常小鼠血漿中抗體濃度變化的圖。
[0795]圖11是顯示人IgE單獨給藥組、人IgE+克隆278抗體給藥組和人IgE+克隆278抗體給藥組的正常小鼠血漿中人IgE濃度變化的圖。
[0796]圖12是顯示正常小鼠血漿中GA2_IgGl和GA2-F1087的抗體濃度變化的圖。
[0797]圖13是顯示給予了 GA2_IgGl和GA2-F1087的正常小鼠血漿中hlgA的濃度變化的圖。
[0798]圖14是顯示C57BL/6J小鼠血漿中278_IgGl和278-F1087的抗體濃度變化的圖。
[0799]圖15 是顯示給予了 278-1gGl 和 278-F1087 的 C57BL/6J 小鼠的血漿中 hIgE(Asp6)的濃度變化的圖。
[0800]圖16是顯示給予了 GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn轉基因小鼠的血漿中GA2-F760或GA2-F1331的濃度變化的圖。
[0801]圖17是顯示給予了 GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn轉基因小鼠的血漿中人IgA的濃度變化的圖。
[0802]圖18是顯示給予了 278-F760或278-F1331的人FcRn轉基因小鼠的血漿中278-F760或278-F1331的濃度變化的圖。
[0803]圖19是顯示給予了 278-F760或278-F1331的人FcRn轉基因小鼠的血漿中人IgE的濃度變化的圖。
[0804]圖20是顯示在ρΗ7.4、ρΗ6.0下PHX-1gGl相對于hsIL_6R的傳感圖的圖。
[0805]圖21是通過ECL法(電化學發(fā)光法)評價Fv4_IgGl和PHX-F29能否同時與IL6R
結合的結果。
[0806]圖22 是顯示 hsIL6R+Fv4-1gGl 給藥組和 hsIL6R+Fv4-1gGl+PHX_IgGl 給藥組的正常小鼠血漿中抗IL6R抗體的濃度變化的曲線圖。
[0807]圖23 是顯示 hsIL6R+Fv4-1gGl 給藥組和 hsIL6R+Fv4-1gGl+PHX_IgGl 給藥組的正常小鼠血漿中人IL6R的濃度變化的曲線圖。
[0808]圖24是顯示使Fe Y R與只含抗體的溶液或者與抗體和抗原的混合溶液作用時的Biacore傳感圖。虛線是顯示與只含抗體的溶液作用的情形，實線是顯示與混合有抗體和抗原的溶液作用時的傳感圖的圖。
[0809]圖25是使人FcRn與只含抗體的溶液或者與抗體和抗原的混合溶液作用時的Biacore傳感圖。實線是顯示與只含抗體的溶液作用時的情形，虛線是顯示與混合有抗體和抗原的溶液作用時的傳感圖的圖。
[0810]圖26是使小鼠FcRn與只含抗體的溶液或者與抗體和抗原的混合溶液作用時的Biacore傳感圖。虛線是顯示與只含抗體的溶液作用的情形，實線是顯示與混合有抗體和抗原的溶液作用時的傳感圖的圖。
[0811]圖27是使小鼠FcRn與只含抗體的溶液或者與抗體和抗原的混合溶液作用時的Biacore傳感圖。虛線是顯示與只含抗體的溶液作用的情形，實線是顯示與混合有抗體和抗原的溶液作用時的傳感圖的圖。

【具體實施方式】
[0812]以下的定義和詳細說明是為了容易理解本說明書中說明的本發(fā)明而提供。
[0813]氨基酸
[0814]本說明書中，以單字母碼或三字母碼或者該兩種方式書寫氨基酸，例如表示為Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff, His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V。
[0815]氨基酸的修飾
[0816]為了修飾抗原結合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以適當采用位點特異性誘變法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重疊延伸 PCR 等公知的方法。另外，作為取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修飾方法，還可以采用多種公知的方法(Annu.Rev.B1phys.B1mol.Struct.(2006) 35, 225-249 ；Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。例如，還優(yōu)選采用無細胞翻譯系統(tǒng)(CloverDirect (Protein Express))等,該系統(tǒng)在作為終止密碼子之一的UAG密碼子(琥拍密碼子)的互補性琥珀抑制基因tRNA中包含結合有非天然氨基酸的tRNA。
[0817]本說明書中，表示氨基酸的修飾位點時使用的“和/或”一詞的意義包括“和”與“或”適當組合的所有組合。具體而言，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸修飾的變異:
[0818](a) 33 位、(b) 55 位、(C) 96 位、(d) 33 位和 55 位、(e) 33 位和 96 位、(f) 55 位和 96位、(g)33位和55位和96位。
[0819]抗原結合單元
[0820]本說明書中，“抗原結合單元”是指“包含本發(fā)明的抗原結合分子所含的抗原結合結構域的一價結合單元所結合的表位的抗原分子在該抗原結合分子的不存在下在血漿中通常存在的形態(tài)的每一分子中存在的該表位數(shù)”。作為抗原結合單元為兩單元的抗原的例子，例示包含通常以⑶F、TOGF或VEGF等同源二聚體的形式存在于血漿中的多聚體的抗原。例如，在形成同源二聚體的GDF的分子中存在兩單元的抗GDF抗體所含的可變區(qū)的一價結合單元所結合的表位，所述抗GDF抗體在其分子中包含同一序列的兩個可變區(qū)(即，不是后述的雙特異性抗體)。另外，作為抗原結合單元為兩單元的抗原的例子，還例示IgE等免疫球蛋白分子。IgE在血漿中通常以包含重鏈二聚體和輕鏈二聚體的四聚體的形式存在，但在該四聚體中存在兩單元的抗IgE抗體所含的可變區(qū)的一價結合單元所結合的表位，所述抗IgE抗體在其分子中包含同一序列的兩個可變區(qū)(即，不是后述的雙特異性抗體)。IgA在血漿中通常以包含重鏈二聚體和輕鏈二聚體的四聚體、或者該四聚體經(jīng)由J鏈進一步形成復合體的八聚體這兩種形式存在，但在該四聚體中和八聚體中分別存在兩單元或四單元的抗IgA抗體所含的可變區(qū)的一價結合單元所結合的表位，所述抗IgA抗體在其分子中包含同一序列的兩個可變區(qū)(即，不是后述的雙特異性抗體)。另外，作為抗原結合單元為三單元的抗原的例子，例示包含通常以作為TNF超家族的TNFa、RANKL或⑶154等同源三聚體的形式存在于血漿中的多聚體的抗原。
[0821]作為抗原結合單元為一單元的抗原分子的例子，例示通常以可溶型IL-6受體(以下還稱作sIL-6R)、IL-6、HMGB-l、CTGF等單體形式存在于血漿中的分子。包含IL_12p40和IL-12p35 的 IL-12、包含 IL_12p40(還稱作 IL-30B)和 IL_23pl9 的 IL-23、或包含 EBI3 和IL27p28的IL-23、或包含IL_12p35和EBI3的IL-35等異源二聚體包含結構彼此不同的兩分子的亞單元。由于分子中包含兩個這些亞單元中的任意一個所結合的可變區(qū)(即，不是后述的雙特異性抗體)的抗亞單元抗體所含的可變區(qū)的一價結合單元所結合的表位是一單元，所以這些異源二聚體的抗原結合單元是一單元。同樣，TNFa-TNFP-hCG的多亞單元復合體等異源三聚體的抗原結合單元也是一單元。
[0822]需要說明的是，由于抗原結合單元是指抗原結合結構域的一價結合單元所結合的表位數(shù)，所以在抗原結合分子中的互補位存在一種和存在多種的情況下，即使這些抗原結合分子所結合的抗原是相同的抗原，但該抗原中的抗原結合單元也是不同的。例如，在上述的異源二聚體的例子中，在抗原結合分子所含的抗原結合結構域中的一價結合單元與該異源二聚體中的一種亞單元結合時，該抗原中的抗原結合單元是一單元，相對于此，在抗原結合分子為包含兩個與形成異源二聚體的各亞單元結合的一價結合單元的雙特異性或雙互補位的抗原結合分子的情況下，該抗原中的抗原結合單元是兩單元。
[0823]多聚體(mu I timer)
[0824]本說明書中，只記作兩個以上的多聚體時，多聚體一詞包括同源多聚體和異源多聚體兩者。作為多聚體所含的亞單元間的結合方式，包括肽鍵或二硫鍵等共價鍵、或者離子鍵、范德華鍵或氫鍵等穩(wěn)定的非共價鍵，但并不限于這些。同源多聚體包含多個相同的亞單元，而異源多聚體包含多個不同的亞單元。例如，二聚體一詞包括同源二聚體和異源二聚體兩者，同源二聚體包含兩個相同的亞單元，而異源二聚體包含兩個不同的亞單元。另外，關于表示形成多聚體的各單元的單體，當該單元為多肽時，所述單體是指通過肽鍵連接的連續(xù)的各結構單元。
[0825]
[0826]本說明書中，“抗原”只要包含抗原結合結構域所結合的表位即可，其結構并不限于特定的結構。從另外的意義來講，抗原既可以是無機物，也可以是有機物。作為抗原，可例示如下所述的分子:17-從、4-比8、40(:、6-酮^^^1&、8-異^^^2&、8-氧代_dG、Al腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素 RIA ALK-2、激活素 RIB ALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2,ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、a -V/ β -1 拮抗劑、ANG、Ang, APAF-UAPE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房鈉尿因子、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細胞刺激因子(BlyS)、BACE, BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-UBAK, Bax、BCA-U BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM, BLC,BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3 成骨蛋白(Osteogenin)、BMP_4BMP_2b、BMP-5、BMP-6Vgr-U BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP_8a、0P-2)、BMPR, BMPR-1A (ALK-3)、BMPR-1B (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-1 I (BRK-3)、BMP、b_NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE,BPDE-DNA, BTC、補體因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、C1、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相關抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPP1、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶 X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCLU CCLlU CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD 1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla, CDllb, CDllc, CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7_1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產(chǎn)氣英膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8_l、CLC, CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-U COX、C-Ret, CRG-2、CT-U CTACK, CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO,CXCLlU CXCLl2, CXCL13、CXCLl4, CXCL15、CXCL16, CXCR、CXCRU CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC, DcR3、DC-SIGN、補體抑制因子(衰變促進因子)、脫(1-3)-1GF-1 (腦 IGF-1) > Dhh、地高辛、DNAM-U Dnase, Dpp, DPPIV/CD26、Dtk, ECAD, EDA、EDA-AU EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA, EMMPRIN、ΕΝΑ、內(nèi)皮素受體、腦啡肽酶、eNOS、Eot, EotaxinUEpCAM, EphrinB2/EphB4、EPO, ERCC, E-選擇素、ET-U因子Ila、因子VI1、因子VIIIc、因子IX、成纖維細胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcRl、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt_3、Flt_4、促卵胞激素、斷裂因子、FZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF,⑶2、⑶3、⑶F、⑶F-1、⑶F_3 (Vgr-2)、⑶F_5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生長抑制素)、⑶F-9、a)F-15(MIC-l)、ffl)NF、a)NF、GFAP、GFRa-l、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap 或 NIP-cap)、HB-EGF, HCC、HCMV gB 包膜糖蛋白、HCMV gH 包膜糖蛋白、HCMVUL,造血生長因子(HGF)、HepB gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMff-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gpl20 V3 環(huán)、HLA、HLA-DR、HMl.24、HMFGPEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨細胞病毒(HCMV)、人生長激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-U I CAM-3, ICE、I COS, IFNg、Ig、IgA 受體、IgE、IGF、IGF 結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-1, IGF-1I, IL、IL-U IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6, IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12, IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-a、INF-β、INF-Y、抑制素、iNOS、胰島素 A鏈、胰島素B鏈、胰島素樣生長因子1、整聯(lián)蛋白a2、整聯(lián)蛋白a3、整聯(lián)蛋白a4、整聯(lián)蛋白α4/β1、整聯(lián)蛋白α4/β7、整聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白α5/β1、整聯(lián)蛋白α5/β3、整聯(lián)蛋白a 6、整聯(lián)蛋白β 1、整聯(lián)蛋白β2、干擾素Y、IP-10、1-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、層連蛋白 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛伏型 TGF-1、潛伏型 TGF_lbpl、LBP、LDGF, LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相關抗原、LFA-U LFA-3、Lfo, LIF、LIGHT、月旨蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇素、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黃體激素、淋巴毒素β 受體、Mac-1、MAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF, MDC, Mer、金屬蛋白酶、MGDF 受體、M GMT, MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMACU MMP, MMP-UMMP-10、MMP-11、MMP—12、MMP—13、MMP—14、MMP—15、MMP—2、MMP—24、MMP—3、MMP—7、MMP—8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、繆勒管抑制物質(zhì)、Mug、MuSK, NAIP, NAP、NCAD, N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶、神經(jīng)營養(yǎng)素_3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4或神經(jīng)營養(yǎng)素-6、Neurturin、神經(jīng)生長因子(NGF)、NGFR、NGF- β、nNOS、NO、NOS、Npn, NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr,甲狀旁腺激素、PARC、PARP,PBR、PBSF, PCAD, P-鈣黏蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, PEM、PF4、PGE, PGF, PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk, PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES,RANTES、松弛素A鏈、松弛素B鏈、腎素、呼吸道合胞體病毒(RSV)F、RSVFgp, Ret、類風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-U SLAM、SLPI, SMAC, SMDF, SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-1I, TACE, TACI,TAG-72 (腫瘤相關糖蛋白-72)、TARC, TCA-3、T細胞受體(例如，T細胞受體α / β )、TdT、TECK, TEMU TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、TGF-β 泛特異性(泛特異性的 TGF-β )、TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RH、TGF-β Rllb、TGF- β RII1、TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、TGF- β 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲狀腺激素、116、11]\^、1'10、組織因子、丁]\^卩卩2、1'111?0、丁]\^1?52、丁,、丁,-0、TNF-α β、TNF_3 2、TNFc、TNF-R1、TNF-RI1、TNFRSF10A(TRAIL Rl Apo_2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF1D (TRAILR4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF1IA (RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSFI IB (OPG OCIF、TRl)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA, LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19(TR0Y TAJ, TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSFIA (TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75_80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RII1、TNFCR)、TNFRSF4 (0X40 ACT35、TXGPIR)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTl、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1)、TNFRSF25 (DR3 Apo_3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF1 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSF1A (TNF_a黏附素(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC,p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體CD153)、TNFSF9 (4-1B B 配體 CD 137 配體)、TP-U t_PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-RUTRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF, Trk, TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原 CA125、腫瘤相關抗原表達病毒Y相關碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD, VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI, VM、病毒抗原、VLA, VLA-U VLA-4、VNR整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德因子、WIF-U WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT1B、WNTl 1、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP,XPD、HMGBl、IgA, A β、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG, Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽釋放酶原、RON、TMEM16F、SODl、嗜鉻粒蛋白A、嗜鉻粒蛋白B、tau、VAPl、高分子激肽原、IL-31、IL_31R、Navl.UNavl.2,Nav1.3,Nav1.4,Nav1.5,Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、Cl、Clq、Clr、Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、備解素、殼硬蛋白(sclerostin)、血纖蛋白原、血纖蛋白、凝血酶原、凝血酶、組織因子、因子V、因子Va、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子X1、因子XIa、因子XI1、因子Xlla、因子XII1、因子XIIIa、TFP1、抗凝血酶II1、EPCR、血栓調(diào)節(jié)蛋白、TAP1、tPA、纖溶酶原、纖溶酶、PA1-1、PA1-2、GPC3、多配體蛋白聚糖-1、多配體蛋白聚糖_2、多配體蛋白聚糖-3、多配體蛋白聚糖_4、LPA、SlP以及用于激素和生長因子的受體。
[0827]如下所述，象雙特異性抗體等在抗原結合分子與抗原分子中的多個表位結合的情況下，可與該抗原結合分子形成復合體的抗原可以是上述例示的抗原中的任一種、或者是其組合，換言之，可以是單體或異源多聚體。作為異源多聚體的非限定性例子，可以列舉:包含 IL-12p40 和 IL-12p35 的 IL-12、包含 IL_12p40 和(還稱作 IL-30B) IL_23pl9 的 IL-23、或者包含EB1-3和IL27p28的IL-23、或者包含IL_12p35和EB1-3的IL-35等異源二聚體。
[0828]在上述抗原的例示中還記載有受體，但在這些受體以可溶型存在于血漿中等生物體液中的情況下，其可以和本發(fā)明的抗原結合分子形成復合體，所以上述列舉的受體只要以可溶型存在于血漿中等生物體液中，則其可以用作與本發(fā)明的抗原結合分子結合能夠形成本發(fā)明的復合體的抗原。作為這種可溶型受體的一個非限定性方案，例如可以例示:由Mullberg 等人(J.1mmunol.(1994) 152 (10), 4958-4968)記載的作為可溶型 IL-6R 的、包含SEQ ID NO:1所表示的IL-6R多肽序列中第I位~第357位的氨基酸的蛋白。
[0829]在上述抗原的例示中，還記載有可溶型抗原，對該抗原所存在的溶液沒有限定，該可溶型抗原可以存在于生物體液、即充滿生物體內(nèi)的脈管或組織.細胞間隙的所有液體。在一個非限定性方案中，本發(fā)明的抗原結合分子所結合的抗原可以存在于細胞外液中。細胞外液是指脊椎動物的血漿、組織間液、淋巴液、致密的結締組織、腦脊髓液、髓液、穿刺液、或關節(jié)液等骨和軟骨中的成分、肺胞液(支氣管肺胞清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊內(nèi)液、或眼房水(房水)等細胞透過液(細胞的主動輸送?分泌活動的結果產(chǎn)生的各種腺腔內(nèi)的液體、和消化道管腔等其他體腔內(nèi)液)的總稱。
[0830]另外，當抗原結合分子所含的抗原結合結構域所結合的表位是單一表位時，作為與該抗原結合分子結合能夠形成本發(fā)明的復合體的抗原的一個非限定性方案，可以例示抗原結合單元中包含同源二聚體或同源三聚體等的下述分子:⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配體、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌聯(lián)蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF- α、TGF- β、泛特異性的 TGF- β、IL-8。
[0831]表位
[0832]表示存在于抗原中的抗原決定簇的表位，意指本說明書中公開的抗原結合分子中的抗原結合結構域所結合的抗原上的位點。所以，例如表位可通過其結構來定義。另外，也可以通過相對于識別該表位的抗原結合分子中的抗原的結合活性來定義該表位?？乖瓰殡幕蛘叨嚯臅r，還可以通過構成表位的氨基酸殘基來規(guī)定表位。另外，表位為糖鏈時，也可以通過特定的糖鏈結構來規(guī)定表位。
[0833]線性表位是下述表位，其包含氨基酸一級序列得到識別的表位。線性表位在固有序列中典型地含有至少3個氨基酸、以及最普通地含有至少5個、例如約8至10個、6至20
個氨基酸。
[0834]與線性表位相對地，立體結構表位是這樣的表位，其中，含有表位的氨基酸的一級序列并非是被識別表位的單一規(guī)定成分(例如，氨基酸的一級序列不需要被規(guī)定表位的抗體所識別的表位)。立體結構表位相對于線性表位可以含有增大數(shù)目的氨基酸。關于立體結構表位的識別，抗體識別肽或蛋白的三維結構。例如，蛋白分子折疊形成三維結構時，形成立體結構表位的某氨基酸和/或多肽主鏈形成并排，使得抗體可以識別表位。確定表位的立體結構的方法例如包括:χ射線結晶學、二維核磁共振分光學以及位點特異性旋轉標記和電子順磁共振分光學，但并非限定于此。例如，參照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B1logy (1996),第 66 卷，Morris (編)。
[0835]與表位結合的抗原結合結構域的結構被稱作互補位。表位和互補位通過在表位和互補位之間發(fā)生作用的氫鍵、靜電引力、范德華力、疏水鍵等穩(wěn)定地結合。該表位和互補位之間的結合力被稱作親和力(affinity)。多個表位與多個互補位結合時的結合力的總和被稱作親合力(avidity)。包含多個互補位(即多價)的抗體等與多個表位結合時，結合力(affinity)相加或協(xié)同地發(fā)揮作用,所以親合力比親和力高。
[0836]結合活性
[0837]下述例示了通過含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子來確認對表位的結合的方法，但通過含有針對IgA以外的抗原的抗原結合結構域的被測抗原結合分子來確認對表位的結合的方法也可以基于下述例示而適當實施。
[0838]例如，含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子是否識別存在于IgA分子中的線性表位，這可以通過如下所示的操作來確認。例如，為了上述目的，合成了包含構成IgA的恒定區(qū)的氨基酸序列的線性肽。該肽可進行化學合成?；蛘?，可以利用IgA的cDNA中編碼相當于恒定區(qū)的氨基酸序列的區(qū)域，通過基因工程技術得到。接下來，對包含構成恒定區(qū)的氨基酸序列的線性肽、和含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子的結合活性進行評價。例如，通過以固定化線性肽作為抗原的ELISA，可以評價該抗原結合分子對該肽的結合活性?；蛘?，基于該抗原結合分子對IgA細胞的結合中的、線性肽造成的抑制水平，也可以明確對線性肽的結合活性。通過這些試驗，可以明確該抗原結合分子對線性肽的結合活性。
[0839]另外，含有針對IgA蛋白的抗原結合結構域的被測抗原結合分子是否識別立體結構表位，這可以通過如下操作來確認。為了上述目的，如本說明書中所述，通過采用普通的重組基因方法，向可以形成IgA蛋白內(nèi)的天然的立體表位的宿主細胞(例如，動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞)中形質(zhì)導入編碼IgA的重組基因。由如此制作的重組細胞的培養(yǎng)液制備含有立體結構表位的IgA。含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子識別立體結構表位是指，該被測抗原結合分子與經(jīng)固定化的含有立體結構表位的IgA接觸時，強烈地與該IgA分子結合，但該抗原結合分子與經(jīng)固定化的包含構成IgA的氨基酸序列的氨基酸序列的線性肽實質(zhì)上不結合的情形等。還可以使用經(jīng)二硫蘇糖醇(dith1threitol)、二硫赤鮮醇(dith1erythritol) β _ 巰基乙醇(β -mercaptoethanol)、膦衍生物(phosphines)、硼氫化鈉(sodium borohydride)等切斷二硫鍵的還原劑和/或胍鹽酸鹽、尿素、十二烷基硫酸鈉等表面活性劑等離液序列高的藥物改性的針對IgA的該被測抗原結合分子來代替上述線性肽。這里，實質(zhì)上不結合是指，對人IgA的結合活性的80%以下、通常50%以下、優(yōu)選30%以下、特別優(yōu)選15%以下的結合活性。
[0840]作為測定含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子對IgA的結合活性的方法，例如可以列舉 Antibodies A Laboratory Manual 記載的方法(Ed Harlow, DavidLane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) ? SP，可以根據(jù)以 IgA 為抗原的ELISA或EIA的原理進行評價。
[0841]在ELISA形式中，含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子對IgA的結合活性，通過比較由酶反應生成的信號水平而定量地進行評價。即，將被測抗原結合分子添加至固定有IgA的ELISA板，利用識別被測抗原結合分子的酶標記抗體，檢測與固定在該板上的IgA結合的被測抗原結合分子。在上述ELISA中，制作被測抗原結合分子的稀釋系列，確定相對于IgA的抗體結合效價(titer),由此可以比較被測抗原結合分子對IgA的結合活性。
[0842]被測抗原結合分子與懸浮于緩沖液等中的細胞表面上表達的抗原的結合可以通過流式細胞儀檢測出。作為流式細胞儀，已知例如如下的裝置:
[0843]ACSCanto?II ；
[0844]FACSAri a? ；
[0845]FACSArray? ；
[0846]FACSVantage?SE ；
[0847]FACSCalibur?(均為 BD B1sciences 公司的商品名)；
[0848]EPICS ALTRA HyPerSort ；
[0849]Cytomics FC 500 ；
[0850]EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC ；
[0851]Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為 Beckman Coulter 公司的商品名)。
[0852]例如，作為含有針對IgE的抗原結合結構域的被測抗原結合分子對抗原的結合活性的優(yōu)選測定方法的一例，可以列舉以下方法。首先，使表達IgE的細胞與被測抗原結合分子反應，將其用識別被測抗原結合分子的經(jīng)FITC標記的二次抗體染色。將被測抗原結合分子用適當?shù)膬?yōu)選緩沖液稀釋，由此將該抗原結合分子制備成所期望的濃度來使用。例如，能夠以10 μ g/ml至10ng/ml之間的任意濃度使用。接著,通過FACSCalibur (BD公司)測定熒光強度和細胞數(shù)?？贵w對該細胞的結合量被反映為使用CELL QUEST軟件(BD公司)進行分析而得到的熒光強度、即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，能夠測定由被測抗原結合分子的結合量表示的被測抗原結合分子的結合活性。
[0853]含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子是否與某抗原結合分子共有表位，這可以通過兩者對相同表位的競爭來確認?？乖Y合分子間的競爭通過交叉阻斷試驗等來檢測。例如競爭ELISA試驗是優(yōu)選的交叉阻斷試驗。
[0854]具體而言，在交叉阻斷試驗中，包被于微量滴定板的孔上的IgA蛋白在候選競爭抗原結合分子的存在下或不存在下經(jīng)孵育后，添加被測抗原結合分子。與孔中的IgA蛋白結合的被測抗原結合分子的量與競爭結合相同表位的候選競爭抗原結合分子的結合能力間接地相關。即，競爭抗原結合分子對相同表位的親和性越大，則被測抗原結合分子對包被有IgA蛋白的孔的結合活性越降低。
[0855]經(jīng)由IgA蛋白而與孔結合的被測抗原結合分子的量可以通過預先標記抗原結合分子來容易地測定。例如，經(jīng)生物素標記的抗原結合分子通過使用親和素過氧化酶結合物和合適的底物來測定。利用過氧化酶等酶標記的交叉阻斷試驗特別被稱為競爭ELISA試驗?？乖Y合分子能夠用可檢測或可測定的其它標志物質(zhì)進行標記。具體而言，公知的是放射標記或突光標記等。
[0856]與在候選競爭抗原結合分子締合體的不存在下實施的對照試驗中得到的結合活性進行比較，競爭抗原結合分子只要可以阻斷至少20%、優(yōu)選至少20-50%、進一步優(yōu)選至少50%的含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子的結合，則該被測抗原結合分子是與競爭抗原結合分子實質(zhì)上結合于相同表位、或者競爭結合于相同的表位的抗原結合分子。
[0857]在鑒定含有針對IgA的抗原結合結構域的被測抗原結合分子所結合的表位的結構時，被測抗原結合分子與對照抗原結合分子是否共有表位，這能夠通過比較兩抗原結合分子對在構成該表位的肽中導入氨基酸突變而得的肽的結合活性來進行評價。
[0858]作為這種測定結合活性的方法，例如，在上述ELISA形式中，可通過比較被測抗原結合分子和對照抗原結合分子對導入了突變的線性肽的結合活性來測定。作為ELISA以外的方法，通過使被測抗原結合分子與對照抗原結合分子流過該柱后，對洗脫液中洗脫的抗原結合分子進行定量，也可以測定對結合于柱的該突變肽的結合活性。使突變肽作為例如與GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0859]另外，在細胞上表達的抗原中的鑒定的表位為立體表位時，被測抗原結合分子與對照抗原結合分子是否共有表位，這例如可通過如下所述的方法來評價。以抗原為IgE的情形為例，以下進行說明。首先，制備表達IgE的細胞和表達在表位中導入了突變的IgE的細胞。將這些細胞懸浮于PBS等適當?shù)木彌_液中，向所得細胞懸浮液中添加被測抗原結合分子和對照抗原結合分子。接著，用合適的緩沖液清洗，向所得細胞懸浮液中添加能夠識別被測抗原結合分子和對照抗原結合分子的經(jīng)FITC標記的抗體。被標記抗體染色的細胞的熒光強度和細胞數(shù)通過 FACSCalibur (BD公司)來測定。被測抗原結合分子和對照抗原結合分子的濃度通過合適的緩沖液適當稀釋，由此可以制備成所期望的濃度來使用。例如，能夠以10 μ g/ml至10ng/ml之間的任意濃度使用。標記抗體對該細胞的結合量被反映為使用CELLQUEST軟件(BD公司)進行分析而得到的熒光強度、即幾何平均值。即，通過得到該幾何平均值，可以測定由標記抗體的結合量表示的被測抗原結合分子和對照抗原結合分子的結合活性。
[0860]本方法中，例如“實質(zhì)上不與突變IgE表達細胞結合”可通過以下方法判斷。首先，用標記抗體染色與表達突變IgE的細胞結合的被測抗原結合分子和對照抗原結合分子。接著，檢測細胞的熒光強度。熒光檢測中使用作為流式細胞儀的FACSCalibur時，所得的熒光強度可以使用CELLQUEST軟件進行分析。由多肽締合體存在下和不存在下的幾何平均值，通過下述計算式計算該比較值(AGeo-Mean)，由此可以求出抗原結合分子的結合造成的熒光強度的增加比例。
[0861]Δ Geo-Mean = Geo-Mean (多肽締合體存在下)/Geo-Mean (多肽締合體不存在下)
[0862]將通過分析得到的、反映被測抗原結合分子對突變IgE表達細胞的結合量的幾何平均比較值(突變IgE分子AGeo-Mean值)與反映被測抗原結合分子對IgE表達細胞的結合量的AGeo-Mean比較值進行比較。此時，計算相對于突變IgE表達細胞和IgE表達細胞的AGeo-Mean比較值時使用的被測抗原結合分子的濃度特別優(yōu)選制備成彼此相同或者實質(zhì)上相同的濃度。預先確定了識別IgE中的表位的抗原結合分子被用作對照抗原結合分子。
[0863]被測抗原結合分子相對于突變IgE表達細胞的AGeo-Mean比較值只要小于被測抗原結合分子相對于IgE表達細胞的AGeo-Mean比較值的至少80%、優(yōu)選50%、進一步優(yōu)選30%、特別優(yōu)選15%，則認為“實質(zhì)上不與突變IgE表達細胞結合”。計算Geo-Mean值(幾何平均)的計算式記載于CELL QUEST軟件用戶指南(BD b1sciences公司)。通過將比較值進行比較，只要是能夠將其實質(zhì)上視為相同的程度，則能夠評價被測抗原結合分子與對照抗原結合分子的表位相同。
_4] 抗原結合結構域
[0865]本說明書中，“抗原結合結構域”只要與目標抗原結合，則可以使用任意結構的結構域。作為這類結構域的實例，例如可以列舉:抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)、生物體內(nèi)存在的細胞膜蛋白Avimer中所含的35個氨基酸左右的被稱為A結構域的組件(國際公開第TO2004/044011號、國際公開第W02005/040229號)、含有與在細胞膜表達的糖蛋白即纖連蛋白中的蛋白結合的結構域即10Fn3結構域的Adnectin(國際公開第W02002/032925號)、以構成蛋白A的包含58個氨基酸的3個螺旋束(bundle)的IgG結合結構域為構架的Affibody(國際公開第W01995/001937號)、具有含33個氨基酸殘基的轉角和2個反向平行螺旋以及環(huán)的亞基重復重疊而成的結構的錨蛋白重復序列(ankyrin repeat:AR)的分子表面露出的區(qū)域 DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins)(國際公開第W02002/020565號)、支持嗜中性粒細胞明膠酶結合脂質(zhì)運載蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂質(zhì)運載蛋白分子中高度保守的8個反向平行鏈在中央方向扭曲的桶結構的單側的4個環(huán)區(qū)域Anticalin等(國際公開第W02003/029462號)、作為七鰓鰻、八目鰻等無顎類的獲得性免疫系統(tǒng)且不具有免疫球蛋白結構的可變性淋巴細胞受體(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸殘基重復(leucine-rich-repea t (LRR))組件反復重疊而成的馬蹄鐵形的結構內(nèi)部的平行型片層結構的凹陷區(qū)域(國際公開第W02008/016854號)。作為本發(fā)明的抗原結合結構域的優(yōu)選實例，可以列舉含有抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的抗原結合結構域。作為這種抗原結合結構域的實例，優(yōu)選列舉“scFv (單鏈Fv) ”、“單鏈抗體”、^’、“8。?￥2(單鏈？￥2) ”、“Fab”或“F(ab，)2” 等。
[0866]本發(fā)明的抗原結合分子中的抗原結合結構域可以與相同的表位結合。這里，相同的表位可以存在于例如包含SEQ ID N0:2所記載的氨基酸序列的蛋白中?；蛘撸景l(fā)明的抗原結合分子中的抗原結合結構域可以與彼此不同的表位結合。這里，不同的表位可以存在于例如包含SEQ ID N0:2所記載的氨基酸序列的蛋白中。
[0867]免疫復合休(Tmmune complex)
[0868]免疫復合體是指，至少一個抗原和至少一個抗原結合分子相互結合形成分子量更大的復合體時產(chǎn)生的比較穩(wěn)定的結構。作為免疫復合體的一個非限定性方案，例示抗原-抗體聚集體。在本說明書中，評價包含兩個以上抗原結合分子和兩個以上抗原結合單元的免疫復合體的形成的方法見后述。
[0869]特異件
[0870]特異性是指特異性結合的分子中的一個分子對于它的一個或多個結合對象分子以外的分子不顯示任何顯著性結合的狀態(tài)。另外，也可用于抗原結合結構域對某抗原中所含的多個表位中特定的表位是特異性的情形。另外，在多個不同的抗原中含有抗原結合結構域所結合的表位時，具有該抗原結合結構域的抗原結合分子可以與含有該表位的各種抗原結合。這里，不顯示任何顯著性結合是指，對于該對象分子以外的分子，顯示出對該對象分子的結合活性的50%以下、通常為30%以下、優(yōu)選15%以下、特別優(yōu)選10%以下、進一步優(yōu)選5%以下的結合活性。
[0871]
[0872]本說明書中，抗體是指天然的免疫球蛋白或者通過部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗體可從其天然存在的血衆(zhòng)或血清等天然資源或產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清中分離得到，或者通過使用基因重組等方法而部分或完全地合成。作為抗體的實例，優(yōu)選列舉免疫球蛋白的同種型和這些同種型的亞型。作為人的免疫球蛋白，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgD、IgE、IgM這9種類型(同種型)。本發(fā)明的抗體中可包含這些同種型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。作為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定區(qū)，由基因多態(tài)性形成的多個同種異型序列記載在Sequences of proteins of immunologicalinterest, NIH Publicat1n N0.91-3242中，但在本發(fā)明中可以是其中的任一種。特別是，作為人IgGl的序列，以EU編號表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。另外，作為人IgK (Kappa)恒定區(qū)和人IgX (Lambda)恒定區(qū)，由基因多態(tài)性形成的多個同種異型序列記載在 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publicat1nN0.91-3242中，但在本發(fā)明可以是其中的任一種。
[0873]制作具有所期望的結合活性的抗體的方法對本領域技術人員來說是公知的。以下例示與IgA結合的抗體(抗IgA抗體)的制作方法。與IgA以外的抗原結合的抗體也可以根據(jù)下述例示而適當制作。
[0874]抗IgA抗體可以使用公知的方法以多克隆或單克隆抗體的形式獲得。作為抗IgA抗體，可優(yōu)選制作來源于哺乳動物的單克隆抗體。來源于哺乳動物的單克隆抗體包含:由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體、和利用基因工程技術通過用含有抗體基因的表達載體進行了轉化的宿主細胞產(chǎn)生的單克隆抗體等。需要說明的是，本申請發(fā)明的單克隆抗體包含“人源化抗體”或“嵌合抗體”。
[0875]產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以通過使用公知技術，例如如下制作。即，使用IgA蛋白作為致敏抗原，按照通常的免疫方法來免疫哺乳動物。通過通常的細胞融合法，將所得免疫細胞與公知的親本細胞融合。接著，通過通常的篩選方法篩選單克隆抗體產(chǎn)生細胞，由此可以選擇出產(chǎn)生抗IgA抗體的雜交瘤。
[0876]具體而言，單克隆抗體的制作例如如下進行。例如，純化的天然IgA蛋白可以用作致敏抗原。另外，為了從培養(yǎng)上清中獲得可溶型IgA，而純化在MGT/GENE-DB中以L00022|IGHE*02的形式記載的、由以SEQ ID NO:2表示的IgA多肽序列構成的重組蛋白。為了表達重組蛋白，首先，表達其核苷酸序列公開在SEQ ID N0:3中的IgA重鏈恒定區(qū)基因，由此可得到由SEQ ID N0:2表示的IgA蛋白，其用作致敏抗原用于抗體制備。即，將編碼IgA的基因序列插入公知的表達載體，由此轉化適當?shù)乃拗骷毎?。以公知的方法從該宿主細胞中或培養(yǎng)上清中純化所期望的IgA蛋白。表達IgA重鏈恒定區(qū)基因時，可以將SEQID N0:3中記載的多核苷酸序列有效連接在信號序列的3’末端。另外，在另一非限定性方案中，可以在編碼5’末端包含信號序列的重鏈可變區(qū)的多核苷酸序列的3’末端有效連接SEQ ID N0:3中記載的多核苷酸序列。另外，為了純化重組蛋白，可以在SEQ ID N0:2的氨基末端或羧基末端添加用于進行適當純化的標簽肽。作為這種例子的一個非限定性方案，可以列舉經(jīng)由GGGGS (SEQ ID NO: 31)接頭連接的作為Avi標簽的GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ IDNO:4)等。作為如上所述的重組蛋白的非限定性制作例，可以列舉下述方法:從重組宿主細胞的培養(yǎng)液中回收如實施例1中記載的與輕鏈組合表達的重組IgA蛋白后進行純化。
[0877]作為用于免疫哺乳動物的致敏抗原，可使用該純化IgA蛋白。IgA的部分肽也可以用作致敏抗原。此時，該部分肽也可以根據(jù)人IgA的氨基酸序列通過化學合成獲得。另外，也可以通過將一部分IgA基因插入到表達載體中使其表達來獲得。進而，還可以使用蛋白分解酶分解IgA蛋白來獲得，但用作部分肽的IgA肽的區(qū)域和大小并不特別限于特定的方案。對于優(yōu)選的區(qū)域，可以從SEQ ID N0:2的氨基酸序列中選擇任意的序列。構成作為致敏抗原的肽的氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為至少5個以上、例如6個以上、或7個以上。更具體而言，可以將8~50、優(yōu)選10~30個殘基的肽用作致敏抗原。
[0878]另外，也可以將IgA蛋白的所期望的部分多肽或肽與不同的多肽進行融合而得的融合蛋白用作致敏抗原。為了制造用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以優(yōu)選利用抗體的Fe片段或肽標簽等。表達融合蛋白的載體可如下制作:將編碼所期望的兩種或更多的多肽片段的基因框內(nèi)融合，將該融合基因如上所述地插入表達載體中。融合蛋白的制作方法記載于 Molecular Cloning 第 2 版.(Sambrook, J 等人，Molecular Cloning 第 2版，9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)。用作致敏抗原的 IL-6 受體的獲得方法和使用它的免疫方法也具體記載于PCT/JP2011/077619等中。
[0879]作為用該致敏抗原免疫的哺乳動物，并不限定于特定的動物，優(yōu)選考慮與細胞融合中使用的親本細胞的適應性來選擇。通常優(yōu)選使用嚙齒類的動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔、猴等。
[0880]按照公知的方法將上述動物用致敏抗原免疫。例如，作為通常的方法，通過注射將致敏抗原給予至哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下來實施免疫。具體而言，將用PBS(磷酸緩沖鹽水(Phosphate-Buffered Saline))或生理鹽水等以適當稀釋倍率稀釋的致敏抗原根據(jù)需要與通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑混合，在乳化后將該致敏抗原對哺乳動物每4至21日給予數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時可以使用適當?shù)妮d體。特別是將分子量小的部分肽用作致敏抗原時，有時希望將與白蛋白、匙孔血藍蛋白等載體蛋白結合的該致敏抗原肽進行免疫。
[0881]另外，產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤可通過使用DNA免疫，如下所示來制作。DNA免疫是指下述免疫方法:被給予了以能在免疫動物中表達編碼抗原蛋白的基因的方式構建的載體DNA的該免疫動物中，致敏抗原在該免疫動物的生物體內(nèi)表達，由此賦予免疫刺激。與將蛋白抗原給予免疫動物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下的優(yōu)越性:
[0882]-抗原為膜蛋白時，能夠維持膜蛋白的結構而賦予免疫刺激；
[0883]-無需純化免疫抗原。
[0884]為了通過DNA免疫獲得本發(fā)明的單克隆抗體，首先，對免疫動物給予表達IgA蛋白的DNA。編碼IgA的DNA可通過PCR等公知方法合成。將所得DNA插入適當?shù)谋磉_載體中，給予免疫動物。作為表達載體，可優(yōu)選利用例如PCDNA3.1等市售的表達載體。作為將載體給予生物體的方法，可采用通常所使用的方法。例如，將吸附有表達載體的金顆粒用基因槍導入免疫動物個體的細胞內(nèi)，由此進行DNA免疫。進而，識別IgA的抗體的制作也可以采用PCT/JP2011/077619中記載的方法來制作。
[0885]如此地將哺乳動物免疫，確認血清中與IgA結合的抗體效價上升后，從哺乳動物采集免疫細胞用于細胞融合。作為優(yōu)選的免疫細胞，特別可使用脾細胞。
[0886]作為與上述免疫細胞融合的細胞,可使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優(yōu)選具備用于篩選的適當?shù)倪x擇標志物。選擇標志物是指能夠(或者不能)在特定培養(yǎng)條件下存活的形態(tài)。選擇標志物中，公知的是次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶缺陷(以下簡稱為HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下簡稱為TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的細胞具有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下簡稱為HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞不能在HAT選擇培養(yǎng)基中進行DNA合成而會死亡，但若與正常細胞發(fā)生融合，則可利用正常細胞的補救途徑繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也會增殖。
[0887]HGPRT缺陷或TK缺陷的細胞各自可通過含有6-硫代鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5’ -溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基來選擇。DNA中整合有這些嘧啶類似物的正常細胞會死亡。而無法整合這些嘧啶類似物的缺乏上述酶的細胞則可以在選擇培養(yǎng)基中存活。此外，被稱為G418抗性的選擇標志物可通過新霉素抗性基因賦予針對2-脫氧鏈霉胺系抗生素(慶大霉素類似物)的抗性。細胞融合中優(yōu)選的各種骨髓瘤細胞是公知的。
[0888]作為這類骨髓瘤細胞，例如可優(yōu)選使用:P3 (P3 X 63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4), 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microb1logyand Immunology (1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976)6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976)8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2)，1-21)、S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0889]基本上，根據(jù)公知的方法，例如Kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73, 3-46)等，進行上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
[0890]更具體而言，例如，可以在細胞融合促進劑的存在下、在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中實施上述細胞融合。作為融合促進劑，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等，為了進一步提高融合效率，根據(jù)期望添加二甲基亞砜等助劑后使用。
[0891]免疫細胞與骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，相對于骨髓瘤細胞，優(yōu)選使免疫細胞達到I至10倍。作為用于上述細胞融合的培養(yǎng)液，使用例如適于上述骨髓瘤細胞株的增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液以及用于此種細胞培養(yǎng)的通常的培養(yǎng)液，進而可優(yōu)選添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
[0892]關于細胞融合，將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中以規(guī)定量充分混合，將預先加熱至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量為1000至6000左右)通常以30至60% (w/v)的濃度添加。通過緩緩地混合混合液，形成所期望的融合細胞(雜交瘤)。接著，依次添加上述列舉的適當?shù)呐囵B(yǎng)液，通過重復進行離心除去上清的操作，可以除去對雜交瘤的生長不利的細胞融合劑等。
[0893]如此操作得到的雜交瘤可通過用通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)進行培養(yǎng)來選擇。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可持續(xù)足夠除所期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間(通常，所述足夠的時間為數(shù)天至數(shù)周)。接著，通過通常的有限稀釋方法，實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0894]如此操作得到的雜交瘤可通過使用對應于用于細胞融合的骨髓瘤所具有的選擇標志物的選擇培養(yǎng)液來進行選擇。例如，具有HGPRT或TK缺陷的細胞可以通過用HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)培養(yǎng)來進行選擇。即，在細胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤細胞時，在HAT培養(yǎng)液中，與正常細胞的細胞融合成功了的細胞可選擇性地增殖。使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)可以持續(xù)足夠除所期望的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的時間。具體而言，通常通過數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇所期望的雜交瘤。接著，可通過通常的有限稀釋法實施產(chǎn)生所期望抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
[0895]所期望抗體的篩選和單克隆優(yōu)選可通過公知的基于抗原抗體反應的篩選方法來實施。例如,可以根據(jù)ELISA的原理來評價抗體對固定化的IgA的結合活性。例如,將IgA固定于ELISA板的孔中。使雜交瘤的培養(yǎng)上清與孔內(nèi)的IgA接觸，檢測與IgA結合的抗體。單克隆抗體來源于小鼠時，與細胞結合的抗體可通過抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。通過這些篩選選擇出的、產(chǎn)生對抗原具有結合能力的所期望的抗體的雜交瘤可以通過有限稀釋法等進行克隆。
[0896]如此操作而制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。另外，該雜交瘤可以在液氮中長期保存。
[0897]按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，可從其培養(yǎng)上清中獲得所期望的單克隆抗體?；蛘?，可以將雜交瘤給予和其具有相容性的哺乳動物并使其增殖，從其腹水中獲得單克隆抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體。
[0898]也可以優(yōu)選使用由從該雜交瘤等抗體產(chǎn)生細胞克隆的抗體基因編碼的抗體。將克隆的抗體基因插入適當?shù)妮d體中，再導入宿主中，由此表達由該基因編碼的抗體。用于抗體基因的分離、向載體中的導入、以及宿主細胞的轉化的方法已經(jīng)由例如Vandamme等人確立(Eur.J.B1chem.(1990) 192 (3)，767-775)。另外，如下所述重組抗體的制造方法也是公知的。
[0899]例如，由產(chǎn)生抗IgA抗體的雜交瘤細胞獲得編碼抗IgA抗體的可變區(qū)(V區(qū))的cDNA。為此，通常首先從雜交瘤中提取總RNA。作為用于從細胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。
[0900]-胍超離心法(B1chemistry(1979) 18 (24)，5294-5299)；
[0901]-AGPC 法(Anal.B1chem.(1987) 162(1), 156-159)。
[0902]所提取的mRNA可使用mRNA純化試劑盒(GE HealthcareB1science制)等進行純化。或者，還市售有象QuickPrep mRNA純化試劑盒(GE Healthcare B1science制)等用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒。使用這種試劑盒，可由雜交瘤獲得mRNA。使用逆轉錄酶，可由所得mRNA合成編碼抗體V區(qū)的cDNA。cDNA可通過AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(生化學工業(yè))等合成。另外，為了 cDNA的合成和擴增，可以適當采用使用了SMART RACE cDNA 擴增試劑盒(Clontech 制)和 PCR 的 5，-RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1988)85 (23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989) 17 (8)，2919-2932)。進而，可以在這種cDNA的合成過程中向cDNA的兩末端導入后述適合的限制酶位點。
[0903]由所得PCR產(chǎn)物純化出目標cDNA片段，接著與載體DNA連接。如此制作重組載體，并導入大腸桿菌等中，選擇集落后，可以由形成該集落的大腸桿菌制備所期望的重組載體。而且，關于該重組載體是否具有目標cDNA的核苷酸序列，這可以通過公知的方法、例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等來確認。
[0904]為了獲得編碼可變區(qū)的基因，簡便的是利用5’ -RACE法，其中使用了可變區(qū)基因擴增用的引物。首先，以從雜交瘤細胞中提取的RNA為模板合成cDNA，獲得5’ -RACE cDNA文庫。在5’ -RACE cDNA文庫的合成中可適當?shù)厥褂肧MART RACE cDNA擴增試劑盒等市售的試劑盒。
[0905]以所得的5’_RACE cDNA文庫為模板，通過PCR法擴增抗體基因。根據(jù)公知的抗體基因序列，可設計小鼠抗體基因擴增用的引物。這些引物根據(jù)免疫球蛋白的亞類而具有不同的核苷酸序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠單克隆抗體同種型分型試劑盒(RocheDiagnostics)等市售試劑盒來預先確定亞類。
[0906]具體而言，例如為了獲得編碼小鼠IgG的基因時，可以使用下述引物，其能夠擴增編碼作為重鏈的Y 1、Y 2a> Y 2b> Y 3、作為輕鏈的κ鏈和λ鏈的基因。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，通常3’側的引物使用會退火到相當于接近可變區(qū)的恒定區(qū)的部分上的引物。而5’側的引物則使用5’ RACEcDNA文庫制作試劑盒所附帶的引物。
[0907]使用如此擴增而得到的PCR產(chǎn)物，可以重構由重鏈和輕鏈的組合構成的免疫球蛋白。將經(jīng)重構的免疫球蛋白針對IgA的結合活性作為指標，可篩選所期望的抗體。例如，為了獲得抗IgA的抗體時，進一步優(yōu)選抗體對IgA的結合是特異性的。與IgA結合的抗體例如可如下進行篩選:
[0908]步驟⑴，使包含由雜交瘤獲得的cDNA所編碼的V區(qū)的抗體與IgA接觸；
[0909]步驟⑵，檢測I gA與抗體的結合；以及
[0910]步驟(3),選擇與IgA表達細胞結合的抗體。
[0911]檢測抗體與IgA的結合的方法是公知的。具體而言，通過之前所述的ELISA等方法，可檢測出抗體與IL-6R表達細胞的結合。
[0912]作為以結合活性為指標的抗體的篩選方法，還優(yōu)選采用淘選法，其利用了噬菌體載體。由多克隆抗體表達細胞群以重鏈和輕鏈的亞類的文庫形式獲得抗體基因時，有利的是利用噬菌體載體的篩選方法。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因通過用適當?shù)慕宇^序列連接，可形成單鏈Fv(ScFv)。通過將編碼scFv的基因插入噬菌體載體中，可以獲得在表面表達scFv的噬菌體。該噬菌體與所期望的抗原接觸后，回收與抗原結合的噬菌體，從而可以回收編碼具有目標結合活性的scFv的DNA。根據(jù)需要重復該操作，從而可以濃縮具有所期望的結合活性的scFv。
[0913]得到目標的編碼抗IgA抗體V區(qū)的cDNA后，該cDNA被識別插入該cDNA的兩末端的限制酶位點的限制酶消化。優(yōu)選的限制酶會識別并消化在構成抗體基因的核苷酸序列中出現(xiàn)的頻率低的核苷酸序列。進而，為了將I拷貝的消化片段以正確方向插入載體中，優(yōu)選插入能提供粘性末端的限制酶。將如上消化的編碼抗IgA抗體V區(qū)的cDNA插入適當?shù)谋磉_載體中，由此可獲得抗體表達載體。此時，只要將編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因和編碼上述V區(qū)的基因框內(nèi)融合，則可獲得嵌合抗體。這里，嵌合抗體是指恒定區(qū)和可變區(qū)的來源不同。因此，除了小鼠-人等異種嵌合抗體之外，人-人同種嵌合抗體也包含在本發(fā)明的嵌合抗體中。通過在預先具有恒定區(qū)的表達載體中插入上述V區(qū)基因，可以構建嵌合抗體表達載體。具體而言，例如，可在保持有編碼所期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA的表達載體的5’側適當?shù)嘏渲孟鲜鯲區(qū)基因的限制酶的限制酶識別序列。對經(jīng)相同組合的限制酶消化的兩者進行框內(nèi)融合，由此構建嵌合抗體表達載體。
[0914]為了制造抗IgA單克隆抗體，以在表達調(diào)控區(qū)的調(diào)控下進行表達的方式，將抗體基因插入表達載體中。用于表達抗體的表達調(diào)控區(qū)包含例如增強子或啟動子。另外，可以在氨基末端添加合適的信號序列，以使表達的抗體分泌到細胞外。在后述實施例中，作為信號序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)的肽，除此之外也可以添加合適的信號序列。表達的多肽在上述序列的羧基末端部分被切斷，被切斷的多肽能夠以成熟多肽的形式分泌到細胞外。接著，用該表達載體轉化適當?shù)乃拗骷毎?，由此可以獲得表達編碼抗IgA抗體的DNA的重組細胞。
[0915]為了表達抗體基因，編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA被分別整合于其他的表達載體中。通過用整合有H鏈和L鏈的載體共轉化(co-transfect)成相同的宿主細胞，可以表達具備H鏈和L鏈的抗體分子?；蛘撸瑢⒕幋aH鏈和L鏈的DNA插入單一表達載體中，從而可以轉化宿主細胞(參照國際公開第WO 1994/011523號)。
[0916]用于將分離的抗體基因導入適當?shù)乃拗髦衼碇谱骺贵w的宿主細胞和表達載體的多個組合是公知的。這些表達系統(tǒng)均可用于分離本發(fā)明的抗原結合分子。將真核細胞用作宿主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體而言，動物細胞可例示下述細胞。
[0917](I)哺乳動物細胞:CH0(中國倉鼠卵巢細胞株)、C0S (猴腎細胞株)、骨髓瘤(Sp2/O、NSO等)、BHK (幼倉鼠腎細胞株)、HEK293(攜帶已剪切腺病毒(Ad)OTNA的人胚腎細胞株)、PER.C6細胞(用5型腺病毒(Ad5)ElA和ElB基因轉化的人胚視網(wǎng)膜細胞株)、Hela、Vero、HEK293(攜帶已剪切腺病毒(Ad) OTNA的人胚腎細胞株)等(Current Protocols inProtein Science (May, 2001, Unit5.9, Table5.9.1))；
[0918](2)兩棲動物細胞:非洲爪蟾卵母細胞等；
[0919](3)昆蟲細胞:sf9、sf21、Tn5 等。
[0920]或者，作為植物細胞，公知有基于來源于煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬的細胞的抗體基因表達系統(tǒng)。在植物細胞的轉化中，可以適當使用進行了愈傷組織培養(yǎng)的細胞。
[0921]進而，作為真菌細胞，可以使用如下細胞:
[0922]-酵母:釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)屬、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等畢赤酵母屬；
[0923]-絲狀真菌:黑曲霉菌(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)屬。
[0924]另外，利用原核細胞的抗體基因表達系統(tǒng)也是公知的。例如，使用細菌細胞時，可適當利用大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌等細菌細胞。通過轉化向這些細胞中導入含有目標抗體基因的表達載體。通過在體外培養(yǎng)經(jīng)轉化的細胞，可以從該轉化細胞的培養(yǎng)物中獲得所期望的抗體。
[0925]除了上述宿主細胞之外，重組抗體的產(chǎn)生也可以利用轉基因動物。即，可以由導入有編碼所期望抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，抗體基因可以通過框內(nèi)插入編碼乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白的基因的內(nèi)部，而構建為融合基因。作為分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，再將該注入了的胚胎導入母山羊體內(nèi)。由接受了胚胎的山羊生出的轉基因山羊(或其后代)產(chǎn)生的乳汁中，能夠以與乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式獲得所期望的抗體。另外，為了使由轉基因山羊產(chǎn)生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以對轉基因山羊給予激素(B1/Technology (1994)，12(7)，699-702)。
[0926]對人給予本說明書中記載的抗原結合分子時，作為該抗原結合分子中的抗原結合結構域，可以適當采用來源于基因重組型抗體的抗原結合結構域，所述基因重組型抗體為了降低針對人的異源抗原性等目的已進行了人工修飾?；蛑亟M型抗體包含例如人源化(humanized)抗體等。這些修飾抗體可使用公知方法適當制造。
[0927]為了制作本說明書中記載的抗原結合分子的抗原結合結構域而使用的抗體的可變區(qū)通常由被4個構架區(qū)(FR)夾持的3個互補性決定區(qū)(complementarity-determiningreg1n ;⑶R)構成。⑶R實質(zhì)上是決定抗體結合特異性的區(qū)域。⑶R的氨基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR的氨基酸序列即便在具有不同結合特異性的抗體之間也往往顯示出高度的同源性。因此，通常認為可以通過CDR的移植來將某抗體的結合特異性移植到其它抗體中。
[0928]人源化抗體也被稱為重構(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動物例如小鼠抗體的⑶R移植到人抗體中的應用了⑶R移植技術(⑶R grafting technology)的人源化抗體等是公知的。用于獲得人源化抗體的通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重疊延伸PCR。重疊延伸PCR中，用于合成人抗體FR的引物中添加有編碼待移植小鼠抗體CDR的核苷酸序列。針對4個FR分別準備引物。通常，將小鼠CDR移植至人FR時，選擇與小鼠FR同源性高的人FR，但在維持CDR功能方面認為有利。即，通常優(yōu)選使用下述人FR，其包含與待移植小鼠CDR的相鄰FR氨基酸序列的同源性高的氨基酸序列。
[0929]另外，連接的核苷酸序列被設計成相互框內(nèi)連接。通過各引物單獨地合成人FR。其結果，得到各FR上添加有編碼小鼠CDR的DNA的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼小鼠CDR的核苷酸序列被設計成相互重疊。接著，使以人抗體基因為模板合成的產(chǎn)物的重疊CDR部分相互退火，進行互補鏈合成反應。通過該反應，人FR經(jīng)由小鼠⑶R序列來連接。
[0930]最終3個⑶R和4個FR連接得到的V區(qū)基因，通過會與其5’末端和3’末端發(fā)生退火并添加有適當?shù)南拗泼缸R別序列的引物而擴增出其全長。將如上得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA以進行框內(nèi)融合的方式插入表達載體中，由此可以制作人型抗體表達用載體。將該整合載體導入宿主中建立重組細胞后，培養(yǎng)該重組細胞，通過表達編碼該人源化抗體的DNA，在該培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體(參照歐州專利公開EP239400、國際公開第 W01996/002576 號)。
[0931]通過定性或者定量地測定并評價如上制作的人源化抗體對抗原的結合活性，可以優(yōu)選選擇人抗體FR，以便經(jīng)由⑶R連接時該⑶R形成良好的抗原結合位點。根據(jù)需要，也可以按照重構人抗體CDR形成合適的抗原結合位點的方式取代FR的氨基酸殘基。例如，可以應用將小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR中導入氨基酸序列的突變。具體而言，可以向會與FR發(fā)生退火的引物中導入部分核苷酸序列的突變。通過這類引物合成的FR中導入了核苷酸序列的突變。通過用上述方法測定并評價進行了氨基酸取代的突變型抗體對抗原的結合活性，可以選擇具有所期望的性質(zhì)的突變FR序列(CancerRes.，(1993)53，851-856)。
[0932]此外，將具有人抗體基因的全部組成成分的轉基因動物(參照國際公開W01993/012227, W01992/003918, W01994/002602, W01994/025585, W01996/034096、W01996/033735)作為免疫動物，通過DNA免疫可以獲得所期望的人抗體。
[0933]進而，使用人抗體文庫通過淘選法獲得人抗體的技術也是已知的。例如,人抗體的V區(qū)以單鏈抗體(scFv)的形式通過噬菌體展示法表達在噬菌體的表面?？梢赃x擇表達與抗原結合的scFv的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行分析，可以確定編碼與抗原結合的人抗體V區(qū)的DNA序列。確定與抗原結合的scFv的DNA序列后，將該V區(qū)序列與所期望的人抗體C區(qū)序列框內(nèi)融合后，插入適當?shù)谋磉_載體中，由此可以制作表達載體。將該表達載體導入上述列舉的適當?shù)谋磉_細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，從而可以獲得該人抗體。這些方法已經(jīng)公知(參照國際公開W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、W01993/019172、W01995/001438、W01995/015388)。
[0934]另外，作為獲得抗體基因的方法，除了上述方法外，還可適當?shù)厥褂萌鏐ernasconi等人(Science (2002) 298，2199-2202)或國際公開W02008/081008中記載的B細胞克隆(各抗體的編碼序列的鑒定和克隆、其分離、以及用于制備各抗體(特別是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的表達載體構建用的用途等)的方法。
[0935]EU編號和Kabat編號
[0936]根據(jù)本發(fā)明中使用的方法，分配給抗體的⑶R和FR的氨基酸位置依照Kabat規(guī)定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nat1nal Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區(qū)的氨基酸按照Kabat編號來表示，恒定區(qū)的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU編號來表不。
[0937]離子濃度條件
[0938]金屬離子濃度條件
[0939]在本發(fā)明的一個方案中，離子濃度是指金屬離子濃度。“金屬離子”是指屬于除了氫以外的堿金屬和銅族等第I族、堿土金屬和鋅族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、鐵族和鉬族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亞族的元素、以及銻、鉍、針等金屬元素的離子。金屬原子具有釋放出原子價電子而形成陽離子的性質(zhì)，稱之為離子化傾向。認為離子化傾向大的金屬富有化學活性。
[0940]作為本發(fā)明中優(yōu)選的金屬離子的實例，可以列舉鈣離子。鈣離子參與多種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，鈣離子參與骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收縮、白細胞的運動和吞噬等的活化、血小板的變形和分泌等的活化、淋巴細胞的活化、組胺的分泌等肥大細胞的活化、兒茶酚胺α受體或乙酰膽堿受體介導的細胞應答、胞吐作用、遞質(zhì)從神經(jīng)元末端的釋放、神經(jīng)元的軸漿流等。作為細胞內(nèi)的鈣離子受體，已知具有多個鈣離子結合位點、且認為在分子進化上來源于共同起源的肌鈣蛋白C、鈣調(diào)蛋白、小白蛋白、肌球蛋白輕鏈等，其結合模體也大多已知。例如，還熟知鈣黏蛋白結構域、鈣調(diào)蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2結構域、凝血蛋白因子IX所含的Gla結構域、脫唾液酸糖蛋白受體或甘露糖結合受體所含的C型凝集素、LDL受體所含的A結構域、膜聯(lián)蛋白、血小板反應蛋白3型結構域和EGF樣結構域。
[0941]本發(fā)明中，在金屬離子為鈣離子時，作為鈣離子濃度條件，可以列舉低鈣離子濃度條件和高鈣離子濃度條件。結合活性隨鈣離子濃度條件而變化是指，低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件的不同導致抗原結合分子對抗原的結合活性發(fā)生變化。例如可以列舉:高鈣離子濃度條件下抗原結合分子對抗原的結合活性高于低鈣離子濃度條件下抗原結合分子對抗原的結合活性的情形。此外還可以列舉:低鈣離子濃度條件下抗原結合分子對抗原的結合活性高于高鈣離子濃度條件下抗原結合分子對抗原的結合活性的情形。
[0942]本說明書中，高鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自100μΜ至1mM之間的濃度。此外，在其他方案中，可以是選自200 μ M至5mM之間的濃度。此外，在不同的方案中，可以是選自400μΜ至3mM之間的濃度，在其他的方案中也可以是選自200 μ M至2mM之間的濃度。進而，還可以是選自400μ M至ImM之間的濃度。特別優(yōu)選列舉選自與生物體內(nèi)血漿中(血中)的鈣離子濃度接近的500 μ M至2.5mM之間的濃度。
[0943]本說明書中，低鈣離子濃度并不特別限于統(tǒng)一的數(shù)值，可以是優(yōu)選選自0.ΙμΜ至30μΜ之間的濃度。此外，在其他方案中，可以是選自0.2μΜ至20μΜ之間的濃度。此外，在不同的方案中，可以是選自0.5μΜ至ΙΟμΜ之間的濃度，在其他的方案中也可以是選自I μ M至5 μ M之間的濃度。進而，還可以是選自2 μ M至4μ M之間的濃度。特別優(yōu)選列舉選自與生物體內(nèi)的早期核內(nèi)體內(nèi)的離子化鈣濃度接近的I μ M至5 μ M之間的濃度。
[0944]本發(fā)明中，低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性意指，抗原結合分子在選自0.1 μ M至30 μ M之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱于選自100μΜ至1mM之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性。優(yōu)選意指抗原結合分子在選自0.5μ M至10μ M之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱于在選自200μΜ至5mM之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性，特別優(yōu)選意指生物體內(nèi)的早期核內(nèi)體內(nèi)的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱于生物體內(nèi)的血漿中的鈣離子濃度下的抗原結合活性，具體意指抗原結合分子在選自ΙμΜ 至5μΜ之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性弱于在選自500 μ M至2.5mM之間的鈣離子濃度下的抗原結合活性。
[0945]抗原結合分子對抗原的結合活性是否隨金屬離子濃度條件而變化，這可以通過使用例如上述結合活性項目中記載的公知測定方法來確定。例如，為了確認與低鈣離子濃度條件下的抗原結合分子的抗原結合活性相比高鈣離子濃度條件下的抗原結合分子的抗原結合活性變得更高，對低鈣離子濃度和高鈣離子濃度條件下的抗原結合分子的抗原結合活性進行比較。
[0946]進而，本發(fā)明中，“低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性”的表述也可以表述為抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性高于在低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性。需要說明的是，本發(fā)明中有時也將“低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性”記載為“低鈣離子濃度條件下的抗原結合能力弱于高鈣離子濃度條件下的抗原結合能力”，此外，有時也將“使低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性”記載為“使低鈣離子濃度條件下的抗原結合能力弱于高鈣離子濃度條件下的抗原結合能力”。
[0947]本領域技術人員可以適當選擇測定抗原結合活性時的鈣離子濃度以外的條件，沒有特別限定。例如，可以在HEPES緩沖液、3 7 °C的條件下進行測定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等進行測定。關于抗原結合分子與抗原的結合活性的測定，在抗原為可溶型抗原時，通過對固定有抗原結合分子的芯片流過作為分析物的抗原，可以評價對可溶型抗原的結合活性；在抗原為膜型抗原時，通過對固定有抗原的芯片流過作為分析物的抗原結合分子，可以評價對膜型抗原的結合活性。
[0948]本發(fā)明的抗原結合分子中，只要低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性弱于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性，則低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性和高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性之比沒有特別限定，優(yōu)選相對于抗原的低鈣離子濃度條件下的KD (Dissociat1n constant:解離常數(shù))與高鈣離子濃度條件下的KD之比即KD (Ca3 μ M) /KD(Ca 2mM)的值為2以上，進一步優(yōu)選KD(Ca 3 μ M)/KD(Ca 2mM)的值為10以上，進一步優(yōu)選KD (Ca 3 μ M) /KD (Ca 2mM)的值為40以上。KD (Ca 3 μ M) /KD (Ca 2mM)的值的上限沒有特別限定，只要本領域技術人員的技術可以制作，則可以是400、1000、10000等任意的值。
[0949]作為抗原結合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用KD (解離常數(shù))，而在抗原為膜型抗原時可以使用表觀KD (Apparent dissociat1n constant:表觀解離常數(shù))。KD(解離常數(shù))和表觀KD(表觀解離常數(shù))可通過本領域技術人員公知的方法進行測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德圖(Scatchard plot)、流式細胞儀等。
[0950]此外，作為顯示本發(fā)明的抗原結合分子的低鈣濃度條件下的抗原結合活性與高鈣濃度條件下的抗原結合活性之比的其它指標，還可優(yōu)選使用例如解離速率常數(shù)kd (Dissociat1n rate constant:解離速率常數(shù))。代替KD (解離常數(shù))而使用kd (解離速率常數(shù))來作為顯示結合活性之比的指標時，相對于抗原的低鈣濃度條件下的kd(解離速率常數(shù))與高鈣濃度條件下的kd (解離速率常數(shù))之比kd(低鈣濃度條件)/kd(高鈣濃度條件)的值優(yōu)選為2以上，進一步優(yōu)選為5以上，進一步優(yōu)選為10以上，更優(yōu)選為30以上。對Kd(低鈣濃度條件)/kd(高鈣濃度條件)的值的上限沒有特別限定，只要本領域技術人員的技術常識可以制作，則可以是50、100、200等任意的值。
[0951]作為抗原結合活性的值，在抗原為可溶型抗原時可以使用kd(解離速率常數(shù))，而在抗原為膜型抗原時可以使用表觀kd (Apparent dissociat1n rate constant:表觀解離速率常數(shù))。kd (解離速率常數(shù))和表觀kd (表觀解離速率常數(shù))可通過本領域技術人員公知的方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞儀等。需要說明的是,本發(fā)明中，在測定不同鈣離子濃度下的抗原結合分子的抗原結合活性時，鈣濃度以外的條件優(yōu)選為相同。
[0952]例如，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(C)的抗原結合結構域或抗體的篩選來獲得:
[0953]步驟(a)，獲得低鈣濃度條件下的抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性；
[0954]步驟(b)，獲得高鈣濃度條件下的抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性；
[0955]步驟(C)，選擇低鈣濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子。
[0956]進而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(c)的抗原結合結構域或抗原結合分子或其文庫的篩選來獲得:
[0957]步驟(a)，在高鈣濃度條件下使抗原結合結構域或抗原結合分子或其文庫與抗原接觸；
[0958]步驟(b)，將在上述步驟(a)中與抗原結合的抗原結合結構域或抗原結合分子置于低鈣濃度條件下；
[0959]步驟(C)，對在上述步驟(b)中發(fā)生解離的抗原結合結構域或抗原結合分子進行分離。
[0960]此外，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(d)的抗原結合結構域或抗原結合分子或其文庫的篩選來獲得:
[0961]步驟(a)，在低鈣濃度條件下使抗原結合結構域或抗原結合分子的文庫與抗原接觸；
[0962]步驟(b)，選擇在上述步驟(a)中未與抗原結合的抗原結合結構域或抗原結合分子;
[0963]步驟(C)，使在上述步驟(b)中選擇的抗原結合結構域或抗原結合分子在高鈣濃度條件下與抗原結合；
[0964]步驟(d)，對在上述步驟(C)中與抗原結合的抗原結合結構域或抗原結合分子進行分離。
[0965]進而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(C)的篩選方法來獲得:
[0966]步驟(a)，在高鈣濃度條件下使抗原結合結構域或抗原結合分子的文庫與固定有抗原的柱接觸；
[0967]步驟(b)，將在上述步驟(a)中與柱結合的抗原結合結構域或抗原結合分子在低鈣濃度條件下從柱上洗脫；
[0968]步驟(C)，對在上述步驟(b)中被洗脫的抗原結合結構域或抗原結合分子進行分離。
[0969]進而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(d)的篩選方法來獲得:
[0970]步驟(a)，在低鈣濃度條件下使抗原結合結構域或抗原結合分子的文庫通過固定有抗原的柱；
[0971]步驟(b)，對在上述步驟(a)中未與柱結合而洗脫的抗原結合結構域或抗原結合分子進行回收；
[0972]步驟(C)，使在上述步驟(b)中回收的抗原結合結構域或抗原結合分子在高鈣濃度條件下與抗原結合；
[0973]步驟(d)，對在上述步驟(C)中與抗原結合的抗原結合結構域或抗原結合分子進行分離。
[0974]進而，作為本發(fā)明提供的一個方案的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子可通過包含以下步驟(a)~(d)的篩選方法來獲得:
[0975]步驟(a)，在高鈣濃度條件下使抗原結合結構域或抗原結合分子的文庫與抗原接觸；
[0976]步驟(b)，獲得在上述步驟(a)中與抗原結合的抗原結合結構域或抗原結合分子；
[0977]步驟(C)，將在上述步驟(b)中獲得的抗原結合結構域或抗原結合分子置于低鈣濃度條件下；
[0978]步驟(d)，對上述步驟(C)中抗原結合活性弱于上述步驟(b)中選擇的標準的抗原結合結構域或抗原結合分子進行分離。
[0979]需要說明的是，上述步驟可以重復兩次以上。因此，根據(jù)本發(fā)明可提供通過上述篩選方法中進一步包括將步驟(a)~(C)或步驟(a)~(d)重復兩次以上的步驟的篩選方法而獲得的低鈣離子濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣離子濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子。步驟(a)~(C)或步驟(a)~(d)的重復次數(shù)沒有特別限定，通常為10次以內(nèi)。
[0980]本發(fā)明的篩選方法中，低鈣濃度條件下的抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性只要是離子化鈣濃度為0.1 μ M~30 μ M之間的抗原結合活性則沒有特別限定，作為優(yōu)選的離子化鈣濃度，可以列舉0.5 μ M~10 μ M之間的抗原結合活性。作為更優(yōu)選的離子化鈣濃度，可以列舉生物體內(nèi)的早期核內(nèi)體內(nèi)的離子化鈣濃度，具體可以列舉I μ M~5 μ M下的抗原結合活性。另外，高鈣濃度條件下的抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性只要是離子化鈣濃度為100μΜ~1mM之間的抗原結合活性則沒有特別限定，作為優(yōu)選的離子化鈣濃度，可以列舉200 μ M~5mM之間的抗原結合活性。作為更優(yōu)選的離子化鈣濃度，可以列舉生物體內(nèi)的血漿中的離子化鈣濃度，具體可以列舉0.5mM~2.5mM時的抗原結合活性。
[0981]抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性可通過本領域技術人員公知的方法測定，關于離子化鈣濃度以外的條件，本領域技術人員可以適當決定。抗原結合結構域或抗原結合分子的抗原結合活性可以作為KD(Dissociat1n constant:解離常數(shù))、表M KD (Apparent dissociat1n constant:表觀解離常數(shù))、解離速率 kd (Dissociat1nrate:解離速率常數(shù))、或表觀kd (Apparent dissociat1n:表觀解離速率常數(shù))等來進行評價。它們可以通過本領域技術人員公知的方法來測定，例如可以使用Biacore (GEhealthcare)、斯卡查德圖、FACS等。
[0982]本發(fā)明中，選擇高鈣濃度條件下的抗原結合活性高于低鈣濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子的步驟，與選擇低鈣濃度條件下的抗原結合活性低于高鈣濃度條件下的抗原結合活性的抗原結合結構域或抗原結合分子的步驟含義相同。
[0983]只要高鈣濃度條件下的抗原結合活性高于低鈣濃度條件下的抗原結合活性，則對高鈣濃度條件下的抗原結合活性與低鈣濃度條件下的抗原結合活性之差沒有特別限定，優(yōu)選高鈣濃度條件下的抗原結合活性是低鈣濃度條件下的抗原結合活性的2倍以上，進一步優(yōu)選為10倍以上，更優(yōu)選為40倍以上。
[0984]通過上述篩選方法篩選的本發(fā)明的抗原結合結構域或抗原結合分子可以是任意的抗原結合結構域或抗原結合分子，例如，可以篩選上述的抗原結合結構域或抗原結合分子。例如，可以篩選具有天然序列的抗原結合結構域或抗原結合分子，也可以篩選氨基酸序列被取代的抗原結合結構域或抗原結合分子。
[0985]文座
[0986]根據(jù)一個方案，本發(fā)明的抗原結合結構域或抗原結合分子可以由文庫獲得，所述文庫主要由多個抗原結合分子形成，所述多個抗原結合分子的序列彼此不同，并且其抗原結合結構域中含有至少一個使抗原結合分子的抗原結合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸殘基。作為離子濃度的實例，優(yōu)選列舉金屬離子濃度或氫離子濃度。
[0987]本說明書中，“文庫”是指多個抗原結合分子或含有抗原結合分子的多個融合多肽、或編碼它們的序列的核酸、多核苷酸。文庫中所含的多個抗原結合分子或含有抗原結合分子的多個融合多肽的序列并非單一的序列，而是序列彼此不同的抗原結合分子或含有抗原結合分子的融合多肽。
[0988]本說明書中，序列彼此不同的多個抗原結合分子的記載中的“序列彼此不同”這一術語意指文庫中的各抗原結合分子的序列彼此不同。即，文庫中的彼此不同的序列的數(shù)量反映文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量，有時也被視為“文庫大小”。通常的噬菌體展示文庫為16至1012，通過使用核糖體展示法等公知的技術，可將文庫大小放大至1014。然而，噬菌體文庫的淘選選擇時使用的噬菌體顆粒的實際數(shù)目通常比文庫大小大10至10，000倍。該過量倍數(shù)也稱為“文庫當量數(shù)”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能夠存在10至10，000個。所以，本發(fā)明中的“序列彼此不同”這一術語意指文庫當量數(shù)除外的文庫中的各抗原結合分子的序列彼此不同，更具體意指序列彼此不同的抗原結合分子存在16至114個分子、優(yōu)選17至112個分子、進一步優(yōu)選18至111個分子、特別優(yōu)選18至101°個分子。
[0989]此外，本發(fā)明中的主要由多個抗原結合分子形成的文庫這一記載中的術語“多個”，對于例如本發(fā)明的抗原結合分子、融合多肽、多核苷酸分子、載體或病毒而言，通常是指這些物質(zhì)的兩種以上的集合。例如，只要某2個以上的物質(zhì)在特定形態(tài)方面彼此不同，則表示該物質(zhì)存在兩種以上。作為實例，可以列舉在氨基酸序列中的特定氨基酸位置觀察到的突變體氨基酸。例如，當除了柔性殘基以外或除了露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨基酸以外序列實質(zhì)上相同、且優(yōu)選存在序列相同的本發(fā)明的2個以上的抗原結合分子時，則存在多個本發(fā)明的抗原結合分子。在其他例子中，當除了編碼柔性殘基的堿基以外或除了編碼露出于表面的超變氨基酸位置的特定突變體氨基酸的堿基以外實質(zhì)上相同、且優(yōu)選存在序列相同的本發(fā)明的2個以上的多核苷酸分子時，則存在多個本發(fā)明中的多核苷酸分子。
[0990]進而，本發(fā)明中的主要由多個抗原結合分子形成的文庫的記載中的“主要由...形成”的表述反映出文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量中，抗原結合分子對抗原的結合活性隨離子濃度條件而不同的抗原結合分子的數(shù)量。具體而言，優(yōu)選顯示出這種結合活性的抗原結合分子在文庫中至少存在14個分子。此外，更優(yōu)選本發(fā)明的抗原結合結構域可由顯示出這種結合活性的抗原結合分子至少存在15個分子的文庫中獲得。進一步優(yōu)選本發(fā)明的抗原結合結構域可由顯示出這種結合活性的抗原結合分子至少存在16個分子的文庫中獲得。特別優(yōu)選本發(fā)明的抗原結合結構域可由顯示出這種結合活性的抗原結合分子至少存在17個分子的文庫中獲得。還優(yōu)選本發(fā)明的抗原結合結構域可由顯示出這種結合活性的抗原結合分子至少存在18個分子的文庫中獲得。在其它表述中，也可適當表述為在文庫中的序列不同的獨立克隆的數(shù)量中抗原結合分子對抗原的結合活性隨離子濃度條件而不同的抗原結合分子的比例。具體而言，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由顯示出這種結合活性的抗原結合分子占文庫中序列不同的獨立克隆的數(shù)量的0.1 %至80 %、優(yōu)選0.5%至60%、更優(yōu)選1%至40%、進一步優(yōu)選2%至20%、特別優(yōu)選4%至10%的文庫中獲得。融合多肽、多核苷酸分子或載體的情形也和上述相同，可以用分子的數(shù)量或全部分子中的比例來表述。此外，病毒的情形也和上述相同，可以用病毒個體的數(shù)量或全部個體中的比例來表述。
[0991]使抗原結合結構域的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸
[0992]通過上述篩選方法篩選的本發(fā)明的抗原結合結構域或抗原結合分子可以任意制備，例如，在金屬離子為鈣離子濃度的情況下，可以使用預先存在的抗原結合分子、預先存在的文庫(噬菌體文庫等)、由對動物進行免疫得到的雜交瘤或來自免疫動物的B細胞制得的抗體或文庫、向這些抗體或文庫中導入能螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突變而得到的抗體或文庫(能螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文庫、或者在特定位置導入能夠螯合鈣的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突變而得到的文庫等)等。
[0993]如上所述，作為使抗原結合分子的抗原結合活性隨離子濃度條件而變化的氨基酸的實例，例如，在金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結合模體的氨基酸即可，不論其種類如何。鈣結合模體為本領域技術人員所周知，并且有詳細記載(例如Springer等人(Cell (2000) 102，275-277) ；Kawasaki 和 Kretsinger(Protein Prof.(1995)2, 305-490)；Moncrief 等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562) ；Chauvaux 等人(B1chem.J.(1990)265, 261-265) ；Bairoch 和 Cox(FEBS Lett.(1990)269, 454-456) ；Davis(NewB1l.(1990) 2, 410-41 9) ;Schaefer 等人(Genomics (1995) 25，638 ~643) ;Economou 等人(EMB0J.(1990)9, 349-354) ;Wurzburg 等人(Structure.(2006) 14, 6, 1049-1058)) ? 即，本發(fā)明的抗原結合分子中可以含有ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知鈣結合模體。作為這種鈣結合模體的優(yōu)選實例，除了上述鈣結合模體之外，還可以列舉SEQ IDNO:6所記載的抗原結合結構域中所含的鈣結合模體。
[0994]此外，作為使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸的實例，也可優(yōu)選使用具有金屬螯合作用的氨基酸。作為具有金屬螯合作用的氨基酸的實例，優(yōu)選列舉例如絲氨酸(Ser(S))、蘇氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
[0995]含有上述氨基酸的抗原結合結構域的位置并不限于特定的位置，只要使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化，則可以是形成抗原結合結構域的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中的任意位置。即，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由重鏈的抗原結合結構域中含有使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。此外，在其他方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由重鏈的CDR3中含有該氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由重鏈的⑶R3的以Kabat編號表示的95位、96位、10a位和/或101位含有該氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。
[0996]此外，在本發(fā)明的一個方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的抗原結合結構域中含有使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。此外，在其他方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的CDRl中含有該氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的CDRl的以Kabat編號表示的30位、31位和/或32位含有該氨基酸、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。
[0997]此外，在其他方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的CDR2中含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。在其它方案中提供下述文庫，所述文庫主要由輕鏈的CDR2的以Kabat編號表示的50位含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。
[0998]進而，在其他方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的CDR3中含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。在其它方案中，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的CDR3的以Kabat編號表示的92位含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。
[0999]此外，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫作為本發(fā)明的不同方案來獲得，所述文庫主要由選自上述記載的輕鏈的⑶RU⑶R2和⑶R3中的2個或3個⑶R含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。進而，本發(fā)明的抗原結合結構域可以由下述文庫獲得，所述文庫主要由輕鏈的以Kabat編號表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上含有該氨基酸殘基、且序列彼此不同的抗原結合分子形成。
[1000]在特別優(yōu)選的實施方案中，理想的是抗原結合分子的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的構架序列具有人的種系構架序列。因此，在本發(fā)明的一個方案中，若構架序列完全為人的序列，則認為在給予人(例如疾病的治療)時，本發(fā)明的抗原結合分子基本或完全不會引起免疫原性反應。根據(jù)上述含義，本發(fā)明中的“含有種系序列”意指本發(fā)明的構架序列的一部分與任意的人的種系構架序列的一部分相同。例如，在本發(fā)明的抗原結合分子的重鏈FR2序列為多個不同的人的種系構架序列的重鏈FR2序列組合得到的序列時，該抗原結合分子也是本發(fā)明的“含有種系序列”的抗原結合分子。
[1001]作為構架的實例，例如優(yōu)選列舉現(xiàn)在已知的完全人型構架區(qū)的序列，其包含在V-Base (http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網(wǎng)站中。這些構架區(qū)的序列能夠適當用作本發(fā)明的抗原結合分子中所含的種系序列。種系序列可根據(jù)其相似性來分類(Tomlinson 等人(J.Mol.B1l.(1992) 227, 776-798) Williams 和 Winter (Eur.J.1mmunol.(1993)23，1456-1461)和 Cox 等人(Nat.Genetics (1994) 7, 162-168))?？梢詮姆诸悶?7 個亞類的Vk、分類為10個亞類的V λ、分類為7個亞類的VH中適當選擇合適的種系序列。
[1002]完全人型VH序列并不僅限于下述序列，優(yōu)選列舉例如VHl亞類(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亞類(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3 亞類(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亞類(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5 亞類(VH5-51)、VH6 亞類(VH6-1)、VH7 亞類(VH7-4、VH7_81)的 VH 序列等。它們也記載于公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998) 188, 1973-1975))等中，本領域技術人員可以根據(jù)它們的序列信息適當設計本發(fā)明的抗原結合分子。也可優(yōu)選使用它們以外的完全人型構架或構架的亞區(qū)域(sub-reg1n)。
[1003]完全人型Vk序列并不僅限于下述序列，例如優(yōu)選列舉:分類為Vkl亞類的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、018 ;分類為 Vk2 亞類的 Al、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ;分類為 Vk3 亞類的 All、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分類為 Vk4 亞類的 B3 ;分類為 Vk5亞類的B2(本說明書中也稱為Vk5-2);分類為Vk6亞類的A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.1mmunol.(2001)31, 1017-1028) ； Schab Ie 和 Zachau (B1l.Chem.HoppeSeyler (1993) 374, 1001-1022)和 Brensing-Kuppers 等人(Gene (1997) 191，173-181))。
[1004]完全人型的V λ序列并不僅限于下述序列，例如優(yōu)選列舉:分類為VLl亞類的Vl-2、Vl-3、Vl-4、Vl-5、Vl-7、Vl-9、Vl-1U Vl-13、Vl-16、Vl-17、Vl-18、Vl-19、V1-20、V1-22 ;分類為 VLl 亞類的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19 ;分類為 VL3 亞類的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分類為 VL4 亞類的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分類為 VL5 亞類的 V5-1、V5-2、V5-4、V5-6 等(Kawasaki 等人(Genome Res.(1997)7，250-261))。
[1005]通常，這些構架序列根據(jù)一個或更多的氨基酸殘基的區(qū)別而彼此不同。這些構架序列可以與本發(fā)明中的“使抗原結合分子的抗原結合活性隨離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基”一起使用。作為與本發(fā)明中的“使抗原結合分子的抗原結合活性隨離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基” 一起使用的完全人型構架的實例，并不僅限于此，另外還可以列舉 KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、POM 等(例如，上述的 Kabat 等人(1991)和 Wu 等人(J.Exp.Med.(1970) 132,211-250))。
[1006]本發(fā)明并不受特定理論的束縛，認為種系序列的使用有望排除大多數(shù)個體中的有害免疫應答的一個理由如下。通常的免疫應答中產(chǎn)生的親和性成熟步驟的結果造成免疫球蛋白的可變區(qū)頻繁地產(chǎn)生體細胞的突變。這些突變主要產(chǎn)生在其序列為超變的⑶R的附近，對構架區(qū)的殘基也造成影響。這些構架的突變在種系基因中不存在，而成為患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于種系基因所表達的構架序列的大多數(shù)，作為免疫耐受性的結果，預測這些種系構架在患者中的免疫原性低或為非免疫原性。為了使免疫耐受性的可能性達到最大，編碼可變區(qū)的基因可以從通常存在的功能性種系基因的集合中選擇。
[1007]為了制作本發(fā)明的、上述可變區(qū)序列的序列、重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的序列、或CDR序列或構架序列中含有使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的氨基酸的抗原結合分子，可以適當?shù)夭捎梦稽c特異性誘變法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82, 488-492))或重疊延伸PCR等公知方法。
[1008]例如，通過將被選擇作為預先含有使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基的構架序列的輕鏈可變區(qū)與被制作為隨機可變區(qū)序列文庫的重鏈可變區(qū)組合，可以制作含有本發(fā)明的多個序列彼此不同的抗原結合分子的文庫。作為這樣的非限定性實例，在離子濃度為鈣離子濃度時，例如優(yōu)選列舉:將SEQ IDN0:6(Vk5-2)所記載的輕鏈可變區(qū)序列和作為隨機可變區(qū)序列文庫而制作的重鏈可變區(qū)組合而成的文庫。
[1009]此外，也可以設計成上述被選擇作為預先含有使抗原結合分子的抗原結合活性隨鈣離子濃度條件而變化的至少一個氨基酸殘基的構架序列的輕鏈可變區(qū)的序列中含有作為該氨基酸殘基以外的殘基的各種氨基酸。在本發(fā)明中這樣的殘基也被稱為柔性殘基。本發(fā)明的抗原結合分子的抗原結合活性只要隨離子濃度條件而變化，則該柔性殘基的數(shù)目和位置并不限于特定的方案。即，重鏈和/或輕鏈的CDR序列和/或FR序列中可以含有一個或更多的柔性殘基。例如，在離子濃度為鈣離子濃度時，作為導入SEQ ID N0:6(Vk5-2)所記載的輕鏈可變區(qū)序列中的柔性殘基的非限定性實例，可以列舉表1或表2所記載的氨基酸殘基。
[1010][表1]
[1011]

【權利要求】
1.可形成免疫復合體的抗原結合分子的用于使該抗原從血漿中消失的應用，是指包含(i)Fe區(qū)和(ii)兩個以上的抗原結合結構域的抗原結合分子的應用，所述抗原結合結構域中的至少一個是對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域； 所述免疫復合體包含(a)兩分子以上的該抗原結合分子和(b)兩分子以上的抗原，其中，所述抗原包含兩個以上的抗原結合單元。
2.權利要求1所述的應用，其中，離子濃度條件為鈣離子濃度條件。
3.權利要求2所述的應用，其中，所述抗原結合結構域是在低鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性低于在高鈣離子濃度條件下對抗原的結合活性的抗原結合結構域。
4.權利要求1~3中任一項所述的應用，其中，離子濃度條件為pH條件。
5.權利要求4所述的應用，其中，所述抗原結合結構域是在pH酸性范圍對抗原的結合活性低于在PH中性范圍條件下對抗原的結合活性的抗原結合結構域。
6.權利要求1~5中任一項所述的應用，其中，包含兩個以上抗原結合單元的所述抗原為多聚體。
7.權利要求6所述的應用，其中，所述抗原為⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-a、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配體、TL2) 、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA(TNF-a 肌聯(lián)蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF_b LTa,TNFSFI),TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (0X40 配體 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8(CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD 137 配體)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL, TGF- a、TGF- β、泛特異性的TGF- β或IL-8中的任一種。
8.權利要求1~5中任一項所述的應用，其中，包含兩個以上抗原結合單元的所述抗原為單體。
9.權利要求1~8中任一項所述的應用，其中，抗原結合分子為多特異性或多互補位的抗原結合分子、或者抗原結合分子混合物。
10.權利要求1~9中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)分別為SEQID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)。
11.權利要求1~9中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在pH酸性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
12.權利要求11所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。
13.權利要求12所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸: . 238位氨基酸為Leu ； . 244位氨基酸為Leu ； . 245位氨基酸為Arg ； . 249位氨基酸為Pro ； . 250位氨基酸為Gln或Glu中的任一個；或者. 251位氨基酸為Arg、Asp、Glu或Leu中的任一個； . 252位氨基酸為Phe、Ser > Thr或Tyr中的任一個； . 254位氨基酸為Ser或Thr中的任一個； . 255位氨基酸為Arg、Gly、Ile或Leu中的任一個； .256 位氨基酸為 Ala 、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一個； . 257位氨基酸為Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一個； . 258位氨基酸為Asp ； . 260位氨基酸為Ser ； . 262位氨基酸為Leu ； .270位氨基酸為Lys ；. 272位氨基酸為Leu或Arg中的任一個；.279位氨基酸為 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 283 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr>Trp或Tyr中的任一個； . 285位氨基酸為Asn ； . 286位氨基酸為Phe ； . 288位氨基酸為Asn或Pro中的任一個； . 293位氨基酸為Val ； . 307位氨基酸為Ala、Glu、Gln或Met中的任一個； . 311位氨基酸為 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一個； . 309位氨基酸為Pro ； . 312位氨基酸為Ala、Asp或Pro中的任一個； . 314位氨基酸為Ala或Leu中的任一個； . 316位氨基酸為Lys ； . 317位氨基酸為Pro ；. 318位氨基酸為Asn或Thr中的任一個； . 332 位氨基酸為 Phe、His、Lys> Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一個； . 339位氨基酸為Asn、Thr或Trp中的任一個；. 341位氨基酸為Pro ； . 343 位氨基酸為 Glu、His、Lys> Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一個； . 375位氨基酸為Arg ； . 376位氨基酸為Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一個；. 377位氨基酸為Lys ； . 378位氨基酸為Asp、Asn或Val中的任一 個；. . 380位氨基酸為Ala、Asn、Ser或Thr中的任一個； . 382 位氨基酸為 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個； . 385位氨基酸為 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys> Ser 或 Thr 中的任一個； . 386位氨基酸為 Arg、Asp、lie、Lys> Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一個； . 387位氨基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一個； . 389位氨基酸為Asn、Pro或Ser中的任一個；. . 423位氨基酸為Asn ； . 427位氨基酸為Asn ； . 428位氨基酸為Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一個； . 430 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一個；. 431位氨基酸為His或Asn中的任一個； . 433位氨基酸為 Arg、Gin、His、lie、Lys> Pro 或 Ser 中的任一個； .434位氨基酸為 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 436 位氨基酸為 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys> Met 或 Thr 中的任一個； 438位氨基酸為Lys、Leu、Thr或Trp中的任一個； .440位氨基酸為Lys ;或者 . 442位氨基酸為Lys、308位氨基酸為lie、Pro或Thr中的任一個。
14.權利要求1~9中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在pH中性范圍條件下對FcRn的結合活性與SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的結合活性相比增強的Fe區(qū)。
15.權利要求14所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為下述Fe區(qū):在SEQID NO: 13、14、15或16中任一個所表示的Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸被取代的Fe區(qū):以EU編號表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
16.權利要求15所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為在SEQID NO: 13、14、15、或16中任一個所表不的Fe區(qū)的氨基酸序列中，以EU編號表不的選自以下的至少一個以上的氨基酸: . 237位氨基酸為Met ； . 248位氨基酸為Ile ； . 250 位氨基酸為 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個；. 252位氨基酸為Phe、Trp或Tyr中的任一個； .254位氨基酸為Thr ； . 255位氨基酸為Glu ； .256位氨基酸為Asp、Asn、Glu或Gln中的任一個； . 257 位氨基酸為 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr 或 Val 中的任一個； . 258位氨基酸為His ； . 265位氨基酸為Ala ； . 286位氨基酸為Ala或Glu中的任一個； .289位氨基酸為His ； . 297位氨基酸為Ala ； . 303位氨基酸為Ala ； .305位氨基酸為Ala ； . 307位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Val、Trp或Tyr中的任一個； . 308位氨基酸為 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一個； . 309位氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一個； . 311位氨基酸為Ala、His或Ile中的任一個； .312位氨基酸為Ala或His中的任一個； . 314位氨基酸為Lys或Arg中的任一個； .315位氨基酸為Ala、Asp或His中的任一個； .317位氨基酸為Ala ； .332位氨基酸為Val ； . 334位氨基酸為Leu ； . 360位氨基酸為His ； .376位氨基酸為Ala ； .380位氨基酸為Ala ； .382位氨基酸為Ala ； . 384位氨基酸為Ala ； . 385位氨基酸為Asp或His中的任一個； . 386位氨基酸為Pro ； . 387位氨基酸為Glu ； .389位氨基酸為Ala或Ser中的任一個； .424位氨基酸為Ala ； . 428位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr> Val、Trp或Tyr中的任一個； .433位氨基酸為Lys ； . 434位氨基酸為Ala、Phe、His、Ser> Trp或Tyr中的任一個；或者 . 436 位氛基酸為 His、lie、Leu> Phe> Thr 或 Val。
17.權利要求1~13中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)包含對Fe Y受體的結合活性比天然型人IgG的Fe區(qū)對Fe Y受體的結合活性高的Fe區(qū)。
18.權利要求17所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，選自以下的至少一個以上的氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸:以EU編號表示的221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位或440位。
19.權利要求18所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，包含以EU編號表示的選自以下的至少一個的氨基酸: 221位氨基酸為Lys或Tyr中的任一個； 222位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 223位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中的任一個； 224位氨基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一個； 225位氨基酸為Glu、Lys或Trp中的任一個； 227位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 228位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 230位氨基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一個； 231位氨基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一個； 232位氨基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一個； 233位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個； 234位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； 235位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； 236位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； 237位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個； 238位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；
239位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr>Val、Trp或Tyr中的任一個；. 240位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個；. 241位氨基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一個； . 243 位氨基酸為 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 244位氨基酸為His ； . 245位氨基酸為Ala ； .246位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； . 247 位氨基酸為 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個；. 249位氨基酸為Glu、His、Gln或Tyr中的任一個； . 250位氨基酸為Glu或Gln中的任一個； . 251位氨基酸為Phe ； . 254位氨基酸為Phe、Met或Tyr中的任一個； . 255位氨基酸為Glu、Leu或Tyr中的任一個； . 256位氨基酸為Ala、Met或Pro中的任一個； . 258位氨基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一個； . 260位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； . 262位氨基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一個； . 263位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； . 264位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一個； . 265位氨基酸為 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 266位氨基酸為Ala、lie、Met或Thr中的任一個； . 267位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr> Val、Trp或Tyr中的任一個； . 268位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Trp中的任一個； . 269位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個； . 270位氨基酸為 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr中的任一個； . 271位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .272位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個； . 273位氨基酸為Phe或Ile中的任一個； . 274 位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg> Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個；. 275位氨基酸為Leu或Trp中的任一個； . 276 位氨基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .278 位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、SerΛ ThrΛVal或Trp中的任一個； .279位氨基酸為Ala ； .280 位氨基酸為 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一個； .281位氨基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一個； .28.2位氨基酸為Glu、Gly、L ys、Pro或Tyr中的任一個； .28.3 位氨基酸為 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一個； .284位氨基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一個； .285位氨基酸為Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一個； .286位氨基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一個； .288位氨基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一個； .290位氨基酸為 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一個； .291位氨基酸為 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一個； .29.2位氨基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一個； .29.3位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一個； .294位氨基酸為 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個； .295位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .296位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr 或Val中的任一個； .297位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .298位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個； .299位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .300位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一個； .301位氨基酸為Asp、Glu、His或Tyr中的任一個； .30.2位氨基酸為Ile ； .30.3位氨基酸為Asp、Gly或Tyr中的任一個； .304位氨基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一個； .305位氨基酸為Glu、lie、Thr或Tyr中的任一個； .311位氨基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一個； .31.3位氨基酸為Phe ； .315位氨基酸為Leu;.317位氨基酸為Glu或Gln ； . 318位氨基酸為 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一個； .320 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 322 位氨基酸為 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .323位氨基酸為Ile ； . 324位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 325位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .326位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一個； . 327位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； . 328位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .329位氨基酸為 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； .330位氨基酸為 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一個； . 331位氨基酸為 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； . 332位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一個； .333位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或 Tyr中的任一個； .334位氨基酸為 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一個； . 335位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr中的任一個； .336位氨基酸為Glu、Lys或Tyr中的任一個； .337位氨基酸為Glu、His或Asn中的任一個； . 339 位氨基酸為 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一個； . 376位氨基酸為Ala或Val中的任一個； . 377位氨基酸為Gly或Lys中的任一個； . 378位氨基酸為Asp ； .379位氨基酸為Asn ； . 380位氨基酸為Ala、Asn或Ser中的任一個； .382位氨基酸為Ala或Ile中的任一個；385位氨基酸為Glu ； 392位氨基酸為Thr ； 396位氨基酸為Leu ； 421位氨基酸為Lys ；
427位氨基酸為Asn ； 428位氨基酸為Phe或Leu中的任一個； 429位氨基酸為Met ； 434位氨基酸為Trp ； 436位氨基酸為Ile ;或者 440位氨基酸為Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一個。
20.權利要求1~16中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)為對抑制型FeY受體的結合活性高于對活性型Fe Y受體的結合活性的Fe區(qū)。
21.權利要求20所述的應用，其中，所述抑制型FeY受體為人FcyRIIb。
22.權利要求20或21中任一項所述的應用，其中，所述活性型FeY受體為人FcyRIa、AFc Y RIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
23.權利要求20~22中任一項所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位或328位的氨基酸包含與天然型人IgG的Fe區(qū)的氨基酸不同的氨基酸。
24.權利要求23所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的以EU編號表示的238位氨基酸為Asp、或者328位氨基酸為Glu。
25.權利要求23或24所述的應用，其中，所述Fe區(qū)的氨基酸序列中，為以EU編號表示的選自以下的至少一個以上的氨基酸: 233位氨基酸為Asp ； 234位氨基酸為Trp或Tyr中的任一個； 237 位氨基酸為 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一個； 239位氨基酸為Asp ； 267位氨基酸為Ala、Gln或Val中的任一個； 268位氨基酸為Asn、Asp或Glu中的任一個； 271位氨基酸為Gly ； 326 位氨基酸為 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一個； 330位氨基酸為Arg、Lys或Met中的任一個； 323位氨基酸為lie、Leu或Met中的任一個；或者 296位氨基酸為Asp。
26.具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的篩選方法，該方法包括以下的步驟(a)~⑴: 步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域； 步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因； 步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接； 步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞攜帶在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因；步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子； 步驟(f)，使上述步驟(e)中得到的抗原結合分子與抗原接觸； 步驟(g)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成。
27.具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~(d): 步驟(a)，使包含F(xiàn)e區(qū)和兩個以上的抗原結合結構域的抗原結合分子與抗原接觸，所述抗原結合結構域中的至少一個是對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域； 步驟(b)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成； 步驟(C)，培養(yǎng)包含載體的宿主細胞，所述載體攜帶編碼在上述步驟(b)中確認到免疫復合體的形成的抗原結合分子的基因； 步驟(d)，從上述步驟(C)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
28.具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~⑴: 步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域； 步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因； 步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接； 步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞攜帶在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因； 步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子； 步驟(f)，使上述步驟(e)中得到的抗原結合分子與抗原接觸； 步驟(g)，評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成； 步驟(h)，培養(yǎng)包含載體的宿主細胞，所述載體攜帶編碼在上述步驟(g)中確認到免疫復合體的形成的抗原結合分子的基因； 步驟(i)，從上述步驟(h)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
29.具有使抗原從血漿中消失的功能的抗原結合分子的制備方法，該方法包括以下的步驟(a)~(e)，還包括如下步驟:使通過該制備方法得到的抗原結合分子與抗原接觸，以評價包含該抗原結合分子和該抗原的免疫復合體的形成； 步驟(a)，得到對抗原的結合活性隨離子濃度條件而變化的抗原結合結構域； 步驟(b)，得到編碼上述步驟(a)中選擇的抗原結合結構域的基因； 步驟(C)，將上述步驟(b)中得到的基因與編碼Fe區(qū)的基因進行有效連接； 步驟(d)，培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞攜帶在上述步驟(C)中進行了有效連接的基因； 步驟(e)，從上述步驟(d)中得到的培養(yǎng)液中分離抗原結合分子。
【文檔編號】C12N15/09GK104080909SQ201280068428
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權日:2011年11月30日
【發(fā)明者】井川智之, 廣庭奈緒香 申請人:中外制藥株式會社