生物合成1,3丁二烯的方法
【專利摘要】本申請描述了通過在丁二烯合成底物中形成兩個乙烯基而產(chǎn)生丁二烯的生物化學(xué)途徑。本申請描述的這些途徑依賴于用于最終酶促步驟的酶如甲羥戊酸二磷酸脫羧酶、異戊二烯合酶和脫水酶。
【專利說明】生物合成1,3 丁二烯的方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2011年12月2日提交的美國申請61/566, 085和2012年10月17日 提交的美國申請61/714, 883的優(yōu)先權(quán)，將其全部公開內(nèi)容并入本文作為參考。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及生物合成1，3- 丁二烯的方法，并且更具體地，涉及使用一種或者多種 分離的酶如去氫酶、單氧化酶、去飽和酶、脫水酶，和脫羧酶，或者使用表達(dá)這些酶中的一種 或者多種的重組宿主細(xì)胞合成1，3- 丁二烯。

【背景技術(shù)】
[0004] 1，3-丁二烯（下文稱為丁二烯）是用于生產(chǎn)合成橡膠（包括苯乙烯-丁二烯-橡 膠（SBR)、聚丁二烯（PB)、苯乙烯-丁二烯膠乳（SBL)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂 (ABS)、丁腈橡膠，和己二腈）的重要單體，其在制造Nylon-66 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)中使用。
[0005] 丁二烯通常作為蒸汽裂化過程的副產(chǎn)品產(chǎn)生，蒸餾成粗制丁二烯流，并經(jīng)萃取蒸 饋純化（White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)。
[0006] 除了其它方法之夕卜，有意的丁二烯也可通過以下方法制備：正丁烷和 正丁烯的脫氫（Houdry方法）；和正丁烯的氧化脫氫（Oxo-D或者O-X-D方法） (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇
[0007] 在工業(yè)上，全球9 5 %的丁二烯生產(chǎn)使用基于石化產(chǎn)品的給料如石腦油經(jīng) 蒸汽裂化過程進行。有意的丁二烯的生產(chǎn)效果不好，制造成本高并且工藝收率低 (White, Chemico-Biological Interactions, 2007, 166, 10-14)〇
[0008] 依賴于石化產(chǎn)品給料和對于有意的丁二烯而言的能源密集型催化步驟；生物技術(shù) 經(jīng)生物催化提供了替代方法。生物催化是使用生物催化劑如酶實施有機化合物的生物化學(xué) 轉(zhuǎn)換。
[0009] 因此，針對這樣的背景，很明顯需要用于制造中間體（具體為丁二烯）的可持續(xù)的 方法，其中所述方法基于生物催化劑（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 20 12, 109(10)，2437 - 2459)。
[0010] 生物來源的給料和石化產(chǎn)品的給料均為用于生物催化過程的可行的起始原料。
[0011] 在經(jīng)生物催化過程合成丁二烯中，在中等碳鏈長度的酶底物中產(chǎn)生兩個乙烯基是 一個關(guān)鍵的考慮因素。
[0012] 在原核生物或者真核生物中沒有已知的導(dǎo)致合成丁二烯的酶途徑。已經(jīng)提出了用 于由生物質(zhì)-糖產(chǎn)生1，3-丁二烯的三種可能的途徑：（1)經(jīng)巴豆?；?CoA從乙?；?CoA ; (2)從赤蘚糖-4-磷酸；和（3)經(jīng)與丙二酸單?；?CoA和乙?；?CoA的縮合反應(yīng)。然而， 使用這些策略的信息還未有報導(dǎo)（Jang等人，Biotechnology and Bioengineering, 2012， 109(10)，2437 - 2459)。
[0013] 通過原核生物或者真核生物合成的最接近的類似化合物是2-甲基-1，3- 丁二 烯（異戊二烯），給出短的五碳鏈長和兩個乙烯基。異戊二烯可經(jīng)兩種導(dǎo)致前體二甲基 乙烯基-PP的途徑合成，即，甲輕戊酸和非甲輕戊酸途徑0^^115^1]^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。
[0014] 甲羥戊酸途徑包括一種脫羧酶，甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（下文稱為 MDD),其在異戊二烯的前體中產(chǎn)生第一乙烯基〇(1^11}^11^，13;[08(3；[.13;[(^6(3111101. Biochem.，2002, 66(8)，1619-1627)。
[0015] 因此在從非天然底物合成丁二烯中可將甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33) 指定為候選酶。
[0016] 在闡釋與天然底物甲羥戊酸二磷酸相關(guān)的3-甲基的功能中，已經(jīng)證實，圖12(a) 中所示的3-羥基-5-二磷酸戊酸的轉(zhuǎn)換數(shù)k eat為0. 23 ±0. 05 [s_1]，這與天然底物的標(biāo)稱 的 8. 33±l[s-1]形成對比（Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994,33, 13355 - 13362)。另 夕卜，與底物的反應(yīng)僅進展至3-羥基的磷酸化，S卩，未檢測到脫羧產(chǎn)物，這暗示與天然底物相 t匕，脫羧率至少降低300倍?？傊?，在穩(wěn)定碳正離子過渡態(tài)中3-甲基被認(rèn)為是不可缺少的 (Dhe-Paganon 等人，Biochemistry, 1994, 33, 13355 - 13362)。
[0017] 已經(jīng)證實，來自釀酒酵母菌的MDD酶接受3-羥基-3-甲基-丁酸（圖12(b))(其 包含穩(wěn)定碳正離子過渡態(tài)的3-甲基）作為底物，從而將所述底物轉(zhuǎn)化成異丁烯。然而，t匕 活性為 4. 8 ? 10_6[ ii mol/(min ? mg)]，比 6. 4[ ii mol/(min ? mg)]的天然底物活性低得多 (Gogerty 和 Bobik，Applied&Environmental Microbiology, 2010, 76(24)，8004 - 8010)。
[0018] 已經(jīng)闡明了在催化裂隙（catalytic cleft)的外圍上的絲氨酸和精氨酸殘基與天 然底物甲羥戊酸二磷酸的焦磷酸酯基的關(guān)鍵底物結(jié)合相互作用。因此，在催化裂隙內(nèi)的正 確底物取向?qū)τ诿富钚允侵匾?，這似乎解釋了當(dāng)接受3-羥基-3-甲基-丁酸（圖14 (b)) 作為底物時 MDD 的低活性（Barta 等人，Biochemistry, 2012, 51，5611-5621)。
[0019]與天然底物相關(guān)的3-甲基和焦磷酸酯基在支持MDD活性中的重要性的教導(dǎo)反對 在從不含這些關(guān)鍵基團的非天然前體合成丁二烯中使用MDD。
[0020] 酶異戊二烯合酶（下文稱為ISPS)在異戊二烯合成的最終前體二甲基乙烯基-PP 中產(chǎn)生第二乙烯基。
[0021] 因此，在從非天然底物合成丁二烯中可將異戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)指定為候 選酶。
[0022] 類似于MDD，與天然底物二甲基乙烯基-PP相關(guān)的3-甲基在穩(wěn) 定已經(jīng)被假定為瞬時中間產(chǎn)物的碳正離子中發(fā)揮重要作用（Silver和 Fall, J. Biol. Chem.，1995, 270 (22)，13010 - 13016 ;Kuzma 等人，Current Microbiology, 1995, 30, 97-103)。
[0023] 3-甲基在支持ISPS活性中的重要性的教導(dǎo)反對從不含3-甲基的非天然前體合成 丁二烯中使用ISPS。
[0024] 除了 MDD和ISPS，微生物通常借助脫水酶、脫氨酶、去飽和酶或者脫羧酶活性可在 代謝物中產(chǎn)生乙烯基。然而，這些酶活性很少催化末端乙烯基的形成。脫水酶和脫氨酶通 常接受具有活化的氫原子的脂肪酸類似物，或者芳族化合物，其中芳環(huán)用作吸電子基團。去 飽和酶在脂肪酸合成中起著重要作用，在沿著長鏈脂肪酸的固定的非末端位置產(chǎn)生不飽和 鍵。接下來，作用于末端羧基的脫羧酶通常在催化后在末端位置留下相關(guān)的a官能團。因 此，這些酶的相關(guān)酶活性的教導(dǎo)反對將它們用于在短鏈或者中鏈碳代謝物中產(chǎn)生末端乙烯 基以合成丁二烯。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0025] 本申請至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：可能構(gòu)建用于產(chǎn)生中鏈碳代謝物的生物化學(xué)途 徑，在所述中鏈碳代謝物中可形成兩個乙烯基，從而合成丁二烯。本申請所述的這些途徑依 賴于酶如MDD、ISPS和脫水酶，用于最終酶促步驟。
[0026] 在本發(fā)明的發(fā)明人的意料不到的發(fā)現(xiàn)之前，不知道能夠在中鏈碳代謝物中形成兩 個末端乙烯基的酶存在或者可被制備用于合成丁二烯。
[0027]因此，在一個方面，本申請?zhí)峁┛蓪⒍《┖铣傻孜镛D(zhuǎn)化成丁二烯的酶。本申請使 用的術(shù)語"丁二烯合成底物"是指這樣的底物：酶可催化這種底物的反應(yīng)，直接得到1，3- 丁 二烯，或者得到在一個或者多個酶催化反應(yīng)后轉(zhuǎn)化成1，3- 丁二烯的產(chǎn)物。
[0028] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在4-草酰巴豆酸 (4-oxalocrotonate)、2_ 輕基粘康酸半醒（2-hydroxymuconate semialdehyde)，或者 2_ 輕 基 _6_ 氧代 _2, 4_ 二烯 _1，9-壬二酸（2-hydroxy-6_oxonona-2, 4-diene-l，9-dioate)中 酶促形成，從而產(chǎn)生2-氧代戊-4-烯酸（2-〇xopent-4-enoate)。參見圖2。
[0029] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在丙酰基_CoA、乳酰基-CoA， 或者3-羥基丙酰基-CoA中酶促形成，從而產(chǎn)生丙烯?；?CoA。參見圖3。
[0030] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在（R) 3-羥基-戊 酸（(R)3-hydroxy_pentanoate)中酶促形成，從而產(chǎn)生3-輕基戊-4-烯酸 (3_hydroxypent-4-enoate)。參見圖 4。
[0031] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在戊-2-烯?；鵞acp]中酶促 形成，從而產(chǎn)生2, 4-戊二烯?；?[acp]。參見圖5。
[0032] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在5-羥基戊酰基-CoA(經(jīng) 5_羥基-戊-2-烯?；?CoA作為中間體）或者戊-3-烯酰基-CoA中酶促形成，從而產(chǎn)生 2, 4_戊二稀醜基_CoA。參見圖6。
[0033] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在4-羥基丁?；?CoA、 003-羥基丁?；?&^或者戊烯二酸單?；?&^&1此&(：〇1^1-&^)中酶促形成，從而產(chǎn)生 巴豆醜基-CoA(crotonyl-CoA)。參見圖7。
[0034] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在2-丁醇中酶促形成，從而產(chǎn) 生3-丁烯-2-醇。參見圖8。
[0035] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶 (mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)( 一種歸類在EC 4. I. I. 33下的酶）形成 (圖9)。例如，將2-羥基戊-4-烯酸相繼通過兩種或者更多種酶轉(zhuǎn)化；從而在最后的酶促 轉(zhuǎn)化中通過脫羧直接產(chǎn)生丁二烯（圖1，反應(yīng)X)。
[0036] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過異戊二烯合酶（ISPS)( - 種歸類在EC 4. 2. 3. 27下的酶）形成（圖10)。例如，活化的丁烯醇（二磷酸酯）可通過一 種或者多種酶從丁烯醇生成（圖1，反應(yīng)II);從而通過去磷酸化在最后的酶促轉(zhuǎn)化中直接 產(chǎn)生丁二烯（圖1，反應(yīng)III)。
[0037] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過歸類在EC 4. 2.L-中的 脫水酶如芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇維酮（kievitone)水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸 水合酶（EC 4. 2. 1. 53)和類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)形成（圖11)。這種脫 水酶接受羥基化底物如丁烯醇。例如，丁烯醇可在一個或者多個酶促步驟中通過脫水酶、水 合酶、去飽和酶、去氫酶或者脫羧酶活性從丁二醇、丁醇、丁烯、丁烯醛或者C5烯醇生成（圖 1，反應(yīng)IV、V、VI、VII、IX);從而在最后的酶促轉(zhuǎn)化中通過脫水直接產(chǎn)生丁二烯（圖1，反應(yīng) I)。丁烯醇包括，例如，1- 丁烯-1-醇、2- 丁烯-1-醇和3- 丁烯-2-醇（參見圖1)。
[0038] 例如，本申請?zhí)峁⒍∠┐嫁D(zhuǎn)化成丁二烯的酶。這種轉(zhuǎn)化可通過單一酶進行，或者 可通過相繼作用的兩種或者更多種酶進行（也就是說，例如，第一酶作用在四碳分子上產(chǎn) 生以第一丁烯醇，然后第二酶作用在該第一丁烯醇上以產(chǎn)生丁二烯）（參見例如，圖1，反應(yīng) I)。
[0039] 本申請也提供從不飽和的羥基化四碳分子產(chǎn)生丁二烯的方法，其包括至少一個生 物催化步驟。例如，可將丁烯醇在轉(zhuǎn)化成丁二烯之前活化成相應(yīng)的丁烯醇二磷酸酯（參見 例如，圖1，反應(yīng)II和III)。在一些實施方案中，丁烯醇選自1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁烯 4醇、2 丁烯1醇、2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或者2 丁烯4醇。對于丁烯醇如1- 丁烯-1-醇、 1-丁烯-2-醇、2-丁烯-2-醇，和2-丁烯-3-醇，所述丁烯醇可作為相應(yīng)的酮或者醛如1-丁 醛或者2- 丁酮的烯醇化物原位生成。
[0040] 在一些實施方案中，丁烯醇通過酶的作用從選自以下的四碳分子產(chǎn)生：丁二醇 (1，4_ 丁二醇、1，3_ 丁二醇、2,3_ 丁二醇）（圖 1，反應(yīng) IV)或者丁醇（1-丁醇，或者 2-丁 醇）（圖1，反應(yīng)V)或者丁烯（1- 丁烯或者2- 丁烯）（圖1，反應(yīng)VI)或者丁烯醛如1- 丁烯 醛或者2-丁烯醛，或者2-酮-丁-1-烯（圖1，反應(yīng)VII)。
[0041] 通過酶進行的反應(yīng)可為凈脫水（即，通過具有脫水酶活性的酶從分子除去H2O,反 應(yīng)IV)、通過具有去飽和酶活性的酶或者酶復(fù)合物脫氫（即，從分子除去氫，其在通過酶催 化的反應(yīng)中導(dǎo)致分子的碳骨架的去飽和）（反應(yīng)V)、通過具有羥化酶活性的酶如烯烴單氧 化酶或者細(xì)胞色素P450或者《 -羥化酶羥基化（即，用羥基替代氫）（反應(yīng)VI)，或者通過 氧化還原酶/酮還原酶還原以將丁烯醛或者C4不飽和酮轉(zhuǎn)化成丁烯醇。對于脫水步驟，酶 可為與用于脫水丁烯醇形成丁二烯的酶種類相同的酶種類，或者可為其它酶種類。在丁烯 醇中雙鍵的遷移可通過異構(gòu)酶催化。
[0042] 本申請還提供來自酶種類4. 2.L-的酶，其將丁二醇轉(zhuǎn)化成丁烯醇（圖1，反應(yīng) VIII)。
[0043] 在一些實施方案中，丁烯醇如1-丁烯-4-醇通過脫羧酶（例如來自EC 4. I. L-的 脫羧酶）的作用從五碳分子如2-羥基戊-4-烯酸產(chǎn)生（圖1，反應(yīng)IX)。2-羥基戊-4-烯 酸也可通過脫羧酶或者GHMP激酶直接轉(zhuǎn)化成丁二烯，而不形成中間體丁烯醇（圖1，反應(yīng) X)。
[0044] 在一些實施方案中，丁烯醇選自1 丁烯2醇、1 丁烯3醇、1 丁烯4醇、2 丁烯1醇、 2 丁烯2醇、2 丁烯3醇或者2 丁烯4醇。對于丁烯醇如1- 丁烯-2-醇、2- 丁烯-2-醇，和 2_ 丁烯-3-醇，丁烯醇可作為相應(yīng)的酮或者醛如1- 丁醛或者2- 丁酮的烯醇化物原位生成。
[0045] 在一個方面，本申請的特征在于生物合成丁二烯的方法。所述方法包括在丁二烯 合成底物中形成兩個末端乙烯基。第一乙烯基可在丁二烯合成底物中酶促形成，從而產(chǎn)生 選自以下的化合物：2-氧代戊-4_烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-輕基戊-4-烯酸、2, 4-戊二烯 醜基-[acp]、2, 4_戊二稀醜基-CoA、巴醜基-CoA，和3_ 丁稀_2_醇。
[0046] 在一個方面，2-氧代戊-4-烯酸可通過在以下物質(zhì)中形成第一乙烯基產(chǎn)生： (i) 4-草酰巴豆酸，使用歸類在EC 4. 1.1. 77中的4-草酰巴豆酸脫羧酶，（ii) 2-羥基粘 康酸半醛，使用歸類在EC 3. 7. 1. 9中的2-羥基粘康酸-半醛水解酶，或者（iii) 2-羥 基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸，使用歸類在EC 3. 7. 1. 14中的2-羥基-6-氧 代-2, 4-二烯壬二酸水解酶。2-氧代戊-4-烯酸可通過以下方法生成：使用歸類在EC 1. 2. 1. 32下的2氨基粘康酸半醛去氫酶將2-羥基粘康酸半醛轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸，使用 歸類在EC 5. 3. 2. 6下的2-羥基粘康酸互變異構(gòu)酶將2-羥基粘康酸轉(zhuǎn)化成4-草酰巴豆 酸，和使用歸類在EC 4. 1. 1.77下的4-草酰巴豆酸脫羧酶將4-草酰巴豆酸轉(zhuǎn)化成2-氧代 戊-4-烯酸。2-羥基粘康酸半醛可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.13. 11. 2下的兒 茶酚2, 3-雙加氧酶將兒茶酚轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸半醛。兒茶酚通過以下方法產(chǎn)生：使用 歸類在EC 1. 14. 12. 1下的鄰氨基苯甲酸1，2_雙加氧酶（anthranilate 1,2-dioxygenase) 轉(zhuǎn)化鄰氨基苯甲酸（anthranilate)，或者使用歸類在EC 4. I. 1. 63下的原兒茶酸脫羧酶 (protocatechuate decarboxylase)轉(zhuǎn)化原兒茶酸（protocatechuate)。鄰氨基苯甲酸 (anthranilate)可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 1. 3. 27下的鄰氨基苯甲酸合酶轉(zhuǎn) 化分支酸（chorismate)。原兒茶酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.118下的 3-去氫莽草酸脫水酶轉(zhuǎn)化3-去氫莽草酸（3-dehydroshikimate)。
[0047] 在一個方面，2-羥基粘康酸半醛可通過以下方法產(chǎn)生：使用5-羧基-2-羥基粘 康酸-6-半醒脫羧酶如praH編碼的5-羧基-2-輕基粘康酸-6-半醒脫羧酶轉(zhuǎn)化5-羧 基 _2_ 輕基粘康酸 _6_ 半醒（5-carboxy-2_hydroxy muconate-6-semiladehyde)。5_ 竣 基-2-羥基粘康酸-6-半醛可通過以下方法產(chǎn)生：使用原兒茶酸2, 3-雙加氧酶如praA編 碼的原兒茶酸2, 3-雙加氧酶轉(zhuǎn)化原兒茶酸。2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 13. 11. 16下的3-羧基乙基兒茶酚2, 3-雙加氧酶 轉(zhuǎn)化 2, 3_ 二輕基苯基丙酸（2, 3-dihydroxy phenylpropionoate)。2, 3_ 二輕基苯基丙酸 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 3. 1. 87下的3-(順式-5, 6-二羥基環(huán)己-1，3-二 烯-1-基）丙酸去氫酶轉(zhuǎn)化順式-3_(羧基-乙基）_3, 5-環(huán)-己二烯-1，2-二醇。順 式-3_(羧基-乙基）_3, 5-環(huán)-己二烯-1，2-二醇可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC L 14. 12. 19下的3-苯基丙酸雙加氧酶轉(zhuǎn)化3-苯基-丙酸（3-phenyl-propionate)。3-苯 基-丙酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 3. 1. 31下的2-烯酸還原酶轉(zhuǎn)化E-肉桂 酸。E-肉桂酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 3. 1. 24下的苯基丙氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化 L-苯基丙氨酸。
[0048] 在一個方面，丁二烯合成底物可為丙?；?CoA。丙烯酰基-CoA可通過在以下 物質(zhì)中形成第一乙烯基產(chǎn)生：（i)丙?；?CoA，使用歸類在EC1. 3. 8. 1下的丁酰基-CoA 去氫酶或者歸類在EC1.3. 8.7下的中鏈?；?CoA去氫酶，（ii)乳?；?CoA，使用歸類 在EC4. 2. 1.54下的乳酰基-CoA脫水酶，或者（iii) 3-羥基丙酰基-CoA，使用歸類在EC 4. 2. 1. 116下的3-羥基丙酰基-CoA脫水酶。丙?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類 在EC2. 1. 3. 1下的甲基丙二酸單?；?CoA羧基轉(zhuǎn)移酶或者歸類在EC4.I.1. 41下的甲基 丙二酸單?；?CoA脫羧酶轉(zhuǎn)化（2S)-甲基丙二酸單?；?CoA ((2S)-methylmalonyI-CoA)。 (2S)-甲基丙二酸單酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 5. I. 99. 1下的甲基丙 二酸單?；?CoA差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化（2R)-甲基丙二酸單?；?CoA。（2R)-甲基丙二酸單酰 基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 5. 4. 99. 2下的甲基丙二酸單酰基-CoA變位 酶轉(zhuǎn)化琥拍酸單?；?CoA(succinyl-CoA)。
[0049] 丙?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2.3. L-下的2-酮丁酸甲酸 裂解酶（2-ketobutyrate formate-lyase)如tdcE編碼的2-酮丁酸甲酸裂解酶轉(zhuǎn)化2-氧 代-丁酸（2-oxo-butyrate)。2_氧代-丁酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 3. 1. 19 下的蘇氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸。
[0050] 丙?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用丙醛去氫酶如pduP編碼的丙醛去氫酶 轉(zhuǎn)化丙醇。丙醇可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4.2. 1.28下的丙二醇脫水酶轉(zhuǎn)化 1，2-丙二醇。
[0051] 丙?；?CoA可由3-乙酰丙酸（levulinic acid)通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 2. 3. 1.-下的轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化3-乙酰丙?；?CoA。3-乙酰丙?；?CoA可通過以下方法產(chǎn) 生：使用歸類在EC 6. 2. 1.-下的?；?CoA合成酶或者連接酶轉(zhuǎn)化3-乙酰丙酸。
[0052] 乳?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 8. 3. 1下的丙酸CoA-轉(zhuǎn)移酶 轉(zhuǎn)化L-乳酸（L-Iactate)。L-乳酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.1. 1.27下的 L-乳酸去氫酶轉(zhuǎn)化丙酮酸（pyruvate)。
[0053] 3-羥基丙酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2. 4下的3-羥 基異丁?；?CoA水解酶轉(zhuǎn)化3-輕基丙酸（3-hydroxypropionate)或者使用歸類在EC I. I. 1. 59下的3-輕基丙酸去氫酶轉(zhuǎn)化丙二酸半醒（malonate semialdehyde)。丙二酸半 醛可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 2. 1. 75下的丙二酸單酰基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化丙二 酸單?；?CoA。
[0054] 丙酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 3. 8. 1下的丁?；?CoA去氫 酶或者歸類在EC 1. 3. 8. 7下的中鏈?；?CoA去氫酶轉(zhuǎn)化丙烯?；?CoA。
[0055] (R) 3-羥基戊-4-烯酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用去飽和酶/單氧化酶或者細(xì)胞 色素P450在（R) 3-羥基戊酸中形成第一乙烯基。（R) 3-羥基-戊酸可通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊?；?CoA。（R) 3-羥基戊?；?CoA 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在ECI. I. 1. 36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代 戊酰基-CoA。3-氧代戊?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC2. 3. 1. 16下的乙 醜基-CoA C-醜基轉(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA C-acyltransferase)轉(zhuǎn)化丙醜基-CoA。
[0056] 2, 4-戊二烯?；?[acp]可通過以下方法產(chǎn)生：使用?；鵢[acp]去氫酶在 戊-2-烯酰基-acp中形成第一乙烯基。2, 4-戊二烯?；?CoA可通過在以下物質(zhì)中形成第 一乙烯基產(chǎn)生：（i) 5-羥基戊酰基-CoA，使用歸類在EC 4. 2. 1.-下的5-羥基戊?；?CoA 脫水酶，或者（ii)戊-3-烯?；?CoA，使用歸類在EC 1.3. 1.34下的2, 4-二烯?；o酶A 還原酶。5-輕基戊?；?CoA脫水酶可源于Clostridium viride。
[0057] 巴豆?；?CoA可通過在以下物質(zhì)中形成第一乙烯基產(chǎn)生：（i)戊烯二酸單酰 基-CoA，使用歸類在EC 4. 1.1. 70下的戊烯二酸單?；?CoA脫羧酶，（ii) 4-羥基丁酰 基-CoA(4-hydroxybutryl_CoA)，使用歸類在 EC 4. 2. L 120 下的 4-輕基丁?；?CoA 脫 水酶和歸類在EC 5. 3. 3. 3下的乙烯基乙?；?CoA異構(gòu)酶，或者（iii) (R) 3-羥基丁酰 基-CoA，使用歸類在EC 4. 2. 1. 119下的烯?；?CoA水合酶。
[0058] 3- 丁烯-2-醇可通過以下方法產(chǎn)生：使用去飽和酶或者單氧化酶在2- 丁醇中形 成第一乙烯基。
[0059] 第二乙烯基在（R)3_羥基戊-4-烯酸中通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MDD)酶促形 成。MDD可歸類在EC 4. 1.1. 33下。在催化裂隙的催化性精氨酸殘基的任一側(cè)的五個殘基 中，MDD可包含最少四個絲氨酸殘基。MDD可來自鏈球菌屬或者葡萄球菌屬。
[0060]第二乙烯基可在 2-丁烯-1-醇二磷酸酯（2-buten-l-ol diphosphate)或者 3-丁 烯-2-醇二磷酸酯（3-buten_2-〇l diphosphate)中通過異戊二烯合酶（ISPS)酶促形成。 第二乙烯基可在3- 丁烯-2-醇或者2- 丁烯-1-醇中通過酶種類EC 4. 2. 1.-中的脫水酶 如芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇維酮水化酶（kievitone hydrase) (EC 4. 2. 1. 95)、油 酸水合酶（EC 4. 2. 1. 53)或者類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)酶促形成。
[0061] 戊-2-烯?；鵢[acp]可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.59下的3-羥 基?；?[acp]脫水酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊?；?[acp]。（R) 3-羥基戊?；?[acp]可通過以 下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. I. 1. 100下的3-氧代?；鵢[acp]還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊酰 基 _[acp]〇
[0062] 3-氧代戊?；?[acp]可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2.3. 1.41下的酮 ?；? [acp]合酶I和?；?轉(zhuǎn)移酶如tcsA轉(zhuǎn)化丙?；?CoA。
[0063] 戊-2-烯?；? [acp]可通過以下方法產(chǎn)生：使用?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯酰 基-CoA。戊-2-烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.119下的烯酰 基-CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊?；?CoA。（R) 3-羥基戊?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC I. I. 1. 36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊?；?CoA。
[0064] 3-氧代戊?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2.3. 1. 16下的乙酰 基-CoA C-酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丙?；?CoA。
[0065] 戊-3-烯酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 5. 3. 3. 8下的異構(gòu)酶轉(zhuǎn) 化戊_2_烯醜基-CoA。
[0066] 5-羥基戊酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2.8.3.14下的 5-輕基戊酸 CoA-轉(zhuǎn)移酶（5-hydroxypentanoate CoA-transferase)轉(zhuǎn)化（i)5_ 輕 基戊酸（5-hydroxypentanoate)或者使用細(xì)胞色素P450如CYP153A6的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化（ii)戊?；?CoA。5-羥基戊酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用5-羥基戊酸去氫酶 (5-hydroxyvalerate dehydrogenase)如 cpnD 的基因產(chǎn)物或者來自 Clostridium viride 的去氫酶轉(zhuǎn)化5-氧代戊酸（5-oxopentanoate)。5-氧代戊酸可通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在60 2.6.1.48下的5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶（5-3111；[110￥316四七6 1：四1183111；[仙86)轉(zhuǎn) 化5-氨基戊酸（5-aminovalerate)。5-氨基戊酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 1.21.4. 1下的D-脯氨酸還原酶轉(zhuǎn)化D-脯氨酸。D-脯氨酸可通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在EC 5. 1.1. 4下的脯氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化L-脯氨酸。L-脯氨酸可通過以下方法產(chǎn) 生：使用歸類在EC 1.5. 1.2下的吡咯啉-5-羧酸還原酶轉(zhuǎn)化（S)-I-吡咯啉-5-羧酸 ((S) -l-Pyrroline-5-carboxylate)。（S) -1-批咯啉_5_羧酸可通過以下方法產(chǎn)生：L-谷 氨酸5-半醒（L-glutamate 5-semialdehyde)的自發(fā)轉(zhuǎn)化。L-谷氨酸5-半醒可通過以下 方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. 2. I. 41下的谷氨酸-5-半醛去氫酶轉(zhuǎn)化L-谷氨?；?5-磷酸(L-glutamyl-5-phosphate)。L-谷氨酰基-5-磷酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 2. 11下的谷氨酸5-激酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸。
[0067]戊?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.3. 1.38下的反式-2-烯酰 基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯?；?CoA。
[0068] 戊烯二酸單?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.-下的脫水酶 轉(zhuǎn)化2-輕基戊二酸單?；?CoA(2-hydroxyglutaryl-CoA)。2-輕基戊二酸單?；?CoA 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 8. 3. 12下的戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶（glutaconate CoA-transferase)轉(zhuǎn)化 2_ 輕基戊二酸（2-hydroxyglutarate)。2_ 輕基戊二酸可通過 以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. 1. 99. 2下的2-羥基戊二酸去氫酶轉(zhuǎn)化2-氧代戊二酸 (2-oxoglutarate)。3-輕基丁?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. I. L 36下 的3-羥基丁?；?CoA去氫酶轉(zhuǎn)化乙酰乙酰基-CoA。乙酰乙?；?CoA可通過以下方法產(chǎn) 生：使用歸類在EC 2. 3. 1. 9下的乙?；?CoA C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化乙?；?CoA。
[0069] 4-羥基丁酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用CoA-轉(zhuǎn)移酶如Ck_cat2的基因 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化4-輕基丁酸（4-hydroxybutyrate)。4-輕基丁酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC I. I. 1. 61下的4-輕基丁酸去氫酶轉(zhuǎn)化琥拍酸半醒（succinate semialdehyde)。 琥珀酸半醛可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.2. 1.76下的琥珀酸-半醛去氫酶 (succinate-semialdehyde dehydrogenase)轉(zhuǎn)化玻拍酸單醜基-CoA。
[0070] 2-丁醇可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. I. 1.B4下的（R)-特異性仲醇 去氫!酶（(R)_specific secondary alcohol dehydrogenase)轉(zhuǎn)化丁麗。丁麗可通過以下 方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4.2. 1.28下的丙二醇脫水酶轉(zhuǎn)化2, 3 丁二醇。2, 3 丁二醇可通 過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.1. 1.4下的（R，R)-丁二醇去氫酶轉(zhuǎn)化（R)-3-羥基丁 酮。（R)-3-羥基丁酮可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 1.1. 5下的乙酰乳酸脫羧酶 (acetolactate decarboxylase)轉(zhuǎn)化 2_ 乙醜乳酸（2-acetolactate)。2_ 乙醜乳酸可通 過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 2. 1. 6下的乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase)轉(zhuǎn) 化丙酮酸（口5^11￥3七6)。（1〇3-輕基戊-4-烯酸（(1〇3-117(11'(?5^6111：-4-61103七6)可通過以下 方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化3-羥基戊-4-烯?；?CoA。3-羥基 戊-4-烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1下的烯酰基-CoA脫水酶2 轉(zhuǎn)化2, 4-戊二烯?；?CoA。2, 4-戊二烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用2-羥基異 己?；?CoA脫水酶如起始子HadI和HadBC的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2-羥基戊-4-烯酰基-CoA。 2_羥基戊-4-烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用CoA-轉(zhuǎn)移酶如GctAB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化2-輕基戊-4-烯酸（2-hydroxypent-4_enoate)。2-輕基戊-4-烯酸可通過以下方法產(chǎn) 生：使用（R) _2_ 輕基異己酸去氧酶（(R)-2_hydroxyisocaproate dehydrogenase)如來自 艱難梭菌的LdhA的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化2-氧代戊-4-烯酸（2-〇xopent-4_enoate)。
[0071] (R)-羥基戊-4-烯酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶 轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA。（R) 3-羥基戊-4-烯酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC I. 1. 1.36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊-4-烯?；?CoA。 3_氧代戊-4-烯酰基-CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 3. 1. 16下的酮硫解 酶轉(zhuǎn)化丙烯?；鵢CoA。（R)-輕基戊-4-烯酸（(R)-hydroxypent-4_enoate)可通過以下方 法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. I. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA。（R) 3-羥 基戊-4-烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用（R) -3-羥基酰基-ACP: CoA轉(zhuǎn)酰酶如phaG 的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化（R)-3-羥基戊-4-烯?；鵢[acp]。（R)-3-羥基戊-4-烯?；鵢[acp]可通 過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1. 59下的3-羥基?；?[?；?載體-蛋白]脫水 酶（3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase)轉(zhuǎn)化 2, 4 戊二烯醜基 _[acp]。 (R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1. 119下的烯酰 基-CoA脫水酶2轉(zhuǎn)化2, 4-戊二烯?；?CoA。
[0072] 2- 丁烯-1-醇二磷酸酯可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸 甲輕戊酸激酶或者使用歸類在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶（diphosphokinase)轉(zhuǎn)化2-丁 烯-1-醇磷酸酯（2-buten-l-ol phosphate)。2-丁烯-1-醇磷酸酯可通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC 2. 7. 1. 36下的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化2-丁烯-1-醇。2-丁烯-1-醇可通過以下 方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. 1. 1.54下的丙烯醇去氫酶轉(zhuǎn)化2-丁烯-1-醛。2-丁烯-1-醛 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.2. 1.48下的長鏈醛去氫酶轉(zhuǎn)化巴豆酸。巴豆酸 可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 6. 2. 1. 5下的琥珀酸-CoA連接酶（succinate-CoA ligase)轉(zhuǎn)化巴豆?；?CoA。
[0073] 2- 丁烯-1-醇二磷酸酯可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 6.-下的二磷 酸激酶如歸類在EC 2. 7. 6. 2下的硫胺素二磷酸激酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醇。
[0074] 3- 丁烯-2-醇二磷酸酯可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 6.-下的二磷 酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇或者使用歸類在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁 烯-2-醇磷酸酯。3- 丁烯-2-醇磷酸酯可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 1. 36下 的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇。
[0075] 在本申請所述的任何方法中，所述方法可使用分離的酶，使用包含酶的細(xì)胞溶胞 產(chǎn)物，或者使用重組宿主進行?？蓪⒅亟M宿主厭氧地、微需氧地或者需氧地培養(yǎng)。在發(fā)酵期 間可將重組宿主細(xì)胞保留在陶瓷中空纖維膜中以維持高細(xì)胞密度。供給至發(fā)酵的主要碳源 可來源于生物或者非生物給料。例如，生物給料來源于或者衍生自單糖類、二糖類、木質(zhì)纖 維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如3-乙酰丙酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯類如甘油和脂肪 酸、農(nóng)業(yè)廢物或者城市廢物。非生物給料來源于或者衍生自天然氣、合成氣、C0 2/H2、甲醇、乙 醇、或者來自環(huán)己烷氧化工藝的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或堿洗廢液流。
[0076] 宿主微生物可為原核生物，其來自埃希氏菌屬如大腸桿菌；來自梭狀芽 胞桿菌屬如楊氏梭菌（Clostridium Ijungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克魯佛梭菌（Clostridium kluyveri);來自棒狀桿菌屬如谷氨酸 棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum);來自貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metallidurans);來自假單胞菌屬如突 光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)或 者食油假單胞菌（Pseudomonas oleavorans);來自代爾夫特菌屬如食酸代爾夫特菌 (Delftia acidovorans);來自芽抱桿菌屬如枯草芽胞桿菌（Bacillus subtillis);來 自乳桿菌屬如德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii);或者來自乳球菌屬如乳酸乳 球菌（Lactococcus lactis)。宿主微生物可為真核生物，其來自曲霉菌屬如黑曲霉菌 (Aspergillus niger);來自酵母菌屬如釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae);來自畢 赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);來自耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵 母（Yarrowia Iipolytica);來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母（Issathenkia orientalis); 來自德巴利酵母屬如漢遜德巴利酵母G)ebaryomyces hansenii);來自Arxula屬如Arxula adenoinivorans;或者來自克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母菌（Kluyveromyces Iactis)。
[0077] 在本申請所述的重組宿主中，可將催化丙酰基-CoA和乙?；?CoA的水解的酶 弱化；可將經(jīng)檸檬酸甲酯循環(huán)（methyl-citrate cycle)消耗丙酰基-CoA的酶弱化；可將 消耗丙酰基-CoA成丙酮酸的酶弱化；可將消耗丙酰基-CoA成丙二酸單?；?CoA的酶弱 化；可將抗反饋蘇氨酸脫氨酶基因工程化至宿主生物體中；可將催化乙?；?CoA縮合成 乙酰乙?；?CoA的P -酮硫解酶如AtoB或者phaA的基因產(chǎn)物弱化；可將在天然累積聚 輕基燒酸酯（polyhydroxyalkanoates)的宿主株中的聚合物合酶弱化；可將編碼磷酸轉(zhuǎn) 乙酰酶的基因如Pta弱化；可將編碼降解丙酸（propanoate)的乙酸激酶的基因如ack弱 化；可將編碼降解丙酮酸成乳酸（lactate)的基因弱化；可將編碼降解磷酸烯醇丙酮酸 (phophoenolpyruvate)成琥拍酸（succinate)的基因如frdBC弱化；可將編碼降解乙酰 基-CoA成乙醇的基因如adhE弱化；可將催化補充檸檬酸循環(huán)中間體的添補反應(yīng)的酶擴 增；可將批陡核苷酸轉(zhuǎn)氫酶（puridine nucleotide transhydrogenase)基因如UdhA過表 達(dá)；甘油醛-3P-去氫酶基因如GapN可在宿主生物體中過表達(dá)；蘋果酸酶基因如maeA或者 maeB在宿主生物體中過表達(dá)；葡萄糖-6-磷酸去氫酶基因如zwf在宿主生物體中過表達(dá)； 果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿主生物體中過表達(dá)；通過以基因工程的方式對細(xì)胞膜進 行結(jié)構(gòu)修飾，可將丁二烯跨越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量增強或者擴大；或者通過 以基因工程的方式使用于丁二烯的任何相關(guān)的轉(zhuǎn)運子活性增加，將丁二烯跨越細(xì)胞膜到達(dá) 細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量增強或者擴大；將丁二烯降解成毒性中間體如1，2-環(huán)氧-3-丁烯和 1，2:3, 4-二環(huán)氧丁烷的加氧酶在宿主生物體中被弱化。
[0078] 在本申請所述的任何方法中，硫酯酶可為tesB的基因產(chǎn)物；乙酰乙酰基-CoA還原 酶可為PhaB的基因產(chǎn)物；乙酰基-CoA C-?；D(zhuǎn)移酶可為BktB的基因產(chǎn)物；烯?；?CoA 水合酶可為phaj的基因產(chǎn)物；去飽和酶可為MdpJ的基因產(chǎn)物；細(xì)胞色素P450可為CYP4家 族的基因產(chǎn)物邛-酮?；鵢[acp]合酶I可為tcsB的基因產(chǎn)物；?；?轉(zhuǎn)移酶可為tcsA 的基因廣物。
[0079] 除非另外定義，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。盡管與本申請所述的方法和材料相似或者等價的 方法和材料可用于實踐本發(fā)明，但是下面描述適合的方法和材料。將本申請所述的所有公 開、專利申請、專利，和其它文獻的全部內(nèi)容并入本文作為參考。在沖突的情況中，將以本發(fā) 明的說明書（包括定義）為準(zhǔn)。另外，材料、方法，和實例僅為說明性的并且不意圖限制本 發(fā)明。
[0080] 本發(fā)明的一個或者多個實施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的描述中闡述。根據(jù)描述和 附圖，以及根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的，和優(yōu)點將顯而易見。根據(jù)專利法中的標(biāo) 準(zhǔn)實踐，在權(quán)利要求中的詞語"包含"可用"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0081] 圖1是從C4醛和酮、C4羥基-醛和二酮、丁烯、丁烯醛或者不飽和的酮、丁烯醇、 丁二醇、C5烯醇，和活化的丁烯醇得到1，3 丁二烯的主要酶活性的示意圖。
[0082]圖2是使用2-氧代戊-4-烯酸作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意 圖。
[0083] 圖3是使用丙烯?；?CoA作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0084] 圖4是使用3-輕基-4-戊烯酸（3-hydroxy-4_pentenoate)作為中心前體得到丁 二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0085] 圖5是使用2, 4-戊二烯酰基_[acp]作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的 示意圖。
[0086] 圖6是使用2, 4-戊二烯?；?CoA作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的示 意圖。
[0087] 圖7是使用巴豆酰基-CoA作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0088] 圖8是使用3- 丁烯-2-醇作為中心前體得到丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0089] 圖9是使用甲羥戊酸二磷酸脫羧酶合成丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0090]圖10是使用異戊二烯合酶合成丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0091]圖11是使用脫水酶合成丁二烯的生物化學(xué)途徑的示意圖。
[0092] 圖12是MDD接受的備選底物的結(jié)構(gòu)，（a)為3-羥基-5-二磷酸戊酸（ 3_hydroxy-5-diphosphatepentanoic acid)和（b)為 3_ 輕基 _3_ 甲基-丁酸 (3-hydroxy-3-methyl_butyrate) 〇
[0093] 圖13是來自釀酒酵母菌的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登錄號P32377, SEQ ID NO: 1)、來自表皮葡萄球菌的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登錄號Q7CCL9, SEQ ID NO:2)， 和來自肺炎鏈球菌（streptococcus pneumonia)的MDD酶的氨基酸序列（Uniprot登錄號 B8ZLF3，SEQ ID N0:3)，用粗體突出在酶的催化裂隙內(nèi)的保守殘基。

【具體實施方式】
[0094] 具體地，本申請將酶、非天然途徑、培養(yǎng)策略、給料、宿主微生物和弱化提供至宿主 的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其在四和五碳鏈代謝物中產(chǎn)生兩個末端乙烯基，從而由中心前體或者中 心代謝物合成1，3 丁二烯（本申請中稱為"丁二烯"）。本申請使用的術(shù)語〃中心前體〃用 于表示合成丁二烯的途徑中的關(guān)鍵代謝物。術(shù)語"中心代謝物"在本申請中用于表示在所 有微生物中產(chǎn)生以支持生長的代謝物。
[0095] 因此，本申請所述的宿主微生物可包括可操縱使得可產(chǎn)生丁二烯的內(nèi)源性途徑。 在內(nèi)源性途徑中，宿主微生物天然地表達(dá)在途徑內(nèi)催化反應(yīng)的所有酶。含有工程化途徑的 宿主微生物不天然地表達(dá)在途徑內(nèi)催化反應(yīng)的所有酶，而是已經(jīng)被工程化使得在宿主中表 達(dá)在途徑內(nèi)的所有酶。在工程化途徑內(nèi)，酶可來自單一來源，即，來自一個物種，或者可來自 多個來源，即，不同物種。編碼本申請所述的酶的核酸已經(jīng)從多種生物鑒別出并可在公開的 數(shù)據(jù)庫如GenBank或者EMBL中容易地得到。工程化宿主不能天然地表達(dá)本申請所述途徑 的酶，或者能天然地表達(dá)本申請所述途徑的酶中的一些（例如，一種或者多種，兩種或者更 多種，三種或者更多種，四種或者更多種，五種或者更多種，或者六種或者更多種）。也可將 工程化宿主的內(nèi)源性基因破壞以防止形成不希望的代謝物，或者防止在途徑中作用于中間 體的其它酶導(dǎo)致所述中間體的損失?？蓪⒐こ袒拗鞣Q為重組宿主或者重組宿主細(xì)胞。因 此，如本申請所述，重組宿主可包括核酸，該核酸編碼脫羧酶、去氫酶、去飽和酶、單氧化酶、 ?；鵞?；d體蛋白（acp)]去氫酶、脫水酶，或者水合酶中的一種或者多種，如下面更詳細(xì) 地描述。
[0096]另外，丁二烯的產(chǎn)生可在體外使用本申請所述的分離的酶，使用宿主微生物的溶 胞產(chǎn)物（例如，細(xì)胞溶胞產(chǎn)物）作為酶源，或者使用來自不同宿主微生物的多種溶胞產(chǎn)物作 為酶源進行。
[0097]圖1提供可用于從多種四或者五碳分子產(chǎn)生丁二烯的主要酶活性的示意圖，所述 四或者五碳分子包括C4醛和酮、C4羥基-醛和二酮、丁烯、丁烯醛或者不飽和的酮、丁烯醇、 丁二醇、C5烯醇，和活化的丁烯醇。
[0098] 4. 1在丁二烯的生物合成中產(chǎn)生第一末端乙烯基的酶
[0099] 如圖2-8中所示，第一乙烯基可在4-草酰巴豆酸、2-羥基粘康酸半醛、2-羥 基 _6-氧代-2, 4- _稀-1，9-壬_酸、丙醜基-CoA、乳醜基-CoA、3 -輕基丙醜基-CoA、 (R) 3-羥基-戊酸、戊-2-烯酰基-[acp]、5_羥基戊?；?CoA(經(jīng)5-羥基-戊-2-烯酰 基-CoA)、戊-3-烯?；?CoA、4-羥基丁酰基-CoA、戊烯二酸單酰基-CoA、（R) 3-羥基丁酰 基-CoA或者2- 丁醇中形成，以產(chǎn)生化合物如2-氧代戊-4-烯酸、丙烯?；?CoA、（R) 3-羥 基戊-4-烯酸、（R) 3-羥基戊-4-烯酰基-[acp]、2, 4-戊二烯?；?CoA、巴豆?；?CoA，和 3_ 丁烯-2-醇。
[0100] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在4-草酰巴豆酸、2-羥基粘康 酸半醛，或者2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸中通過4-草酰巴豆酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 77)、2-羥基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯壬 二酸水解酶（EC 3. 7. 1. 14)酶促形成，從而產(chǎn)生2-氧代戊-4-烯酸。參見例如，圖2。
[0101] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在丙?；鵢CoA、乳?；?CoA、 3_羥基丙?；?CoA中通過丁?；?CoA去氫酶（EC 1.3.8. 1)、中鏈?；?CoA去氫酶 (EC 1. 3. 8. 7)、乳酰基-CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 54)或者3-羥基丙?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 116)酶促形成，從而產(chǎn)生丙烯?；?CoA。參見例如，圖3。
[0102] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在（R) 3-羥基-戊酸中通過去 飽和酶或者單氧化酶如MdpJ的基因產(chǎn)物或者細(xì)胞色素P450如CYP4家族的基因產(chǎn)物酶促 形成，從而產(chǎn)生（R) 3-羥基戊-4-烯酸。參見例如，圖4。
[0103] 單氧化酶MdpJ的基因產(chǎn)物去飽和與仲醇相鄰的乙基的末端（ScMfer等人， Applied and Environmental Microbiology, 2012,78(24))〇
[0104] 細(xì)胞色素P450 CYP4家族的基因產(chǎn)物已經(jīng)顯示出對于末端去飽和的特異性，而非 對于C5羧酸丙戊酸的to-輕基化的特異性（Rettie等人，Biochemistry, 1995, 34, 7889-7 895)。
[0105] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在戊-2-烯?；?[acp]中通過 酰基_[acp]去氫酶如TcsD的基因產(chǎn)物酶促形成，從而產(chǎn)生2, 4戊二烯?；?[acp]。參見 例如，圖5。
[0106] ?；鵢[acp]去氫酶TcsD的基因產(chǎn)物去飽和戊-2-烯?；?[acp]的末端亞甲基 成2, 4-戊二烯酰基-[acp] (Mo等人，J.Am.Chem. Soc.，2011，133(4)，976-985)。
[0107] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在5-羥基戊?；?CoA中經(jīng) 5-羥基-戊-2-烯酰基-CoA通過5-羥基戊?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. I.-)或者通過 2, 4-二烯?；o酶A還原酶（EC 1. 3. 1. 34)酶促形成，從而產(chǎn)生2, 4-戊二烯酰基-CoA。參 見例如，圖6。
[0108] 5-羥基戊酸通過5-羥基戊?；?CoA脫水酶脫水成2, 4戊二烯酰 基-CoA 已經(jīng)從 Clostridium viride 中得到表征（Eikmanns 和 Buckel, Eur. J. Biochem.，1991，197, 661 - 668)。
[0109] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在3-羥基丁酰基-CoA、4-羥基 丁酰基-CoA或者戊烯二酸單?；?CoA中通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj 的基因產(chǎn)物、4-羥基丁酰基-CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 120)或者戊烯二酸單?；?CoA脫羧酶 (EC 4. I. 1. 70)酶促形成，從而產(chǎn)生巴豆?；?CoA。參見例如，圖7。
[0110] 可逆脫水酶4-羥基丁?；?CoA脫水酶已經(jīng)在數(shù)個梭菌屬物種如克 魯佛梭菌中得到表征，從而提供經(jīng)中心代謝物琥珀酸到達(dá)巴豆?；?CoA的路 線（Scherf 等人，Arch. Microbiol, 1994，161 (3) ,239-245 ;Sherf 和 Buckel, Eur. J.Biochem.，1993, 215, 421-429)。
[0111] 生物素依賴性脫羧酶戊烯二酸單?；?CoA脫羧酶在脫羧后維持底物的乙烯基的 位置，從而提供經(jīng)中心代謝物2-氧代戊二酸到達(dá)巴豆?；?CoA的路線（Kerstin等人，The EMBO Journal, 2003, 22(14)，3493-3502)。
[0112] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第一乙烯基在2- 丁醇中通過去飽和酶或 者單氧化酶如MdpJ的基因產(chǎn)物或者細(xì)胞色素P450如CYP4家族的基因產(chǎn)物形成，從而產(chǎn)生 3- 丁烯-2-醇。參見例如，圖8。
[0113] 4. 2在丁二烯的生物合成中產(chǎn)生第二末端乙烯基的酶
[0114] 如圖9-11中所示，第二乙烯基可使用甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（MDD)、異戊二烯合 酶（ISPS)，或者脫水酶酶促形成。
[0115] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶 (MDD)，一種歸類在EC 4. I. 1. 33下的酶形成。參見例如，圖9。
[0116] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過異戊二烯合酶（ISPS)，一 種歸類在4. 2. 3. 27下的酶酶促形成。參見例如，圖10。
[0117] 在一些實施方案中，導(dǎo)致丁二烯合成的第二乙烯基通過酶種類EC 4. 2.L-中的 脫水酶，具體為芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇維酮水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸水合酶 (EC 4. 2. 1. 53)或者類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)酶促形成。參見例如，圖11。
[0118] 可將芳樟醇視為在a位置取代有異己烯基R基團的3-丁烯-2-醇。芳樟醇脫水 成香葉烯在熱力學(xué)上是有利的并且很可能經(jīng)去質(zhì)子化進行，其中R基團在機理上不具有作 用（Bordkorb 等人，J. Biol. Chem.，2010, 285 (40)，30436-30442)。
[0119] 油酸水合酶將長鏈不飽和的脂肪酸油酸轉(zhuǎn)化成（R)-IO-羥基硬脂酸 ((R)-lO-hydroxystearate)。然而，在篩查E.meningoseptica的油酸水合酶序列的 165 個同系物中，數(shù)個同系物接受異丁醇作為底物形成異丁烯（Bianca等人，Appl. Microbiol Biotechnol.，2012, 93, 1377-1387)。
[0120] 4.3生物化學(xué)途徑
[0121] 4. 3. 1使用2-氧代戊-4-烯酸作為丁二烯的中心前體的途徑
[0122] 充分表征了從諸如以下的芳族化合物產(chǎn)生2-氧代戊-4-烯酸的途徑：原兒茶酸 (Kasai 等人，J. Bacteriol.，2009, 191 (21)，6758 - 6768)、兒茶酚（He 和 Spain, J. Bacterio 1. , 1998, 180(9), 2502 - 2506)、鄰氨基苯甲酸（Muraki 等人，Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (3)，1564 - 1572)和 3-苯基丙酸（Ferrandez 等人，J. Bacteriol.， 1997, 179 (8)，2573 - 2581)。經(jīng) 3_ 去氧莽草酸（3-dehydroshikimate)通過 3_ 去氧莽草酸 脫水酶（EC 4. 2. 1. 118)，經(jīng)分支酸通過鄰氨基苯甲酸合酶（EC 4. 1. 3. 27)，和經(jīng)L-苯基丙 氨酸通過苯基丙氨酸脫氨酶（EC 4. 3. 1. 24)和2-烯酸還原酶（EC 1. 3. 1. 31)，可將碳通量 從中心代謝物引導(dǎo)至這些降解途徑。
[0123] 在一些實施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法合成：通過鄰氨基苯甲 酸合酶（EC 4. 1.3.27)將中心代謝物分支酸轉(zhuǎn)化成鄰氨基苯甲酸；然后通過鄰氨基苯 甲酸1，2-雙加氧酶（EC 1.14. 12. 1)轉(zhuǎn)化成兒茶酚；然后通過兒茶酚2, 3-雙加氧酶 (EC 1. 13. 11. 2)轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸半醛；然后通過2-羥基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)轉(zhuǎn)化成2-氧代戊-4-烯酸。另外，可將2-羥基粘康酸半醛通過氨基粘康酸半醛 去氫酶（EC 1. 2. 1. 32)轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸，可將2-羥基粘康酸通過2-羥基粘康酸互變 異構(gòu)酶（EC 5. 3. 2. 6)轉(zhuǎn)化成4-草酰巴豆酸，并且可將4-草酰巴豆酸通過4-草酰巴豆酸 脫羧酶（EC 4. I. 1. 77)轉(zhuǎn)化成2-氧代戊-4-烯酸。參見例如，圖2。
[0124] 在一些實施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法合成：將中心代謝物3-去氫 莽草酸通過3-去氫莽草酸脫水酶（EC 4. 2. 1. 118)轉(zhuǎn)化成原兒茶酸；然后通過原兒茶酸脫 羧酶（EC 4. I. 1. 63)轉(zhuǎn)化成兒茶酚；然后通過兒茶酚2, 3-雙加氧酶（EC 1. 13. 11. 2)轉(zhuǎn)化 成2-羥基粘康酸半醛；然后通過2-羥基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者通過氨基 粘康酸半醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 32)、2_羥基粘康酸互變異構(gòu)酶（EC 5. 3. 2. 6)和4-草酰巴 豆酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 77)轉(zhuǎn)化成2-氧代戊-4-烯酸。參見例如，圖2。
[0125] 在一些實施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法合成：將中心代謝物3-去 氫莽草酸通過3-去氫莽草酸脫水酶（EC 4. 2. 1. 118)轉(zhuǎn)化成原兒茶酸；然后通過原兒茶 酸2, 3-雙加氧酶如praA的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成5-羧基-2-輕基粘康酸-6-半醒；然后通 過5-羧基-2-輕基粘康酸-6-半醒脫羧酶如praH的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成2-輕基粘康酸半 醛；然后通過2-羥基粘康酸-半醛水解酶（EC 3. 7. 1. 9)或者通過氨基粘康酸半醛去氫 酶（EC 1. 2. 1. 32)、2-羥基粘康酸互變異構(gòu)酶（EC 5. 3. 2. 6)和4-草酰巴豆酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 77)轉(zhuǎn)化成2-氧代戊-4-烯酸。參見例如，圖2。
[0126] 在一些實施方案中，2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法合成：將中心代謝物 L-苯基丙氨酸通過苯基丙氨酸脫氨酶（EC 4.3.1.24)轉(zhuǎn)化成E-肉桂酸；然后通過 2-烯酸還原酶（EC 1.3. 1.31)轉(zhuǎn)化成3-苯基-丙酸；然后通過3-苯基丙酸雙加氧 酶（3-phenylpropanoate dioxygenase) (EC L 14. 12. 19)轉(zhuǎn)化成順式 _3_(羧基-乙 基）-3, 5-環(huán)-己二烯-1，2-二醇；然后通過3-(順式-5, 6-二輕基環(huán)己-1，3-二烯-1-基） 丙酸去氫酶（EC L 3. L 87)轉(zhuǎn)化成 2, 3-二輕基苯基丙酸（2, 3-dihydroxyphenylpropiono ate);然后通過3-羧基乙基兒茶酚2, 3-雙加氧酶（EC 1. 13. 11. 16)轉(zhuǎn)化成2-羥基-6-氧 代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸；然后通過2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯壬二酸水解酶（EC 3. 7. 1. 14)轉(zhuǎn)化成2-氧代戊-4-烯酸。參見例如，圖2。
[0127] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將2-氧代戊-4-烯酸通過 (R) -2-羥基異己酸去氫酶如LdhA的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成2-羥基戊-4-烯酸；然后通過CoA 轉(zhuǎn)移酶如GctAB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成2-羥基戊-4-烯酰基-CoA ;然后通過2-羥基異己酰 基-CoA脫水酶如起始子HadI和HadBC的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?CoA ;然后通 過烯?；?CoA脫水酶2 (EC 4. I. I. 119)轉(zhuǎn)化成（R) -3-羥基戊-4-烯?；?CoA ;然后通過 硫酯酶（EC 3. 1. 2.-)如tesB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯酸；然后通過甲羥戊 酸二磷酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖9。
[0128] (R)-2-羥基異己酸去氫酶（LdhA的基因產(chǎn)物）接受2-氧代戊酸 (2-oxopentanoate)和 2_ 氧代己酸（2-oxohexanoate)作為底物（Kim, On the enzymatic mechanism of 2-hydroxyisocaproyI-CoA dehydratase from Clostridium difficile，2004, Ph. D. dissertation，Philipps-Universiliit，Marburg，2004)。2_氧代戊酸 是2-氧代戊-4-烯酸的接近的底物類似物。
[0129] 戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶（GctAB)是雜亂酶，其接受長度為3-6個碳的碳鏈，所述碳 鏈為支化的和非支化的，a -取代的和未取代的單羧酸和二羧酸（參見例如，Buckel等人， Eur. J. Biochem.，1981，118, 315 - 321)。2-羥基戊-4-烯酸具有可比較的結(jié)構(gòu)和官能團，其 中CoA活化是2-羥基異己?；?CoA脫水酶的活性所需要的。
[0130] 2-羥基異己?；?CoA脫水酶（HadI和HadBC)接受底物類似物2-羥基 戊-4-烯酰基-CoA作為底物，從而合成2, 4-戊二烯?；?CoA (Kim等人，Nature Letters,2008, 452, 239 - 243)。
[0131] 短和中碳鏈酰基-CoA底物的水解已經(jīng)使用tesB的基因產(chǎn)物證實（Liu 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ,2007, 76, 811-818)。tesB 的硫酯酶 II 基 因產(chǎn)物有效水解（R) _3_輕基戊?；?CoA (Martin和Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61-67)。
[0132] 4. 3. 2合成作為通向丁二烯的中心前體的前體的丙?；?CoA的途徑
[0133] 在一些實施方案中，丙酰基-輔酶A (CoA)是在合成丁二烯中通向中心前體的前體 (參見例如，圖3)。
[0134] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物琥珀酸單酰 基-CoA通過甲基丙二酸單?；?CoA變位酶（EC 5. 4. 99. 2)轉(zhuǎn)化成（2R)-甲基丙二酸單酰 基-CoA;然后通過甲基丙二酸單酰基-CoA差向異構(gòu)酶（EC 5. 1.99. 1)轉(zhuǎn)化成（2S)-甲基 丙二酸單?；?CoA ;然后通過甲基丙二酸單酰基-CoA羧基轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 1. 3. 1)或者甲基 丙二酸單?；?CoA脫羧酶（EC 4. I. 1. 41)轉(zhuǎn)化成丙?；?CoA。參見例如，圖3。
[0135] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物L(fēng)-蘇氨酸通 過蘇氨酸脫氨酶（EC 4. 3. 1. 19)轉(zhuǎn)化成2-氧代丁酸（2-oxobutyrate);然后通過2-酮丁 酸甲酸裂解酶如tdcE的基因產(chǎn)物（EC 2.3. 1.-)轉(zhuǎn)化成丙?；?CoA (參見Tseng等人， Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。參見例如，圖 3。
[0136] 作為其它產(chǎn)物的前體，來自L-蘇氨酸的丙?；?CoA在細(xì)胞內(nèi)累積已經(jīng)被證實 (Tseng 等人，Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。
[0137] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將1，2-丙二醇通過丙二醇脫 水酶（EC 4. 2. 1. 28)轉(zhuǎn)化成丙醛；然后通過CoA依賴性丙醛去氫酶如pduP的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 成丙醜基-CoA(參見 Luo 等人，Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6)。參見例如，圖 3。
[0138] 來自1，2-丙二醇的丙?；?CoA在細(xì)胞內(nèi)累積已經(jīng)被報導(dǎo)（Luo等人，Bioresource Technology, 2012, 103, 1-6)。
[0139] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將碳源3-乙酰丙酸 (levulinic acid)通過酰基-CoA合成酶或者連接酶（EC 6. 2. 1.-)轉(zhuǎn)化成3-乙酰丙酰 基-CoA ;然后通過EC 2. 3. 1.-中的轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化成丙?；?CoA (Jaremko和Yu, Journal of Biotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298)。參見例如，圖 3。
[0140] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物丙酮酸通過 L-乳酸去氫酶（EC I. I. 1. 27)轉(zhuǎn)化成L-乳酸（L-Iactate);然后通過丙酸CoA-轉(zhuǎn)移酶 (proprionate CoA-transferase) (EC 2. 8. 3. 1)轉(zhuǎn)化成乳醜基-CoA ;然后通過乳醜基-CoA 脫水酶（EC 4. 2. 1. 54)轉(zhuǎn)化成丙烯?；?CoA;然后通過丁酰基-CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 1) 或者中鏈?；?CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 7)轉(zhuǎn)化成丙酰基-CoA。參見例如，圖3。
[0141] 在一些實施方案中，丙?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物丙二酸單酰 基-CoA通過丙二酸單酰基-CoA還原酶（EC 1. 2. 1. 75)轉(zhuǎn)化成丙二酸半醛；然后通過3-羥 基丙酸去氫酶（EC I. I. 1. 59)轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸；然后通過3-羥基異丁?；?CoA水解 酶（EC 3. 1. 2. 4)轉(zhuǎn)化成3-羥基丙?；?CoA;然后通過3-羥基丙?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 116)轉(zhuǎn)化成丙烯酰基-CoA ;然后通過丁?；?CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 1)或者中鏈酰 基-CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 7)轉(zhuǎn)化成丙酰基-CoA。參見例如，圖3。
[0142] 4. 3. 3使用丙烯?；?CoA作為丁二烯的中心前體的途徑
[0143] 在一些實施方案中，丙烯?；?CoA從丙?；?CoA通過丁?；?CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 1)或者中鏈?；?CoA去氫酶（EC 1. 3. 8. 7)合成。參見例如，圖3。
[0144] 在一些實施方案中，丙烯酰基-CoA通過以下方法合成：將中心代謝物丙酮酸通過 L-乳酸去氫酶（EC I. I. 1. 27)轉(zhuǎn)化成L-乳酸；然后通過丙酸CoA-轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 8. 3. 1)轉(zhuǎn) 化成乳酰基-CoA;然后通過乳?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 54)轉(zhuǎn)化成丙烯酰基-CoA。參 見例如，圖3。
[0145] 在一些實施方案中，丙烯?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物丙二酸單酰 基-CoA通過丙二酸單?；?CoA還原酶（EC 1. 2. 1. 75)轉(zhuǎn)化成丙二酸半醛；然后通過3-羥 基丙酸去氫酶（EC I. I. 1. 59)轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸；然后通過3-羥基異丁酰基-CoA水解 酶（EC 3. 1. 2. 4)轉(zhuǎn)化成3-羥基丙?；?CoA;然后通過3-羥基丙?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 116)轉(zhuǎn)化成丙烯酰基-CoA。參見例如，圖3。
[0146] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將丙烯酰基-CoA通過酮硫解 酶如EC 2. 3. 1. 16轉(zhuǎn)化成3-氧代戊_4_烯醜基-CoA;然后通過乙醜乙醜基-CoA還原酶 (EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯?；?CoA;然后通過硫酯 酶（EC. 3. 1. 2.-)如tesB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯酸；然后通過甲羥戊酸二 磷酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖9。
[0147] 4. 3. 4使用（R) 3-羥基戊-4-烯酸作為丁二烯的中心前體的途徑
[0148] 在一些實施方案中，（R)3_羥基戊-4-烯酸通過以下方法合成：將丙?；?CoA通 過乙?；?CoA C-酰基轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 16)轉(zhuǎn)化成3-氧代戊?；?CoA;然后通過乙酰 乙酰基-CoA還原酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基戊?；?CoA; 然后通過硫酯酶如tesB的基因產(chǎn)物（EC 3. 1. 2.-)轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA ; 然后通過去飽和酶如MdpJ的基因產(chǎn)物或者細(xì)胞色素P450如CYP4家族的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成 (R) 3-羥基戊-4-烯酸。參見例如，圖4。
[0149] 羧酸通過CYP4家族中的細(xì)胞色素P450酶的末端去飽和已有闡述。通過除去末端 的氫，CYP4B1將十二碳鏈長度的脂肪酸月桂酸去飽和（Guan等人，Chemico-Biology Interactions, 1998, 110, 103 - 121)。
[0150] 在一些實施方案中，丁二烯從（R) 3-羥基戊-4-烯酸通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶 (EC 4. I. 1. 33)合成。參見例如，圖9。
[0151] 4. 3. 5使用2, 4-戊二烯?；鵢[acp]作為丁二烯的中心前體的途徑
[0152] 在一些實施方案中，（R)3_羥基戊-4-烯?；鵢[acp]通過以下方法合成：將丙酰 基-CoA通過乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 16)轉(zhuǎn)化成3-氧代戊?；?CoA ;然后 通過3-羥基酰基-CoA去氫酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基戊酰 基-CoA;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成戊-2-烯 酰基-CoA;然后在與?；D(zhuǎn)移酶如tcsA的基因產(chǎn)物的反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成戊-2-烯?；鵢[acp]; 然后通過?；鵢[acp]去氫酶如TcsD的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R) 2, 4-戊二烯?；鵢[acp]。參見 例如，圖5。
[0153] 在一些實施方案中，（R)3_羥基戊-4-烯?；鵢[acp]通過以下方法合成：將丙 ?；?CoA通過P -酮?；?[acp]合酶I (EC 2. 3. 1. 41)如tcsB和?；?轉(zhuǎn)移酶如tcsA 轉(zhuǎn)化成3-氧代戊?；鵢[acp];然后通過3-氧代?；?[?；?載體-蛋白]還原酶（EC 1.1. 1.100)轉(zhuǎn)化成（R)3-羥基戊?；?CoA;然后通過3-羥基?；鵢[acp]脫水酶（EC 4. 2. 1. 59)轉(zhuǎn)化成戊-2-烯?；?[acp];然后通過?；鵢[acp]去氫酶如TcsD的基因產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?[acp]。參見例如，圖5。
[0154] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將（R)-3_羥基戊-4-烯酰 基- [acp]通過（R)-3-輕基酰基- [acp] : CoA轉(zhuǎn)酰酶如phaG的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-輕 基戊-4-烯?；?CoA;然后通過硫酯酶如tesB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯酸； 然后通過甲羥戊酸二磷酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖9。
[0155] phaj的基因產(chǎn)物（EC 4.2. 1. 119)是關(guān)鍵酶，用于將來自脂肪酸合成的短和中 鏈R-特異性3-輕基?；?CoA單體提供至聚輕基燒酸酯合酶（Chung和Rhee, Biosci. Biotechnol.Biochem. , 2012, 76(3), 613-616 ；Tsuge 等人，International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31，195-205)。
[0156] 使用4-戊烯酸作為產(chǎn)生聚羥基烷酸酯的細(xì)菌的碳源，經(jīng)氧化產(chǎn)生（R)-3-羥 基戊-4-烯酸。因此，將4-戊烯酸轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?CoA，其在通過R-特異性烯酰 基-CoA脫水酶活性水合成（R)-3-羥基戊-4-烯酸之后可用于聚合物合酶（Ulmer等人，M acromolecules，1994, 27, 1675-1679)。
[0157] 4. 3. 6使用2, 4戊二烯酰基-CoA作為丁二烯的中心前體的途徑
[0158] 在一些實施方案中，2, 4-戊二烯酰基-CoA通過以下方法合成：將丙?；?CoA通 過乙?；?CoA C-酰基轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成3-氧代-戊酰 基-CoA;然后通過3-羥基?；?CoA去氫酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成 (R) 3-羥基戊酰基-CoA;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化成戊-2-烯酰基-CoA ;然后通過異構(gòu)酶（EC 5. 3. 3. 8)轉(zhuǎn)化成戊-3-烯?；?CoA ;然后 通過2, 4-二烯酰基輔酶A還原酶（EC I. 3. I. 34)轉(zhuǎn)化成2, 4,-戊二烯?；?CoA。參見例 如，圖6。
[0159] 在一些實施方案中，2, 4-戊二烯?；?CoA通過以下方法合成：將丙?；?CoA通 過乙酰基-CoA C-?；D(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成3-氧代-戊酰 基-CoA ;然后通過3-羥基?；?CoA去氫酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成 (R) 3-羥基戊?；?CoA ;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化成戊-2-烯?；?CoA ;然后通過異構(gòu)酶（EC 5. 3. 3. 8)轉(zhuǎn)化成戊-3-烯?；?CoA ;然后 通過2, 4-二烯酰基輔酶A還原酶（EC 1. 3. 1. 34)轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?CoA。參見例 如，圖6。
[0160] 在一些實施方案中，2, 4-戊二烯?；?CoA通過以下方法合成：將丙酰基-CoA通 過乙?；?CoA C-酰基轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 16)如bktB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成3-氧代-戊酰 基-CoA ;然后通過3-羥基?；?CoA去氫酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成 (R) 3-羥基戊?；?CoA;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. I. 119)如phaj的基因產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化成2E-戊烯?；?CoA ;然后通過反式-2-烯?；?CoA還原酶如EC 1. 3. 1. 38轉(zhuǎn)化成 戊酰基-CoA;然后通過細(xì)胞色素P450單氧化酶如CYP153A6的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成5-羥基戊 ?；?CoA ;然后通過5-羥基戊酰基-CoA脫水酶（EC 4. 2. 1.-)(例如，來自Clostridium viride)轉(zhuǎn)化成2, 4,-戊二烯?；?CoA。參見例如，圖6。
[0161] 在一些實施方案中，2, 4-戊二烯?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物 L-谷氨酸通過谷氨酸5-激酶（EC 2.7.2. 11)轉(zhuǎn)化成L-谷氨?；?5-磷酸；然后通過谷氨 酸-5-半醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 41)轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸-5-半醛；然后自發(fā)轉(zhuǎn)化成（S) -1-吡 咯啉-5-羧酸；然后通過吡咯啉-5-羧酸還原酶（EC 1. 5. 1. 2)轉(zhuǎn)化成L-脯氨酸；然后通過 脯氨酸消旋酶（EC 5. I. 1. 4)轉(zhuǎn)化成D-脯氨酸；然后通過D-脯氨酸還原酶（EC 1. 21. 4. 1) 轉(zhuǎn)化成5-氨基戊酸；然后通過5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶（EC 2. 6. 1. 48)轉(zhuǎn)化成5-氧代戊酸；然 后通過5-輕基戊酸去氫酶如cpnD的基因產(chǎn)物或者來自Clostridium viride的去氫酶轉(zhuǎn) 化成5-羥基戊酸；然后通過5-羥基戊酸CoA-轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 8. 3. 14)轉(zhuǎn)化成5-羥基戊 ?；?CoA ;然后通過5-羥基戊?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1.-)(例如，來自Clostridium viride)轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?CoA。參見例如，圖6。
[0162] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將2, 4-戊二烯酰基-CoA通過烯 ?；?CoA脫水酶2(EC 4. 2. 1. 119)如phaj的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯酰 基-CoA;然后通過硫酯酶如tesB的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基戊-4-烯酸；然后通過甲 羥戊酸二磷酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖9。
[0163] phaj的基因產(chǎn)物（EC 4.2. 1. 119)是關(guān)鍵酶，用于將來自脂肪酸合成的短和中 鏈R-特異性3-輕基酰基-CoA單體提供至聚輕基燒酸酯合酶（Chung和Rhee, Biosci. Biotechnol. Biochem.，2012,76(3)，613 - 616 ;Tsuge 等人，International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 31，195-205)。
[0164] 使用4-戊烯酸作為產(chǎn)生聚羥基烷酸酯的細(xì)菌的碳源，經(jīng)氧化產(chǎn)生（R)-3-羥 基戊-4-烯酸。因此，將4-戊烯酸轉(zhuǎn)化成2, 4-戊二烯?；?CoA，其在通過R-特異性烯 ?；?CoA脫水酶活性水合成（R)-3-羥基戊-4-烯酸之后可用于聚合物合酶（參見例如， Ulmer等人，Macromolecules,1994, 27, 1675 - 1679)。
[0165] 4. 3. 7使用巴豆?；?CoA作為丁二烯的中心前體的途徑
[0166] 在一些實施方案中，巴豆?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物乙?；?CoA 通過乙酰基-CoA C-乙?；D(zhuǎn)移酶（EC 2. 3. 1. 9)如atoB或者phaA的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成乙 酰乙?；?CoA ;然后通過3-羥基丁?；?CoA去氫酶（EC I. I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基丁酰基-CoA ;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC 4. 2. 1. 119)如phaj的 基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成巴豆酰基-CoA。參見例如，圖7。
[0167] 在一些實施方案中，巴豆酰基-CoA通過以下方法合成：將中心代謝物琥珀酸單酰 基-CoA通過琥珀酸-半醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 76)轉(zhuǎn)化成琥珀酸半醛；然后通過4-羥基丁 酸去氫酶（EC I. I. 1. 61)轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酸；然后通過CoA-轉(zhuǎn)移酶如Ck-cat2的基因產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化成4-羥基丁酰基-CoA ;然后通過4-羥基丁?；?CoA脫水酶（EC 4. 2. 1. 120)和乙 烯基乙酰基-CoA異構(gòu)酶（EC 5. 3. 3. 3)轉(zhuǎn)化成巴豆?；?CoA。參見例如，圖7。
[0168] 在一些實施方案中，巴豆?；?CoA通過以下方法合成：將中心代謝物2-氧 代-戊二酸通過2-羥基戊二酸去氫酶（EC I. 1. 99. 2)轉(zhuǎn)化成2-羥基戊二酸；然后通過 戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶（EC 2. 8. 3. 12)轉(zhuǎn)化成2-羥基戊二酸單酰基-CoA ;然后通過脫水 酶（EC 4. 2. 1.-)轉(zhuǎn)化成戊烯二酸單?；?CoA ;然后通過戊烯二酸單?；?CoA脫羧酶（EC 4. I. 1. 70)轉(zhuǎn)化成巴豆?；?CoA。參見例如，圖7。
[0169] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將巴豆?；?CoA通過琥珀酸-CoA 連接酶（EC 6. 2. 1. 5)轉(zhuǎn)化成巴豆酸；然后通過長鏈醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 48)轉(zhuǎn)化成2- 丁 烯-醛；然后通過丙烯醇去氫酶（EC 1.1. 1.54)轉(zhuǎn)化成2-丁烯-1-醇；然后通過甲羥戊 酸激酶（EC 2.7. 1.36)轉(zhuǎn)化成2-丁烯-1-醇磷酸酯；然后通過磷酸甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2)轉(zhuǎn)化成2- 丁烯-1-醇二磷酸酯；然后通過異戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)轉(zhuǎn)化成 丁二烯。參見例如，圖10。
[0170] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將巴豆?；?CoA通過琥珀酸-CoA 連接酶（EC 6. 2. 1. 5)轉(zhuǎn)化成巴豆酸；然后通過長鏈醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 48)轉(zhuǎn)化成2- 丁 烯-醛；然后通過丙烯醇去氫酶（EC I. I. 1. 54)轉(zhuǎn)化成2- 丁烯-1-醇；然后通過二磷酸轉(zhuǎn) 移酶如硫胺素二磷酸激酶（EC 2. 7. 6. 2)轉(zhuǎn)化成2- 丁烯-1-醇二磷酸酯；然后通過異戊二 烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖10。
[0171] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將巴豆?；?CoA通過琥珀酸-CoA 連接酶（EC 6. 2. 1. 5)轉(zhuǎn)化成巴豆酸；然后通過長鏈醛去氫酶（EC 1. 2. 1. 48)轉(zhuǎn)化成2- 丁 烯-醛；然后通過丙烯醇去氫酶（EC I. I. 1. 54)轉(zhuǎn)化成2- 丁烯-1-醇；然后通過酶種類EC 4. 2. 1.-中的脫水酶如芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇維酮水合酶（EC 4. 2. 1. 95)、油酸 水合酶（EC 4. 2. 1. 53)或者類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見 例如，圖11。
[0172] 4. 3. 8使用3- 丁烯-2-醇作為丁二烯的中心前體的途徑
[0173] 在一些實施方案中，3-丁烯-2-醇通過以下方法合成：將中心代謝物丙酮酸通過 乙酰乳酸合酶（EC 2. 2. 1. 6)轉(zhuǎn)化成2-乙酰乳酸；然后通過乙酰乳酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 5) 轉(zhuǎn)化成（R)-3-羥基丁酮；然后通過（R，R) _ 丁二醇去氫酶（EC I. I. 1. 4)轉(zhuǎn)化成2, 3 丁二 醇；然后通過丙二醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 28)轉(zhuǎn)化成丁酮；然后通過（R)-特異性仲醇去氫酶 (EC I. I. I. B4)轉(zhuǎn)化成2- 丁醇；然后通過去飽和酶或者單氧化酶如MdpJ的基因產(chǎn)物或者 細(xì)胞色素P450(例如，在CYP4家族中）轉(zhuǎn)化成3- 丁烯-2-醇。參見例如，圖8。
[0174] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將3- 丁烯-2-醇通過甲羥戊酸激 酶（EC 2. 7. 1. 36)轉(zhuǎn)化成3-丁烯-2-醇磷酸酯；然后通過磷酸甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2) 轉(zhuǎn)化成3- 丁烯-2-醇二磷酸酯；然后通過異戊二烯合酶（EC 4. 2. 3. 27)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參 見例如，圖10。
[0175] 在一些實施方案中，丁二烯通過以下方法合成：將3-丁烯-2-醇通過二磷酸轉(zhuǎn)移 酶如硫胺素二磷酸激酶（EC 2. 7. 6. 2)轉(zhuǎn)化成3- 丁烯-2-醇二磷酸酯；然后通過異戊二烯 合酶（EC 4. 2. 3. 27)轉(zhuǎn)化成丁二烯。參見例如，圖10。
[0176] 在一些實施方案中，丁二烯從3-丁烯-2-醇通過酶種類EC 4. 2. L-中的脫 水酶如芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1.127)、奇維酮水合酶（EC 4. 2. 1.95)、油酸水合酶（EC 4. 2. 1.53)或者類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)合成。參見例如，圖11。
[0177] 4. 4培養(yǎng)策略
[0178] 在一些實施方案中，丁二烯在重組宿主中使用發(fā)酵策略生物合成，所述發(fā)酵策略 可包括厭氧地、微需氧地或者需氧地培養(yǎng)重組宿主。
[0179] 在合成丁二烯中，包括需要分子氧的酶和在體外表征為氧敏感性的酶的途徑需要 微需氧培養(yǎng)策略，從而維持低溶解氧濃度，同時維持足夠的氧轉(zhuǎn)移以防止底物氧化控制的 條件（Chayabatra 和 Lu-Kwang, Appl. Environ. Microbiol. ,2000, 66 (2) ,493 0 498)。
[0180] 在一些實施方案中，細(xì)胞保留策略（使用例如陶瓷中空纖維膜）用于在合成丁二 烯中的分批供料或者連續(xù)發(fā)酵期間實現(xiàn)和維持高細(xì)胞密度。
[0181] 在一些實施方案中，在合成丁二烯中供料至發(fā)酵的主要碳源來源于生物或者非生 物給料。
[0182] 在一些實施方案中，生物給料為，包括，或者衍生自單糖類、二糖類、木質(zhì)纖維素、 半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如3-乙酰丙酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯類如甘油和脂肪酸、農(nóng) 業(yè)廢物或者城市廢物。
[0183] 起源于生化柴油生產(chǎn)的粗制甘油的有效分解代謝已經(jīng)在數(shù)種微生物如大腸桿 菌、鉤蟲貪銅菌、食油假單胞菌、惡臭假單胞菌和解脂耶羅維亞酵母中證實（Lee等人， Appl.Biochem. Biotechnol.，2012, 166, 1801 - 1813 ;Yang 等人，Biotechnology for Biofuels, 2012, 5:13 ;Meijnen 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2011，90, 885-893)。
[0184] 木質(zhì)纖維素衍生的3-乙酰丙酸的有效分解代謝已經(jīng)在數(shù)種生物體如鉤蟲貪銅 菌和惡臭假單胞菌中在經(jīng)前體丙?；?CoA合成3-輕基戊酸（3-hydroxyvalerate)中 證實（Jaremko和Yu, Journal of Biotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298 ;Martin和 Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61 - 67)〇
[0185] 木質(zhì)素衍生的芳族化合物如苯甲酸類似物的有效分解代謝已經(jīng)在數(shù) 種微生物如惡臭假單胞菌、鉤蟲貪銅菌中證實（Bugg等人，Current Opinion in Biotechnology, 2011，22, 394 - 400 ;P6rez_Pantoja 等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0186] 農(nóng)業(yè)廢物如橄欖油廠廢水的有效利用已經(jīng)在包括解脂耶羅維亞酵母的數(shù)種微生 物中證實（Papanikolaou 等人，Bioresour. Technol.，2008, 99 (7)，2419-2428)。
[0187] 可發(fā)酵糖如衍生自纖維素、半纖維素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和 其它農(nóng)業(yè)來源的單糖類和二糖類的有效利用已經(jīng)在數(shù)種微生物如大腸桿菌、 谷氨酸棒狀桿菌和德氏乳桿菌和乳酸乳球菌中證實（參見例如，Hermann等 人，Journal of Biotechnology, 2003，104，155 - 172 ;Wee 等人，F(xiàn)ood Technol. Biotechnol.，2006, 44 (2)，163 - 172 ;0hashi 等人，Journal of Bioscience 和 Bioenginee ring, 1999, 87(5)，647-654)。
[0188] 衍生自多種農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素源的糠醛的有效利用已經(jīng)在鉤蟲貪銅菌中證實（Li 等人，Biodegradation, 2011，22, 1215 - 1225)。
[0189] 在一些實施方案中，非生物給料為或者衍生自天然氣、合成氣、C02/H 2、甲醇、乙醇、 或者來自環(huán)己烷氧化工藝的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或堿洗廢液流。
[0190] 甲醇的有效分解代謝已經(jīng)在甲基營養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母中證實。
[0191] 乙醇的有效分解代謝已經(jīng)在克魯佛梭菌中證實（Seedorf等人，？1~〇(：.似1:1.4〇3(1. Sci. USA, 2008, 105(6)2128-2133)。
[0192] CO2和H2(其可衍生自天然氣和其它化學(xué)和石化產(chǎn)品源）的有效分解代謝已經(jīng)在 鉤蟲貪銅菌中證實（Prybylski 等人，Energy, Sustainability and Society, 2012, 2:11)。
[0193] 合成氣的有效分解代謝已經(jīng)在大量微生物如楊氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌中證實 (Kdpke等人，Applied and Environmental Microbiology, 2011，77 (15)，5467 - 5475) 〇
[0194] 來自環(huán)己烷工藝的非揮發(fā)性殘留物廢物流的有效分解代謝已經(jīng)在大量微生物如 食酸代爾夫特菌和鉤蟲貪銅菌中證實（Ramsay等人，Applied and Environmental Microb iology，1986, 52(1)，152 - 156)。
[0195] 在一些實施方案中，宿主微生物為原核生物。例如，所述原核生物可來自埃希氏菌 屬如大腸桿菌；來自梭狀芽胞桿菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；來自棒 狀桿菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；來自貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；來自假單胞 菌屬如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；來自代爾夫特菌屬如食酸代爾夫 特菌；來自芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；來自乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者來自乳球菌屬 如乳酸乳球菌。這種原核生物也可為構(gòu)建本申請所述的能夠產(chǎn)生丁二烯的重組宿主細(xì)胞的 基因源。
[0196] 在一些實施方案中，所述宿主微生物為真核生物。例如，真核生物可來自曲霉菌屬 如黑曲霉菌；來自酵母菌屬如釀酒酵母菌；來自畢赤酵母菌屬如巴斯德畢赤酵母；或者來 自耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵 母屬如漢遜德巴利酵母；來自Arxula屬如Arxula adenoinivorans;或者來自克魯維酵母 屬如乳酸克魯維酵母菌。這種真核生物也可為構(gòu)建本申請所述的能夠產(chǎn)生丁二烯的重組宿 主細(xì)胞的基因源。
[0197] 4. 5代謝工程
[0198] 本申請?zhí)峁┓椒?，所述方法包括少于對所有上面途徑所述的所有步驟。這種方法 可包括，例如，這些步驟中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或者 更多個步驟。在這種方法包含少于所有步驟的情況下，第一步驟可為所列步驟中的任何步 驟。
[0199] 而且，本申請所述的重組宿主可包括上面的酶中的任何組合，使得所述步驟中的 一個或者多個，例如，這些步驟中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十 個或者更多個步驟可在重組宿主內(nèi)實施。
[0200] 另外，本申請認(rèn)識到，在已經(jīng)將酶描述為接受CoA活化的底物的情況下，存在與 [acp]結(jié)合底物相關(guān)的類似的酶活性，其不一定在相同酶種類中。
[0201] 此外，本申請認(rèn)識到，在已經(jīng)將酶描述為接受底物的（R)-對映異構(gòu)體的情況下， 存在與（S)-對映異構(gòu)體底物相關(guān)的類似的酶活性，其不一定在相同酶種類中。
[0202] 本申請還認(rèn)識到，在酶顯示接受特定輔助因子如NADPH或者共底物如乙?；?CoA 的情況下，許多酶在催化特定酶活性中在接受許多不同輔助因子或者共底物方面是雜亂的 (promiscuous)。此外，本申請認(rèn)識到，在酶對于例如特定輔助因子如NADH具有高特異性的 情況下，對于輔助因子NADPH具有高特異性的具有類似或者相同活性的酶可在不同酶種類 中。
[0203] 在一些實施方案中，在小節(jié)4. 3中概述的途徑中的酶是經(jīng)非直接或者合理的酶設(shè) 計方法的酶工程的結(jié)果，目標(biāo)為改善活性、改善特異性、減少反饋抑制、減少阻遏、改善酶溶 解度、改變立體特異性，或者改變輔助因子特異性。
[0204] 在一些實施方案中，將在小節(jié)4. 3中概述的途徑中的酶經(jīng)附加型或者染色體整合 方法基因給予（即，過表達(dá)）至所得的基因修飾生物體中。
[0205] 在一些實施方案中，使用基因組規(guī)模的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)如通量平衡分析來設(shè)計用 于將碳通量引導(dǎo)至丁二烯的基因組規(guī)模的弱化或者敲除策略。
[0206] 弱化策略包括但不限于使用轉(zhuǎn)位子、同源重組（雙交換方法）、誘變、酶抑制劑和 RNAi干擾。
[0207]在一些實施方案中，使用通量組（fluxomic)、代謝組（metabolomic)和轉(zhuǎn)錄組 (transcriptomal)數(shù)據(jù)通知或者支持基因組規(guī)模的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，由此在將碳通量引導(dǎo) 至丁二烯中設(shè)計基因組規(guī)模的弱化或者敲除策略。
[0208] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯?；?CoA的細(xì) 胞內(nèi)可用性）中，可將催化丙?；?CoA和乙酰基-CoA的水解的酶在宿主生物體中弱化。
[0209] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的丙?；?CoA或者丙烯酰基-CoA的細(xì) 胞內(nèi)可用性）中，將經(jīng)檸檬酸甲酯循環(huán)消耗丙酰基-CoA的酶在宿主生物體中弱化（Upton 和 Mckinney，Microbiology, 2007, 153, 3973-3982)。
[0210] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯?；?CoA的細(xì) 胞內(nèi)可用性）中，將消耗丙?；?CoA成丙酮酸的酶在宿主生物體中弱化。
[0211] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的丙酰基-CoA或者丙烯?；?CoA的細(xì) 胞內(nèi)可用性）中，將消耗丙?；?CoA成丙二酸單?；?CoA的酶在宿主生物體中弱化。
[0212] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的經(jīng)L-蘇氨酸作為中心代謝物的丙酰 基-CoA或者丙烯酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將抗反饋蘇氨酸脫氨酶基因工程化至宿 主生物體中（Tseng 等人，Microbial Cell Factories, 2010, 9:96)。
[0213] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙?；?CoA和丙?；?CoA/丙烯酰 基-CoA的縮合）中，可將催化乙?；?CoA縮合成乙酰乙?；?CoA的P -酮硫解酶如AtoB 或者PhaA的基因產(chǎn)物弱化。
[0214] 在一些實施方案（其使用天然累積聚羥基烷酸酯的宿主）中，可將聚合物合酶在 宿主株中弱化。
[0215] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，可 使用缺乏（例如，弱化的活性水平）在乙酸合成途徑（acetate synthesis pathway)中的 一種或者多種酶的宿主。例如，可使用缺乏磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（由Pta基因編碼）的宿主（Shen 等人，Appl. Environ. Microbio.，2011，77 (9)，2905 - 2915)。
[0216] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將 在乙酸合成途徑中編碼乙酸激酶（acetate kinase)的基因如ack弱化。
[0217] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將 編碼降解丙酮酸成乳酸的基因如IdhA弱化（Shen等人，Appl. Environ. Microbio.，2011，7 7(9)，2905-2915)。
[0218] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將 編碼降解磷酸烯醇丙酮酸成琥珀酸的基因如frdBC弱化（參見例如，Shen等人，2011，同 上）。
[0219] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將 編碼降解乙?；?CoA成乙醇的基因如adhE弱化（Shen等人，2011，同上）。
[0220] 在一些實施方案（其需要用于丁二烯合成的L-谷氨酸的細(xì)胞內(nèi)可用性）中，將催 化補充檸檬酸循環(huán)中間體的添補反應(yīng)的酶擴增。
[0221] 在一些實施方案（其使用MDD酶促形成第二乙烯基以形成丁二烯）中，tesB的硫 酯酶II基因產(chǎn)物將（R) -3-羥基戊-4-烯?；?CoA水解成（R) -3-羥基戊-4-烯酸。
[0222] 在一些實施方案（其中途徑在合成丁二烯中需要過量NADPH輔助因子）中，吡啶 核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因如UdhA在宿主生物體中過表達(dá)（Brigham等人，Advanced Biofuels and Bioproducts，2012, Chapter 39, 1065-1090)。
[0223] 在一些實施方案（其中途徑在合成丁二烯中需要過量NADPH輔助因子）中，甘油 醛-3P-去氫酶基因如GapN在宿主生物體中過表達(dá)（Brigham等人，2012,同上）。
[0224] 在一些實施方案（其中途徑在合成丁二烯中需要過量NADPH輔助因子）中，蘋果 酸酶基因如maeA或者maeB在宿主生物體中過表達(dá)（Brigham等人，2012，同上）。
[0225] 在一些實施方案（其中途徑在合成丁二烯中需要過量NADPH輔助因子）中，葡萄 糖-6-磷酸去氫酶基因如zwf在宿主生物體中過表達(dá)（Lim等人，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(6), 543-549) 〇
[0226] 在一些實施方案（其中途徑在合成丁二烯中需要過量NADPH輔助因子）中， 果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿主生物體中過表達(dá)（Becker等人，Journal of Biotechnology, 2007, 132, 99-109)〇
[0227] 在一些實施方案中，通過以基因工程的方式對細(xì)胞膜進行結(jié)構(gòu)修飾或者提高丁二 烯的任何相關(guān)轉(zhuǎn)運子活性，將丁二烯跨越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量增強或者擴 大。
[0228] 在一些實施方案中，將降解丁二烯成毒性中間體如1，2-環(huán)氧-3-丁烯和 1，2:3, 4-二環(huán)氧丁燒的加氧酶在宿主生物體中弱化（參見例如，Sweeney等人，Carcinoge nesis，1997, 18(4)，611 - 625)。
[0229] 本發(fā)明將在以下實施例中進一步描述，其不限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范 圍。
[0230] 實施例
[0231] 實施例I
[0232] 接受3-羥基戊-4-烯酸作為底物的甲羥戊酸二磷酸脫羧酶的酶活性
[0233] 在含有Luria Broth培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中的大腸桿菌中，將來自釀酒酵母菌、表 皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的his標(biāo)記的MDD基因克隆和表達(dá)。
[0234] 將來自每一誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的沉淀物通過離心收集，然后將沉淀物重新懸浮并 溶解。細(xì)胞碎片與上清液通過離心分離，并使用〇. 2 ii m濾器過濾。使用Ni-親和色譜從上 清液中純化MDD酶，濃縮并通過使用IOkDa聚醚砜膜超濾至50mM氨基丁三醇緩沖劑（pH = 7. 5)、IOOmM NaCl和5% (v/v)甘油中而進行緩沖交換。
[0235]天然酶活性在包含 50mM Tris-HCl (pH = 7. 5)、IOOmM NaCl、5% (v/v)甘油、IOmM MgCl2、15mM ATP和5mM天然底物甲羥戊酸二磷酸（來自Sigma Aldrich)的緩沖液中在30°C 得到證實。酶活性測定反應(yīng)通過以下方法引發(fā)：將10 U L每一純化的MDD酶添加至含有底 物的測定緩沖液中。所有三種MDD酶接受甲羥戊酸二磷酸作為底物，如經(jīng)LC-MS所證實。
[0236]非天然酶活性測定在包含 50mM Tris HCl(pH= 7.5)、100mM NaCl、5% (v/v)甘 油、IOmM MgCl2、15mM ATP和4mM非天然外消旋底物3-羥基戊-4-烯酸（純度>95%，來自 Epison Chimie)的緩沖液中在30°C進行。非天然活性測定在2mL隔膜密封的小瓶中進行， 由此允許丁二烯在頂部空間中的累積。反應(yīng)通過以下方法引發(fā)：將IOu L每一純化的MDD 酶變體添加至含有底物的測定緩沖液中。
[0237] 對于使用3-羥基戊-4-烯酸作為底物的非天然酶活性測定，來自釀酒酵母菌、表 皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的三種MDD酶具有相似的色譜圖和波譜。
[0238] 丁二烯標(biāo)準(zhǔn)物和測定樣品的保留時間在2%內(nèi)。丁二烯標(biāo)準(zhǔn)物的MS離子峰面積和 樣品的MS離子峰面積的比率適合在20%內(nèi)。此外，離子峰面積高于GC/MS的定量限。
[0239] 來自釀酒酵母菌、表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的MDD酶接受3-羥基戊-4-烯酸作 為底物，從而合成丁二烯。
[0240] 實施例2
[0241] 在接受3-羥基戊-4-烯酸作為底物中提高甲羥戊酸二磷酸脫羧酶活性的氨基酸 殘基
[0242] 圖13提供來自釀酒酵母菌、表皮葡萄球菌和肺炎鏈球菌的MDD酶的氨基酸序列， 酶的催化裂隙內(nèi)的保守殘基以粗體表示。
[0243] 使用總蛋白質(zhì)濃度和來自光密度測定法的純度，來自釀酒酵母菌的純化的MDD的 酶濃度為385iig/mL以及對于來自肺炎鏈球菌的純化的MDD，酶濃度為88iig/mL。
[0244] 假設(shè)作為非天然底物的3-羥基戊-4-烯酸不完全轉(zhuǎn)化，來自釀酒酵母菌的MDD 的比轉(zhuǎn)化率為809 [(m/z 54離子的峰面積）Aiig MDD)]以及來自肺炎鏈球菌的MDD為 3200[(m/z 54離子的峰面積V(ygMDD)]。因此，來自肺炎鏈球菌的MDD的比轉(zhuǎn)化率約為 來自釀酒酵母菌的MDD的比轉(zhuǎn)化率的四倍。來自表皮葡萄球菌的MDD的比轉(zhuǎn)化率位于來自 肺炎鏈球菌的MDD的比轉(zhuǎn)化率和來自釀酒酵母菌的MDD的比轉(zhuǎn)化率之間（未計算）。
[0245] 在催化性精氨酸殘基的區(qū)域（在釀酒酵母菌中在R158,在表皮葡萄球菌中在R144 以及在肺炎鏈球菌中在R144)中的氨基酸殘基揭示了在5個氨基酸殘基內(nèi)增加絲氨酸密 度的趨勢。在釀酒酵母菌中的R158在5個氨基酸殘基內(nèi)具有3個絲氨酸殘基（殘基153、 155,和159)，在表皮葡萄球菌中的R144在5個氨基酸殘基內(nèi)具有4個絲氨酸殘基（殘基 139、141、143,和145)以及在肺炎鏈球菌中的R144在5個氨基酸殘基內(nèi)具有5個絲氨酸殘 基（殘基139、141、142、143，和145)。參見例如圖13。
[0246] MDD在接受3-羥基戊-4-烯酸作為非天然底物中的活性隨著在催化裂隙的催化性 精氨酸殘基的區(qū)域內(nèi)絲氨酸密度增加而增加。
[0247] 實施例3
[0248] 接受反式-2-丁烯基焦磷酸（trans-2-butenylpyrophosphate)作為底物的異戊 二烯合酶的酶活性
[0249] 在含有Luria Broth培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中的大腸桿菌中，將來自銀白楊 (Populus alba)的his標(biāo)記的異戊二烯合酶（ISPS)基因克隆和表達(dá)。
[0250] 將來自每一誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的沉淀物通過離心收集，然后將沉淀物重新懸浮并 溶解。細(xì)胞碎片和上清液經(jīng)離心分離，并通過〇. 2 i! m濾器過濾。使用Ni-親和色譜從上清 液中純化ISPS酶變體，濃縮并使用IOkDa聚醚砜膜緩沖交換至50mM氨基丁三醇緩沖劑（pH =7. 5)、IOOmM NaCl 和 5 % (v/v)甘油中。
[0251]天然酶活性在包含 50mM Tris*HCl(pH = 7.5)、100mM NaCl、5% (v/v)甘油、20mM MgCl；^P5mM天然底物二磷酸二甲基烯丙酯（來自Sigma-Aldrich)的緩沖液中在30°C得到 證實。天然活性測定在2mL隔膜密封的小瓶中進行，由此允許異戊二烯在頂部空間中的累 積。酶活性測定反應(yīng)通過以下方法引發(fā)：將10 U L每一純化的ISPS酶添加至含有底物的測 定緩沖液中。來自銀白楊（P. alba)的ISPS接受焦磷酸二甲基烯丙酯作為底物，如經(jīng)GC-MS 所證實。
[0252]非天然酶活性測定在包含 50mM Tris ? HCl(pH = 7. 5)、100mM NaCl、5% (v/v) 甘油、20mM MgCl2和5mM非天然底物反式-2- 丁烯基焦磷酸（純度>90% )(來自DALTON Pharma Services)的緩沖液中在30°C進行。非天然活性測定在2mL隔膜密封的小瓶中進 行，由此允許丁二烯在頂部空間中的累積。酶活性測定反應(yīng)通過以下方法引發(fā)：將10 U L純 化的ISPS酶添加至含有底物的測定緩沖液中。
[0253] 丁二烯標(biāo)準(zhǔn)物和測定樣品的保留時間在2%內(nèi)。丁二烯標(biāo)準(zhǔn)物的MS離子峰面積和 樣品的MS離子峰面積的比率適合在20%內(nèi)。此外，離子峰面積高于GC/MS的定量限。
[0254] 銀白楊的ISPS酶接受反式-2- 丁烯基焦磷酸作為底物，從而合成丁二烯。
[0255] 其它實施方案
[0256] 應(yīng)理解的是，盡管結(jié)合【具體實施方式】描述了本發(fā)明，但是前面的描述意圖說明本 發(fā)明并且不意圖限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍通過所附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、優(yōu) 點和修飾在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 用于生物合成丁二烯的方法，所述方法包括在丁二烯合成底物中形成兩個末端乙烯 基。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在所述丁二烯合成底物中酶促形成第一乙烯基，從而產(chǎn)生 選自以下的化合物：2-氧代戊 -4_烯酸、丙烯基-CoA、（R) 3-輕基戊_4_烯酸、2, 4-戊二烯 醜基-[acp]、2, 4_戊二稀醜基-CoA、巴?醜基-CoA，和3_ 丁稀_2_醇。
3. 權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的方法，其中2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在EC 4. 1. 1.77中的4-草酰巴豆酸脫羧酶在（i)4-草酰巴豆酸中形成第一乙烯基， 使用歸類在EC 3.7. 1.9中的2-羥基粘康酸-半醛水解酶在（ii)2-羥基粘康酸半醛中形 成第一乙烯基，或者使用歸類在EC 3. 7. 1. 14中的2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯壬二酸水解 酶在（iii) 2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸中形成第一乙烯基。
4. 權(quán)利要求2或者3的方法，其中2-氧代戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 1. 2. 1. 32下的2氨基粘康酸半醛去氫酶將2-羥基粘康酸半醛轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸，使 用歸類在EC 5. 3. 2. 6下的2-羥基粘康酸互變異構(gòu)酶將2-羥基粘康酸轉(zhuǎn)化成4-草酰巴豆 酸，并使用歸類在EC 4. I. 1. 77下的4-草酰巴豆酸脫羧酶將4-草酰巴豆酸轉(zhuǎn)化成2-氧代 戊-4-烯酸。
5. 權(quán)利要求3或者權(quán)利要求4的方法，其中2-羥基粘康酸半醛通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在EC 1. 13. 11. 2下的兒茶酚2, 3-雙加氧酶將兒茶酚轉(zhuǎn)化成2-羥基粘康酸半醛。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中兒茶酚通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.14. 12. 1下的 鄰氨基苯甲酸1，2-雙加氧酶轉(zhuǎn)化鄰氨基苯甲酸或者使用歸類在EC 4. I. 1. 63下的原兒茶 酸脫羧酶轉(zhuǎn)化原兒茶酸。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中鄰氨基苯甲酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 1. 3. 27 下的鄰氨基苯甲酸合酶轉(zhuǎn)化分支酸。
8. 權(quán)利要求5的方法，其中原兒茶酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.118下 的3-去氫莽草酸脫水酶轉(zhuǎn)化3-去氫莽草酸。
9. 權(quán)利要求3或者4的方法，其中2-羥基粘康酸半醛通過以下方法產(chǎn)生：使用5-羧 基-2-輕基粘康酸-6-半醒脫羧酶轉(zhuǎn)化5-羧基-2-輕基粘康酸-6-半醒。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述5-羧基-2-羥基粘康酸-6-半醛脫羧酶由praH編 碼。
11. 權(quán)利要求8或者9的方法，其中5-羧基-2-羥基粘康酸-6-半醛通過以下方法產(chǎn) 生：使用原兒茶酸2, 3-雙加氧酶轉(zhuǎn)化原兒茶酸。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述原兒茶酸2, 3-雙加氧酶由praA編碼。
13. 權(quán)利要求3的方法，其中2-羥基-6-氧代-2, 4-二烯-1，9-壬二酸通過以下方法 產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 13. 11. 16下的3-羧基乙基兒茶酚2, 3-雙加氧酶轉(zhuǎn)化2, 3-二羥基 苯基丙酸。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中2, 3-二羥基苯基丙酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 3. 1. 87下的3-(順式-5, 6-二羥基環(huán)己-1，3-二烯-1-基）丙酸去氫酶轉(zhuǎn)化順式-3-(羧 基-乙基）_3, 5-環(huán)-己_稀-1，2- _醇。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中順式-3-(羧基-乙基）-3,5-環(huán)-己二烯-1,2-二醇通 過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 14. 12. 19下的3-苯基丙酸雙加氧酶轉(zhuǎn)化3-苯基-丙 酸。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中3-苯基-丙酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 3. 1. 31下的2-烯酸還原酶轉(zhuǎn)化E-肉桂酸。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中E-肉桂酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 3. 1. 24 下的苯基丙氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化L-苯基丙氨酸。
18. 權(quán)利要求1或者權(quán)利要求2的方法，其中所述丁二烯合成底物為丙?；?CoA。
19. 權(quán)利要求2或者權(quán)利要求18的方法，其中丙烯?；?CoA是通過以下方法產(chǎn)生的化 合物：使用歸類在EC 1.3. 8.1下的丁?；?CoA去氫酶或者歸類在EC 1.3. 8. 7下的中鏈酰 基-CoA去氫酶在（i)丙?；?CoA中形成第一乙烯基，使用歸類在EC 4. 2. 1. 54下的乳酰 基-CoA脫水酶在（ii)乳酰基-CoA中形成第一乙烯基，或者使用歸類在EC 4. 2. 1. 116下 的3-羥基丙?；?CoA脫水酶在（iii) 3-羥基丙?；?CoA中形成第一乙烯基。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中丙?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 1. 3. 1 下的甲基丙二酸單?；?CoA羧基轉(zhuǎn)移酶或者歸類在EC 4. I. 1. 41下的甲基丙二酸單酰 基-CoA脫羧酶轉(zhuǎn)化（2S)-甲基丙二酸單?；?CoA。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中（2S)-甲基丙二酸單?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 歸類在EC 5. 1.99. 1下的甲基丙二酸單?；?CoA差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化（2R)-甲基丙二酸單酰 基 _CoA。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中（2R)-甲基丙二酸單?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 歸類在EC 5. 4. 99. 2下的甲基丙二酸單酰基-CoA變位酶轉(zhuǎn)化琥珀酸單?；?CoA。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中丙?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 3. 1.-下的2-酮丁酸甲酸裂解酶轉(zhuǎn)化2-氧代-丁酸。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述2-酮丁酸甲酸裂解酶由tdcE編碼。
25. 權(quán)利要求23或者權(quán)利要求24的方法，其中2-氧代-丁酸通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在EC 4. 3. 1. 19下的蘇氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化L-蘇氨酸。
26. 權(quán)利要求18的方法，其中丙?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用丙醛去氫酶轉(zhuǎn)化丙 醇。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述丙醛去氫酶由pduP編碼。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中丙醇通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.28下的 丙二醇脫水酶轉(zhuǎn)化1，2-丙二醇。
29. 權(quán)利要求18的方法，其中丙?；?CoA由3-乙酰丙酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 2. 3. 1.-下的轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化3-乙酰丙?；?CoA。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中3-乙酰丙酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 6. 2. 1.-下的?；?CoA合成酶或者連接酶轉(zhuǎn)化3-乙酰丙酸。
31. 權(quán)利要求19的方法，其中乳?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 8. 3. 1 下的丙酸CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化L-乳酸。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中L-乳酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.1. 1.27下 的L-乳酸去氫酶轉(zhuǎn)化丙酮酸。
33. 權(quán)利要求19的方法，其中3-羥基丙?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2. 4下的3-羥基異丁?；?CoA水解酶轉(zhuǎn)化3-羥基丙酸。
34. 權(quán)利要求19的方法，其中3-羥基丙?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. I. 1. 59下的3-羥基丙酸去氫酶轉(zhuǎn)化丙二酸半醛。
35. 權(quán)利要求35的方法，其中丙二酸半醛通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 2. 1. 75 下的丙二酸單?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化丙二酸單酰基-CoA。
36. 權(quán)利要求2或者權(quán)利要求19的方法，其中丙酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 1. 3. 8. 1下的丁?；?CoA去氫酶或者歸類在EC 1. 3. 8. 7下的中鏈?；?CoA去氫 酶轉(zhuǎn)化丙烯酰基-CoA。
37. 權(quán)利要求2的方法，其中（R) 3-羥基戊-4-烯酸丙烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生： 使用去飽和酶/單氧化酶或者細(xì)胞色素 P450在（R) 3-羥基戊酸中形成第一乙烯基。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中（R)3-羥基-戊酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊?；?CoA。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中（R)3-羥基戊?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC I. I. 1. 36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊?；?CoA。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中3-氧代戊?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 3. 1. 16下的乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丙?；?CoA。
41. 權(quán)利要求2的方法，其中2, 4-戊二烯?；鵢[acp]通過以下方法產(chǎn)生：使用酰 基-[acp]去氫酶在戊_2_烯醜基_acp中形成第一乙烯基。
42. 權(quán)利要求2的方法，其中2, 4-戊二烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.-下的5-羥基戊?；?CoA脫水酶在（i) 5-羥基戊?；?CoA中形成第一乙烯基或者 使用歸類在EC 1. 3. 1. 34下的2, 4-二烯?；o酶A還原酶在（ii)戊-3-烯?；?CoA中 形成第一乙烯基。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述5-輕基戊酰基-CoA脫水酶來源于Clostridium viride。
44. 權(quán)利要求2的方法，其中巴豆?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. I. 1. 70下的戊烯二酸單?；?CoA脫羧酶在（i)戊烯二酸單?；?CoA中形成第一乙烯 基，使用歸類在EC 4. 2. 1. 120下的4-羥基丁?；?CoA脫水酶和歸類在EC 5. 3. 3. 3下的 乙烯基乙?；?CoA異構(gòu)酶在（ii) 4-羥基丁酰基-CoA中形成第一乙烯基，或者使用歸類在 EC 4. 2. 1. 119下的烯酰基-CoA水合酶在（iii) (R)3-羥基丁?；?CoA中形成第一乙烯基。
45. 權(quán)利要求2的方法，其中3-丁烯-2-醇通過以下方法產(chǎn)生：使用去飽和酶或者單 氧化酶在2- 丁醇中形成第一乙烯基。
46. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在（R)3-羥基戊-4-烯酸中通過甲羥戊酸 二磷酸脫羧酶（MDD)酶促形成。
47. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在2- 丁烯-1-醇二磷酸酯或者3- 丁 烯-2-醇二磷酸酯中通過異戊二烯合酶（ISPS)酶促形成。
48. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第二乙烯基在3- 丁烯-2-醇或者2- 丁烯-1-醇中通 過酶種類EC 4. 2. 1.-中的脫水酶酶促形成。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述脫水酶為芳樟醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 127)、奇維 酮水化酶（EC 4. 2. 1.95)、油酸水合酶（EC 4. 2. 1.53)或者類胡蘿卜素1，2-水合酶（EC 4. 2. 1. 131)。
50. 權(quán)利要求41的方法，其中戊-2-烯酰基-[acp]通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1. 59下的3-羥基?；鵢[acp]脫水酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊酰基-[acp]。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中（R)3-羥基戊?；?[acp]通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類 在EC I. I. 1. 100下的3-氧代?；?[acp]還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊?；?[acp]。
52. 權(quán)利要求18和權(quán)利要求51的方法，其中3-氧代戊酰基-[acp]通過以下方法產(chǎn) 生：使用歸類在EC 2. 3. 1. 41下的β -酮?；?[acp]合酶I和酰基-轉(zhuǎn)移酶如tcsA轉(zhuǎn)化 丙醜基_CoA。
53. 權(quán)利要求41的方法，其中戊-2-烯?；?[acp]通過以下方法產(chǎn)生：使用?；D(zhuǎn)移 酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯?；?CoA。
54. 權(quán)利要求53的方法，其中戊-2-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. I. 119下的烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊?；?CoA。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中（R)3-羥基戊酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC I. I. 1. 36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊?；?CoA。
56. 權(quán)利要求18和權(quán)利要求55的方法，其中3-氧代戊?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC 2. 3. 1. 16下的乙酰基-CoA C-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丙酰基-CoA。
57. 權(quán)利要求42和權(quán)利要求54的方法，其中戊-3-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC 5. 3. 3. 8下的異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化戊-2-烯?；?CoA。
58. 權(quán)利要求42的方法，其中5-羥基戊?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 8. 3. 14下的5-羥基戊酸CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化（i) 5-羥基戊酸或者使用細(xì)胞色素 P450轉(zhuǎn)化 (ii)戊?；?CoA。
59. 權(quán)利要求58的方法，其中所述細(xì)胞色素 P450是CYP153A6的基因產(chǎn)物。
60. 權(quán)利要求58的方法，其中5-羥基戊酸通過以下方法產(chǎn)生：使用5-羥基戊酸去氫 酶轉(zhuǎn)化5-氧代戊酸。
61. 權(quán)利要求60的方法，其中所述5-羥基戊酸去氫酶是cpnD的基因產(chǎn)物或者來自 Clostridium viride 的去氫酶。
62. 權(quán)利要求60的方法，其中5-氧代戊酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 6. 1. 48下的5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化5-氨基戊酸。
63. 權(quán)利要求6262的方法，其中5-氨基戊酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 21. 4. 1下的D-脯氨酸還原酶轉(zhuǎn)化D-脯氨酸。
64. 權(quán)利要求63的方法，其中D-脯氨酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 5. 1. 1.4下 的脯氨酸消旋酶轉(zhuǎn)化L-脯氨酸。
65. 權(quán)利要求64的方法，其中L-脯氨酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.5. 1.2下 的吡咯啉-5-羧酸還原酶轉(zhuǎn)化（S) -1-吡咯啉-5-羧酸。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中（S)-I-吡咯啉-5-羧酸通過以下方法產(chǎn)生：L-谷氨酸 5-半醒的自發(fā)轉(zhuǎn)化。
67. 權(quán)利要求66的方法，其中L-谷氨酸5-半醛通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 2. 1. 41下的谷氨酸-5-半醛去氫酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酰基-5-磷酸。
68. 權(quán)利要求67的方法，其中L-谷氨酰基-5-磷酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 7. 2. 11下的谷氨酸5-激酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸。
69. 權(quán)利要求54和權(quán)利要求58的方法，其中戊?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 1. 3. 1. 38下的反式_2_稀醜基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化戊_2_稀醜基_CoA。
70. 權(quán)利要求44的方法，其中戊烯二酸單?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.-下的脫水酶轉(zhuǎn)化2-羥基戊二酸單?；?CoA。
71. 權(quán)利要求70的方法，其中2-羥基戊二酸單?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 2. 8. 3. 12下的戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化2-羥基戊二酸。
72. 權(quán)利要求71的方法，其中2-羥基戊二酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. 1. 99. 2下的2-羥基戊二酸去氫酶轉(zhuǎn)化2-氧代戊二酸。
73. 權(quán)利要求44的方法，其中3-羥基丁?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. I. 1. 36下的3-羥基丁酰基-CoA去氫酶轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA。
74. 權(quán)利要求73的方法，其中乙酰乙酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 3. 1. 9下的乙?；?CoA C-乙?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化乙酰基-CoA。
75. 權(quán)利要求44的方法，其中4-羥基丁?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用CoA-轉(zhuǎn)移 酶轉(zhuǎn)化4-羥基丁酸。
76. 權(quán)利要求75的方法，其中所述CoA-轉(zhuǎn)移酶是Ck-cat2的基因產(chǎn)物。
77. 權(quán)利要求75的方法，其中4-羥基丁酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. I. 1. 61下的4-羥基丁酸去氫酶轉(zhuǎn)化琥珀酸半醛。
78. 權(quán)利要求77的方法，其中琥珀酸半醛通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 2. 1. 76 下的琥珀酸-半醛去氫酶轉(zhuǎn)化琥珀酸單?；?CoA。
79. 權(quán)利要求45的方法，其中2-丁醇通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC LI. 1.B4下 的（R)-特異性仲醇去氫酶轉(zhuǎn)化丁酮。
80. 權(quán)利要求79的方法，其中丁酮通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. 2. 1.28下的 丙二醇脫水酶轉(zhuǎn)化2, 3 丁二醇。
81. 權(quán)利要求80的方法，其中2, 3 丁二醇通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1.1. 1.4 下的（R，R)-丁二醇去氫酶轉(zhuǎn)化（R)-3-羥基丁酮。
82. 權(quán)利要求81的方法，其中（R)-3-羥基丁酮通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 4. I. 1. 5下的乙酰乳酸脫羧酶轉(zhuǎn)化2-乙酰乳酸。
83. 權(quán)利要求82的方法，其中2-乙酰乳酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 2. 1.6 下的乙酰乳酸合酶轉(zhuǎn)化丙酮酸。
84. 權(quán)利要求46的方法，其中（R) 3-羥基戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化3-羥基戊-4-烯?；?CoA。
85. 權(quán)利要求84的方法，其中3-羥基戊-4-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 4. 2. 1.下的烯?；?CoA脫水酶2轉(zhuǎn)化2, 4-戊二烯?；?CoA。
86. 權(quán)利要求85的方法，其中2, 4-戊二烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用2-羥基 異己?；?CoA脫水酶轉(zhuǎn)化2-羥基戊-4-烯酰基-CoA。
87. 權(quán)利要求86的方法，其中所述2-羥基異己?；?CoA脫水酶是起始子HadI和 HadBC的基因產(chǎn)物。
88. 權(quán)利要求86的方法，其中2-羥基戊-4-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 CoA-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化2-羥基戊-4-烯酸。
89. 權(quán)利要求88的方法，其中所述CoA-轉(zhuǎn)移酶是GctAB的基因產(chǎn)物。
90. 權(quán)利要求88的方法，其中2-羥基戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使用（R)-2-羥 基異己酸去氫酶轉(zhuǎn)化2-氧代戊-4-烯酸。
91. 權(quán)利要求90的方法，其中所述（R)-2-羥基異己酸去氫酶是來自艱難梭菌的LdhA 的基因產(chǎn)物。
92. 權(quán)利要求46的方法，其中（R)-羥基戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA。
93. 權(quán)利要求92的方法，其中（R) 3-羥基戊-4-烯酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 歸類在EC I. I. 1. 36下的乙酰乙?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代戊-4-烯酰基-CoA。
94. 權(quán)利要求93的方法，其中3-氧代戊-4-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用歸 類在EC 2. 3. 1. 16下的β -酮硫解酶轉(zhuǎn)化丙烯?；?CoA。
95. 權(quán)利要求46的方法，其中（R)-羥基戊-4-烯酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 3. 1. 2.-下的硫酯酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA。
96. 權(quán)利要求95的方法，其中（R) 3-羥基戊-4-烯?；?CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 (R) -3-羥基酰基-ACP: CoA轉(zhuǎn)酰酶轉(zhuǎn)化（R) -3-羥基戊-4-烯?；?[acp]。
97. 權(quán)利要求96的方法，其中所述（R)-3-羥基?；?ACP: CoA轉(zhuǎn)酰酶是phaG的基因產(chǎn) 物。
98. 權(quán)利要求96的方法，其中（R)-3-羥基戊-4-烯?；?[acp]通過以下方法產(chǎn)生： 使用歸類在EC 4. 2. 1. 59下的3-羥基?；?[?；?載體-蛋白]脫水酶轉(zhuǎn)化2, 4戊二烯 ?；? [acp]。
99. 權(quán)利要求95的方法，其中（R) 3-羥基戊-4-烯酰基-CoA通過以下方法產(chǎn)生：使用 歸類在EC 4. 2. I. 119下的烯?；?CoA脫水酶2轉(zhuǎn)化2, 4-戊二烯酰基-CoA。
100. 權(quán)利要求47的方法，其中2-丁烯-1-醇二磷酸酯通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 2. 7. 4. 2下的磷酸甲羥戊酸激酶或者使用歸類在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶轉(zhuǎn)化2-丁 烯-1-醇磷酸酯。
101. 權(quán)利要求100的方法，其中2-丁烯-1-醇磷酸酯通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 2. 7. 1. 36下的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醇。
102. 權(quán)利要求101的方法，其中2-丁烯-1-醇通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I. I. 1. 54下的丙烯醇去氫酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醛。
103. 權(quán)利要求102的方法，其中2-丁烯-1-醛通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 1. 2. 1. 48下的長鏈醛去氫酶轉(zhuǎn)化巴豆酸。
104. 權(quán)利要求103的方法，其中巴豆酸通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 6. 2. 1. 5下 的琥珀酸-CoA連接酶轉(zhuǎn)化巴豆?；?CoA。
105. 權(quán)利要求100和102的方法，其中2- 丁烯-1-醇二磷酸酯通過以下方法產(chǎn)生：使 用歸類在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶轉(zhuǎn)化2- 丁烯-1-醇。
106. 權(quán)利要求100或者105的方法，其中所述二磷酸激酶是歸類在EC 2. 7. 6. 2下的硫 胺素二磷酸激酶。
107. 權(quán)利要求47的方法，其中3- 丁烯-2-醇二磷酸酯通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類 在EC 2. 7. 6.-下的二磷酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇或者使用歸類在EC 2. 7. 4. 2下的磷酸 甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇磷酸酯。
108. 權(quán)利要求107的方法，其中3- 丁烯-2-醇磷酸酯通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在 EC 2. 7. 1. 36下的甲羥戊酸激酶轉(zhuǎn)化3- 丁烯-2-醇。
109. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述方法使用分離的酶進行。 11 〇.前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述方法使用包含所述酶的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物 進行。
111. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述方法在重組宿主中進行。
112. 權(quán)利要求111的方法，其中將所述重組宿主厭氧地、微需氧地或者需氧地培養(yǎng)。
113. 權(quán)利要求112的方法，其中在發(fā)酵期間將所述重組宿主細(xì)胞保留在陶瓷中空纖維 膜中，從而維持高細(xì)胞密度。
114. 權(quán)利要求112的方法，其中供給至所述發(fā)酵的主要碳源來源于生物或者非生物給 料。
115. 權(quán)利要求114的方法，其中所述生物給料來自于或者衍生自單糖類、二糖類、木質(zhì) 纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如3-乙酰丙酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯類如甘油和脂 肪酸、農(nóng)業(yè)廢物或者城市廢物。
116. 權(quán)利要求114的方法，其中所述非生物給料來自于或者衍生自天然氣、合成氣、 C02/H2、甲醇、乙醇、或者來自環(huán)己烷氧化工藝的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或堿洗廢液流。
117. 權(quán)利要求46的方法，其中所述歸類在EC 4. 1. 1.33下的甲羥戊酸二磷酸脫羧酶的 氨基酸序列在催化裂隙的催化性精氨酸殘基的任一側(cè)的五個殘基內(nèi)包含四個絲氨酸殘基 的最小數(shù)值。
118. 權(quán)利要求46的方法，其中所述甲羥戊酸二磷酸脫羧酶來源于鏈球菌屬或者葡萄 球菌屬。
119. 權(quán)利要求111的方法，其中所述宿主微生物是原核生物或者真核生物。
120. 權(quán)利要求1199的方法，其中所述宿主微生物是原核生物，所述原核生物來自埃希 氏菌屬如大腸桿菌；來自梭狀芽胞桿菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；來 自棒狀桿菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；來自貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；來自假 單胞菌屬如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；來自代爾夫特菌屬如食酸代 爾夫特菌；來自芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；來自乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者來自乳球 菌屬如乳酸乳球菌。
121. 權(quán)利要求119的方法，其中所述宿主微生物是真核生物，所述真核生物來自曲霉 菌屬如黑曲霉菌；來自酵母菌屬如釀酒酵母菌；來自畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母；來自 耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母 屬如漢遜德巴利酵母；來自Arxula屬如Arxula adenoinivorans ;或者來自克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母菌。
122. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中催化丙?；?CoA和乙?；?CoA的水解 的酶在宿主生物體中弱化。
123. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中經(jīng)檸檬酸甲酯循環(huán)消耗丙?；?CoA的酶 在宿主生物體中弱化。
124. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中消耗丙?；?CoA成丙酮酸的酶在宿主生 物體中弱化。
125. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中消耗丙酰基-CoA成丙二酸單?；?CoA 的酶在宿主生物體中弱化。
126. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中將抗反饋蘇氨酸脫氨酶基因工程化至宿 主生物體中。
127. 權(quán)利要求19、37、41或者42的方法，其中將催化乙?；?CoA縮合成乙酰乙酰 基-CoA的β -酮硫解酶如AtoB或者phaA的基因產(chǎn)物弱化。
128. 權(quán)利要求119的方法，其中將在天然累積聚羥基烷酸酯的宿主株中的聚合物合酶 弱化。
129. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的基因如？丨&弱 化。
130. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將編碼降解丙酸的乙酸激酶的基因如 ack弱化。
131. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將編碼降解丙酮酸成乳酸的基因弱 化。
132. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將編碼降解磷酸烯醇丙酮酸成琥珀酸 的基因如frdBC弱化。
133. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將編碼降解乙酰基-CoA成乙醇的基 因如adhE弱化。
134. 權(quán)利要求42的方法，其中將催化補充檸檬酸循環(huán)中間體的添補反應(yīng)的酶擴增。
135. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因如UdhA在 宿主生物體中過表達(dá)。
136. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將甘油醛-3P-去氫酶基因如GapN在 宿主生物體中過表達(dá)。
137. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將蘋果酸酶基因如maeA或者maeB在 宿主生物體中過表達(dá)。
138. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將葡萄糖-6-磷酸去氫酶基因如zwf 在宿主生物體中過表達(dá)。
139. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中將果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在宿 主生物體中過表達(dá)。
140. 權(quán)利要求19、37、41、42或者44的方法，其中通過以基因工程的方式對細(xì)胞膜進行 結(jié)構(gòu)修飾，將丁二烯跨越所述細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量增強或者擴大。
141. 權(quán)利要求120或者權(quán)利要求121的方法，其中通過以基因工程的方式使用于丁二 烯的任何相關(guān)的轉(zhuǎn)運子活性增加，將丁二烯跨越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量增強或 者擴大。 權(quán)利要求120或者權(quán)利要求121的方法，其中將降解丁二烯成毒性中間體如1，2_環(huán) 氧-3- 丁烯和1，2:3, 4-二環(huán)氧丁烷的加氧酶在宿主生物體中弱化。
142. 權(quán)利要求38、84、92,或者95的方法，其中所述硫酯酶是tesB的基因產(chǎn)物。
143. 權(quán)利要求39、55,或者93的方法，其中所述乙酰乙?；?CoA還原酶是phaB的基 因產(chǎn)物。
144. 權(quán)利要求40或者56的方法，其中所述乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶是BktB的基因 產(chǎn)物。
145. 權(quán)利要求44或者54的方法，其中所述烯酰基-CoA水合酶是phaj的基因產(chǎn)物。
146. 權(quán)利要求37或者45的方法，其中所述去飽和酶是MdpJ的基因產(chǎn)物。
147. 權(quán)利要求37或者45的方法，其中所述細(xì)胞色素 P450是CYP4家族的基因產(chǎn)物。
148. 權(quán)利要求52的方法，其中所述β -酮酰基_[acp]合酶I是tcsB的基因產(chǎn)物。
149. 權(quán)利要求52的方法，其中所述酰基-轉(zhuǎn)移酶是tcsA的基因產(chǎn)物。
【文檔編號】C12P5/02GK104321434SQ201280068870
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】P.S.珀爾曼, C.陳, A.波特斯, A.V.E.康拉蒂 申請人:英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司