具有編碼突變的乙酰羥酸合成酶蛋白大亞基的突變的多核苷酸且除草劑抗性增強(qiáng)的高粱植物的制作方法
【專利摘要】一種在其基因組中包括至少一種多核苷酸的高粱種子，該多核苷酸編碼多肽，該多肽在高粱AHAS蛋白大亞基的第93位上的丙氨酸被替換為蘇氨酸。該植物相比于野生型高粱植物對一種或多種除草劑具有增強(qiáng)的抗性，其中除草劑例如為來自咪唑啉酮組的除草劑。高粱植物在其基因組中可以包括一個、兩個、三個或更多個拷貝的多核苷酸，該多核苷酸編碼高粱AHAS的突變的大亞基，或本發(fā)明的高粱AHAS多肽。在此上下文中，高粱植物可以對能夠抑制AHAS酶活性的任何除草劑都有耐受性。例如，高粱植物可以對咪唑啉酮類型的除草劑(諸如，咪草煙、滅草煙和甲基咪草煙)有耐受性，或者對磺酰脲組的除草劑有耐受性。NCIMB 4187020111012
【專利說明】具有編碼突變的乙醜超酸合成酶蛋白大亞基的突變的多核 音酸且除草劑抗性增強(qiáng)的高梁植物

【背景技術(shù)】
[0001] 高梁（Sor曲um SPP.)是包括約20種草類植物的植物屬。高梁原產(chǎn)于東非的熱帶 和亞熱帶地區(qū)，并且作為人類和動物食用的谷物在每一個大洲都有種植。高梁也用作飼料， 并且用于制造酒精飲料。由于高梁是無款質(zhì)的，因此適合患乳糜瀉疾病的個體食用。
[0002] 與大部分谷類作物相比，高梁對干旱和過多的±壤含水量具有更高的耐受性。高 梁能夠在不同的±壤和氣候條件下正常生長。同樣地，高梁有利地響應(yīng)灌觀，在其生命周期 中最少需要250mm的灌觀，且最佳灌觀范圍為400?550mm。
[0003] 為了實現(xiàn)快速且均勻的出苗，從而實現(xiàn)良好的作物培植，±壤在種植時必須具有 適當(dāng)?shù)暮?。對水的最大需求開始于出苗后的30天并且一直持續(xù)到谷物飽滿，最關(guān)鍵的 階段是穗形成和開花的階段，因為此時缺水會導(dǎo)致產(chǎn)量降低。
[0004] 而且，高梁具有在干旱時期保持休眠并且在有利時期恢復(fù)生長的能力，但是該些 壓力狀態(tài)可影響特性。
[0005] 高梁的正常發(fā)育需要高溫，并因此它比其它作物對低溫更敏感。不小于181：的± 壤溫度是發(fā)芽所需要的；并且，直到溫度達(dá)到15C才會實現(xiàn)植物的實際活躍生長，最佳溫 度為約32C。
[0006] 己醜輕酸合成酶（AHA巧是催化支鏈氨基酸額氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成的 第一酶。AHAS是一些除草劑，諸如，賴醜脈類、咪哇晰麗類、H哇并嚼巧類和嚼巧氧基苯甲酸 鹽類（pyrimid^oxybenzoates)的祀標(biāo)。前兩個除草劑種類由于其毒性低且對雜草具有高 功效而被廣泛用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。
[0007] 除草劑的咪哇晰麗種類包括；咪草煙（imazethapyr)、滅草唾（imazaquin)和滅草 煙（imazapir)。
[0008] 市場中存在的一些賴醜脈類是：甲賴?。状祝╩etsul化ron-methyl)、氯 賴隆 khlorosulfuron)、煙嚼賴隆（nicosulfuron)、離賴?。╟inosulfuron)、醜亞賴 ?。╥midasulfuron),氯化嚼賴隆化alosulfuron)、玉嚼賴隆（rimsulfuron)、離賴醜胺 (trisulfuron-methyl)和苯賴隆（甲醋）（tribenuron-methyl)。
[0009] 但是，存在對咪哇晰麗和/或賴醜脈種類的除草劑有抗性的植物；例如，諸如 玉米狂ea mays)、擬南芥（Ar油idopsis thaliana)、歐洲油菜炬rassica napus)、大 豆（Glycine max)、煙草（Nicotiana tabacum)和稻（Oryza sativa)(Sebastian 等 人，（1989) Crop Sci. , 29:1403-1408 ;Swanson 等人，1989Theor. Appl. Genet. 78:525-530 ; Newhouse 等人，（1991) Hieor.Appl. Genet. ,83:65-70 ;Sathasivan 等人，（1991)Plant 曲ysiol.，97:1044-1050 ;Mourand 等人，（1993)J. Heredity 84:91-96 ;U.S.Patent No. 5, 545, 822)的物種。已描述了在向日葵中的AHAS的大亞基中的點突變，該點突變賦予 了對咪哇晰麗類型的除草劑的抗性（W0 2007/0118920)。
[0010] 也已檢測到了對咪哇晰麗或賴醜脈類型的除草劑有抗性的植物。該些植物已經(jīng) 自然地獲得了抗性，并且已經(jīng)用于雜交育種W產(chǎn)生抗除草劑的品種。通過對抗性植物的 分析，確定了向日葵AHAS蛋白中的點突變，該點突變使氨基酸Ala被Val替換（White等 人，（2003)Weed Sci.，51:845-853)。
[0011] 此外，美國專利號 4, 761，373、5, 331，107、5, 304, 732、6, 211，438、6, 211，439 和 6, 222, 100都公開了對咪哇晰麗除草劑有抗性的植物。所有該些專利都籠統(tǒng)地描述了改變 的AHAS基因在植物中引發(fā)除草劑抗性的應(yīng)用，并且具體公開了一些咪哇晰麗抗性的玉米 品系。美國專利號5, 731，180和美國專利號5, 767, 361討論了在野生型單子葉植物AHAS 氨基酸序列中具有單個氨基酸替換的分離的基因，該分離的基因產(chǎn)生了對咪哇晰麗類特異 性的抗性。
[0012] 專利文件W0 2006/007373和W0 2006/060634公開了一些突變，該突變在小麥植 物中賦予了對咪哇晰麗類型的除草劑的抗性。
[0013] 出 片反物"Amino acids conferring herbicide resistance in tobacco acetohy化oxyacid synthase (在煙草己醜輕酸合成酶中賦予除草劑抗性的氨基酸）"描述 了在AHAS中賦予除草劑抗性的不同的點突變佑M化ops 1:2, 62-67 ;2010年2月16日）。
[0014] 專利文件US 20100115663提及了通過改變己醜輔酶A駿化酶基因來獲得抗除草 劑的高梁植物。還公開了對除草劑二硝基苯胺有抗性的高梁植物扣S 20100205686)和對 除草劑己醜乳酸合成酶有抗性的高梁植物（W02008/073800)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 與野生型高梁植物相比，本發(fā)明的高梁植物示出對除草劑，例如祀向AHAS酶的除 草劑（即，咪哇晰麗類和賴醜脈類）的增強(qiáng)的抗性。具體地，本發(fā)明的高梁植物（Sor曲um bicolor)在其基因組中包括至少一種多核巧酸。所述多核巧酸編碼AHAS的大亞基，該 AHAS的大亞基在高梁AHAS大亞基的第93位或等效位置處的丙氨酸被替換成蘇氨酸，其 中，所述植物相比于野生型高梁植物具有對一種或多種除草劑（諸如選自哇晰麗類的組的 除草劑）的增強(qiáng)的抗性。高梁植物在其基因組中可W包括一個、兩個、H個或更多拷貝的 多核巧酸，該多核巧酸編碼高梁AHAS的突變的大亞基或本發(fā)明的高梁AHAS多膚。由于該 個原因，高梁植物可W對能夠抑制AHAS酶活性的任何除草劑都有耐受性，即，高梁植物可 W對W下除草劑有耐受性；咪哇晰麗類型的除草劑，諸如，但不限于咪草煙、滅草煙和甲基 咪草煙；或者，賴醜脈類的組的除草劑，諸如，但不限于氯賴隆、甲賴隆（甲醋）、嚼賴?。?醋）（sulfome1:u;ron meth}d)、氯嚼賴隆（己醋）（chlorimuron eth}d)、喔吩賴隆（甲醋） (thiofensulfuron meth}d)、苯賴隆（甲醋）、予嚼賴?。状祝╞ensulfuron meth}d)、 煙嚼賴隆、胺苯賴?。状祝╡thametsul化ron methyl)、玉嚼賴隆、氣胺賴?。状祝?(triflusulfuron meth}d)、離苯賴?。╰riasulfuron)、氣嚼賴?。状祝╬rimisulfuron meth}d)、離賴隆、醜嚼賴?。╝midosulfuron)、巧嚼賴?。╢ luzasulfuron)、哇化嚼賴 ?。╥mazosulfuron)、化嚼賴隆（己醋）（pyrazosulfuron eth}d) W 及氯化嚼賴隆 化alosulfuron)。
[0016] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的對屬于咪哇晰麗類或賴醜脈類的組中的除草劑有 抗性的高梁植物是指定為VT11-11331-BK的高梁品系，該指定為VT11-11331-BK的高梁品 系的種子根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于2011年10月12日被保藏在NCIMB收集（collection) 中，登記號為NCIMB 41870。突變的VT11-11331-BK植物、其部分及其種子包括：在其基因 組中的包括一多核巧酸的突變的AHAS基因，該多核巧酸具有編碼多膚的SEQ ID NO. 1所示 的核巧酸序列；或者，具有SEQ ID ^.2所示的序列的4齡5大亞基。與4齡5大亞基對應(yīng)的 SEQ ID NO. 2的氨基酸序列與高梁AHAS大亞基的野生型氨基酸序列（SEQ ID NO. 3)具有一 個氨基酸的差異，所述差異包括在高梁AHAS大亞基第93位或等同位置處的丙氨酸被替換 成蘇氨酸。
[0017] 本發(fā)明的耐除草劑的高梁植物種質(zhì)（germoplasm)對于通過基因滲入將耐受性狀 引入到其它高梁品種中是有用的。本發(fā)明的高梁植物包括含多核巧酸的植物的后代和種 子，其中該多核巧酸編碼AHAS大亞基并且在高梁AHAS的所述大亞基的第93位或等效位置 處的丙氨酸被替換成蘇氨酸，其中，所述植物相比于野生型高梁植物示出對一種或多種咪 哇晰麗和/或賴醜脈除草劑的增強(qiáng)的抗性。
[0018] 在優(yōu)選的實施方式中，抗除草劑的高梁植物包括NCIMB 41870的抗性性狀，并且 可W是如NCIMB 41870所述的植物、NCIMB 41870植物的后代、NCIMB 41870植物的突變體 和NCIMB 41870突變體的后代。植物可W是轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的植物，并且屬于適合于農(nóng) 藝應(yīng)用或其它應(yīng)用（諸如作為觀賞植物）的任何植物物種。
[0019] 進(jìn)一步提供的是高梁種子，該高梁種子在其基因組中包括至少一種多核巧酸，其 中，所述多核巧酸編碼一多膚，該多膚在高梁AHAS蛋白大亞基的第93位的丙氨酸被替換成 蘇氨酸。種子發(fā)芽，并且產(chǎn)生相比于野生型高梁植物對一種或多種咪哇晰麗組的除草劑具 有增強(qiáng)的抗性的植物。在優(yōu)選的實施方式中，所述種子是作為NCIMB 41870保藏的種子。
[0020] 進(jìn)一步提供的是一種用于識別對除草劑有抗性的植物的方法，該除草劑來自咪哇 晰麗類或賴醜脈類的組，該方法包括：
[0021] a)提供來自高梁植物的核酸樣本；
[0022] b)擴(kuò)增與核酸樣本中存在的高梁植物的AHAS基因?qū)?yīng)的區(qū)域；
[0023] C)基于在所述擴(kuò)增的核酸樣本中至少一種突變的存在，來識別對咪哇晰麗組的除 草劑有抗性的高梁植物，該突變賦予對咪哇晰麗除草劑的抗性。在優(yōu)選的實施方式中，選擇 包括AHAS中的至少一種突變（諸如NCIMB 41870中的突變）的植物，其中AHAS基因中的 所述至少一種突變編碼AHAS的多膚或大亞基，該AHAS的多膚或大亞基相比于野生型的高 梁AHAS氨基酸序列包括Ala93T虹的替換。植物可W是單子葉植物或雙子葉植物。植物優(yōu) 選是農(nóng)藝學(xué)感興趣的植物，諸如，高梁、稻、玉米、大豆、小麥、燕麥、大麥、黑麥、亞麻、棉花、 甘藏、向日葵等。識別方法可W利用特異性的點突變SNP標(biāo)記物。
[0024] 本發(fā)明提供了一種用于控制與農(nóng)藝植物（例如高梁植物）緊鄰的雜草的方法，其 中所述高梁植物對除草劑有抗性，該除草劑諸如為選自咪哇晰麗類和/或賴醜脈類的組的 除草劑。在優(yōu)選的實施方式中，除草劑是咪哇晰麗。咪哇晰麗除草劑可W是咪草煙、甲基咪 草煙或滅草煙。植物可W表現(xiàn)出如NCIMB 41870的抗性性狀，并且它可W是其衍生物、突變 體或后代植物。
[0025] 本發(fā)明提供了一種多膚，該多膚包括，但不限于W下核巧酸序列中的一種或多 種：
[0026] -SEQ ID NO. 1 所示的序列，
[0027] -編碼SEQ ID No. 2的多膚的核巧酸序列，
[002引-編碼與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的多膚的核巧酸序 列，其中，該多膚顯示出抗除草劑的AHAS活性；
[0029] -與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列具有至少85%同一性的核巧酸序列，其中，該 核巧酸序列編碼包括AHAS大亞基的多膚并且顯示出抗除草劑的AHAS活性；
[0030] 或者與其互補(bǔ)的序列。多核巧酸優(yōu)選編碼包括Ala93T虹替換的AHAS大亞基的多 膚。
[0031] 本發(fā)明也提供了一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括具有W下核巧酸序列的至少一種多核 巧酸；SEQ ID NO. 1 ;編碼SEQ ID NO. 2所示的多膚的核巧酸序列；編碼與氨基酸序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多膚的核巧酸序列，其中多膚顯示出抗除草劑的AHAS 活性；與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列具有至少85%同一性的核巧酸序列，其中核巧酸 序列編碼包括AHAS大亞基的多膚并且顯示出抗除草劑的AHAS活性；或者與其互補(bǔ)的序列。 多核巧酸優(yōu)選編碼包括Ala93Thr替換的AHAS大亞基的多膚；所述序列可操作地連接至用 于進(jìn)行表達(dá)的核巧酸序列，例如一種或多種啟動子、增強(qiáng)子或其它已知的調(diào)控序列。啟動子 可W是用于在植物、植物組織、葉綠體、動物、細(xì)菌、真菌或酵母細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。
[0032] 本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化載體，轉(zhuǎn)化載體包括具有W下核巧酸序列中一種的至少一 種多核巧酸；a) SEQ ID NO. 1所示的序列；b)編碼SEQ ID No. 2的多膚的核巧酸序列；C)編 碼與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的多膚的核巧酸序列，其中多膚 顯示出抗除草劑的AHAS活性；d)與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列具有至少85%同一性 的核巧酸序列，其中，核巧酸序列編碼包括AHAS大亞基的多膚并且顯示出抗除草劑的AHAS 活性；進(jìn)一步包括可操作地連接的序列，W驅(qū)動核巧酸序列和選擇性標(biāo)記物的表達(dá)。載體適 應(yīng)于每種特定的情況下可用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌、真菌、酵母、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明提供了一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，該轉(zhuǎn)化的植物包括整合在其基因組中的與多核 巧酸可操作地連接的至少一種啟動子，該多核巧酸選自；a)SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序 列；b)編碼SEQ ID NO. 2所示的多膚的核巧酸序列；C)編碼與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列 具有至少95%序列同一性的多膚的核巧酸序列，其中多膚顯示出抗除草劑的AHAS活性；d) 與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列具有至少85%同一性的核巧酸序列，其中核巧酸序列編 碼包括AHAS大亞基并且具有抗除草劑的AHAS活性的多膚；e)與核巧酸序列a)至d)中的 一種核巧酸序列完全互補(bǔ)的核巧酸序列，其中載體進(jìn)一步包括選擇性基因和至少一種啟動 子，該至少一種啟動子可操作地連接至核巧酸序列W驅(qū)動該核巧酸序列的表達(dá)。啟動子是 驅(qū)動植物中（例如，在植物組織或葉綠體中）的多膚表達(dá)的啟動子。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可W是： 單子葉植物，例如，高梁、玉米、稻或小麥；或者雙子葉植物，例如，向日葵、擬南芥、煙草或油 菜。當(dāng)將等量的除草劑（咪哇晰麗類和賴醜脈類）施用至經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和相同的野生型植 物時，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物對所述除草劑的抗性高于相同的野生型植物。
[0034] 本發(fā)明也提供了一種用于獲得抗除草劑的植物或?qū)Τ輨┛剐栽鰪?qiáng)的植物的方 法，所述方法包括W下步驟：i)用包括多核巧酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，ii)使植物細(xì)胞 再生W獲得抗除草劑的植物，所述多核巧酸具有W下核巧酸序列中的至少一種；a)SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，b)編碼SEQ ID NO. 2所示的多膚的核巧酸序列，c)編碼與氨基酸 序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多膚的核巧酸序列，其中多膚顯示出抗除草 劑的AHAS活性，d)與SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列具有至少85%同一性的核巧酸序列， 其中核巧酸序列編碼包括AHAS大亞基的多膚并且具有抗除草劑的AHAS活性，W及e)與 核巧酸序列a)至d)中的一種核巧酸序列完全互補(bǔ)的核巧酸序列。DM表達(dá)盒包括至少一 種啟動子，用于驅(qū)動多膚在植物中（例如，在植物組織或葉綠體中）的表達(dá)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物 可W是：單子葉植物，例如，高梁、玉米、稻或小麥；或雙子葉植物，例如，向日葵、擬南芥、煙 草、大豆或油菜。當(dāng)將等量的除草劑（咪哇晰麗類和賴醜脈類）施用至經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和野 生型植物時，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物相比于野生型植物對所述除草劑有抗性。植物包括對除草劑有 抗性的AHAS的大亞基。

【專利附圖】

【附圖說明】
[00巧]圖1示出了抗咪哇晰麗的突變體高梁品系（ADV-IMI-R)，和原始的同系交配的高 梁品系80237或野生型品系的劑量-反應(yīng)曲線。檢測的除草劑是；比率為0 (對照）、1X、2X、 3X和4X的咪草煙、滅草煙和甲基咪草煙。W地上組織（aerial tissue)的干物質(zhì)值M)相 對于未處理的對照的百分比來測量除草效果；每個值均是H次檢測的平均值。
[0036] 圖2示出了突變體ADV-IMI-R AHAS核巧酸序列與原始的同系交配的高梁品系 80237或野生型品系的比對。在第+277位指出核巧酸G被替換成A，W區(qū)別兩種序列。在 用于擴(kuò)增重疊的擴(kuò)增子序列的不同引物下面畫有下劃線。
[0037] 圖3示出了對高梁AHAS基因的密碼子93處的SNP G/A的基因分型檢巧IJ。在來自 ADV-IMI-RX巧90523的177株巧后代植物的基因型中，分析特異性的SNP-SbAHAS標(biāo)記物。 清楚地界定并且識別了H個集群：圓點（?)，對應(yīng)于突變等位基因的純合植物（A/A) ;H 角形（▲)，對應(yīng)于突變等位基因的雜合植物（A/G) ; W及菱形（?)，野生型等位基因的純 合植物佑/G)。
[003引圖4示出了通過將高梁AHAS基因的核巧酸序列（登記號GM663363. 1)與 Phytozome核巧酸序列數(shù)據(jù)庫化ttp: //www.地ytozome. net/search. php)中保藏的 高梁（Sor曲um bicolor)基因組序列進(jìn)行匹配而獲得的結(jié)果。該種匹配示出了；AHAS GM663363. 1序列表現(xiàn)出與位于高梁基因組染色體4上的AHAS序列具有高度顯著的同源性 (值e = 0)，表明感興趣的基因存在于該個連鎖群中。
[0039] 圖5示出了 S. bicolor染色體4的連鎖圖譜。相鄰標(biāo)記物之間的距離W厘摩（cM) 給出。示出：在177株巧植物的基因型的染色體4中，SNP-訊AHAS和對咪草煙的抗性相對 于7個SSR的染色體位置。使用化inMap軟件，使用L0D = 3且最大Kosambi距離為50cM 的默認(rèn)參數(shù)來建立圖譜。

【具體實施方式】
[0040] 為了獲得耐除草劑的植物，用甲賴酸己醋（EM巧的水溶液處理同系交配的高梁 (Sor曲um bicolor)品系80237的植物。種植經(jīng)處理的種子并進(jìn)行自由授粉。選擇兩 百走十H株Ml植物并且將每株植物的兩粒種子種植在苗圃中，從而獲得總共546株M2植 物。從每對植物中的一株植物收集花粉，并且將收集的花粉用于對該對植物中的另一株植 物進(jìn)行授粉。收獲由273株經(jīng)授粉的M2植物中的每一株植物得到的M3種子。將M3后代 種植在總共273個壟溝中。用100ml L a. i./ha的咪草煙噴灑每一 M3壟溝的五十株植 物。在用除草劑處理后，壟溝中的六十八株植物示出了正常生長并且沒有癥狀，因此認(rèn)為該 六十八株植物對除草劑有抗性并且識別它們?yōu)閂T09-9754。識別壟溝中的抗性植物的系譜， 并將它們命名為80237EMS2-192 (下文稱為ADV-IMI-R)。獲得選自原始ADV-IMI-R突變體 (命名為VT11-11331-BK)的耐除草劑的M7突變體植物和種子，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款 于2011年10月12日將其保藏于NCIMB收集且登記號為NCIMB 41870。
[0041] 本發(fā)明不限于用EMS進(jìn)行突變的高梁植物。通過其它突變方法，例如通過福射 和化學(xué)突變劑的突變方法，所獲得的高梁植物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？钩輨┑耐蛔凅w 植物也可W是通過如下方式獲得：對用除草劑培養(yǎng)的細(xì)胞施加選擇壓力并且選擇抗性細(xì) 胞，W產(chǎn)生抗除草劑的植物。突變和育種方法的細(xì)節(jié)可W見于叩rinciples of化Itivar Development (栽培品種發(fā)展的原理"）"Fe虹，1993, Macmillan Publishing Company (麥克 米倫出版社），其公開內(nèi)容通過引用而納入本文。
[0042] 隨后，對抗咪哇晰麗的突變體植物ADV-IMI-R(原始突變）噴灑除草劑的效果與同 系交配的高梁品系80237(安地（Advanta)專有的優(yōu)秀品系）的反應(yīng)進(jìn)行比較。為了實現(xiàn) 該一目標(biāo)，植物在田間經(jīng)H種屬于咪哇晰麗系列的除草劑（咪草煙、滅草煙和甲基咪草煙） 進(jìn)行處理。對于每種除草劑，檢測四種不同的比率；1X、2X、3X和4X。對于每種除草劑，推薦 的田間施用比率（1幻示于表1中。
[0043] 表 1
[0044] 對于各種除草劑，推薦的田間施用比率
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種高梁植物，在所述高梁植物的基因組中包括至少一種多核苷酸，其中，所述多核 苷酸編碼多肽，所述多肽在高粱AHAS蛋白的大亞基的第93位上的丙氨酸被替換成蘇氨酸， 所述植物相比于野生型高粱植物對一種或多種除草劑具有增強(qiáng)的抗性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，所述除草劑選自由咪唑啉酮和磺酰脲組成 的組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高粱植物，其中，所述咪唑啉酮除草劑選自由咪草煙、滅草煙 和甲基咪草煙組成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，至少一種多核苷酸包括SEQ ID NO. 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，經(jīng)編碼的所述多肽包括SEQ ID NO. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，包括如在NCMB 41870中所示的AHAS基因 中的突變。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，所述高粱植物對咪唑啉酮組中的一種或多 種除草劑具有增強(qiáng)的抗性性狀，該增強(qiáng)的抗性性狀如NCIMB 41870所示的抗性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6和7中任意一項所述的高粱植物，其中，對一種或多種除草劑具有增 強(qiáng)的抗性的所述高粱植物對于通過基因滲入將所述抗性性狀引入到另一高粱植物中是有 用的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，所述植物是轉(zhuǎn)基因的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粱植物，其中，所述植物是非轉(zhuǎn)基因的。
11. 一種抗除草劑的高粱植物，包括NCMB 41870的抗性性狀，其中，所述高粱植物選 自由以下植物組成的組：諸如，NCMB 41870, NCMB 41870植物的后代，NCMB 41870的突 變體植物，以及NCMB 41870突變體的后代。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的高粱植物，其中，所述除草劑屬于咪唑啉酮的組。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的高粱植物，其中，所述植物是轉(zhuǎn)基因的。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的高粱植物，其中，所述植物是非轉(zhuǎn)基因的。
15. -種高梁種子，在所述高梁種子的基因組中包括至少一種多核苷酸，其中，所述多 核苷酸編碼多肽，所述多肽在高粱AHAS蛋白的大亞基的第93位上的丙氨酸被替換成蘇氨 酸。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的種子，其中，所述種子生成植物，所述植物相比于野生型高 粱植物對來自咪唑啉酮的組中的一種或多種除草劑具有增強(qiáng)的抗性。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的種子，其中，所述種子包括如在保藏的種子NCMB 41870中 所示的AHAS基因中的突變。
18. -種根據(jù)權(quán)利要求1至10中任意一項所述的植物的種子。
19. 一種根據(jù)權(quán)利要求11至14中任意一項所述的植物的種子。
20. -種用于識別抗除草劑的植物的方法，包括： a) 提供來自高粱植物的核酸樣本； b) 擴(kuò)增如下區(qū)域，該區(qū)域?qū)?yīng)于來自高粱植物的所述核酸樣本中存在的AHAS基因； c) 基于在經(jīng)擴(kuò)增的核酸樣本中存在的至少一種突變，來識別抗除草劑的植物，其中所 述突變賦予對來自咪唑啉酮的組的除草劑的抗性。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述核酸樣本包括至少一種突變，諸如在 NCMB 41870中存在的突變。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述至少一種突變包括在經(jīng)編碼的多肽中的 Ala93Thr替換，其中，所述多肽具有乙酰羥酸合成酶的活性。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述核酸樣本包括SEQ ID NO. 1。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述多肽包括SEQ ID NO. 2。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述植物是單子葉植物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述植物是雙子葉植物。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述植物是轉(zhuǎn)基因植物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述植物是非轉(zhuǎn)基因植物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述除草劑選自由咪唑啉酮和磺酰脲組成的 組。
30. -種控制雜草的方法，所述雜草緊鄰作物，所述方法包括將有效量的來自咪唑啉酮 或磺酰脲的組中的除草劑施加至雜草和作物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述咪唑啉酮除草劑選自由咪草煙、甲基咪草 煙和滅草煙組成的組。
32. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述作物選自由以下植物組成的組： a) 基因組中包括至少一種多核苷酸的高粱植物，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多 肽在高粱AHAS蛋白的第93位上的丙氨酸被替換成蘇氨酸，其中，所述植物相比于野生型高 粱植物對來自咪唑啉酮或磺酰脲的組的一種或多種除草劑具有增強(qiáng)的抗性； b) 包括AHAS基因中的突變的高粱植物，所述突變諸如為在NCMB 41870中的AHAS基 因中的突變； c) 包括對來自咪唑啉酮或磺酰脲的組中的一種或多種除草劑具有增強(qiáng)的抗性性狀的 高粱植物，所述增強(qiáng)的抗性性狀諸如為NCIMB 41870所示出的抗性。 d) 高粱植物a)至c)的植物、后代、衍生物或突變體。
33. -種多核苷酸，包括選自由以下核苷酸序列組成的組中的核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， b) 編碼SEQ ID NO. 2所示的多肽的核苷酸序列； c) 編碼與氨基酸序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其 中，該多肽具有抗除草劑的AHAS活性； d) 與SEQ ID NO. 1所不的核苷酸序列具有至少85%同一'丨生的核苷酸序列，其中，該核 苷酸序列編碼包括AHAS的大亞基的多肽，并且顯示出抗除草劑的AHAS活性； e) 與核苷酸序列a)至d)中的一種核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸編碼多肽，該多肽包括在 AHAS的大亞基中的Ala93Thr替換。
35. -種表達(dá)盒，包括可操作地連接在其中的根據(jù)權(quán)利要求33所述的核苷酸序列，所 述核苷酸序列可操作地連接在所述表達(dá)盒中。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的表達(dá)盒，進(jìn)一步包括至少一種啟動子，所述啟動子驅(qū)動所 述多核苷酸的表達(dá)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的表達(dá)盒，其中，所述啟動子選自包括用于在植物、細(xì)菌、真 菌、動物細(xì)胞和原生動物中進(jìn)行表達(dá)的啟動子的組。
38. -種經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求35所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞選自由細(xì)菌、真菌、酵母、植物細(xì)胞和 動物細(xì)胞組成的組。
40. -種具有多核苷酸的轉(zhuǎn)化載體，所述多核苷酸包括選自以下組中的核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， b) 編碼SEQ ID NO. 2所示的多肽的核苷酸序列； c) 編碼與氨基酸序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其 中，該多肽顯示出抗除草劑的AHAS活性； d) 與SEQ ID NO. 1所不的核苷酸序列具有至少85%同一'丨生的核苷酸序列，其中，該核 苷酸序列編碼包括AHAS的大亞基的多肽，并且顯示出抗除草劑的AHAS活性； e) 與核苷酸序列a)至d)中的一種核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列； 其中，所述載體進(jìn)一步包括選擇性基因、至少一種啟動子，所述至少一種啟動子可操作 地連接至所述核苷酸序列，能夠驅(qū)動所述核苷酸序列的表達(dá)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的載體的應(yīng)用，用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述細(xì)胞選自包括細(xì)菌、真 菌、酵母、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞的組。
42. -種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，其中，所述植物包括整合在所述植物的基因組中的至少一種 啟動子，所述啟動子可操作地連接至多核苷酸，所述多核苷酸選自包括以下核苷酸序列的 組： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， b) 編碼SEQ ID NO. 2所示的多肽的核苷酸序列； c) 編碼與氨基酸序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其 中，所述多肽顯示出抗除草劑的AHAS活性； d) 與SEQ ID NO. 1所不的核苷酸序列具有至少85%同一'丨生的核苷酸序列，其中，所述 核苷酸序列編碼包括AHAS的大亞基的多肽，并且顯示出抗除草劑的AHAS活性； e) 與核苷酸序列a)至d)中的一種核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列； 其中，所述載體進(jìn)一步包括選擇性基因、至少一種啟動子，所述至少一種啟動子可操作 地連接至所述核苷酸序列，能夠驅(qū)動所述核苷酸序列的表達(dá)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中，所述啟動子選自由組織特異性啟動子和葉綠 體特異性啟動子組成的組。
44. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中，所述植物是單子葉植物。
45. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中，所述植物是雙子葉植物。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的植物，其中，所述植物選自由高粱、玉米、稻和小麥組成的 組。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的植物，其中，所述植物選自由大豆和油菜組成的組。
48. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中，所述植物相比于非轉(zhuǎn)化的植物包括增強(qiáng)的除 草劑抗性。
49. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物，其中，所述除草劑選自由咪唑啉酮和磺酰脲組成的 組。
50. -種獲得抗除草劑的植物或具有增強(qiáng)的除草劑抗性的植物的方法，其中，所述方法 包括： i) 用表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒或載體包括多核苷酸，所述多核苷酸具 有選自以下組中的核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， b) 編碼SEQ ID NO. 2所示的多肽的核苷酸序列； c) 編碼與氨基酸序列SEQ ID NO. 2具有至少95%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其 中，該多肽顯示出抗除草劑的AHAS活性； d) 與SEQ ID NO. 1所不的核苷酸序列具有至少85%同一'丨生的核苷酸序列，其中，該核 苷酸序列編碼包括AHAS的大亞基的多肽，并且顯示出抗除草劑的AHAS活性；以及 e) 與核苷酸序列a)至d)中的一種核苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列； 其中，所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括至少一種啟動子，所述至少一種啟動子可操作地連接至 所述多核苷酸，其中所述啟動子驅(qū)動所述多核苷酸的表達(dá)； ii) 使所述植物細(xì)胞再生，以獲得抗除草劑的植物。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述啟動子包括植物組織特異性的啟動子。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述啟動子包括葉綠體特異性的啟動子。
53. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述除草劑選自由咪唑啉酮和磺酰脲組成的 組。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中，咪唑啉酮除草劑選自包括咪草煙、甲基咪草煙 和滅草煙的組。
55. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述植物是單子葉植物。
56. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述植物是雙子葉植物。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述植物選自由高粱、玉米、稻和小麥組成的 組。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述植物選自由大豆和油菜組成的組。
59. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述植物相比于非轉(zhuǎn)化的植物包括增強(qiáng)的除 草劑抗性。
60. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述植物包括AHAS的大亞基，并且顯示出抗除 草劑的AHAS活性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104395472SQ201280073443
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月5日
【發(fā)明者】韋森特·特魯齊奧·尤萊爾特, A·D·贊貝利, M·卡斯帕, 亞歷杭德羅·佩德羅·帕爾多 申請人:優(yōu)勢國際有限責(zé)任公司