具有修飾的生物堿含量的大紅罌粟的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳修飾的大紅罌粟(Papaver bracteatum)物種植物，其中由所述植物產(chǎn)生一種或多種生物堿的類型或量已被改變。具體地，相對于野生型大紅罌粟(P.bracteatum)，所述遺傳修飾的植物具有蒂巴因6-O-脫甲基酶、可待因O-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達，從而使所述遺傳修飾的罌粟植物相對于野生型大紅罌粟產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。還提供以上述遺傳修飾的罌粟植物作為親本的子代植物；上述植物的突變體或衍生植物；來源于上述植物的繁殖材料，由上述植物產(chǎn)生的稈，由上述植物產(chǎn)生的稈濃縮物，來源于上述植物的膠乳，或來源于上述植物的一種或多種分離的細胞。還提供由上述植物產(chǎn)生生物堿的方法以及6-O-脫甲基酶和可待因O-脫甲基酶基因的核酸和氨基酸序列變體。
【專利說明】具有修飾的生物堿含量的大紅罌粟 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳修飾的大紅S粟（Papaver bracteatum)物種植物，其中由所述植 物產(chǎn)生的一種或多種生物堿的類型或量已被改變。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 許多國家在調(diào)控下商業(yè)化培育阿片S粟（Opium poppies)(鴉片s粟（Papaver somniferum))。通過切開特有的蒴果得到的膠乳稱為阿片，并且是一些藥理學(xué)上重要的生 物堿的來源。嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿是由該植物產(chǎn)生的最重要的生物堿，并 且在制藥工業(yè)上用作止痛藥、鎮(zhèn)咳藥和鎮(zhèn)痙藥。
[0004] 然而，在商業(yè)規(guī)模上，罌粟桿和桿濃縮物（而不是膠乳）是用于生產(chǎn)嗎啡和其他罌 粟來源的生物堿的最常用的原料。例如，現(xiàn)在，世界上多于50%的嗎啡是由罌粟桿或罌粟桿 濃縮物制備的。
[0005] 澳大利亞生產(chǎn)世界上很大部分的（2006年約為30% )用于嗎啡生產(chǎn)的罌粟桿濃縮 物。此外，澳大利亞的塔斯馬尼亞是世界上最大的用于制藥市場的阿片生物堿生產(chǎn)地。在 塔斯馬尼亞，播種罌粟的面積在2011年接近34, OOOha。
[0006] 目前，有價值的生物堿，如嗎啡，由一年生罌粟物種鴉片罌粟（Papaver somniferum)產(chǎn)生。
[0007] 然而，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到，與一年生植物物種相比，多年生的植物物種提供多種 農(nóng)業(yè)益處，諸如增加的硬度，增加的水分和/或營養(yǎng)利用效率，消除每個季節(jié)重新種植的需 要，減少與作物建立相關(guān)的風(fēng)險以及基本上減少作物輪作的需要。已經(jīng)認(rèn)識到上文列出的 益處中的一種或多種具有增加生物堿總產(chǎn)率和/或效率的潛力。
[0008] 大紅罌粟（本文稱作P. bracteatum)是一種產(chǎn)生大量的生物堿蒂巴因的多年生罌 粟物種。蒂巴因本身不用于治療，然而，這種生物堿用作制備其他生物堿的給料，包括用作 制備羥考酮的給料。
[0009] 然而，在本領(lǐng)域中認(rèn)識到，大紅罌粟不產(chǎn)生大量的其他商業(yè)價值的生物堿，如可待 因、東罌粟堿和/或嗎啡。
[0010] 此外，盡管已經(jīng)利用誘變來改變由一年生罌粟物種鴉片罌粟（Papaver somniferum)產(chǎn)生的生物堿的類型（例如，參見WO 98/02033)，但是，本發(fā)明人沒有獲知任 何描述改變大紅罌粟（P. bracteatum)的生物堿類型的報道。
[0011] 在至少一些罌粟種植地區(qū)（包括澳大利亞的塔斯馬尼亞）影響大紅罌粟的耕作的 更顯著的問題是多個品種在種子萌發(fā)后的第一個生長季不產(chǎn)生種皮和大量的生物堿。
[0012] 因此，產(chǎn)生可提取量的可待因、東罌粟堿和/或嗎啡中的一種或多種生物堿的多 年生罌粟植物（諸如大紅罌粟物種）將是特別合乎需要的。此外，在至少溫帶罌粟種植地 區(qū)（如澳大利亞的塔斯馬尼亞），此類耕種品種在萌發(fā)后的第一個生長季產(chǎn)生如嗎啡和/或 可待因的生物堿的能力也將是合乎需要的。
[0013] 在本說明書中對任意現(xiàn)有技術(shù)的引用不是，并且不應(yīng)該視為承認(rèn)或以任何形式暗 示該現(xiàn)有技術(shù)在任何國家形成常識的一部分。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 在第一方面，本發(fā)明提供遺傳修飾的大紅罌粟物種的罌粟植物，或其雜交體，其 中，相對于野生型大紅罌粟，蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還 原酶中的一種或多種的表達增加，并且，其中相對于野生型大紅罌粟，所述遺傳修飾的罌粟 植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0016] 在一個實施方案中，相對于野生型大紅罌粟，至少蒂巴因 6-0-脫甲基酶的表達增 加。
[0017] 在一些實施方案中，所述罌粟植物包含一種或多種編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可 待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的轉(zhuǎn)基因。在一些實施方案中，所述一種或多種轉(zhuǎn) 基因包含SEQ ID NOs : 1-8,12和13中的任一項或多項列出的核苷酸序列。
[0018] 在一些實施方案中，蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基 酸序列。
[0019] 在一些實施方案中，所述罌粟植物在溫帶罌粟種植地區(qū)在萌發(fā)后的第一個生長季 產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0020] 在一些實施方案中，所述罌粟植物在40° -44°的緯度在萌發(fā)后的第一個生長季 產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0021] 在一些實施方案中，所述罌粟植物在澳大利亞的塔斯馬尼亞在萌發(fā)后的第一個生 長季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0022] 在一些實施方案中，所述罌粟植物包括不開裂的種皮或開裂的種皮。
[0023] 在第二方面，本發(fā)明提供以本發(fā)明第一方面的罌粟植物作為親本的子代植物，其 中，相對于野生型大紅罌粟，所述子代植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶 和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達，并且，其中相對于野生型大紅罌粟， 所述子代植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0024] 在第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一或第二方面的植物的突變體或衍生植物，其 中，相對于野生型大紅罌粟，所述突變體或衍生植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因 〇-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶中的一種或多種的增加的表達，并且，其中相對于野生 型大紅罌粟，所述突變體或衍生植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生 物堿。
[0025] 在第四方面，本發(fā)明提供來源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中的任一方面的 植物的繁殖材料。在一些實施方案中，所述繁殖材料包括種子。
[0026] 在第五方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物產(chǎn) 生的桿。
[0027] 在第六方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植物產(chǎn) 生的桿濃縮物。
[0028] 在第七方面，本發(fā)明提供來源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植 物的膠乳。
[0029] 在第八方面，本發(fā)明提供一片穩(wěn)定繁殖的本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一 方面的罌粟植物。
[0030] 在第九方面，本發(fā)明提供來源于本發(fā)明的第一、第二或第三方面中任一方面的植 物的分離的細胞。
[0031] 在第十方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明第九方面的細胞中的一種或多種的體外培養(yǎng) 物。在一個實施方案中，所述培養(yǎng)物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0032] 在第十一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿的方 法，所述方法包括種植本發(fā)明第一、第二或第三方面中任一方面的植物，以使所述植物產(chǎn)生 選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿；并且從所述罌粟植物或其部分提取可待因、東 罌粟堿和/或嗎啡。
[0033] 在第十二方面，本發(fā)明提供按照本發(fā)明第十一方面的方法生產(chǎn)的選自可待因、東 罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
[0034] 在第十三方面，本發(fā)明提供包含一種或多種編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因 〇-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的轉(zhuǎn)基因的表達構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因可 操作性地連接到在大紅罌粟中有活性的轉(zhuǎn)錄控制序列上。
[0035] 在一些實施方案中，所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NOs : 1-8,12和13中任一 項或多項列出的核苷酸序列。
[0036] 在本發(fā)明第十三方面的一些實施方案中，所述蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
[0037] 在第十四方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項列出的核苷酸 序列的分尚的核酸分子。
[0038] 在第十五方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，所述分離的核酸分子選自由下述組 成的組：
[0039] ⑴包含與SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項列出的核苷酸序列至少50%相同 的核苷酸序列的核酸分子；和
[0040] (ii)在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項列出的核苷酸序列 的核酸分子雜交的核酸分子。
[0041] 在第十六方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列的分離 的多肽。
[0042] 在第十七方面，本發(fā)明提供包含與SEQ ID NOs :9-11中任一項列出的氨基酸序列 至少50%相同的氨基酸序列的分離的多肽。
[0043] 附圖簡述
[0044] 圖1是顯示在鴉片罌粟中由蒂巴因生物合成嗎啡的示意圖。T60DM-蒂巴因6-0-脫 甲基酶；CODM-可待因0-脫甲基酶；COR-可待因酮還原酶。
[0045] 圖2時顯示使用針對T60DM和CODM基因的引物對由鴉片罌粟和大紅罌粟分離的 DNA的PCR擴增產(chǎn)物的電泳凝膠照片。與凝膠中的每個泳道相對應(yīng)的引物組合提供在表2 中。鴉片罌粟基因組DNA作為模板（上圖）；大紅罌粟基因組DNA作為模板（下圖）。
[0046] 圖3是顯示CODM和T60DM基因中用PCR擴增圖2種顯示的產(chǎn)物的引物的位置的 示意圖。
[0047] 圖4是T60DM變體（克隆21，22, 23和11)與用于T60DM的參比cDNA序列 (GQ500139)(在比對中稱為"cDNA"）的核苷酸序列比對。克隆序列以黑色框出，內(nèi)含子序 列以灰色框出。核苷酸序列差別以白色框出。
[0048] 圖5是由圖4的核苷酸序列編碼的T60DM變體的氨基酸序列比對。與用于T60DM 的參比cDNA序列（GQ500139)(在比對中稱為"cDNA"）編碼的氨基酸序列相比較，顯示變體 克隆21、22和23的氨基酸序列。
[0049] 圖6是CODM變體（克隆21)與用于CODM的參比cDNA序列（GQ500141)(在比對 中稱為"cDNA"）的核苷酸序列比對。克隆序列以黑色框出，內(nèi)含子序列以灰色框出。核苷 酸序列差別以白色框出。
[0050] 圖7是顯示在實施例4中產(chǎn)生的T60DM的構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0051] 圖8是顯示在實施例4中產(chǎn)生的bar (Basta)構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0052] 圖9時顯示在實施例4中產(chǎn)生的CODM構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0053] 圖10是顯示在實施例4中產(chǎn)生的CORL 1構(gòu)建體的載體圖譜的示意圖。
[0054] 圖11提供證明大紅罌粟var PB-I的愈傷組織誘導(dǎo)和植物再生的照片。（A)8周后 來自種子的愈傷組織；(B) 20周后莖再生；（C) 24周后具有根的小植株；(D，E和F)在分別用 35S: :Basta、35S: :C0DM和35S: :T60DM進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化后，在選擇條件下的新的 愈傷組織生長。
[0055] 發(fā)明描述
[0056] 在本文中核苷酸和氨基酸序列由序列標(biāo)識號（SEQ ID NO :)表示。表1中提供了 序列識別的概述。在本說明書終了提供序列表。
[0057] 表 1
[0058] 序列標(biāo)識的概述
[0059]
【權(quán)利要求】
1. 遺傳修飾的大紅II粟（Papaver bracteatum)物種的II粟植物，或其雜交體，其中， 相對于野生型大紅罌粟（P. bracteatum)，蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或 可待因酮還原酶中的一種或多種的表達增加，并且，其中相對于野生型大紅罌粟，所述遺傳 修飾的罌粟植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
2. 權(quán)利要求1的罌粟植物，其中，相對于野生型大紅罌粟，至少蒂巴因6-0-脫甲基酶的 表達增加。
3. 權(quán)利要求1或2的罌粟植物，其中所述罌粟植物包含編碼蒂巴因6-0-脫甲基酶、可 待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的一種或多種轉(zhuǎn)基因。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項的罌粟植物，其中所述罌粟植物包含編碼蒂巴因6-0-脫甲基 酶的一種或多種轉(zhuǎn)基因。
5. 權(quán)利要求4的罌粟植物，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包含SEQ ID N0s:l-8,12和13 中的任一項或多項列出的核苷酸序列。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項或多項的罌粟植物，其中所述蒂巴因6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項的罌粟植物，其中所述植物在溫帶罌粟種植地區(qū)在萌發(fā)后的 第一個生長季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項的罌粟植物，其中所述植物在40° -44°的緯度在萌發(fā)后的 第一個生長季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
9. 權(quán)利要求1-10中任一項的罌粟植物，其中所述植物在澳大利亞的塔斯馬尼亞在萌 發(fā)后的第一個生長季產(chǎn)生種皮和選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項的罌粟植物，其中所述植物包括不開裂的種皮。
11. 權(quán)利要求1-9中任一項的罌粟植物，其中所述植物包括開裂的種皮。
12. 以權(quán)利要求1-11中任一項的罌粟植物作為親本的子代植物，其中，相對于野生型 大紅罌粟，所述子代植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮還 原酶中的一種或多種的增加的表達，并且，其中相對于野生型大紅罌粟，所述子代植物產(chǎn)生 增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項的植物的突變體或衍生植物，其中，相對于野生型大紅罌 粟，所述突變體或衍生植物包含蒂巴因6-0-脫甲基酶、可待因0-脫甲基酶和/或可待因酮 還原酶中的一種或多種的增加的表達，并且，其中相對于野生型大紅罌粟，所述突變體或衍 生植物產(chǎn)生增加量的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
14. 來源于權(quán)利要求1-13中任一項的植物的繁殖材料。
15. 權(quán)利要求14的繁殖材料，其中所述繁殖材料包括種子。
16. 由權(quán)利要求1-13中任一項的植物產(chǎn)生的桿。
17. 由權(quán)利要求1-13中任一項的植物或由權(quán)利要求16的桿產(chǎn)生的桿濃縮物。
18. 來源于權(quán)利要求1-13中任一項的植物的膠乳。
19. 一片穩(wěn)定繁殖的權(quán)利要求1-13中任一項的罌粟植物。
20. 來源于權(quán)利要求1-13中任一項的植物的分離的細胞。
21. 包含權(quán)利要求20的細胞中的一種或多種的體外培養(yǎng)物。
22. 權(quán)利要求21的體外培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡 的生物堿。
23. -種生產(chǎn)選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿的方法，所述方法包括種植權(quán) 利要求1-13中任一項的植物，以使所述植物產(chǎn)生選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物 堿；并且從所述罌粟植物或其部分提取所述可待因、東罌粟堿和/或嗎啡。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法產(chǎn)生的選自可待因、東罌粟堿和/或嗎啡的生物堿。
25. 包含編碼蒂巴因 6-0-脫甲基酶、可待因 0-脫甲基酶和/或可待因酮還原酶的一種 或多種轉(zhuǎn)基因的表達構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因可操作性地連接到在大紅罌粟中 有活性的轉(zhuǎn)錄控制序列。
26. 權(quán)利要求25的表達構(gòu)建體，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因包含SEQ ID NOs : 1-8,12 和13中任一項或多項列出的核苷酸序列。
27. 權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的表達構(gòu)建體，其中所述蒂巴因 6-0-脫甲基酶包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列。
28. 包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項中列出的核苷酸序列的分離的核酸分子。
29. -種分離的核酸分子，其選自由下述組成的組： (i) 包含與SEQ ID NOs : 1-8,12和13中任一項列出的核苷酸序列至少50%相同的核 苷酸序列的核酸分子；和 (ii) 在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NOs :1-8,12和13中任一項列出的核苷酸序列的核 酸分子雜交的核酸分子。
30. 包含SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列的分離的多肽。
31. 包含與SEQ ID NOs :9-11之一列出的氨基酸序列至少50%相同的氨基酸序列的分 離的多肽。
【文檔編號】C12N15/53GK104487576SQ201280073863
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2012年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】賈斯廷·泰勒·庫姆斯, 賈羅德·戴維·里奇, 馬克·阿爾弗雷德·特斯特, 達明·萊特富特, 迪帕·杰哈 申請人:Tpi企業(yè)有限公司