專利名稱：丹波黑大豆SGF14a基因的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹波黑大豆(簡稱RB)的14-3-3a基因(5GF7辦)的植物表達(dá)載體及其在提高植物耐鋁能力中的應(yīng)用，屬于植物分子基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
14-3-3蛋白最早是在動(dòng)物腦組織中發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)其在DEAE中的遷移率將其命名為14-3-3蛋白，起初被認(rèn)識(shí)是腦組織中特異性蛋白。最近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，包括動(dòng)物、植物和微生物。植物14-3-3蛋白是一個(gè)大的基因家族，存在很多不同的亞型。擬南芥中存在12種不同亞型的14-3-3基因，煙草中有12種，水稻中有6種，大豆中存在18種14-3-3基因，其中有16種能夠發(fā)生轉(zhuǎn)錄，并且不同亞型的14_3_3基因表達(dá)還存在明顯的組織特異性。植物14-3-3蛋白通常以同源或異源二聚體的形式存在，并且能夠與磷酸化靶蛋白相互作用，調(diào)節(jié)一系列生物過程，如代謝、生長、發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等。植物14-3-3蛋白能夠參與多種生物過程的調(diào)節(jié)。14-3-3蛋白能夠參與GA、ΑΒΑ、BR和乙烯等植物激素信號(hào)通路來調(diào)控植物生長發(fā)育過程。植物14-3-3蛋白在調(diào)控植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中也發(fā)揮著重要作用，14-3-3蛋白能夠通過調(diào)節(jié)NR、SPS和GS等代謝酶的活性來調(diào)控植物體內(nèi)碳氮代謝過程。并且14-3-3蛋白也能夠調(diào)節(jié)質(zhì)膜中的K+泵和H+-ATPase酶的活性來維持細(xì)胞內(nèi)外電化學(xué)梯度，來調(diào)控植·物體內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸過程。同時(shí)，植物14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)葉片中質(zhì)膜H+-ATPase的活性，來調(diào)控氣孔的開閉，從而對(duì)滲透脅迫作出響應(yīng)。植物14-3-3蛋白也能夠參與多種脅迫的應(yīng)答。在逆境脅迫的條件下，植物14-3-3蛋白也能對(duì)多種生物和非生物脅迫作出應(yīng)答，包括鹽脅迫、磷缺乏、干旱脅迫、冷脅迫和重金屬脅迫等非生物脅迫，以及損傷和病原菌侵染等生物脅迫。用鹽和冷處理的水稻愈傷組織和幼苗中整個(gè)14-3-3基因家族的表達(dá)上調(diào)。此外，其他的脅迫包括熱、氧化和重金屬對(duì)水稻OsGFM基因的表達(dá)也有不同程度的影響，必和OsGFMg幾乎可以被所有的脅迫誘導(dǎo)，水稻經(jīng)損傷處理48h后能夠降低0sGF14e基因的表達(dá)。磷饑餓使擬南芥中14-3-3y、m的轉(zhuǎn)錄水平下降。長期的鉀缺乏導(dǎo)致擬南芥中14_3_3c、j的蛋白表達(dá)水平下降，14-3-3 的蛋白表達(dá)水平增加。另外，14-3-3蛋白在植物免疫響應(yīng)中具有重要作用。在Cf9/Avr9介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答中10個(gè)番茄14_3_3基因中有3個(gè)能夠被特異性誘導(dǎo)表達(dá)。最近研究表明，擬南芥14-3-3蛋白能夠與RPW8. 2蛋白相互作用，在R蛋白介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。最近，許多研究者通過基因工程的手段增強(qiáng)或抑制植物14-3-3蛋白的表達(dá)來研究其功能。在馬鈴薯中過量表達(dá)14-3-3蛋白能夠改變脂類、氨基酸和礦物質(zhì)的組成，并且提高抗氧化能力提高，而抑制14-3-3蛋白的表達(dá)則出現(xiàn)相反的結(jié)果。在水稻中過量表達(dá)玉米的基因后能夠增強(qiáng)水稻的抗旱能力，并且在棉花中過量表達(dá)擬南芥的
基因后能夠使棉花保持“常青”及增強(qiáng)了棉花對(duì)干旱脅迫的耐受。通過反義技術(shù)抑制擬南芥14-3-3蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了葉片中淀粉的積累及增加了植物的生長。
全世界大約有50%的可耕地屬于酸性土壤，而鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一。鋁毒早期最明顯的癥狀是抑制根尖細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂，從而抑制根生長，導(dǎo)致根系損傷，影響水分和養(yǎng)分的吸收，限制了植物的生長。近年來許多研究者都致力于植物耐鋁機(jī)制的研究，目前的研究的結(jié)果表明能適應(yīng)酸性土壤生長的植物有兩種耐鋁機(jī)制外部排斥機(jī)制和內(nèi)部耐受機(jī)制。外部排斥機(jī)制是根尖對(duì)鋁的排斥，將鋁阻止在細(xì)胞外；主要包括鋁誘導(dǎo)有機(jī)酸分泌、根際PH的升高和細(xì)胞壁對(duì)鋁離子的固定等。內(nèi)部耐受機(jī)制主要是利用有機(jī)酸在共質(zhì)體中螯合鋁離子從而賦予植物對(duì)鋁的耐受能力，減小鋁的毒害。因此無論是外部排斥機(jī)制還是內(nèi)部耐受機(jī)制都涉及到有機(jī)酸的參與，可見有機(jī)酸在緩解鋁毒方面具有重要的作用。在鋁脅迫下，許多鋁耐受型的植物能夠分泌不同的有機(jī)酸，從而抵御鋁的毒害。例如，在鋁脅迫后，大豆和玉米能夠分泌檸檬酸、蕎麥能夠分泌草酸、鋁耐受型小麥能夠分泌蘋果酸。植物質(zhì)膜H+-ATPase是細(xì)胞膜上含量最豐富的蛋白，是植物生長所必須的，能夠參與多種脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)，包括對(duì)鋁毒和磷缺乏的調(diào)節(jié)等。并且，質(zhì)膜H+-ATPase主要是通過調(diào)節(jié)有機(jī)酸的分泌來調(diào)控植物對(duì)鋁脅迫的應(yīng)答。Shen等(2005)研究表明大豆能夠通過增加質(zhì)膜H+-ATPase基因表達(dá)、促進(jìn)質(zhì)膜H+-ATPase翻譯后磷酸化，最終增強(qiáng)了大豆根尖檸檬酸的分泌，從而賦予了大豆對(duì)鋁的高度耐受。而多年來的研究結(jié)果表明14-3-3蛋白在調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase的活性中發(fā)揮著重要作用。質(zhì)膜H+-ATPase是14_3_3蛋白在質(zhì)膜上的主要結(jié)合祀點(diǎn)，14-3-3蛋白能夠通過與質(zhì)膜H+-ATPase的C末端結(jié)合而維持其磷酸化的穩(wěn)定性并增加其活性。然而目前有關(guān)14-3-3蛋白能否參與鋁脅迫應(yīng)答的研究報(bào)道非常少，還缺少具體可信的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確信14-3-3蛋白在鋁脅迫應(yīng)答中的作用。并且關(guān)于鋁脅迫下14-3-3蛋白能否參與調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase活性的研究還未見報(bào)道。本發(fā)明技術(shù)是通過Gateway技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體PK-35S-515F7辦，為研究大豆SGFMa基因在植物耐鋁機(jī)制中的作用提供了有效的分子基因工程技術(shù)工具，方便了利用分子生物學(xué)的手段研究大豆辦基因的功能。以及通過該載體轉(zhuǎn)染野生型煙草所獲得的轉(zhuǎn)辦基因的煙草在提高煙草耐鋁能力中的應(yīng)用，為通過基因工程的方法提高植物耐鋁能力奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本發(fā)明中所獲得的結(jié)果能夠?yàn)槲覀兺ㄟ^基因工`程手段提高植物耐鋁能力提高了更多的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過Gateway技術(shù)構(gòu)建丹波黑大豆(RB)的#Ha基因{SGF14a)的植物表達(dá)載體pK-35S-515F7辦，該載體中SGF14a基因在35S組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型煙草中后，外源SGFMa基因在35S組成型啟動(dòng)子控制下能夠準(zhǔn)確高效表達(dá)，同時(shí)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草的耐鋁能力及耐受酸性土壤的能力也明顯提高。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方法1、外源515F7辦基因的獲得
根據(jù)GenBank上發(fā)表的大豆辦)基因全長序列，設(shè)計(jì)如下特異性引物 SGF14a 上游5’ -AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3> (含 HindIII 酶切位點(diǎn)) SGF14a 下游5，-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3，(含有 XhoI 酶切位點(diǎn))2、植物表達(dá)載體ρΚ-355-5Κ^Μ3的構(gòu)建
Gateway (通路克隆)技術(shù)的LR反應(yīng)構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體時(shí)，通過重組過程將外源基因連入植物表達(dá)載體PK2GW7. O中，不需要經(jīng)過復(fù)雜的限制性內(nèi)切酶的酶切和連接酶的連接過程,只需要把入門克隆載體和目的載體的質(zhì)粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的酶就能夠完成目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建，因此用Gateway技術(shù)構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體不僅成功幾率高，而且可以節(jié)省很多時(shí)間。因此，本文利用該技術(shù)來構(gòu)建目的基因辦的植物表達(dá)載體。構(gòu)建策略如圖3所示，以大豆cDNA為模板，用51^7辦基因的特異性引物，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增獲得SGFMa基因的全長。然后通過T/A克隆獲得pMD18T_515F7辦載體，對(duì)獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)外源基因辦是否發(fā)生突變，再經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切pMD18T-5iF7^3和pENTR載體，將SGFMa基因片段亞克隆到pENTR載體上，形成入門克隆載體PENTR-515F7辦。最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入門克隆載體PENTR-515F7辦和植物載體pK2GW7. O進(jìn)行LR反應(yīng)，形成植物表達(dá)載體簡稱pK-35S-515F7辦。、植物表達(dá)載體PK-35S-515F7辦轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因煙草篩選
通過電轉(zhuǎn)化法將植物表達(dá)載體PK-35S-515F7辦轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌pMP105菌中，經(jīng)壯觀霉素(Spe)篩選得到陽性克隆，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)陽性克隆中是否含有外源植物表達(dá)載體^hS-SGFMa質(zhì)粒。然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染野生型煙草，將轉(zhuǎn)染后的葉片在含有篩選因子Km (卡那抗生素WPCef (頭孢噻肟鈉抗生素)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4固體上誘導(dǎo)外植體發(fā)芽，約15天繼代一次。待有芽生成后，將芽從外植體上切下轉(zhuǎn)入含Km和Cef的生根培養(yǎng)基MS上，進(jìn)行根誘導(dǎo)生長，得到的能夠抗Km的煙草幼苗還需進(jìn)一步在基因和蛋白水平上檢測(cè)外源基因是否正確表達(dá)。、轉(zhuǎn)基因煙草的檢測(cè)
經(jīng)Km篩選得到的能夠抗Km的煙草植株，用CTAB法提取其基因組，分別以野生型煙草和轉(zhuǎn)基因型煙草基因組為模板，用外源基因辦的特異性引物，經(jīng)過PCR分析檢測(cè)，外源基因是否插入到野生型煙草 基因組中。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的RNA，在反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SGFMa基因的特異性引物，經(jīng)過RT-PCR法檢測(cè)外源基因515F7辦能夠正確轉(zhuǎn)錄。最后通過Western-blotting法從蛋白水平上分析外源基因在煙草中的表達(dá)情況。、轉(zhuǎn)基因煙草耐鋁能力分析
由于我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋁脅迫能夠誘導(dǎo)RB根中SGF14a基因的表達(dá)，因此我們?cè)谝吧蜔煵葜羞^量表達(dá)來自RB飽SGFMa基因后，考察轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鋁脅迫的響應(yīng)情況。將生長一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在水培條件下培養(yǎng)2周后，再用50μΜ的AlCl3 (ρΗ4. 3)處理24h后，檢測(cè)煙草根相對(duì)生長量的變化，以及鋁脅迫后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性總蛋白、MDA和H2O2含量的變化。最后，由于鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一，因此為了模擬在實(shí)際生產(chǎn)中本發(fā)明的應(yīng)用，我們將野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草在酸性土壤中培養(yǎng)，觀察其在酸性土壤中的生長情況，考察本發(fā)明在實(shí)際生長條件下是否具有潛在的利用價(jià)值。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下
本發(fā)明提供的植物表達(dá)載體為進(jìn)一步研究辦對(duì)鋁脅迫的應(yīng)答提供了更好的基因工程操作手段和工具，以及通過該載體轉(zhuǎn)染野生型煙草所獲得的轉(zhuǎn)辦基因的煙草擴(kuò)大了在增強(qiáng)作物對(duì)酸性土壤耐受性及在提高煙草耐鋁能力中的應(yīng)用，為通過基因工程的方法提高植物耐鋁能力奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本發(fā)明中所獲得的結(jié)果能夠?yàn)槲覀兺ㄟ^基因工程手段提高植物耐鋁能力奠定理論基礎(chǔ)以及提供更多的基因資源。


圖1為本發(fā)明中鋁脅迫下SGF14a基因轉(zhuǎn)錄水平變化電泳示意 圖2為本發(fā)明中外源515F7辦基因的獲得電泳示意圖；其中A ..SGFMa基因PCR產(chǎn)物；B ..SGFMa 基因 PCR 膠回收，圖中 M Maker III ；
圖3為本發(fā)明中植物表達(dá)載體ρΚ-355-5Κ^Μ3的構(gòu)建策略示意 圖4為本發(fā)明中TA克隆載體ρΜ0-18Τ-5Κ^7辦的檢測(cè)電泳示意圖；其中A :pMD18T-515F743酶切檢測(cè)，圖中1_4表示不同質(zhì)粒的編號(hào)，對(duì)照是沒有經(jīng)過酶切；B :ΡΜ 18 -SGFl4a質(zhì)粒和菌液PCR檢測(cè)，圖中M為Maker III ；
圖5為本發(fā)明中入門克隆載體pENTR-515F7辦的檢測(cè)電泳示意圖，其中A是2B(pENTR)和pMD18T-5^F7^3的HindIII和XhoI雙酶切后膠回收產(chǎn)物；B是入門克隆載體PENTR-515F7辦雙酶切檢測(cè)，圖中1_4表示不同質(zhì)粒的編號(hào)，對(duì)照是沒有經(jīng)過酶切；C是入門克隆載體pENTR-5iF7^3菌液和質(zhì)粒PCR檢測(cè)，圖中M為Maker III ；
圖6為本發(fā)明中植物表達(dá)載體pK-35S-515F7辦的檢測(cè)電泳示意圖，其中A是植物表達(dá)載體的HindIII和XhoI雙酶切以及HindIII單酶切檢測(cè)，圖中A-D表示不同編號(hào)質(zhì)粒經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切，a-d表示不同編號(hào)質(zhì)粒經(jīng)HindIII單酶切；B是植物表達(dá)載體pK-35S-5^F7辦的質(zhì)粒和菌液PCR檢測(cè)，圖中M =Maker III ；
圖7為本發(fā)明中植物表達(dá)載體pK-35S-5K^M3電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌pMP105后的菌液PCR檢測(cè)電泳示意圖；其中1-6是獲得的不 同農(nóng)桿菌單菌落編號(hào)，圖中對(duì)照為沒有加農(nóng)桿菌單菌落;M為 Maker III ；
圖8是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草的篩選流程示意 圖9是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定電泳示意圖，其中A是基因組PCR檢測(cè)示意圖，圖中負(fù)對(duì)照是沒有加基因組；CK是以ρΚ-355-5Κ^7辦的質(zhì)粒為模板，作為正對(duì)照；WT :野生型煙草；4、9、11、12、13、19和23是獲得的不同的轉(zhuǎn)基因柱系；M :Maker III ;B是轉(zhuǎn)基因植物的RT-PCR檢測(cè)示意圖，圖中WT :野生型煙草；4、9、11、12、13、19和23是獲得的不同的轉(zhuǎn)基因柱系；M :Maker III ;C是轉(zhuǎn)基因煙草Western-blotting檢測(cè)示意圖，圖中WT :野生型煙草；S1US19和S23是最終獲得的轉(zhuǎn)SGFMa基因煙草植株；
圖10是本發(fā)明鋁脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草相對(duì)根生長量和根中可溶性總蛋白含量的變化示意圖，其中A是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(S11、S19和S23)經(jīng)50μΜ的A1C13溶液處理24h后根相對(duì)生長量(RRG)的變化示意圖；B是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(S11、S19和S23)經(jīng)50μΜ的A1C13溶液處理24h后可溶性總蛋白含量變化示意圖；圖11是本發(fā)明鋁脅迫處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草根中丙二醛和H2O2含量的變化，其中A是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(Sll、S19和S23)經(jīng)50μΜ的AlCl3溶液處理24h后MDA變化示意圖；B是野生型煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(Sll、S19和S23)經(jīng)50μΜ的AlCl3溶液處理24h后H2O2的變化示意 圖12是本發(fā)明酸性土壤中轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生長30天的狀況示意圖，圖中WT是是野生型煙草；S11、S19和S23是獲得的不同轉(zhuǎn)基因柱系；
圖13是本發(fā)明酸性土壤中轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生長90天的狀況示意圖，圖中WT是是野生型煙草；S11、S19和S23是獲得的不同轉(zhuǎn)基因柱系。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施中采用的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 :外源SGF14a基因的獲得
(I)鋁脅迫下SGF14a基因的表達(dá)水平檢測(cè)
選取水培2周的生長一致的丹波黑大豆(RB)幼苗，先用pH4. 3的O. 5mM CaCl2預(yù)處理過夜后，然后置 于50μΜ的AlCl3溶液(含有O. 5mM CaCl2, pH 4. 3)分別處理O (CK)、2、4、8、12和24 h后，收集的O. 3g的1-2 cm根尖樣品，速用液氮凍存，使用Trolz試劑盒提取根尖總RNA，用DNase消化RNA中可能殘留的DNA，經(jīng)苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)抽提純化。從各 RNA 樣品中取 5Kg,用 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega 公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以28s rRNA為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR分析。根據(jù)SGF14a基因序列設(shè)計(jì)引物為5-AGGTTGAGGAGTTGACGGTGGA-3，下游5-GCGGATGGGATGAGGTTGGAC-3 ；28S rRNA 的引物序列上游5-CCCGTCTCAGATTGGTGTCATT_3，下游5-ATAGCGAGCAAGTCGGTGGATT-3。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，隨著鋁處理時(shí)間的延長，SGF14a呈現(xiàn)出逐漸上升的表達(dá)的趨勢(shì)，這說明在鋁脅迫下，能夠顯著誘導(dǎo)SGF14a基因的表達(dá)。(2)外源SGF14a基因的克隆
提取RB根中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用帶有合適酶切位點(diǎn)的SGF14a基因引物擴(kuò)增獲得的基因片段。引物序列上游為5_AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3 (含 HindIII 酶切位點(diǎn))，下游為5_CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3 C^XhoI酶切位點(diǎn))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2顯示，從圖中可以看出PCR產(chǎn)物大小大約在O. 8Kb(圖2A)，與目的基因SGF14a的大小(774)類似。然后將PCR產(chǎn)物切膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物(圖2B)，以便后續(xù)的T/A克隆。實(shí)施例2 :植物表達(dá)載體pK-35S-515F7辦的構(gòu)建 (1)T/A克隆載體的構(gòu)建
植物表達(dá)載體的構(gòu)建策略如圖3所示，將經(jīng)膠回收得到的PCR產(chǎn)物(兩端帶有HindIII和XhoI酶切位點(diǎn))，在T4-DNA連接酶的作用下與pMD-18T載體進(jìn)行連接，得到重組載體ΡΜ 18 -SGFMa0然后通過酶切和PCR來檢測(cè)重組載體pMD18T_515F7辦是否連接正確。由于SGFMa基因兩端含有HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)，用這兩個(gè)酶酶切重組載體的質(zhì)粒，如果連接正確能夠酶切出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖4A)。同時(shí)，經(jīng)過菌液和質(zhì)粒PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)都能夠擴(kuò)增出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖4B)，而負(fù)對(duì)照并不能擴(kuò)增出目的基因大小的片段。
(2)入門克隆載體pENTR_SGF14a載體的構(gòu)建
用HindIII和XhoI雙酶切pMD18T-5^F7辦載體和原始入門克隆載體pENTR_2B，經(jīng)過膠回收試劑盒分別回收酶切后的SGFMa和2B片段，結(jié)果如圖5A所示。然后在T4-DNA連接酶的作用下將這兩個(gè)回收的片段連接，得到入門克隆載體pENTR-5^F7辦，最后在經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切和PCR檢測(cè)該入門克隆載體pENTR_515F7辦連接是否正確。雙酶切結(jié)果顯示入門克隆載體酶切后能夠切出與目的基因大小類似的片段O. 8Kb (圖5B)，并且質(zhì)粒和菌液PCR檢測(cè)都能夠擴(kuò)增出目的基因大小的片段(圖5C)，這與預(yù)期結(jié)果是一致的。
(3)最終植物表達(dá)載體ρΚ-355-5Κ^7辦的構(gòu)建
在LR mix enzyme的作用下，將入門克隆載體pENTR-515F7辦與植物表達(dá)載體pK2WG7. O進(jìn)行LR重組反應(yīng)。然后對(duì)獲得的重組反應(yīng)后的最終植物表達(dá)載體進(jìn)行酶切和PCR檢測(cè)。LR反應(yīng)步驟為在Gateway的LR反應(yīng)體系中加入pENTR-515F743和Gateway的目的載體pK2GW7. O 各 150 ng, I μ L LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen),混均勻于 25°C反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把515F7辦基因整合到PK2GW7中，獲得515F7辦的植物表達(dá)載體卩1(-355-5斯7辦。由于在？1(2167.0載體上含有把11(1111酶切位點(diǎn)，如果外源目的基因51^7辦(兩端帶有HindIII和XhoI酶切位點(diǎn))正確重組進(jìn)入pK2WG7. O中，則經(jīng)過HindIII和XhoI雙酶切后能夠得到O. 8Kb和O. 4Kb (片段太短酶切后不易觀察到)片段，以及經(jīng)過HindIII單酶切后能夠得到1. 2Kb的片段，酶切后的結(jié)果與預(yù)期都一致(圖6A)。菌液和質(zhì)粒PCR后也擴(kuò)增到了與目的基因大小一致的O. 8Kb片段(圖6B)。實(shí)施例3 :植物表達(dá)載體pK-35S_SGF14a的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及轉(zhuǎn)基因煙草篩選
取少量檢測(cè)正確的植物表達(dá)載體PK-35S-515F7辦質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀滑槽中，電擊后，立即取出電轉(zhuǎn)化杯迅速加入O. 5mL SOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中；28°C 200rpm搖床培養(yǎng)3_5h ;室溫下,7500rpm離心Imin,棄其上清至100 μ I將細(xì)胞懸??；將細(xì)菌涂布帶有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天；挑選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果中可以看到能夠得到O. 8Kb的大小片段(見圖7,表 I)。
權(quán)利要求
1.一種丹波黑大豆基因的植物表達(dá)載體pK-35S-515F743，其特征在于該載體通過Gateway技術(shù)構(gòu)建，該載體中含有35S組成型啟動(dòng)子和SGFMa基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述丹波黑大豆SGFMa基因的植物表達(dá)載體pK-35S_515F7辦，其特征在于'SGFMa基因來源于丹波黑大豆，其GenBank登錄號(hào)為HM004359。
3.權(quán)利要求1所述的丹波黑大豆515F7辦基因的植物表達(dá)載體pK-35S-515F7辦在增強(qiáng)作物對(duì)酸性土壤耐受性及提高作物耐鋁能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種丹波黑大豆SGF14a基因的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用，本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫下RB根中SGF14a基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，然后從RB根中克隆得到SGF14a基因的全長序列，并通過Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物表達(dá)載體pK-35S-SGF14a，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，篩選得到能夠正確表達(dá)SGF14a基因的轉(zhuǎn)基因煙草，最后對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了耐鋁能力分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在煙草中過量表達(dá)外源SGF14a基因能夠顯著提高煙草的耐鋁及耐受酸性土壤能力。本發(fā)明中首次報(bào)道SGF14a基因能夠參與鋁脅迫應(yīng)答，并且通過Gateway技術(shù)構(gòu)建的植物表達(dá)載體pK-35S-SGF14a和獲得的轉(zhuǎn)基因煙草能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究SGF14a基因的在鋁脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)，以及為研究鋁脅迫應(yīng)答機(jī)制提供了新的基因資源和基因工程操作手段。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103045640SQ20131000046
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者陳麗梅, 郭傳龍, 李松, 周磊, 王琳 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)