專利名稱：一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細胞庫及其構(gòu)建方法，具體地說是涉及一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。間充質(zhì)干細胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細胞最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后還發(fā)現(xiàn)其存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的許多種組織中。目前，我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質(zhì)干細胞，用得最多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細胞。但骨髓來源的間充質(zhì)干細胞存在以下問題:隨著年齡的老化，干細胞數(shù)目顯著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制備過程不容易質(zhì)控；移植給異體可能引起免疫反應(yīng)；取材時對患者有損傷,患者有骨髓疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。這都限制了骨髓間充質(zhì)干細胞臨床應(yīng)用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質(zhì)干細胞來源成為一個重要的問題。2006年，我國在胎盤和臍帶組織中分離出間充質(zhì)干細胞，這種組織來源的間充質(zhì)干細胞不僅保持了間充質(zhì)干細胞 的生物學特性，與傳統(tǒng)骨髓間充質(zhì)干細胞相比，該類間充質(zhì)干細胞由于來源于更原始的胎盤和臍帶，所以免疫原性尚未發(fā)育完全，移植后異體的免疫反應(yīng)不強。再加上胎盤與臍帶作為醫(yī)療廢棄物，更容易獲得，取材容易。但是，胎盤和臍帶組織來源有限，已經(jīng)出生的人無法再獲得胎盤與臍帶，這就誘發(fā)我們?nèi)ふ揖屠硐氲拈g充質(zhì)干細胞來源。最近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間質(zhì)干細胞，是脂肪組織中一類多能性干細胞。由于脂肪組織來源廣泛、取材容易、不涉及倫理問題、便于自體移植、給患者帶來的痛苦較小，因此日益受到研究者的重視，而且與骨髓來源相比，脂肪來源間充質(zhì)干細胞分離效率高40倍，200 mL脂肪，可分離出約IXlO6個間質(zhì)干細胞。目前，研究人員已成功地在體內(nèi)、體外條件下，將其誘導(dǎo)分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉等組織類型細胞。干細胞庫就是將干細胞于深低溫狀態(tài)下長期保存。一個完善的干細胞庫可為臨床細胞治療提供良好的、足夠量的細胞來源。目前，國內(nèi)主要的干細胞庫按來源可分為臍帶干細胞庫，胎盤干細胞庫，牙髓干細胞庫，牙周膜干細胞庫等；按提供方法可分為公共庫和自體庫。脂肪間充質(zhì)干細胞庫尚無，特別的是脂肪間充質(zhì)干細胞自體庫尚無
發(fā)明內(nèi)容
為了彌補無人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的不足，本發(fā)明提供一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫及其制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于:包括下述步驟，
(1)無菌采集人體脂肪；
(2)油脂的去除:將脂肪剪碎，收集于離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩沖液，劇烈震蕩后室溫靜置分層，收集上層部分用磷酸鹽緩沖液洗滌；
(3)膠原酶消化:加入等體積的膠原酶消化；加入等體積的含10%血清的DMEM-LG終止消化，充分混均后室溫靜置IOmin分層；去掉上層，離心，收集下層部分；
(4)紅細胞的裂解:加入2倍體積的紅細胞裂解液重懸3min，離心，棄上清；用PBS液清洗，40 μ m濾膜過濾后，向所得細胞中加含10%血清的DMEM-LG培養(yǎng)液，離心收集細胞，并于100U/mL青霉素/鏈霉素、10%血清的DMEM-LG中培養(yǎng)，即獲得人脂肪間充質(zhì)干細胞；
(5)擴大培養(yǎng):人脂肪間充質(zhì)干細胞進行擴大培養(yǎng)；
(6)凍存:收集擴大培養(yǎng)后的人脂肪間充質(zhì)干細胞于凍存液中，置液氮冷凍，按AB0/RH分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構(gòu)建出人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，步驟(4)得到的人脂肪間充質(zhì)干細胞需要進行增殖能力驗證，選擇增殖能力強的人脂肪間充質(zhì)干細胞進行擴大培養(yǎng)。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，所述血清為自體血清。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，自體血清由下述方法制得:無菌采集外周靜脈血20mL，于4°C冰箱靜置4h，在37°C溫箱孵育4h，1500r/min離心5min，吸取上層血清，0.22 μ m過濾滅菌，在超凈工作臺內(nèi)分裝，經(jīng)細菌培養(yǎng)陰性，_20°C保存?zhèn)溆?。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，所述人脂肪間充質(zhì)干細胞庫為自體庫。一種采用本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法構(gòu)建出的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有顯著的有益效果。人脂肪間質(zhì)干細胞是脂肪組織中一類多能性干細胞，能誘導(dǎo)分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉等組織類型細胞。脂肪組織來源廣泛、取材容易、不涉及倫理問題、便于自體移植、給患者帶來的痛苦較?。欢遗c骨髓等來源的間充質(zhì)干細胞相比，脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖快，分離效率高，200 mL脂肪，可分離出約I X 106個間質(zhì)干細胞，是骨髓的40倍。本發(fā)明提供一種人脂肪間充質(zhì)細胞庫及其構(gòu)建方法，彌補了無脂肪間充質(zhì)干細胞庫的不足。



圖1自體血清與胎牛血清培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細胞增殖柱狀圖。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施方式
做進一步說明。一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
(I)無菌采集人體脂肪:先對脂肪間充質(zhì)干細胞保存人進行AB0/RH血型分型、HLA分型、微生物學檢測，HIV, HBV, HCV, TP檢測，然后無菌采集脂肪；采集位點最好是人體脂肪較豐厚的大腿內(nèi)側(cè)部位；為了方便操作，采集的脂肪條優(yōu)選長7-8cm。(2)油脂的去除:取5g脂肪組織，先用無菌的手術(shù)剪刀或者小刀剪碎，長度要求不大于3mm，然后收集于15mL離心管，加入等體積的磷酸鹽緩沖液，劇烈震蕩后室溫靜至5min，等分為兩層后小心收集上層部分(包含有間充質(zhì)干細胞、脂肪細胞、磷酸鹽緩沖液及紅細胞)，去掉下層的油脂/脂質(zhì) ，收集的上層部分采用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍。(3)膠原酶的消化:加入等體積的0.075%的膠原酶I消化，37°C水浴30min ;加入等體積的含10%血清的DMEM終止消化，充分混均后室溫靜置IOmin分層；去掉上層(脂質(zhì)/碎片)，200C，280g離心5min收集下層部分(基質(zhì)血管部分、干細胞、紅細胞)。(4)紅細胞裂解:加入2倍體積的紅細胞裂解液重懸3min，離心，棄上清；用PBS液清洗，40 μ m濾膜過濾后，向所得細胞中加含10%血清的DMEM-LG培養(yǎng)液，離心收集細胞，并于100U/mL青霉素/鏈霉素、10%血清的DMEM-LG中培養(yǎng)，即獲得人脂肪間充質(zhì)干細胞。將獲得的人脂肪間充質(zhì)干細胞按1/3接種量接種于24細胞孔培養(yǎng)板中，等待細胞貼壁后加入CCK-8試劑，對獲得的人脂肪間充質(zhì)干細胞進行增殖能力驗證。CCK-8試劑在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的四氮唑鹽的還原產(chǎn)物。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。(5)擴大培養(yǎng):選擇增殖能力強的人脂肪間充質(zhì)干細胞進行擴大培養(yǎng)。(6)凍存:將人脂肪間充質(zhì)干細胞置液氮冷凍，按AB0/RH分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構(gòu)建出人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，所述血清為自體血清。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，自體血清由下述方法制得:無菌采集外周靜脈血20mL，于4°C冰箱靜置4h，在37°C溫箱孵育4h，1500r/min離心5min，吸取上層血清，0.22 μ m過濾滅菌，在超凈工作臺內(nèi)分裝，經(jīng)細菌培養(yǎng)陰性，_20°C保存?zhèn)溆?。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法的一種優(yōu)選實施方式，所述人脂肪間充質(zhì)干細胞庫為自體庫。一種采用本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法構(gòu)建出的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。為了保證人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的成功建成和其安全性，上述全部過程均在無菌環(huán)境下操作。實施例1
人脂肪間充質(zhì)干細胞庫，采用如下方法構(gòu)建:
(I)無菌采集人體脂肪:先對脂肪間充質(zhì)干細胞保存人進行AB0/RH血型分型、HLA分型、微生物學檢測，HIV, HBV, HCV, TP檢測，以上各指標的檢測結(jié)果均為陰性；然后無菌采集脂肪，I次可取200 mL脂肪，從中可分離出約I X IO6個間質(zhì)干細胞。(2)油脂的去除:將獲取的脂肪組織先用無菌的手術(shù)剪刀或者小刀剪碎，長度要求不大于3mm，再用等體積PBS液反復(fù)沖洗，靜置等分層，去掉下層的油脂/脂質(zhì)，收集的上層部分。(3)膠原酶消化:加入0.075% I型膠原酶，37 °C振蕩、消化30 min，然后以含10%自體血清的DMEM-LG培養(yǎng)基終止消化；280g離心5 min,棄上清液及懸浮的殘存組織，重懸細胞；
(4)紅細胞的裂解:加入2倍體積的紅細胞裂解液(160 mM NH4Cl + KHCO3 10 mmol/L+ EDTA 0.1 mmol/L)靜置3 min,280g離心5 min,棄上清液。用適量的PBS液清洗3次，40 μ m濾膜過濾，所得細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，加5 mL 10%自體血清的DMEM-LG培養(yǎng)基，混合均勻，置于37 °C、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)特征及增殖情況，第二天首次換液，以后每三天換液I次。待細胞融合超過培養(yǎng)瓶底80%時，常規(guī)胰酶消化傳代。將分離所得細胞按1/3接種量接種于24細胞孔培養(yǎng)板中，等待細胞貼壁后加入CCK-8試劑，CCK-8試劑在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的四氮唑鹽的還原產(chǎn)物。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。(5)擴大培養(yǎng):選擇增殖能力強的細胞進行擴大培養(yǎng)。(6)凍存:將所獲得的人脂肪間充質(zhì)干細胞裝進凍存管，用程序除溫盒置于-80 V，第二天將凍存管存在_196°C的液氮罐中，將其詳細信息記錄入庫，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構(gòu)建出人脂肪間充質(zhì)干自體細胞庫。在國內(nèi)外傳統(tǒng)干細胞培養(yǎng)方法中，常采用胎牛血清作為營養(yǎng)支持，胎牛血清對于細胞的生長起著重要的作用，但同時也成為未來臨床應(yīng)用的一個障礙。因為胎牛血清可增加病毒感染及異種蛋白所導(dǎo)致基因免疫應(yīng)答反應(yīng)、排異反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)的可能性，尤以反復(fù)體內(nèi)輸入時更易發(fā)生。盡管采用國外優(yōu)質(zhì)的胎牛血清，經(jīng)過了嚴格的處理，但仍然存在病毒或細菌感染的潛在風險。據(jù)報道，采用異體/異種血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞后移植治冶療后導(dǎo)致惡性室性心律失常；胎牛血清中的朊病毒通過按照自身結(jié)構(gòu)重建正常蛋白結(jié)構(gòu)來引發(fā)Creutzfeldt-Jakob病(或在牛身上引發(fā)“瘋牛病”)；研究發(fā)現(xiàn)，擴增獲得108個細胞時含7-30mg的胎牛血清，所在風險將進一步擴大。而采用自體血清作為營養(yǎng)支持，排異反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)的可能性大大降低。作為本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的一種優(yōu)選實施方式，自體血清由下述方法制得:無菌采集外周靜脈血20mL，于4°C冰箱靜置4h，在37°C溫箱孵育4h, 1500r/min離心5min,吸取上層血清,0.22 μ m過濾滅菌,在超凈工作臺內(nèi)分裝,經(jīng)細菌培養(yǎng)陰性，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｓ煤ヅＱ宓腄EME-LG培養(yǎng)基做對照，與使用胎牛血清培養(yǎng)方法相比原代培養(yǎng)時貼壁時間無統(tǒng)計學差異，傳代培養(yǎng)時自體血清培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細胞增殖速率明顯增快，如圖1所示。本發(fā)明采用人自體血清培炎脂肪間充質(zhì)干細胞,不含動物血清,大大降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的概率。而且，在擴增前進行增殖 能力檢測，有選擇性的進行擴增培養(yǎng)，大大提高了干細胞庫中干細胞的數(shù)量和質(zhì)量。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以`所附權(quán)利要求為準。
權(quán)利要求
1.一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括下述步驟: (1)無菌采集人體脂肪； (2)油脂的去除:將脂肪剪碎，收集于離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩沖液，劇烈震蕩后室溫靜置分層，收集上層部分用磷酸鹽緩沖液洗滌； (3)膠原酶消化:加入等體積的膠原酶消化；加入等體積的含10%血清的DMEM-LG終止消化，充分混均后室溫靜置IOmin分層；去掉上層，離心，收集下層部分； (4)紅細胞的裂解:加入2倍體積的紅細胞裂解液重懸3min，離心，棄上清；用PBS液清洗，40 μ m濾膜過濾后，向所得細胞中加含10%血清的DMEM-LG培養(yǎng)液，離心收集細胞，并于100U/mL青霉素/鏈霉素、10%血清的DMEM-LG中培養(yǎng)，即獲得人脂肪間充質(zhì)干細胞； (5)擴大培養(yǎng):對人脂肪間充質(zhì)干細胞進行擴大培養(yǎng)； (6)凍存:收集擴大培養(yǎng)后的人脂肪間充質(zhì)干細胞于凍存液中，置液氮冷凍，按AB0/RH分型和HLA分型進行保存，建立可供檢索的細胞信息檔案，即構(gòu)建出人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(4)得到的人脂肪間充質(zhì)干細胞需要進行增殖能力驗證，選擇增殖能力強的人脂肪間充質(zhì)干細胞進行擴大培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于:所述血清為自體血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于:自體血清由下述方法制得:無菌采集外周靜脈`血20mL，于4°C冰箱靜置4h，在37°C溫箱孵育4h，1500r/min離心5min,吸取上層血清,0.22 μ m過濾滅菌,在超凈工作臺內(nèi)分裝，經(jīng)細菌培養(yǎng)陰性，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫構(gòu)建方法，其特征在于:所述人脂肪間充質(zhì)干細胞庫為自體庫。
6.一種權(quán)利要求1-5任一項所述的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫的構(gòu)建方法構(gòu)建出的人脂肪間充質(zhì)干細胞庫。
全文摘要
本發(fā)明公開一種人脂肪間充質(zhì)干細胞庫及其構(gòu)建方法，本發(fā)明人脂肪間充質(zhì)干細胞庫由下述步驟構(gòu)建得到(1)無菌采集人體脂肪；(2)油脂的去除；(3)膠原酶消化；(4)紅細胞的裂解；(5)擴大培養(yǎng)；(6)凍存。人脂肪間質(zhì)干細胞是脂肪組織中一類多能性干細胞，能誘導(dǎo)分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉等組織類型細胞。脂肪組織來源廣泛、取材容易、不涉及倫理問題、便于自體移植、給患者帶來的痛苦較??；而且與骨髓等來源的間充質(zhì)干細胞相比，脂肪來源間充質(zhì)干細胞增殖快，分離效率高。
文檔編號C12N5/0775GK103074298SQ20131000064
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者馮文峰, 列浦昌, 佘志勇, 方海慶 申請人:廣州愛菲科生物科技有限公司