專利名稱：一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
右旋糖酐酶是新的酶種，可以把右旋的糖酐催化分解為葡萄糖或寡糖的酶，是一種蛋白質(zhì)。右旋糖酐酶在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)都有重要的用途。右旋糖酐酶的研究對于齲齒的防治進(jìn)而開發(fā)齲齒疫苗具有重要意義；右旋糖酐酶可以用于藥用右旋糖酐的生產(chǎn)，并且可以用于制備葡聚糖凝膠藥物緩釋體系；在制糖工業(yè)中，可改善糖產(chǎn)品的濾過性，增加糖的回收率，降低黏度，因此該產(chǎn)品市場前景廣闊?，F(xiàn)有右旋糖酐酶的發(fā)酵方法是在固定的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)發(fā)酵一定時間直至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過程中培養(yǎng)基是不變的，這種發(fā)酵方法所得到右旋糖酐酶的酶活單位較低，酶活單位在450u/ml 460 u/ml之間。右旋糖酐酶產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源為右旋糖酐，同時右旋糖酐也是產(chǎn)生右旋糖酐酶的誘導(dǎo)齊U，產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑的持續(xù)性誘導(dǎo)作用是提高產(chǎn)酶量的重要方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，顯著提高右旋糖酐酶的酶活單位，酶活單位的最高增幅達(dá)18%。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的，一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，包括以下步驟
(1)將右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的沙土孢子接種于斜面培養(yǎng)基，保持溫度28°c、濕度40-60%、培養(yǎng)5— 6天；
(2)將成熟的斜面孢子接入搖瓶種子培養(yǎng)基，保持溫度28°C、濕度40-60%、轉(zhuǎn)速220—240RPM,培養(yǎng) 40— 60 小時；
(3)將搖瓶種子按1%的接種量接種于種子罐中培養(yǎng)種子液,保持28°C培養(yǎng)40—60小
時；
(4)按1%的接種量將步驟(3)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持28°C發(fā)酵；
其特征在于，所述步驟(4)發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至O. 26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5-1. 5%，繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至O. 20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5-1. 5%，繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵。所述的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌為棘孢青霉菌。按重量比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨O. 2-0. 5%，K2HP04 O. 3-0. 5%，KCl
O.01-0. 02%, FeS04 O. 001-0. 002%，右旋糖酐1. 5-3. 5%，余量為井水。本發(fā)明的優(yōu)選方案是，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液的質(zhì)量濃度為30%-40%，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1%。
發(fā)明人在研究如何提高右旋糖酐酶酶活單位的過程中發(fā)現(xiàn)，在右旋糖酐酶發(fā)酵過程中后期補(bǔ)入適量的右旋糖酐作為產(chǎn)右旋糖酐酶的持續(xù)性誘導(dǎo)劑，其產(chǎn)酶時間延長，酶活單位增幅明顯，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在右旋糖酐酶發(fā)酵過程中補(bǔ)入重量比1.0%的右旋糖酐，酶活單位增幅最為明顯，酶活單位提高18%左右；本發(fā)明具有操作性強(qiáng)，投入低、產(chǎn)出高的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明發(fā)酵過程補(bǔ)入右旋糖酐對右旋糖酐酶生物合成的影響，使用的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌為棘孢青霉菌，所使用的比例均為重量百分比，右旋糖酐酶的酶活單位采用DNS法進(jìn)行檢測。在本發(fā)明的實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蛋白胨O. 2-0. 5%，K2HP04
O.3-0. 5%, KCl O. 01-0. 02%, FeS04 O. 001-0. 002%，右旋糖酐1. 5-3. 5%,余量為深井水。補(bǔ)料為質(zhì)量濃度30%-40%的右旋糖酐液，補(bǔ)入右旋糖酐的量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量
O.5-1. 5%。實(shí)施例1
發(fā)酵培養(yǎng)基配方蛋白胨O. 5%, K2HP04 O. 5%,，KCl O. 02%, FeS04 O. 002%，右旋糖酐3. 0%，余量為深井水。以50L發(fā)酵罐進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)，將右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的沙土孢子接種于斜面培養(yǎng)基，溫度28°C、濕度40-60%、培養(yǎng)5— 6天；將成熟的斜面孢子接入搖瓶種子培養(yǎng)基，溫度280C、濕度40-60%、轉(zhuǎn)速220—240RPM，培養(yǎng)40—60小時；將搖瓶種子按1%的接種量接種于種子罐培養(yǎng)種子液，28°C培養(yǎng)40—60小時；將種子液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持28°C發(fā)酵至發(fā)酵培養(yǎng)基總糖含量降至O. 26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5% ;繼續(xù)發(fā)酵，菌體出現(xiàn)大量空泡，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基總糖含量降至O. 20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5% ;繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵。 采用DNS法檢測酶活單位，本發(fā)明實(shí)施例1的酶活單位為503 u/ml，同等條件下發(fā)酵過程未補(bǔ)入右旋糖酐的酶活單位為461 u/ml，酶活單位增幅為8%。實(shí)施例2
發(fā)酵培養(yǎng)基配方蛋白胨O. 3%, K2HP04 O. 4%,，KCl O. 015%, FeS04 O. 0015%，右旋糖酐3. 0%，余量為深井水。以50L發(fā)酵罐進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)，將右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的沙土孢子接種于斜面培養(yǎng)基，溫度28°C、濕度40-60%、培養(yǎng)5— 6天；將成熟的斜面孢子接入搖瓶種子培養(yǎng)基，溫度28°C、濕度40-60%、轉(zhuǎn)速220— 240RPM，培養(yǎng)40— 60小時；將搖瓶種子按1%的接種量接種于種子罐培養(yǎng)種子液，28°C培養(yǎng)40—60小時；將種子液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持28°C發(fā)酵至發(fā)酵培養(yǎng)基總糖含量降至O. 26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1% ;繼續(xù)發(fā)酵，菌體出現(xiàn)大量空泡，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基總糖含量降至O. 20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1% ;繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵。采用DNS法檢測酶活單位，本發(fā)明實(shí)施例2的酶活單位為543u/ml，同等條件下發(fā)酵過程未補(bǔ)入右旋糖酐的酶活單位為459u/ml，酶活單位增幅為18%。實(shí)施例3
發(fā)酵培養(yǎng)基配方蛋白胨O. 2%, K2HP04 O. 3%,，KCl O. 01%, FeS04 O. 001%，右旋糖酐
3.0%，余量為深井水。以50L發(fā)酵罐進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)，將右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的沙土孢子接種于斜面培養(yǎng)基，溫度28°C、濕度40-60%、培養(yǎng)5— 6天；將成熟的斜面孢子接入搖瓶種子培養(yǎng)基，溫度280C、濕度40-60%、轉(zhuǎn)速220—240RPM，培養(yǎng)40—60小時；將搖瓶種子按1%的接種量接種于種子罐培養(yǎng)種子液，28°C培養(yǎng)40—60小時；將種子液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持28°C發(fā)酵至發(fā)酵培養(yǎng)基總糖降含量至O. 26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1. 5% ;繼續(xù)發(fā)酵，菌體出現(xiàn)大量空泡，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基總糖含量降至O. 20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加質(zhì)量濃度為30%-40%的右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1. 5% ;繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵。

采用DNS法檢測酶活單位，本發(fā)明實(shí)施例3的酶活單位為465 u/ml,同等條件下發(fā)酵過程未補(bǔ)入右旋糖酐的酶活單位為451 u/ml，酶活單位增幅為3%。結(jié)果顯示，在發(fā)酵過程中補(bǔ)入發(fā)酵培養(yǎng)基總重量O. 5-1. 5%的右旋糖酐，右旋糖酐酶的酶活單位增幅3 —18%，隨著右旋糖酐補(bǔ)入量的逐步提高，右旋糖酐酶的酶活單位開始下降，酶活單位的最高增幅達(dá)18%，對應(yīng)的發(fā)酵過程右旋糖酐補(bǔ)入量為當(dāng)時發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1. 0%。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，包括以下步驟 (1)將右旋糖酐酶產(chǎn)生菌的沙土孢子接種于斜面培養(yǎng)基，保持溫度28°c、濕度40-60%、培養(yǎng)5—6天； (2)將成熟的斜面孢子接入搖瓶種子培養(yǎng)基，保持溫度28°C、濕度40-60%、轉(zhuǎn)速220—240RPM,培養(yǎng) 40— 60 小時； (3)將搖瓶種子按1%的接種量接種于種子罐中培養(yǎng)種子液,保持28°C培養(yǎng)40—60小時； (4)按1%的接種量將步驟(3)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持28°C發(fā)酵； 其特征在于，所述步驟(4)發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至O. 26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5-1. 5%，繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至O. 20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的O. 5-1. 5%，繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，其特征在于，所述的右旋糖酐酶產(chǎn)生菌為棘孢青霉菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，其特征在于，按重量比計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有:蛋白胨O. 2-0. 5%, K2HP04 O. 3-0. 5%, KCl O. 01-0. 02%,FeS04 O. 001-0. 002%，右旋糖酐1. 5-3. 5%，余量為井水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，其特征在于，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液的質(zhì)量濃度為30%-40%，所流加右旋糖酐液中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的1%。
全文摘要
本發(fā)明公開一種提高右旋糖酐酶酶活單位的發(fā)酵方法，發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至0.26%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的0.5-1.5%，繼續(xù)發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖量降至0.20%時，向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加右旋糖酐液，其中右旋糖酐的含量為發(fā)酵培養(yǎng)基總重量的0.5-1.5%，繼續(xù)發(fā)酵160-170小時后結(jié)束發(fā)酵；本發(fā)明通過在右旋糖酐酶發(fā)酵過程中后期補(bǔ)入適量的右旋糖酐作為生產(chǎn)右旋糖酐酶的持續(xù)性誘劑，其產(chǎn)酶時間延長，酶活單位增幅明顯，最大增幅達(dá)18%，本發(fā)明具有操作性強(qiáng)，投入低、產(chǎn)出高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N9/46GK103060292SQ201310000980
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者曹新年, 楊春麗, 李為全, 劉瑞華, 陳偉 申請人:安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司