專利名稱：一種純化蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及微生物發(fā)酵，生物制藥，發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離和純化工藝，特別涉及一種純化蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法。
背景技術(shù)：
臘樣芽孢桿菌(Bacillus, cereus簡稱B.cereus)廣泛地分布在在自然界中，在空氣、塵埃、土壤、水及植物中都可以分離出蠟樣芽孢桿菌。蠟樣芽孢桿菌活菌制劑是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的微生物制品，具有調(diào)節(jié)宿主微生態(tài)平衡的功能，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、飼料、醫(yī)藥保健和食品等領(lǐng)域。然而，此制劑也和其他微生態(tài)制劑一樣，存在以下幾個(gè)問題:生產(chǎn)過程中溫度、壓片等因素導(dǎo)致活菌數(shù)減少有效期內(nèi)活菌量不穩(wěn)定，產(chǎn)品有效期不長、貨架期短等。因此，提聞臘樣芽抱桿菌制劑的活菌數(shù)對(duì)廣品質(zhì)量的提聞具有重大意義，也為工業(yè)化生產(chǎn)蠟樣芽孢桿菌活菌制劑奠定了基礎(chǔ)。蠟樣芽孢桿菌可單獨(dú)制成微生態(tài)制劑，用于胃腸道疾病的防治、降血脂、抗衰老、防止細(xì)菌移位、抗腫瘤及自身免疫性疾病防治，如能效改善肝硬化患者腸道菌群失調(diào)，并可降低血清LBP濃度，可以作為肝硬化患者的輔助治療措施。蠟樣芽孢桿菌不但其本身可以被制成微生物菌劑和微生物肥料，它還能通過體內(nèi)的SOD酶，調(diào)節(jié)作物細(xì)胞微生境，維持細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng)，提高抗逆性，加速生長，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。有益蠟樣芽孢桿菌具有分泌各種蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(S0D)、抗菌素及多種氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的能力，因此可以被廣泛應(yīng)用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等各領(lǐng)域。研究表明:蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性物質(zhì)主要是其活菌的生理與代謝活動(dòng)而產(chǎn)生的抗菌蛋白、多肽類及幾丁質(zhì)酶等多種物質(zhì)。但蠟樣芽孢桿菌制劑普遍存在產(chǎn)品有效期不長、貨架期短等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有的技術(shù)中存在的缺陷或者不足，提供一種純化蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為:利用自主篩選鑒定的臘樣芽孢桿菌Bacillus cereusCGMCC N0.4348，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液，并利用硫酸銨分級(jí)沉淀方法提取出抑菌蛋白粗品，具體培養(yǎng)及提取方法見本發(fā)明人申請(qǐng)的專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01210056365.7);利用葡聚糖凝膠柱來進(jìn)一步純化抑菌蛋白粗品，并將其對(duì)真菌病害進(jìn)行抑菌活性檢測。本發(fā)明操作方便、工藝簡單、成本低廉，可以顯著提高其發(fā)酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。本發(fā)明的具體技術(shù)方案:一種純化蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus CGMCC4348發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法，其具體步驟如下:(I)抑菌蛋白的提取:利用蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus CGMCC N0.4348，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，并將此發(fā)酵液采用硫酸銨分級(jí)沉淀以提取獲得抑囷蛋白粗品；(2)裝柱:稱取葡聚糖凝膠用蒸餾水以15_20mL/g的比例進(jìn)行裝柱前的溶脹3_5h ；將處理好的葡聚糖凝膠用濕法上柱；上柱后用緩沖液進(jìn)行充分平衡；(3)上樣:將步驟(I)中獲得的抑菌蛋白粗品配成15-20mg/ml樣品溶液，注入到平衡好的凝膠柱上；(4)洗脫收集:用緩沖液進(jìn)行洗脫，其中緩沖液的流速為0.5-1.0mL/min，每2-5min收集一次洗脫液；將收集的洗脫液分別在波長為280nm下測定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脫液，濃縮干燥后得到抑菌蛋白。本發(fā)明中抑菌活性測定:把抑菌蛋白用無菌水配成5.0-10.0ug/mL的蛋白溶液。培養(yǎng)出中心接有棉花枯萎病病菌和黃瓜枯萎病病菌菌碟的PDA平板培養(yǎng)48h后，于平板上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2cm處各用打孔器(d=6mm)各打一個(gè)圓孔，在其中三個(gè)孔內(nèi)注入10-20uL的抑菌蛋白溶液，另一個(gè)圓孔中以無菌水作為對(duì)照。27 32°C培養(yǎng)42 48h，觀察發(fā)現(xiàn)純化的抑菌蛋白具有顯著的拮抗作用。本發(fā)明步驟(I)中所述的臘樣芽孢桿菌Bacillus cereus CGMCC4348抑菌蛋白粗品的提取的方法詳見本發(fā)明人申請(qǐng)的專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01210056365.7)，本發(fā)明是在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究得到的。優(yōu)選上述的葡聚糖凝膠型號(hào)為:Sephadex G-150、Sephadex G-100或SephadexG-75 ;凝膠柱的徑高比為:1:(10-15)。優(yōu)選步驟(2)和(4)中所述的緩沖液為:0.02-0.05mol/L的Tris-HCl，pH為
7.1-8.5 ;步驟(2)中充分平衡凝膠柱的時(shí)間為2-5h。

優(yōu)選步驟(3)中所述的注入到凝膠柱上的抑菌蛋白粗品溶液的體積為凝膠柱柱床體積的10%-15% ；本專利選用的蠟樣芽孢桿菌，其分類命名為蠟狀芽孢桿菌，菌種的拉丁學(xué)名是Bacillus cereus，參據(jù)的微生物:NJYH63305，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC N0.4348。有益效果:采用本發(fā)明的微生物發(fā)酵提純發(fā)酵液中的抑菌蛋白的方法，利用自主篩選鑒定的蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus CGMCC N0.4348，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，采用硫酸銨分級(jí)沉淀來獲取抑菌蛋白的；利用葡聚糖凝膠柱來進(jìn)一步純化抑菌蛋白，并將其對(duì)真菌病害進(jìn)行抑菌活性檢測。本發(fā)明操作方便、工藝簡單、成本低廉，可以顯著提高其發(fā)酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。保藏信息上述臘樣芽孢桿菌Bacillus cerreus CGMCC N0.4348是由本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，其簡稱為CGMCC，登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC N0.4348，保藏日期是:2010年11月15日(見本發(fā)明人申請(qǐng)的專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01010579133.0)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
(1)抑菌蛋白的提取:利用自主篩選鑒定的蠟樣芽孢桿菌BacillusCereuSCGMCC4348，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，并將此發(fā)酵液采用硫酸銨分級(jí)沉淀以提取獲得抑菌蛋白粗品，參見本發(fā)明人申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01210056365.7)中的實(shí)例I中提取的抑菌蛋白組分A，其對(duì)棉花枯萎病病菌的抑菌率為62% ；(2)裝柱:稱取葡聚糖凝膠S^hadex G-100用蒸餾水以16mL/g的比例進(jìn)行裝柱前的溶脹3h ;將處理好的葡聚糖凝膠用濕法上柱；柱的徑高比為:1:15，上柱后用0.02mol/LpH為7.1的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行充分平衡3h ；(3)上樣:將步驟(I)中獲得的抑菌蛋白配成15mg/ml樣品溶液，注入到平衡好的凝膠柱上；上樣的抑菌蛋白粗品溶液的體積為凝膠柱柱床體積的14% ；(4)洗脫收集:用0.02mol/L pH為7.1的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，其中，緩沖液的流速為0.8mL/min,每3min收集一次洗脫液,將收集的洗脫液分別在波長為280nm下測定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脫液，濃縮干燥后得到抑菌蛋白。(5)活性測定:把步驟(4)中純化的抑菌蛋白用無菌水配成6.0ug/mL的蛋白溶液。培養(yǎng)出中心接有棉花枯萎病病菌的PDA平板培養(yǎng)48h后，于平板上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2cm處各用打孔器(d=6mm)各打一個(gè)圓孔，在其中三個(gè)孔內(nèi)注入15uL的抑菌蛋白溶液，另一個(gè)圓孔中以無菌水作為對(duì)照。28°C培養(yǎng)47h，觀察發(fā)現(xiàn)純化的抑菌蛋白組分A的抑菌率達(dá)到73%。實(shí)施例2(1)抑菌蛋白的提取:利用自主篩選鑒定的蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCGMCC4348,通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，并將此發(fā)酵液采用硫酸銨分級(jí)沉淀以提取獲得抑菌蛋白粗品；參見本發(fā)明人申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01210056365.7)中的實(shí)例2中提取的抑菌蛋白組分B，其對(duì)黃瓜枯萎病病菌的抑菌率為42% ；(2)裝柱:稱取葡聚糖凝膠S印hadex G-150用蒸餾水以20mL/g的比例進(jìn)行裝柱前的溶脹5h ;將處理好的葡聚糖凝膠用濕法上柱；柱的徑高比為:1:15，上柱后用0.03mol/LpH為7.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行充分平衡4h ；(3)上樣:將步驟(I)中獲得的抑菌蛋白配成18mg/ml樣品溶液，注入到平衡好的凝膠柱上；上樣的抑菌蛋白粗品溶液的體積為凝膠柱柱床體積的15% ；(4)洗脫收集:用0.03mol/L pH為7.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，其中，緩沖液的流速為0.6mL/min,每2min收集一次洗脫液,將收集的洗脫液分別在波長為280nm下測定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脫液，濃縮干燥后得到抑菌蛋白。(5)活性測定:把步驟(4)中純化的抑菌蛋白用無菌水配成10.0ug/mL的蛋白溶液。培養(yǎng)出中心接有黃瓜枯萎病病菌的PDA平板培養(yǎng)48h后，于平板上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2cm處各用打孔器(d=6mm)各打一個(gè)圓孔，在其中三個(gè)孔內(nèi)注入20uL的抑菌蛋白溶液，另一個(gè)圓孔中以無菌水作為對(duì)照。30°C培養(yǎng)45h，觀察發(fā)現(xiàn)純化的抑菌蛋白組分B的抑菌率達(dá)到59%ο實(shí)施例3(1)抑菌蛋白的提取:利用自主篩選鑒定的蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCGMCC4348,通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，并將此發(fā)酵液采用硫酸銨分級(jí)沉淀以提取獲得抑菌蛋白粗品；參見本發(fā)明人申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)枮?01210056365.7)中的實(shí)例3中提取的抑菌蛋白組分A，其對(duì)棉花枯萎病病菌的抑菌率為59% ；(2)裝柱:稱取葡聚糖凝膠Sephadex G-75用蒸懼水以18mL/g的比例進(jìn)行裝柱前的溶脹4h ;將處理好的葡聚糖凝膠用濕法上柱；柱的徑高比為:1:10，上柱后用0.04mol/LpH為8.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行充分平衡2h ；(3)上樣:將步驟(1)中獲得的抑菌蛋白配成20mg/ml樣品溶液，注入到平衡好的凝膠柱上；上樣的抑菌蛋白粗品溶液的體積為凝膠柱柱床體積的10% ；(4)洗脫收集:用0.04mol/L pH為8.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，其中，緩沖液的流速為1.0mL/min,每5min收集一次洗脫液,將收集的洗脫液分別在波長為280nm下測定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脫液，濃縮干燥后得到抑菌蛋白；(5)活性測定:把步驟(4)中純化的抑菌蛋白用無菌水配成8.0ug/mL的蛋白溶液。培養(yǎng)出中心接有棉花枯萎病病菌的PDA平板培養(yǎng)42h后，于平板上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2cm處各用打孔器(d=6mm)各打一個(gè)圓孔，在其中三個(gè)孔內(nèi)注入IOuL的抑菌蛋白溶液，另一個(gè)圓孔中以無菌水作為對(duì)照。32°C培養(yǎng)42h，觀察發(fā)現(xiàn)純化的抑菌蛋白組分A的抑菌率達(dá)到71%。
權(quán)利要求
1.一種純化蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法，其具體步驟如下: (1)抑菌蛋白的提取:利用蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus CGMCC N0.4348，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出含有抑菌蛋白的發(fā)酵液，并將此發(fā)酵液采用硫酸銨分級(jí)沉淀以提取獲得抑菌蛋白粗品； (2)裝柱:稱取葡聚糖凝膠用蒸餾水以15-20mL/g的比例進(jìn)行裝柱前的溶脹3-5h;將處理好的葡聚糖凝膠用濕法上柱；上柱后用緩沖液進(jìn)行充分平衡； (3)上樣:將步驟(I)中獲得的抑菌蛋白粗品配成15-20mg/ml樣品溶液，注入到平衡好的凝膠柱上； (4)洗脫收集:用緩沖液進(jìn)行洗脫，其中緩沖液的流速為0.5-1.0mL/min，每2-5min收集一次洗脫液；將收集的洗脫液分別在波長為280nm下測定其吸光度，保存具有吸收峰的洗脫液，濃縮干燥后得到抑菌蛋 白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的葡聚糖凝膠型號(hào)為:Sephadex G-150、Sephadex G-100 或 Sephadex G-75 ;凝膠柱的徑高比為:1: (10-15)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)和(4)所述的緩沖液均為:0.02-0.05mol/L的Tris-HCl, pH為7.1-8.5 ;步驟(2)中充分平衡凝膠柱的時(shí)間為2_5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的注入到凝膠柱上的抑菌蛋白粗品溶液的體積為凝膠柱柱床體積的10-15%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中抑菌蛋白的方法，利用自主篩選鑒定的蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus(CGMCC NO.4348)，通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)出蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液，并利用硫酸銨分級(jí)沉淀方法提取出抑菌蛋白粗品；再利用葡聚糖凝膠柱來進(jìn)一步純化抑菌蛋白粗品，并將其對(duì)真菌病害進(jìn)行抑菌活性檢測。本發(fā)明操作方便、工藝簡單、成本低廉，可以顯著提高其發(fā)酵液中抑菌蛋白的抑菌能力。
文檔編號(hào)C12R1/085GK103088093SQ20131000617
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者胡永紅, 楊文革, 江心敏, 唐容容, 沈飛, 朱文俊, 馮旌 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)