專利名稱：兩種dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及兩種dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麥蚜(尤其是麥長管蚜)是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計，中國每年小麥蚜蟲危害面積可高達(dá)0.17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15% — 30%，嚴(yán)重時可高達(dá)50%。近 年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點(diǎn)之一，通過寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲危害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過程是雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成2123nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過植物介導(dǎo)的昆蟲腸道特異基因RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問題，目前已完成生產(chǎn)性試驗。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能；Zha等從褐飛虱中腸中克隆了 3個高度表達(dá)的基因:N1HT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水平下降了 40%到70%，并且在水稻的篩管部發(fā)現(xiàn)了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達(dá))和Rack-1(主要在腸道中表達(dá))2個基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-1的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲的產(chǎn)仔數(shù)目減少。小麥抗蚜蟲種質(zhì)資源缺乏，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過基因工程育種提高小麥抗蚜特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供了 dsRNA。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下1)、2)或3):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。上述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質(zhì)量比為1:1。上述1)、2)或3)所示的所述dsRNA的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，具體如下:1)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸；2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸；3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。上述dsRNA或上述的編碼基因的下述任一種應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或制備在防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；

2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制ill牙蟲生長中的應(yīng)用或制備在抑制ill牙蟲生長廣品中的應(yīng)用；4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)中的應(yīng)用或制備在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長、抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)；所述導(dǎo)入具體為飼喂； 所述蚜蟲具體為麥長管蚜。含有上述dsRNA的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒的下述任一種應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲生長產(chǎn)品中的應(yīng)用；4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述蚜蟲具體為麥長管蚜。本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C中至少一種:A、上述 dsRNA;B、上述的編碼基因；C、上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒；所述產(chǎn)品為如下I)-4)中任意一種:1)防治蚜蟲產(chǎn)品；2)促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品；3)抑制蚜蟲生長產(chǎn)品；4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表達(dá)產(chǎn)品；所述蚜蟲具體為麥長管蚜。抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表達(dá)的物質(zhì)的下述任一種應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:I)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用；3)在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲生長產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述蚜蟲具體為麥長管蚜。上述生長發(fā)育相關(guān)基因23028的核苷酸序列為序列表中的序列I ;上述唾液分泌蛋白基因coo2的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發(fā)明中抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表達(dá)的物質(zhì)為上述A-C中的任意一種。本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明得到麥長管蚜相關(guān)基因23028和coo2表達(dá)cDNA的序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長管蚜體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和coo2表達(dá)，導(dǎo)致麥長管蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，并且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸增大。表明蚜蟲生長發(fā)育相關(guān)基因23028和coo2的保守序列可應(yīng)用于通過植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥抗蚜性的研究。


圖1為基因23028、coo2和GFP的PCR擴(kuò)增圖2為飼喂8天后麥長管蚜的生長發(fā)育情況
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中麥長管蚜(錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的研究.植物保護(hù)，1982，01，14-15.，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲的小麥品種為科農(nóng)199，將蚜蟲接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中(溫度(20±2) °C，濕度60% — 80%，光周期L: D=16: 8)進(jìn)行繁殖。質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，內(nèi)切酶BamH 1、EcoR V及Hiscribe T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaqDNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel ExtractionKit、RNA Cleaning Kit購自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。實(shí)施例1、麥長管蚜相關(guān)基因23028dsRNA和coo2dsRNA的獲得1、麥長管蚜總RNA的提取和cDNA的合成分別取約20頭麥 長管蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總RNA,用RNA Cleaning Kit進(jìn)行純化,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,操作步驟均參考試劑盒說明書。2、引物設(shè)計與基因克隆
根據(jù)本實(shí)驗室對于麥長管蚜轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果得到生長發(fā)育相關(guān)基因23028 (序列I)和根據(jù)桃蚜唾液分泌蛋白coo2 (序列7)的序列，用DNAman5.0進(jìn)行比對，選擇保守序列，利用Primer Primer5.0軟件設(shè)計引物Pl和P2(表1)，由北京華大基因公司合成。綠色熒光蛋白基因(GFP)片段從國家小麥改良中心實(shí)驗室保存的GFP質(zhì)粒上擴(kuò)增，利用PrimerPrimer5.0軟件設(shè)計引物P3 (表I)。PCR 反應(yīng)體系為 10XPCR Buffer5 μ L, dNTP (2.5mmol.L-1) 4 μ L、rTaq0.5 μ L，F(xiàn)orward primer (20 μ mol.L-1) I μ L> Reverse primer (20 μ mol.L-1) I μ L> cDNA/GFP M粒 I μ L，用 ddH20補(bǔ)足至 50 μ L。PCR 的反應(yīng)條件為 94。。4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s,39 個循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。以麥長管蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到238bp PCR產(chǎn)物(基因23028序列上部分片段，含40bp的T7啟動子序列)，經(jīng)過測序，該238bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列I (可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列I所示的核苷酸編碼66個氨基酸。以麥長管蚜的cDNA為模板，用P2作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到307bp PCR產(chǎn)物(基因coo2序列上部分片段，含40bp的T7啟動子序列)，經(jīng)過測序，該307bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列2 (可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列2所示的核苷酸編碼89個氨基酸。以GFP質(zhì)粒為模板，用P3作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到324bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動子序列)，其具有序列表中的序列3 (可人工合成)所示的核苷酸。將上述PCR 電泳結(jié)果如圖1 所示，M:Trans2K DNA marker ；1:23028 基因；2:coo2基因；3:GFP，可以看出得到目的片段。

表I為PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.sRNA，為如下 1),2)或 3): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA； 3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA，其特征在于:所述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質(zhì)量比為1:1。
3.權(quán)利要求1中1)、2)或3)所示的dsRNA的編碼基因； 1)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸； 2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸； 3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。
4.權(quán)利要求1或2所述dsRNA或權(quán)利要求3所述的編碼基因的下述任一種應(yīng)用: 1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或制備在防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用； 2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用； 3)在抑制Φ牙蟲生長中的應(yīng)用或制備在抑制Φ牙蟲生長廣品中的應(yīng)用； 4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)中的應(yīng)用或制備在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1或2所述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長、抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述導(dǎo)入為飼喂。
7.有權(quán)利要求1或2所述的dsRNA的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
8.權(quán)利要求7重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒的下述任一種應(yīng)用:: 1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用； 2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用； 3)在抑制Φ牙蟲生長中的應(yīng)用或在制備抑制Φ牙蟲生長廣品中的應(yīng)用； 4)在抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)中的應(yīng)用或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2的表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.品，其活性成分為如下A-C中至少一種: A、權(quán)利要求1或2所述dsRNA； B、權(quán)利要求3所述的編碼 基因； C、權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒； 所述產(chǎn)品為如下I)-4)中任意一種:1)防治蚜蟲產(chǎn)品；2)促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品；3)抑制蚜蟲生長產(chǎn)品；4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表達(dá)產(chǎn)品。
10.制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和/或唾液分泌蛋白基因coo2表達(dá)的物質(zhì)的下述任一種應(yīng)用: 1)在防治蚜蟲中的應(yīng)用或在制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用； 2)在促進(jìn)蚜蟲死亡中的應(yīng)用或在制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用； 3)在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用 或在制備抑制蚜蟲生長產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了兩種dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下1)、2)或3)1)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；3)由如下兩條雙鏈RNA組成1)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。本發(fā)明的實(shí)驗證明，本發(fā)明得到麥長管蚜體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和唾液分泌蛋白基因coo2的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長管蚜體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因23028和唾液分泌蛋白基因coo2，導(dǎo)致麥長管蚜生長發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。
文檔編號C12N15/63GK103088024SQ20131000720
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者夏蘭琴, 張珉, 李雪峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所