專利名稱：一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，屬于微生物生態(tài)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變性梯度凝膠電泳技術(shù)(denaturing gradient gelelectrophoresis)近年來廣泛用于不同環(huán)境中微生物遺傳多樣性分析的一種分子指紋分析技術(shù)。1993年，Muyer等首次將該技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)的研究，隨后便大量用于自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面研究。根據(jù)DNA的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發(fā)生變性所要求的變性劑濃度不同，混合雙鏈DNA在變性劑濃度呈線性梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，當(dāng)泳動(dòng)到與DNA變性所需變性劑濃度一致的凝膠位置時(shí)，相對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)生解鏈變性，導(dǎo)致電泳遷移速率降低。由于泳動(dòng)受阻的DNA分子在梯度凝膠中的停留位置不同，從而使不同DNA分子得以分離。影響變性梯度凝膠電泳的因素主要有電泳電壓、電泳時(shí)間、變性膠濃度、變性膠質(zhì)量等。在多菌種存在的復(fù)雜環(huán)境中，由于大量相似菌群的存在，變性梯度膠中差異很小的基因片段很難將其完全分離，且變性膠的制作差異也嚴(yán)重影響分離效果，在樣品因數(shù)和人為操作等因素的影響下，造成大量微生物信息的丟失。尋求一種能很好將復(fù)雜環(huán)境中菌株分離的方法，才能更加全面準(zhǔn)確地揭示環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)信息。在現(xiàn)有方法中，將DGGE膠上的一條帶所代表的DNA片段切下、回收后以該回收單一條帶DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再次進(jìn)行DGGE分析，通過對(duì)第二次DGGE中可能存在的多條帶再次回收條帶基因，該方法可以一定程度上分離出多條帶信息，高度相似的條帶即使經(jīng)多次DGGE分析,仍無法將條帶分開。此外DGGE成本高、操作繁瑣,大量相似條帶能否完全分開，仍受質(zhì)疑。尋求一種能很好將復(fù)雜環(huán)境中菌株分離的方法，才能更加全面準(zhǔn)確地揭示環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)信息。中國(guó)白酒生產(chǎn)具有開放式的多菌種共存的固態(tài)發(fā)酵工藝的特點(diǎn)，多菌系的共同作用形成了白酒獨(dú)特的風(fēng)格特征。對(duì)白酒微生物的研究歷史久遠(yuǎn)，但由于技術(shù)方法的限制，對(duì)酒醅微生物群落多樣性的認(rèn) 識(shí)僅依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)特征、生理生化特性的分類和鑒定，且傳統(tǒng)方法研究的是體系中主要的可培養(yǎng)微生物，不適應(yīng)對(duì)難于培養(yǎng)和不能培養(yǎng)微生物菌群分析的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，包括基因組DNA的提取、16S rDNA的PCR擴(kuò)增、DGGE電泳(變性梯度凝膠電泳)、回收電泳后的16S rDNA單一條帶、分析回收條帶；所述分析回收條帶包括如下步驟用電泳后回收的16S rDNA構(gòu)建克隆庫(kù)、酶切分型、測(cè)序及GenBank比對(duì)分析，即得到酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息。其中，所述的基因組DNA的提取包括酒醅樣品的PBS(磷酸緩沖液)預(yù)處理和基因組DNA提?。凰龅腜BS預(yù)處理包括如下步驟向酒醅中加入pH7. 4的PBS緩沖液和玻璃珠，渦旋，20(T500g (優(yōu)選 200g)離心 5 lOmin，吸取上清液，1000(Tl2000rpm (優(yōu)選 12000rpm)離心5 10min，收集菌體沉淀；酒醅與PBS緩沖液之間的質(zhì)量比為廣5 Γ Ο (優(yōu)選1: 3);酒醅與玻璃珠之間的質(zhì)量比為廣2 Γ5 (優(yōu)選1: 3);玻璃珠的直徑為2 8mm。優(yōu)選的，離心時(shí)間為5min。其中，所述的DGGE電泳的變性膠濃度為10 50%，電壓為15(T220V，電泳時(shí)間12(T300min。其中，所述的DGGE電泳的電壓為200V，電泳時(shí)間210min。其中，所述的回收電泳后的16S rDNA單一條帶包括如下步驟完成DGGE電泳后，切割變性膠中單一條帶放于滅菌離心管，加入3(Γ60 μ L超純水，于4 10°C放置10 24小時(shí)后100(T3000rpm離心5 10min，取上清液。該上清液可作為PCR模板擴(kuò)增回收條帶中16SrDNA基因片段。其中，所述的構(gòu)建克隆庫(kù)包括如下步驟以電泳后回收的16S rDNA單一條帶上清液為模板，擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增片段后與T載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆構(gòu)建克·隆庫(kù)。前述步驟中所用的擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)的通用引P2和P3_GC。其中，所述的酶切分型包括如下步驟從克隆庫(kù)中挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒作為模板，根據(jù)T載體設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rDNA，選取至少兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切后經(jīng)1. 59Γ2%的瓊脂糖電泳，具有相同電泳圖譜的克隆即為同一型，每一型選取一個(gè)克隆送去測(cè)序即可。優(yōu)選的，所述的限制性內(nèi)切酶為Hinf I和CSP6 I。本發(fā)明中，酒醅中有大量相似菌群的存在，DGGE電泳變性梯度膠中差異很小的基因片段很難將其完全分離。為了進(jìn)一步確定所分離的16S rDNA的純度，將電泳后的單一條帶回收，然后用16S rDNA的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行T載體克隆，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，選取陽(yáng)性菌落，即得到一個(gè)克隆庫(kù)。若將電泳后的多個(gè)條帶進(jìn)行回收，即可得到多個(gè)克隆庫(kù)。通過構(gòu)建克隆庫(kù)，可將該條帶中可能含有的多個(gè)16S rDNA片段進(jìn)行回收，以免丟失微生物種群信息。構(gòu)建得到克隆庫(kù)后，提取所有菌落的質(zhì)粒DNA，再次擴(kuò)增16S rDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種Hinf I和CSP6 I分別酶切，酶切后經(jīng)1. 59Γ2%的瓊脂糖電泳，根據(jù)酶切后的電泳圖譜進(jìn)行分型。分型原理如下具有相同酶切電泳圖譜的克隆中含有相同16S rDNA，即為同一型。采用兩種酶進(jìn)行酶切，可以進(jìn)一步的比對(duì)，以確定哪些克隆中含有相同的16S rDNA。從每一分型的菌種中選擇一個(gè)克隆的16S rDNA進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和比對(duì)分析。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法將經(jīng)PCR-DGGE技術(shù)得到的條帶進(jìn)行克隆構(gòu)建克隆庫(kù)，通過對(duì)條帶基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建可以彌補(bǔ)PCR-DGGE中相似條帶分不開造成群落信息丟失的不足，廣泛適用于白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析及變化規(guī)律研究。本發(fā)明方法無需重復(fù)多次進(jìn)行DGGE電泳，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間，為分析微生物群落結(jié)構(gòu)提供了新的選擇。


圖1操作流程圖
圖2DGGE 圖譜圖3酶切電泳圖譜(A)Csp6 I酶切；(B)Hinf I酶切(圖中M代表Marker2000，捷瑞DL1001)圖4酶切圖譜類型變化情況(A) Csp6 I酶切；(B) Hinf I酶切
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案是一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，包括基因組DNA的提取、16S rDNA的PCR擴(kuò)增、DGGE電泳(變性梯度凝膠電泳)、回收電泳后的16S rDNA單一條帶、分析回收條帶；所述分析回收條帶包括如下步驟用電泳后回收的16S rDNA構(gòu)建克隆庫(kù)、酶切分型、測(cè)序及GenBank比對(duì)分析，即得到酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息。其中，所述的基因組DNA的提取包括酒醅樣品的PBS(磷酸緩沖液)預(yù)處理和基因組DNA提取。所述的PBS預(yù)處理包括如下步驟向酒醅中加入pH7. 4的PBS緩沖液和玻璃珠，渦旋，200 500g (優(yōu)選 200g)離心 5 lOmin，吸取上清液，1000(Tl2000rpm (優(yōu)選 12000rpm)離心5 10min，收集菌體沉淀；酒醅與PBS緩沖液之間的質(zhì)量比為f 5 Γ Ο (優(yōu)選1:3);酒醅與玻璃珠之間的質(zhì)量比為廣2 Γ5 (優(yōu)選1: 3);玻璃珠的直徑為2 8mm。優(yōu)選的，離心時(shí)間為5min。其中，所述的PCR擴(kuò)增是指擴(kuò)增16S rDNA。

前述步驟中所用的擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)的通用引物P2 (SEQ ID No.1 5，-ATTACC GCG GCT GCT GG-3，)和 P3-GC (SEQ ID No. 2 :5，-CGC CCG CCGCGC GCG GCGGGCGGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3，)。其中，所述的DGGE電泳的變性膠濃度為10 50%，電壓為15(T220V，電泳時(shí)間12(T300min。其中，所述的DGGE電泳的電壓為200V，電泳時(shí)間210min。電泳電壓與電泳時(shí)間共同作用直接影響電泳結(jié)果。電壓高低影響條帶遷移速度。電泳時(shí)間太短，條帶分離效果差。電泳時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致條帶跑出變性膠，電泳時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使DNA分解。發(fā)明人通過多次實(shí)驗(yàn)確定了，在控制變性膠濃度為1(Γ50%時(shí)，電泳電壓和電泳時(shí)間以15(T220V和12(T300min為宜，尤其在電泳的電壓為200V，電泳時(shí)間210min時(shí)電泳效果可達(dá)最佳，條帶清晰，適于回收。其中，所述的回收電泳后的16S rDNA單一條帶包括如下步驟完成DGGE電泳后，切割變性膠中單一條帶放于滅菌離心管，加入3(Γ60 μ L超純水，于4 10°C放置10 24小時(shí)后100(T3000rpm離心5 10min，取上清液。該上清液可作為PCR模板擴(kuò)增電泳后回收的條帶中的16S rDNA基因片段。其中，所述的構(gòu)建克隆庫(kù)包括如下步驟以電泳后回收的16S rDNA單一條帶上清液為模板，擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增片段后與T載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)，挑選陽(yáng)性克隆構(gòu)
建克隆庫(kù)。前述步驟中所用的擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)的通用引物P2和P3_GC。其中，所述的酶切分型包括如下步驟從克隆庫(kù)中挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒作為模板，根據(jù)T載體設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rDNA，選取至少兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切后經(jīng)1. 59Γ2%的瓊脂糖電泳，具有相同電泳圖譜的克隆即為同一型，每一型選取一個(gè)克隆送去測(cè)序即可。一種限制性內(nèi)切酶酶切不能保證分型的完全性，發(fā)明人經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用至少兩種限制性內(nèi)切酶酶切可以保證分型的完全。采用越多的限制性內(nèi)切酶去酶切，可使得分型結(jié)果更準(zhǔn)確，但也會(huì)增加成本。優(yōu)選的，所述的限制性內(nèi)切酶為Hinf I和CSP6 I。其中，所述的測(cè)序是指根據(jù)酶切分型結(jié)果，不同類型選取一個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明中，酒醅中有大量相似菌群的存在，DGGE電泳變性梯度膠中差異很小的基因片段很難將其完全分離。為了進(jìn)一步確定所分離的16S rDNA的純度，將電泳后的單一條帶回收，然后用16S rDNA的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行T載體克隆，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，選取陽(yáng)性菌落，即得到一個(gè)克隆庫(kù)。若將電泳后的多個(gè)條帶進(jìn)行回收，即可得到多個(gè)克隆庫(kù)。通過構(gòu)建克隆庫(kù)，可將該條帶中可能含有的多個(gè)16S rDNA片段進(jìn)行回收，以免丟失微生物種群信息。構(gòu)建得到克隆庫(kù)后，提取所有菌落的質(zhì)粒DNA，再次擴(kuò)增16S rDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物用兩種Hinf I和CSP6 I分別酶切，酶切后經(jīng)1. 59Γ2%的瓊脂糖電泳，根據(jù)酶切圖譜進(jìn)行分型。分型原理如下具有相同酶切圖譜的克隆中含有相同16S rDNA的克隆相同，采用兩種酶進(jìn)行酶切，可以進(jìn)一步的比對(duì)，以確定哪些克隆中含有相同的16S rDNA。通過酶切分型，從每一分型的菌種中選擇一個(gè)克隆 的16S rDNA進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和比對(duì)分析。所述的GenBank是美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechno logy Informat ion, NCBI)建立的 DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. ncb1. nlm. nih.gov/)，從公共資源中獲取序列數(shù)據(jù)，主要是科研人員直接提供或來源于大規(guī)模基因組測(cè)序計(jì)劃。為保證數(shù)據(jù)盡可能的完全，GenBank與EMBL、DDBJ建立了相互交換數(shù)據(jù)的合作關(guān)系。因此，分型后測(cè)序結(jié)果可在GenBank進(jìn)行比對(duì)。實(shí)施例采用本發(fā)明方法分析酒醅微生物選取瀘州老窖羅漢基50年窖齡窖池酒醅為研究對(duì)象。分別稱取0.5g酒醅樣品于50mL離心管，向離心管加入3mL PBS緩沖液(0. lmol/L)和0. 3g玻璃珠(2mm),鏇潤(rùn)震蕩5min, 200 X g離心5min,吸取上清液,重復(fù)上述操作三次，合并上清液，4°C下12000rpm離心5min,取沉淀。沉淀作為基因組DNA提取材料，提取基因組DNA采用蛋白酶K與CTAB組合得到提取方法。以細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)的通用引 P2 (SEQ ID No.1 :5，-ATTACCGCGGCT GCTGG-3，)和 P3-GC (SEQ ID No. 2 :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ )作為PCR擴(kuò)增引物。PCR模板量為10ng，擴(kuò)增體系為25 μ LExTaq體系，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性lmin，應(yīng)用降落PCR，65°C開始退火，每?jī)奢喗档?°C，最終降至 56°C，退火 lmin, 72°C延伸 Imin ;再 94°C變性 lmin, 55°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin,共10個(gè)循環(huán)，72°C終延伸6min。變性梯度凝膠電泳采用伯樂Dcode系統(tǒng)，變性濃度為10飛0%，200V電壓下電泳210min，SYBR I (博凌科)染色45min，凝膠成像儀(伯樂Dcode)拍照得到DGGE凝膠圖譜(圖2)。切割單一條帶后放入滅菌的編號(hào)EP管(1. 5mL)中，分別用Tip頭(200 μ L)將EP管中膠剁碎，加入50 μ L無菌水，4°C過夜，2000rpm離心取2 μ L上清作為PCR模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增體系為25 μ LExTaq體系，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，共20個(gè)循環(huán)，72°C終延伸6min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，采用膠回收試劑盒(上海生工sanprep膠回收試劑盒)回收DNA片段，回收片段連接T載體(大連寶生takara PMD19-T),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(大連寶生takara JM109),培養(yǎng)后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選(藍(lán)白斑篩選原理如下質(zhì)?；蚪M存在一特殊基因，該基因片段中未插入外來片段的情況下會(huì)產(chǎn)生一種酶，這種酶能夠培養(yǎng)基中的x-gal產(chǎn)生藍(lán)色，這樣，一次篩選可以判斷出未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長(zhǎng)成白色菌落)并挑取50個(gè)陽(yáng)性克隆子。將陽(yáng)性克隆子接種于預(yù)先準(zhǔn)備好氨芐抗性(在平板中加入氨芐是為了防止雜菌的生長(zhǎng)，抗生素的選擇主要是根據(jù)所選用的T載體的抗性)的固體LB培養(yǎng)基96孔板中，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。分別用Tip頭在96孔板培養(yǎng)基中戳數(shù)次后放于40 μ L含有濃度為20%的曲拉通溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中靜止30min, 3000rpm離心2min,取2μ L上清作為質(zhì)粒PCR 模板，引物為 RV-M (SEQ ID No. 3 :5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG_3，)和 Μ13-47 (SEQID No. 4 :5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)，擴(kuò)增體系為 25 μ LExTaq 體系,擴(kuò)增條件為94°〇預(yù)變性311^11，941變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸Imin，共25個(gè)循環(huán)，72°C終延伸IOmin0質(zhì)粒PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切分型，Hinf I酶切體系為PCR產(chǎn)物3yL，Hinf I酶O. 2μ L, Buffer Β0· 5 μ L，雙蒸水 4· 5 μ L。CSP6 I 酶切體系為PCR 產(chǎn)物 3 μ LCSP6 I 酶O. 2 μ L, Buffer R0. 5 μ L，雙蒸水4. 5 μ L。酶切反應(yīng)條件均為4°C酶切過夜。酶切后的樣品在濃度為1. 5%的瓊脂糖電泳，電泳條件為電泳電壓110V，電泳時(shí)間為40min。根據(jù)酶切分型圖(圖3)，以實(shí)際分析的克隆的序號(hào)為橫坐標(biāo)，以限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的酶切圖譜類型的數(shù)目為縱坐標(biāo)繪制克隆序號(hào)與酶切圖譜類型曲線(圖4)，當(dāng)曲線就由上升狀態(tài)轉(zhuǎn)為水平，說明此時(shí)陽(yáng)性克隆經(jīng)酶消化后反映的序列多樣性已經(jīng)足夠說明整個(gè)基因文庫(kù)的多樣性，進(jìn)而選取相應(yīng)克隆送上海生工測(cè)序部，測(cè)序結(jié)果登陸Genbank進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。根據(jù)圖4(A)可以看出Hinf I酶切后在11號(hào)克隆后曲線達(dá)到平穩(wěn)點(diǎn)，說明前面11個(gè)克隆已經(jīng)包括所有含有不同16S rDNA的克隆信息，再根據(jù)圖3 (A)中1、2、3、4、9、10號(hào)分型為一類，5、8號(hào)分型為I類，6、7號(hào)為一類，11號(hào)為一類，此時(shí)得到Hinf I酶切結(jié)果。同樣方法分析得到CSp6 I酶切分型結(jié)果，即在1`、號(hào)克隆已經(jīng)包含所有克隆信息，并將1、3、6號(hào)分型為一類，2、4、7號(hào)為一類，5、8號(hào)為一類，9號(hào)為一類。最后綜合兩種酶切結(jié)果選取1、2、5、6、9號(hào)克隆送樣測(cè)序。實(shí)驗(yàn)過程將所有條帶均回收、建庫(kù)、酶切后進(jìn)行測(cè)序。最終根據(jù)酶切圖譜一個(gè)送樣3(Γ40個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中顯示酒醅中細(xì)菌存在以下11個(gè)菌屬=Prevotella(Prevot 桿菌屬)、Pediococcus (片球菌屬)、Serratia (沙雷菌屬)、Staphylococcus (葡萄球菌屬)、Saccharopo Iyspora (糖多抱菌屬)、Brevibacter ium (短桿菌屬)、Thermoactinomyces(高溫放線菌屬)、Bacillus (芽孢桿菌屬)、Lactobacillus (乳桿菌屬)、(Weissella魏斯氏菌屬)、Petrimonas (理研菌屬)。
權(quán)利要求
1.一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，包括基因組DNA的提取、16S rDNA的PCR擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳、回收電泳后的16S rDNA單一條帶、分析回收條帶；其特征在于所述分析回收條帶包括如下步驟用電泳后回收的16S rDNA構(gòu)建克隆庫(kù)、酶切分型、測(cè)序及GenBank比對(duì)分析，即得到酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的基因組DNA的提取包括酒醅樣品的PBS預(yù)處理和基因組DNA提取；所述的PBS預(yù)處理包括如下步驟向酒醅中加入PH7. 4的PBS緩沖液和玻璃珠，渦旋，20(T500g離心5 lOmin，吸取上清液，1000(Tl2000rpm離心5 lOmin，收集菌體沉淀；酒醅與PBS緩沖液之間的質(zhì)量比為1^5 f 10 ;酒醅與玻璃珠之間的質(zhì)量比為廣2 f 5 ;玻璃珠的直徑為2 8mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的變性梯度凝膠電泳的變性膠濃度為10 50%，電壓為150 220V，電泳時(shí)間12(T300min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的DGGE電泳電壓為200V，電泳時(shí)間210min。
5.根據(jù)權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的回收電泳后單一條帶包括如下步驟完成DGGE電泳后，切割變性膠中單一條帶放于滅菌離心管，加入30 60ii L超純水，于4 10°C放置10 24小時(shí)后100(T3000rpm離心5 lOmin，取上清液。
6.根據(jù)權(quán)利要求f5任一項(xiàng)所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的構(gòu)建克隆庫(kù)包括如下步驟以電泳后回收的16S rDNA單一條帶上清液為模板，擴(kuò)增16SrDNA,擴(kuò)增片段與T載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆構(gòu)建克隆庫(kù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1飛任一項(xiàng)所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的酶切分型包括如下步驟從克隆庫(kù)中挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒作為模板，根據(jù)T載體設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rDNA，選取至少兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切后經(jīng)1. 5%^2%的瓊脂糖電泳，具有相同電泳圖譜的克隆即為同一型，每一型選取一個(gè)克隆送去測(cè)序即可。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于所述的限制性內(nèi)切酶為Hinf I和CSP6 I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，屬于微生物生態(tài)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是分析酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，包括基因組DNA的提取、16S rDNA的PCR擴(kuò)增、DGGE電泳(變性梯度凝膠電泳)、回收電泳后的16S rDNA單一條帶、分析回收條帶；所述分析回收條帶包括如下步驟用電泳后回收的16S rDNA構(gòu)建克隆庫(kù)、酶切分型、測(cè)序及GenBank比對(duì)分析，即得到酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息。本發(fā)明方法廣泛適用于白酒釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析及變化規(guī)律研究。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103031384SQ20131000771
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月9日
發(fā)明者李德林, 王松濤, 許正宏, 敖宗華, 易彬 申請(qǐng)人:瀘州品創(chuàng)科技有限公司