專(zhuān)利名稱(chēng)：低危型人乳頭瘤病毒hpv6/11檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的HPV6/11-DNA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一類(lèi)分子量較小的無(wú)包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，專(zhuān)性侵染和寄生人體生殖器官及其它組織器官的上皮細(xì)胞。在臨床上，根據(jù)HPV不同亞型的致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小可將HPV分為高危型和低危型兩大類(lèi)。低危型HPV主要引起肛門(mén)皮膚及男性外生殖器、女性大小陰唇、尿道口、陰道下段的外生性疣類(lèi)病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤，其病毒亞型主要有HPV6、11、40、42、43和44型。尖銳濕疣(Genital warts, Condylomata acuminata, CA)又名性撫,肛門(mén)生殖器撫,是由某些特定類(lèi)型的HPV感染所引起的男女生殖器、會(huì)陰和肛門(mén)部位的表皮瘤樣增生，多發(fā)生于青壯年男女。本病流行于全世界，是目前歐美及非洲國(guó)家最常見(jiàn)的性傳播疾病之一。CA在我國(guó)的發(fā)病率較高，近年又迅速增加，成為僅次于淋病的第二大性病。在近百種HPV亞型中有30余種與尖銳濕疣相關(guān)，其中HPV6型和HPVll型又是被確認(rèn)引起尖銳濕疣的主要亞型，有學(xué)者稱(chēng)之為經(jīng)典亞型。因此，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出HPV6型和11型對(duì)于尖銳濕疣的輔助診斷、早期治療和預(yù)防其流行等具有重要的意義。目前低危型人乳頭瘤病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有細(xì)胞學(xué)檢查、病理學(xué)檢查、免疫組化檢測(cè)、分子生物學(xué)技術(shù)等。細(xì)胞學(xué)檢查是群體篩查的常規(guī)手段，但受取材、涂片制作質(zhì)量、閱片技術(shù)影響，準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差，敏感性也有限。病理學(xué)檢查對(duì)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不典型者特異性較差。免疫組化是通過(guò)檢測(cè)HPV的衣殼抗原來(lái)進(jìn)一步明確HPV感染，其所得陽(yáng)性反應(yīng)定位明確，判斷可靠；但是必須在HPV DNA復(fù)制成熟后才有衣殼裝備；陰性者也不能否定診斷，且該方法敏感性較低。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，目前認(rèn)為PCR技術(shù)是檢測(cè)HP V DNA及分型的最好方法。熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。大量研究表明用PCR技術(shù)檢測(cè)HPV DNA的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)技術(shù)，是當(dāng)今用于尖銳濕疣以及HPV感染診斷最常用的有力工具，且能更好的應(yīng)用于HPV致病、致癌機(jī)理的研究之中。運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)人乳頭瘤病毒的核酸進(jìn)行提取，具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。該方法核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)高濃度的樣本裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染；另外，對(duì)于濃縮這一步，不同廠(chǎng)家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無(wú)法看到；看得到沉淀的是因?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，這樣導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無(wú)法看到沉淀的則會(huì)使操作者無(wú)法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到病毒核酸。臨床上檢測(cè)HPV6/11-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線(xiàn)，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)與熒光閾值線(xiàn)的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線(xiàn)的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線(xiàn)性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HPV6/11的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測(cè)靈敏度不高，約在50(Tl000COpies/ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿(mǎn)足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0I 2%和乙醇0.05 1% 。在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該病毒檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。本發(fā)明提供一種低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0f 2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提?。槐景l(fā)明試劑盒檢測(cè)HPV6/11的靈敏度可達(dá)400copies/ml,定量線(xiàn)性范圍為400 4.00E+09copies/ml。具體的，用于靶多核苷酸的上游弓I物序列為5 ’ -CGGCCTAGCGACAGCACAG-3 ’，下游引物序列為 5’ -ACATACGCATCCGTGGCAA-3’，探針序列為 5’ -TGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCC-3’。本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測(cè)靶多核苷酸的上述引物和/或探針序列，具有很好的特異性。本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列為5’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAA-3’。本發(fā)明中所述內(nèi)標(biāo)為插入pUC18T載體的一段長(zhǎng)為103堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，它作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。在所述試劑盒中包含內(nèi)標(biāo)的情況下，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；內(nèi)標(biāo)上游引物序列為5’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTG-3’，內(nèi)標(biāo)下游引物序列為 5’ -TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’，內(nèi)標(biāo)探針序列為 5’ -ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC-3'。優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述試劑盒中還包括HPV6/11定量參考品、HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照和HPV6/11陰性對(duì)照。本發(fā)明還提供一種HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -CGGCCTAGCGACAGCACAG-3’，下游引物序列為5’ -ACATACGCATCCGTGGCAA-3’。本發(fā)明還提供一種HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為5’ -TGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCC-3’。

本發(fā)明還具體提供一種HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、內(nèi)標(biāo)、酶混合液、HPV6/11定量參考品、HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照和HPV6/11陰性對(duì)照；且所述核酸釋放劑中包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0Γ2%,乙醇0.05 1%和溶劑TE緩沖液；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，用于內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增和檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針，10XPCR反應(yīng)緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP ;所述內(nèi)標(biāo)為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為103堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。本發(fā)明提供的HPV6/11熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)疣體表面脫落細(xì)胞、生殖道分泌物等未知樣本中的HPV6/11-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷HPV6/11感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。


圖1中①為實(shí)施例中低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11-DNA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)，圖1中②為實(shí)施例中HPV6/11-DNA檢測(cè)結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本的擴(kuò)增曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進(jìn)行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種具體的低危型人乳頭瘤病毒(HPV6/11)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分:①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.1mM/L,氯化鉀100mM/L,十二燒基磺酸鈉(SDS) 0.1%, 0.1% 的乙醇。

②內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照):為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為103堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為2.00E+05copies/ml, 103堿基對(duì)的序列為:5’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAA-3，。③PCR反應(yīng)液:包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物均為0.3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針為0.3 μ mol/L,用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物均為0.1 μ mol/L，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為0.1 μ mol/L。其中，所述10XPCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP ;所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于HPV6型和HPVll型核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為:上游引物:5’ -CGGCCTAGCGACAGCACAG-3’ ；下游引物:5’ -ACATACGCATCCG TGGCAA-3’ ；探針:5’ -TGTGCCTCCTCCCAACCCTG TATCC-3’;所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為:上游引物:5’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTG-3’ ；下游引物:5’ -TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’ ；探針:5’-ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’ 。④酶混合液:包含5U/ μ I的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和IU/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。⑤HPV6/11定量參考品:來(lái)源于使用HPV6/11企業(yè)定量線(xiàn)性參考品Lf L5定值后的HPV6/11強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，該HPV6/11病毒定量參考品包括Α、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為 4.00E+07copies/ml (Α)、4.00E+06copies/ml (Β)、4.00E+05copies/ml(C)、4.00E+04copies/ml (D)0⑥HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照:為臨床醫(yī)院收集的HPV6/11強(qiáng)陽(yáng)性樣本，其濃度為4.00E+05copies/ml。⑦HPV6/11陰性對(duì)照:為滅菌生理鹽水。實(shí)施例2本實(shí)施例提供上述實(shí)施例1所述試劑盒用于檢測(cè)疣體表面脫落細(xì)胞、生殖道分泌物等未知樣本中HPV6/11-DNA的操作步驟:一、試劑準(zhǔn)備根據(jù)待測(cè)樣本、HPV6/11陰性對(duì)照、HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照以及HPV6/11定量參考品A D的數(shù)量,按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 μ I/人份)、酶混合液(2 μ I/人份)及內(nèi)標(biāo)0.25 μ I/人份，充分混勻成PCR-mix，例如待測(cè)樣本為3人份時(shí)，一共需配制9人份(上述四者的人份數(shù)分別為3、1、I和4)的PCR-mix ;瞬時(shí)離心后備用。二、樣本處理每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入核酸釋放劑2 5μ I (建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡)，各管依次加入待測(cè)樣本、HPV6/11陰性對(duì)照、HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照及HPV6/11定量參考品A D各3 5μ I ;間隔10分鐘以上,每管加入PCR_mix40 45 μ I,蓋上管蓋。三、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析(在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行)I)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)及定量參考品濃度。2)突光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測(cè)HPV6/11 ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher: None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比突光(Passive Reference)設(shè)置為 none。3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1:表I
權(quán)利要求
1.一種核酸釋放劑在低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.θΓθ.5mM/L，氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01 2%和乙醇0.05 1%。
2.一種低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin) 0.θΓθ.5mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.0f 2%和乙醇0.05^1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列為5’ -CGGCCTAGCGACAGCACAG-3’，用于靶多核苷酸的下游引物序列為5’ -ACATACGCATCCGTGGCAA-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探針序列為5’-TGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCC-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，所述內(nèi)標(biāo)的序列 為 5 ’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAA-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還包括用于內(nèi)標(biāo)檢測(cè)的上游引物、下游引物和探針；內(nèi)標(biāo)上游引物序列為5’ -CTGCCGTTACTGCCCTGTG-3’，內(nèi)標(biāo)下游引物序列為 5’ -TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3’，內(nèi)標(biāo)探針序列為 5’ -ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’ 。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 4中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括HPV6/11定量參考品、HPV6/11陽(yáng)性對(duì)照和HPV6/11陰性對(duì)照。
9.一種HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的上游引物序列為5 ’ -CGGCCTAGCGACAGCACAG-3 ’，下游引物序列為5’ -ACATACGCATCCGTGGCAA-3’。
10.一種HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針，且用于靶多核苷酸的探針序列為 5’ -TGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCC-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種低危型人乳頭瘤病毒HPV6/11檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01~0.5mM/L，氯化鉀20~300mM/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針。使用本發(fā)明的核酸釋放方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提??；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)HPV6/11的靈敏度可達(dá)400copies/ml，定量線(xiàn)性范圍為400~4.00E+09copies/ml。應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)疣體表面脫落細(xì)胞、生殖道分泌物等未知樣本中的HPV6/11-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷HPV6/11感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103173565SQ20131000907
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者戴立忠, 劉佳, 熊曉燕 申請(qǐng)人:湖南圣湘生物科技有限公司