專利名稱：檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物、試劑盒，以及檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155表達(dá)量的方法，屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均占男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的首位，且呈逐年上升趨勢(shì)。膀胱癌患者初診時(shí)30%已發(fā)生肌層浸潤(rùn)，而在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中，仍有30%會(huì)復(fù)發(fā)為浸潤(rùn)性膀胱癌。早期診斷和早期治療是預(yù)防和控制膀胱癌的關(guān)鍵。目前臨床上診斷膀胱癌主要依賴于膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)和影像學(xué)檢查等。膀胱鏡是膀胱癌診斷的常用方法，可造成不同程度的尿道和膀胱損傷以及感染等并發(fā)癥；尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有非侵入性、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，其敏感性低于50%，對(duì)早期患者僅為30%，易受檢測(cè)者主觀因素的影響；CT和超聲檢查是目前診斷膀胱癌及術(shù)前分期最常用的影像學(xué)檢查方法，但對(duì)膀胱內(nèi)較小病變不易發(fā)現(xiàn)，對(duì)膀胱癌分期預(yù)測(cè)受到一定限制。尋找敏感性、特異性高的早期診斷生物標(biāo)志物，建立一種經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確、安全有效的血清學(xué)膀胱癌診斷方法是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。miRNAs是在真核生物中 發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其通過(guò)對(duì)mRNA的完全和部分配對(duì)結(jié)合，降解mRNA或干擾mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控特定基因的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞增殖、分化與凋亡起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，尿液中存在豐富穩(wěn)定的miRNAs，其與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為腫瘤的無(wú)創(chuàng)性診斷開(kāi)辟了一條新的途徑。并且，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)尿液中微量的miRNAs已成為可能。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR的進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)模板進(jìn)行定量分析。由于該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、敏感性高、重復(fù)性好，目前已在核苷酸檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

miRNA-155為癌基因BIC的表達(dá)產(chǎn)物，其在造血細(xì)胞分化、免疫、腫瘤及心血管等疾病各種生理或病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。2005年1rio應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)首次篩選出乳腺癌異常表達(dá)的miRNAs譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-155是上調(diào)最明顯的miRNAs之一。Zhu等發(fā)現(xiàn)miRNA-155的表達(dá)水平較正常乳腺組織顯著上調(diào)，并且其與乳腺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體、孕激素受體呈明顯相關(guān)。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA-155在肺癌、胰腺癌、腎癌以及頭頸部腫瘤中表達(dá)均明顯升高，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系，表明miRNA有可能成為一種良好的腫瘤標(biāo)志物分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒及檢測(cè)方法，能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)膀胱癌尿液中miRNA-155的表達(dá)量。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物，包括:(I) miRNA-155的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID N0:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)miRNA-191的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID NO:4所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(3)miRNA-16的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID N0:7所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，包括上述引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5% (體積百分?jǐn)?shù))，三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))。所述檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液由IXSyber Green I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。優(yōu)選的，各物質(zhì)的濃度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。上述檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物在定量檢測(cè)膀胱癌miRNA-155表達(dá)量的應(yīng)用。上述檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒在定量檢測(cè)膀胱癌miRNA-155表達(dá)
量的應(yīng)用。 一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155表達(dá)量的方法，步驟如下:(I)分離尿液標(biāo)本上清液，與等體積的RNA分離液混合，1600g離心5分鐘，之后16000g離心10分鐘，分離上清；(2) RT-PCR擴(kuò)增:將上述分離的上清液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)樣本閾值Cq (Test sample);同時(shí)以人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)中提取miRNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為校對(duì)樣本，在每個(gè)PCR反應(yīng)板中進(jìn)行檢測(cè)，記錄Cq值；內(nèi)參基因miRNA_191、miRNA-16的RT-PCR擴(kuò)增，除引物采用相對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物外，方法相同；(3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:上述檢測(cè)完成后，拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E=IO (_vs)-l，計(jì)算擴(kuò)增效率E ;(4)計(jì)算:選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本閾值Cq (T)和校對(duì)樣本閾值Cq (C)，根據(jù)公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)],得出基因的校正起始拷貝數(shù)Q ;將miRNA-155的Q值與內(nèi)參基因miRNA_191、miRNA_16的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明建立的膀胱癌尿液miRNA-155檢測(cè)方法，為膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。本發(fā)明利用RNA分離液對(duì)尿液樣本進(jìn)行處理，得到的混合液直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，省略了對(duì)尿液樣本RNA的提取過(guò)程，不僅簡(jiǎn)化了操作步驟，降低了檢測(cè)成本，還避免了傳統(tǒng)方法提取RNA降解的問(wèn)題。本發(fā)明使用了表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的miRNA-191、miRNA-16作為內(nèi)參基因，對(duì)標(biāo)本中的miRNA-155進(jìn)行相對(duì)定量分析，避免了單一內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。本發(fā)明根據(jù)公式E=10(_1/S)_l，計(jì)算擴(kuò)增效率(E)，根據(jù)公式Q= (E+l)_AQl計(jì)算miRNA-155基因相對(duì)miRNA-191、miRNA-16的表達(dá)量，避免了傳統(tǒng)2_AA&1法必須要求PCR擴(kuò)增效率為100%的限制，使結(jié)果分析更加可靠。`


圖1 (A)為miRNA-16的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖1 (B)為miRNA-191的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖1 (C)為miRNA-155的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為尿液miRNA-155在26例膀胱癌患者和20例健康對(duì)照者中的相對(duì)表達(dá)水平；圖3為血清miRNA-155檢測(cè)對(duì)膀胱癌診斷的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1( I)試劑盒的組成及配制:根據(jù)microRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.mirbase.0rg/)上報(bào)的核苷酸序列 miRNA-155(MIMAT0000646)、miRNA-191 (MIMAT0000440), miRNA-16 (MIMAT0000069)為模板，自主設(shè)計(jì)的檢測(cè)目標(biāo)基因(miRNA-155)和內(nèi)參基因(miRNA-191和miRNA-16)的引物，其引物序列、Tm值見(jiàn)表I。表I引物序列、Tm值
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物，其特征在于，包括: (1)miRNA-155的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID N0:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miRNA-155-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’ ；miRNA-155-F:5’ -CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’ ；miRNA-155-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)miRNA-191的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID N0:4所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:miRNA-191-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’ ；miRNA-191-F:5’ -GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’ ；miRNA-191-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (3)miRNA-16的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQID NO:7所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
2.一種 檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的專用引物，以及RNA分離液；所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，其中，濃度如下:吐溫20:2.5%，三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，其特征在于，所述專用試劑盒還包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液由Syber Green I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒，其特征在于，各物質(zhì)的濃度如下:DNA聚合酶:100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。
5.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物在定量檢測(cè)膀胱癌miRNA-155表達(dá)量的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用試劑盒在定量檢測(cè)膀胱癌miRNA-155表達(dá)量的應(yīng)用。
7.—種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155表達(dá)量的方法,其特征在于,步驟如下: (1)分離尿液標(biāo)本上清液，與等體積的RNA分離液混合，離心，分離上清； (2)RT-PCR擴(kuò)增:將上述分離的上清液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)樣本閾值Cq ;同時(shí)以人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞中提取miRNAs，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為校對(duì)樣本，在每個(gè)PCR反應(yīng)板中進(jìn)行檢測(cè)，記錄Cq值；內(nèi)參基因miRNA-191、mi RNA-16的RT-PCR擴(kuò)增，除引物采用相對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄弓I物和檢測(cè)引物外，方法相同； (3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:上述檢測(cè)完成后，拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E=IO (_vs)-l，計(jì)算擴(kuò)增效率E ; (4)計(jì)算:選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本閾值Cq (T)和校對(duì)樣本閾值Cq (C)，根據(jù)公式Q= (E+1)_Ag% A Cq=[Cq (T)-Cq (C)]，得出基因的校正起始拷 貝數(shù)Q ;將miRNA-155的Q值與內(nèi)參基因miRNA-191、miRNA_16的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用引物、試劑盒及檢測(cè)方法，能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)膀胱癌尿液中miRNA-155的表達(dá)量。該專用試劑盒包括檢測(cè)膀胱癌尿液miRNA-155的專用逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物以及RNA分離液；RNA分離液由2.5%吐溫20、50mmol/L三羥甲基氨基甲烷、1mmol/L乙二胺四乙酸和1%牛血清白蛋白組成。本發(fā)明為膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103074430SQ201310012169
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者王傳新, 張欣, 劉益民 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院