專利名稱：一種卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的mtt細(xì)胞毒性試驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性的試驗方法，屬于煙草及卷煙煙氣安全性評價技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卷煙煙氣是由幾千種化學(xué)物質(zhì)組成的氣溶膠，其中有部分化學(xué)物質(zhì)已經(jīng)確定為致癌物或輔助致癌物，吸煙與人類一些重要疾病的發(fā)生存在著密切的相關(guān)性。卷煙煙氣的體外毒性試驗研究已經(jīng)成為評價吸煙對健康危害的有力手段，其中，體外細(xì)胞毒性試驗在評價卷煙煙氣以及低危害卷煙制品危害性方面起著十分重要的作用。進(jìn)行卷煙煙氣細(xì)胞毒性評價時采用的方法大多基于細(xì)胞存活率測定的原理。國際煙草科學(xué)研究合作中心(C0RESTA)推薦選用合適的哺乳動物細(xì)胞并采用中性紅試驗方法評價卷煙煙氣總粒相物的細(xì)胞毒性。但中性紅試驗操作步驟較為煩瑣，試驗過程中的染色、及多個清洗步驟增加了誤差的可能性。另外，目前國內(nèi)外的相關(guān)研究通常采用嚙齒類動物細(xì)胞系(如CHO細(xì)胞)進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗。而煙氣主要毒性還是作用于人體，用動物細(xì)胞評價卷煙煙氣總粒相物細(xì)胞毒性存在著一定的局限性。毒理學(xué)試驗的最終目的是關(guān)注人類健康。針對卷煙煙氣毒性較低的特點，在進(jìn)行煙氣的細(xì)胞毒性評價時，需要選擇針對性強(qiáng)的細(xì)胞系以及靈敏度高的試驗方法；同時在進(jìn)行高通量樣品的毒性檢測時也要求測試方法能夠更加簡便、快速、準(zhǔn)確。MTT (噻唑藍(lán))法，是一種廣泛用于檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。用二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞中的甲瓚并測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。與中性紅法相比，該方法可省去一些清洗步驟，靈敏度高、操作簡便。BEAS-2B細(xì)胞是永生化的人支氣管上皮細(xì)胞，為煙氣作用于人體的靶器官來源細(xì)胞，常用于呼吸道疾病的相關(guān)研究中。采用BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行卷煙煙氣的細(xì)胞毒性測試，更具針對性，可以較好地解決物種差異的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對現(xiàn)有技術(shù)中所存 在的不足之處，而專門開發(fā)的一種用于卷煙煙氣總粒相物細(xì)胞毒性的測試方法。本方法使用人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性試驗評價卷煙煙氣總粒相物的細(xì)胞毒性，不僅操作簡便，靈敏度高，而且結(jié)果可以較為真實地反映卷煙煙氣總粒相物的細(xì)胞毒性。本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)措施來實現(xiàn):I)配制試驗試劑:
(1)細(xì)胞生長培養(yǎng)基:LHC-8培養(yǎng)基，使用前加入硫酸慶大霉素，終濃度為100單位/
mL ；
(2)消化終止液=DMEM-1640+ 10%胎牛血清；
(3)0.01M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS):0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2.9 gNa2HP0412H20，加超純水至I L，pH 6.9 7.2，高壓滅菌；
(4)MTT溶液:稱取250 mg MTT，放入小燒杯中，加50 mL PBS在電磁力攪拌器上攪拌30 min,用0.22 μm的微孔濾器除菌，分裝，_20°C保存；
(5)0.05%胰酶溶液:稱取0.1g胰酶，加入200 mL PBS冰水浴攪拌30 min, 0.22 μπι的微孔濾器除菌，分裝，_20°C保存；
(6)十二烷基磺酸鈉溶液:稱取一定量的十二烷基磺酸鈉溶解于無菌水中，使其濃度為10mg/mL,用0.22 μπι的微孔濾器除菌，4°C保存。2)細(xì)胞接種培養(yǎng):擴(kuò)增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)經(jīng)胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔I X IO4個細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2)中孵育24 h。3)卷煙煙氣總粒相物(TPM)染毒:移除96孔培養(yǎng)板中的溶液，設(shè)四類實驗組，分別為:空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組和煙氣總粒相物組，并按下述要求在相應(yīng)孔內(nèi)加入細(xì)胞生長培養(yǎng)基、二甲基亞砜、十二烷基磺酸鈉和煙氣總粒相物的二甲基亞砜提取液樣品。空白對照組不接種細(xì)胞，只加細(xì)胞生長培養(yǎng)基；溶劑對照組加二甲基亞砜，加入量與TPM組最高檢測劑量相當(dāng)；煙氣總粒相物組加入不同劑量的煙氣總粒相物二甲基亞砜提取液樣品，使每mL細(xì)胞培養(yǎng)基中TPM的劑量依次是0、10、15、20、30、40、50、60、70 μ g ;陽性對照組加入十二烷基磺酸鈉溶液。每孔內(nèi)加入的細(xì)胞生長培養(yǎng)基和各種受試物的總體積均為200 μ L,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。4) MTT細(xì)胞毒性檢測:向染毒24 h處理后的細(xì)胞培養(yǎng)板中直接加入MTT溶液，每孔20 μ L,置于培養(yǎng)箱中孵育4 h ;棄掉培養(yǎng)板中的溶液,加入DMSO溶液150 yL/孔,置于微孔板振蕩器內(nèi)震蕩15 min ;在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的每孔吸光值。計算相對吸光值，相對吸光值代表細(xì)胞存活率。5 結(jié)果與分析:根據(jù)吸光值，按照公式(I)計算細(xì)胞存活率，并繪制卷煙煙氣總粒相物暴露下細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。公式如下:
權(quán)利要求
1.一種卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 1)配制試驗試劑， 2)細(xì)胞接種培養(yǎng)， 3)卷煙煙氣總粒相物(TPM)染毒， 4)MTT細(xì)胞毒性檢測， 5)結(jié)果與分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，其特征在于:配制試驗試劑有以下: (1)細(xì)胞生長培養(yǎng)基:LHC-8培養(yǎng)基，使用前加入硫酸慶大霉素，終濃度為100單位/mL ； (2)消化終止液:DMEM-1640+ 10%胎牛血清； (3)0.01M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS):0.2 g KCl, 0.2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2.9 gNa2HPO4* 12H20，加超純水至 I L，pH 6.9-7.2，高壓滅菌； (4)MTT溶液:稱取250mg MTT，放入小燒杯中，加50 mL PBS在電磁力攪拌器上攪拌30min，用0.22 μπι的微孔濾器除菌，分裝，_20°C保存； (5)0.05%胰酶溶液:稱取0.1g胰酶，加入200 mL PBS冰水浴攪拌30 min, 0.22 μπι的微孔濾器除菌，分裝，_20°C保存； (6)十二烷基磺酸鈉溶液:稱取一定量的十二烷基磺酸鈉溶解于無菌水中，使其濃度為10mg/mL，用0.22 μπι的微孔濾器除菌，4°C保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，其特征在于:細(xì)胞接種培養(yǎng)過程如下:擴(kuò)增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)經(jīng)胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔IX IO4個細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2)中孵育24 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，其特征在于:卷煙煙氣總粒相物染毒過程如下:移除96孔培養(yǎng)板中的溶液，設(shè)四類實驗組，分別為:空白對照組、溶劑對照組、陽性對照組和煙氣總粒相物組，并按下述要求在相應(yīng)孔內(nèi)加入細(xì)胞生長培養(yǎng)基、二甲基亞砜、十二烷基磺酸鈉和煙氣總粒相物的二甲基亞砜提取液樣品；空白對照組不接種細(xì)胞，只加細(xì)胞生長培養(yǎng)基；溶劑對照組加二甲基亞砜，加入量與TPM組最高檢測劑量相當(dāng)；煙氣總粒相物組加入不同劑量的煙氣總粒相物二甲基亞砜提取液樣品，使每mL細(xì)胞培養(yǎng)基中TPM的劑量依次是O、10、15、20、30、40、50、60、70 μ g ;陽性對照組加入十二烷基磺酸鈉溶液；每孔內(nèi)加入的細(xì)胞生長培養(yǎng)基和各種受試物的總體積均為200 μ L,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，其特征在于:MTT細(xì)胞毒性檢測過程如下:向染毒24 h處理后的細(xì)胞培養(yǎng)板中直接加入MTT溶液，每孔20 μ L，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h;棄掉培養(yǎng)板中的溶液，加入DMSO溶液150 μ L/孔，置于微孔板振蕩器內(nèi)震蕩15 min ;在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的每孔吸光值；計算相對吸光值，相對吸光值代表細(xì)胞存活率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法， 其特征在于:結(jié)果與分下如下:根據(jù)吸光值，按照公式(I)計算細(xì)胞存活率，并繪制卷煙煙氣總粒相物暴露下細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線，公式如下:
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于卷煙煙氣總粒相物生物學(xué)評價的MTT細(xì)胞毒性試驗方法，屬于煙草及卷煙煙氣安全性評價技術(shù)領(lǐng)域。其特征是接種培養(yǎng)永生化人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)，并進(jìn)行卷煙煙氣總粒相物染毒，采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測，根據(jù)試驗結(jié)果分析評價卷煙煙氣總粒相物的細(xì)胞毒性。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下特點BEAS-2B細(xì)胞為人源細(xì)胞，是煙氣作用于人體的靶器官來源細(xì)胞，采用BEAS-2B細(xì)胞系進(jìn)行卷煙煙氣的細(xì)胞毒性評價，針對性更強(qiáng)；試驗過程中減少了多次洗滌細(xì)胞的步驟，也無需進(jìn)行甲醛固定步驟，縮短了測試周期，使得操作更為快速簡便，靈敏性更高，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。此外，本發(fā)明所涉及的MTT測試方法，還適用于多種細(xì)胞系的煙氣細(xì)胞毒性測試，通用性更強(qiáng)。
文檔編號C12Q1/02GK103088105SQ201310013300
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者毛健, 李鵬, 盧斌斌, 孫世豪, 謝劍平, 張建勛, 宗永立 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院