專利名稱：一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量pcr方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
甘鹿黃銹病(Sugarcane orange rust disease)是由屬于屈恩柄銹菌的甘鹿黃銹病菌O0WCCiflia引起的一種真菌性病害。病原菌可經(jīng)由風快速傳播,然后通過氣孔侵入，造成感病品種蔗莖產(chǎn)量損失和蔗糖分的降低。初次侵染源主要來自甘蔗本身或其他中間寄主。控制甘蔗黃銹病發(fā)生的首要措施為培育和栽種抗黃銹病甘蔗品種。 甘蔗黃銹病菌的檢測及其效率和準確性直接影響甘蔗抗黃銹病育種的進程和效果。迄今，已經(jīng)有三種方法被證明可用于檢測待檢測甘蔗品種中是否含有黃銹病菌第一種是分離培養(yǎng)技術，在建立純培養(yǎng)物的基礎上，根據(jù)培養(yǎng)物所產(chǎn)生孢子的形態(tài)特征進行鑒定；第二種是根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定；第三種是常規(guī)PCR檢測技術。以上三種方法中，分離培養(yǎng)技術中分離培養(yǎng)以及最終建立純培養(yǎng)物需要時間長，加上分離過程雜菌污染等，都會影響分離效果，檢出效率不高；田間基于誘發(fā)的抗病性鑒定方法，鑒定結果不夠穩(wěn)定，而且還存在不同地點、不同年份間的鑒定結果有較大的差異以及耗時長達幾個月等逆勢；常規(guī)PCR檢測技術靈敏度不夠高，且無法實時監(jiān)測PCR過程。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過樣品到達域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)對未知模板進行定量分析的方法。與常規(guī)PCR檢測技術相比，實時熒光定量PCR檢測技術，靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，僅需1-10 ng的總RNA或基因組DNA，還能實時直觀地監(jiān)測P CR擴增過程。綜上，目前已有的三種甘蔗黃銹病菌檢測技術，均有待進一步改進和完善，急需建立一種簡便、快速、準確和靈敏度高的檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測。本發(fā)明的一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于1、實時熒光定量PCR檢測體系的建立實時熒光定量PCR擴增體系總體積為25 μ 1，內含 12. 5 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F和 qPCR-R各 O. 75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L探針，5-10 ng 基因組 DNA，ddH20補足到 25 μ I ； PCR擴增程序如下50 V 2 min，94 V 10 min ；90 V 15 s，60 V I min，40個循環(huán)，在60 °〇進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下qPCR-F :5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’，qPCR-R :5’- GTTAATAATGAGGTTTCCC -3/，
探針5’_ FAM-TATAACATTATCCCC-TAMRA-3'。2、實驗有效性判定
同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線如圖1所示，為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線；閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環(huán)數(shù)為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗黃銹病菌的樣品；陰性對 照為已知不含甘蔗黃銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH20代替模板DNA ；
3、實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下
A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗黃銹病菌；
B、Ct值<35.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗黃銹病菌；
C、當Ct值>35. O,則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值，則該樣品中不含甘蔗黃銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗黃銹病菌。本發(fā)明的應用效果
本發(fā)明的一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，具有靈敏度高，特異性好，所需要的DNA用量少的特點；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定、根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定以及常規(guī)PCR檢測技術相比，具有靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，還能實時直觀地監(jiān)測P CR擴增過程等優(yōu)點。本發(fā)明為甘蔗黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度、特異性強的快速檢測體系，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測，對抗黃銹病甘蔗育種和抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。


圖1為甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR檢測示意圖。其中，I代表直角坐標系，2代表閾值線，3代表閾值線2和典型的擴增曲線4的交點所對應的定量PCR擴增循環(huán)數(shù)，即Ct值，4代表典型的擴增曲線，5代表陰性對照樣品擴增曲線，K代表陰性對照樣品擴增曲線的最高點，橫坐標X值代表定量PCR擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標Y值代表定量PCR擴增過程中所檢測到的熒光值。
具體實施例方式為了進一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結合實施例加以說明。實施例1 一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法 一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括以下步驟1、基因組DNA的提取
(I)在待檢測的甘蔗品種E、F、M、N中各取5g葉片組織，置研缽，加入液氮磨碎成粉末，并在解凍前轉入50 ml的離心管中；(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1預冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后,鉤出漂浮在液面的DNA,置于1. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉移上清至另一支1.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g,4 °C ,離心10 min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70 %的乙醇清洗2次，并晾干； (8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、實時熒光定量PCR檢測體系的建立
實時熒光定量PCR擴增體系為總體積25 μ I,內含12. 5 μ L 2XTaqMan UniversalMaster Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F 和 qPCR-R 各 0· 75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L探針，5-10 ng待檢測甘蔗品種基因組DNA, ddH20補足到25 μ L·PCR 擴增程序如下50 0C 2 min, 94 °C 10 min ；90 °C 15 s，60 °C I min，40 個循環(huán)，在60°C進行單點熒光檢測。
所述檢測引物qPCR-F和qPCR-R，是采用ITS-PCR技術，經(jīng)過大量的篩選試驗，獲得了甘蔗黃銹病菌的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計甘蔗黃銹病菌的檢測引物。所述檢測引物和探針如下 qPCR-F :5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’， qPCR-R :5’- GTTAATAATGAGGTTTCCC -3'，
探針5’_ FAM-TATAACATTATCCCC-TAMRA-3'。3、實驗有效性的判定
本實驗中，用已知含甘蔗黃銹病菌的樣品作陽性對照，已知不含甘蔗黃銹病菌的樣品作陰性對照，同時以等體積的無菌ddH20代替模板DNA作空白對照。對照實驗結果中，空白對照無Ct值且無典型的擴增曲線、陰性對照無Ct值且無典型的擴增曲線，而陽性對照的Ct值為28，小于30.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，因此，本次實驗的結果符合實驗有效性的三個條件，實驗是有效的。4、實時熒光定量PCR檢測
如圖1所示，實時熒光定量PCR檢測中設定的閾值線以陰性對照樣品擴增曲線的最高點K為基準，與橫坐標X平行。針對甘蔗品種E、F、M、N制作的樣品，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定實時熒光定量PCR檢測結果如表I所示
表I實時熒光定量PCR檢測結果
權利要求
1.一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于(1)實時熒光定量PCR檢測體系的建立實時熒光定量PCR擴增體系總體積為25μ 1， 內含 12. 5 μ L 2 X TaqMan Universal Master Mix, 10 μ mol/L 的檢測引物 qPCR-F 和 qPCR-1^0.75 μ L,0. 4 μ L 10 μ mol/L探針，5-10 ng 基因組 DNA，ddH20補足到 25 μ I ； PCR 擴增程序如下50 °C 2 min，94 °C 10 min ；90 °C 15 s，60 °C I min，40 個循環(huán)，在 60 °C進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下qPCR-F:5’- TAACAATGGATCTCTAGGC _3’ ；qPCR-R :5’- GTTAATAATGAGGTTTCCC -3'；探針5’_ FAM-TATAACATTATCCCC-TAMRA-3'；(2)實驗有效性判定同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值< 30.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線； 閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環(huán)數(shù)為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗黃銹病菌的樣品；陰性對照為已知不含甘蔗黃銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH20代替模板DNA ；(3)實時熒光定量PCR檢測實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗黃銹病菌；B、Ct值<35.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗黃銹病菌；C、當Ct值>35. 0，則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值則該樣品中不含甘蔗黃銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗黃銹病菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定以及實時熒光定量PCR檢測。本發(fā)明的一種檢測甘蔗黃銹病菌的實時熒光定量PCR方法，具有靈敏度高，特異性好，所需要的DNA用量少的特點；與常規(guī)的根據(jù)病菌培養(yǎng)后的孢子形態(tài)特征鑒定、根據(jù)田間種植后病害表型癥狀鑒定以及常規(guī)PCR檢測技術相比，具有靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，還能實時直觀地監(jiān)測PCR擴增過程等優(yōu)點。為甘蔗黃銹病菌的鑒定，提供了高靈敏度、特異性強的快速檢測體系，可用于田間甘蔗黃銹病菌的早期診斷及檢測，對抗黃銹病甘蔗育種和抗黃銹病甘蔗種質資源的保護具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/04GK103014172SQ201310015708
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權日2013年1月16日
發(fā)明者闕友雄, 許莉萍, 張玉葉, 郭晉隆, 徐景升, 羅俊, 高世武, 陳如凱 申請人:福建農(nóng)林大學