專利名稱：一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核桃(Juglans regia L)為核桃科、核桃屬植物,列世界四大堅(jiān)果之首,素有“木本油料之王”的稱號，其種仁有極高營養(yǎng)價(jià)值和保健功能。核桃又是重要用材和生態(tài)綠化樹種，被廣泛種植于山區(qū)、丘陵、田園和城鄉(xiāng)，具有經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會多重效益。中國是世界上最大的核桃生產(chǎn)國和消費(fèi)國，核桃栽培面積和堅(jiān)果總產(chǎn)量均居世界首位，全國有20多個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)有核桃分布。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年中國核桃種植總面積超過200萬公頃，年堅(jiān)果總產(chǎn)量突破90萬噸。近年來，隨著核桃種植效益的迅速提高，核桃施肥投入不斷增加，施肥已經(jīng)成為核桃豐產(chǎn)栽培的一項(xiàng)重要管理措施。現(xiàn)階段核桃施用的肥料，主要是化肥組合成的復(fù)合肥料、農(nóng)家肥為主的有機(jī)肥料等。由于核桃多種植在丘陵山區(qū)，土壤保水保肥能力差，復(fù)合肥的肥料養(yǎng)分利用率低下，造成了地表水的富營養(yǎng)化和地下水的污染；以農(nóng)家肥為主的有機(jī)肥料雖能改善土壤理化性質(zhì)，但其中的有機(jī)質(zhì)性質(zhì)良莠不齊、含有的病菌和病蟲卵等易造成土壤污染。微生物肥料不僅能改良土壤，改善土壤生態(tài)環(huán)境，還能有效提高植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用。因此，探尋適用于核桃的新型肥料，尤其是微生物肥料，以減少化肥用量、提升有機(jī)肥效應(yīng)的研究倍受關(guān)注。國內(nèi)關(guān)于核桃微生物肥料的研究報(bào)道較少。楊春華等(1998)從林木葉分離選育了 6個(gè)細(xì)菌菌株制劑，對核桃實(shí)生苗均有促生效果；顧斌等(2002)選用以芽孢桿菌為主要成份的生物磷肥和以硅酸鹽菌為主要成份的生物鉀肥等商品生物肥，在優(yōu)種核桃幼齡果園中進(jìn)行了應(yīng)用試驗(yàn)；唐周斌等(2003)利用已在多種農(nóng)作物上應(yīng)用的PGPR菌劑，對核桃苗噴施，產(chǎn)生了較好的促生作用。

植物根際促生菌(plantgrowth-promoting rhizobacteria, PGPR)是微生物肥料有效菌株的重要來源。PGPR是指生存于植物根際、根表，對植物生長有促進(jìn)或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌統(tǒng)稱。大量研究證實(shí)，PGPR具有一定的專用型、土著性，因此將一些常用的微生物直接在核桃生產(chǎn)中應(yīng)用，很難持續(xù)穩(wěn)定的產(chǎn)生類似于農(nóng)作物中的實(shí)驗(yàn)效果。核桃生長周期長，相對于一般的農(nóng)作物來說，更容易形成一些相對穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，有必要針對核桃篩選具有促生作用的PGPR。目前，針對核桃專用PGPR的篩選未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌，其分類命名為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128,已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No. 7071。所述核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌的菌落特征及菌體形態(tài)將該菌在LB平板上培養(yǎng)24h后形成菌落有光澤，圓形，半透明。表面光滑，扁平，邊緣整齊；菌體細(xì)胞大小為(1-1. 2) μ mX (O. 5-0. 6) μ m ;產(chǎn)芽孢，G-,細(xì)胞呈短桿狀。所述核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌的生理生化特征明膠水解試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陽性，葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)陽性，谷氨酸轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)陽性，生長溫度試驗(yàn)37°C陽性(可生長)，41°C陰性，44°C陰性。將所述核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，結(jié)果表明X128與Acinetobacter calcoaceticus同處于一個(gè)最小分支上，其 16S rDNA 序列與 Acinetobacter calcoaceticus (AJ888983)的相似性達(dá) 99%。結(jié)合菌落形態(tài)，生理生化特征和16S rDNA序列分析,鑒定為乙酸I丐不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticu)。

所述核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌可產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)，對調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育具有重要作用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌制成菌劑接種到核桃，可明顯促進(jìn)根系生長，提高側(cè)根數(shù)，增加核桃地徑和苗高的生長，與對照相比，差異達(dá)到顯著水平。因此，本發(fā)明為將來開發(fā)核桃專用的微生物肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌，其分類命名為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128,已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No. 7071。實(shí)施例1核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌的篩選( I)篩選過程通過梯度稀釋法，從山東省章丘市曹范鎮(zhèn)核桃根際土樣中分離出342株分離物。通過三區(qū)劃線法對分離到的細(xì)菌進(jìn)行純化，并通過鏡檢判斷菌株是否純化，對純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到LB斜面上保存?zhèn)溆?。通過保綠法篩選出21株保綠效果較好的菌株，結(jié)合蘿卜子葉增重法，最終篩選出I株具有良好促生效果的細(xì)菌，記為X128。( 2 )菌落特征及菌體形態(tài)將X128在LB平板上培養(yǎng)24h后形成菌落有光澤，圓形，半透明。表面光滑，扁平，邊緣整齊；菌體細(xì)胞大小為(1-1. 2) μ mX (0. 5-0. 6) μ m ;產(chǎn)芽孢，G-,細(xì)胞呈短桿狀。(3)生理生化特征明膠水解試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陽性，葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)陽性，谷氨酸轉(zhuǎn)移酶試驗(yàn)陽性，生長溫度試驗(yàn)37°C陽性(可生長)，41°C陰性，44°C陰性。(4 )產(chǎn)IAA能力測定將X128接種于LB培養(yǎng)基，28 V，180rpm搖床培養(yǎng)4d。用分光光度法測定菌懸液的0D600值，然后將菌懸液IOOOOrpm離心lOmin，取上清液加入等體積Salkowski (50mL35%HC104+lmL0. 5M FeCl3)比色液，避光靜置 30min，測定其 0D530 值。計(jì)算菌濃度0D600值為I時(shí)，單位體積發(fā)酵液中IAA的含量，通過IAA梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA的含量。通過測定，乙酸鈣不動桿菌X128產(chǎn)IAA含量為26. 44yg/(mL · OD600)'(5) 16S rDNA 序列分析16S rDNA基因序列，見核苷酸序列表所示。將所測16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，結(jié)果表明X128與Acinetobacter calcoaceticus同處于一個(gè)最小分支上，其 16S rDNA 序列與 Acinetobacter calcoaceticus (AJ888983)的相似性達(dá) 99%。結(jié)合菌落形態(tài)，生理生化特征和16S rDNA序列分析,鑒定為乙酸I丐不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticu)。實(shí)施例2盆栽試驗(yàn)將保存的核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌X128在LB斜面上活化，挑取一環(huán)接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏O. 3%，蛋白胨1%，氯化鈉O. 5%，瓊脂2%，pH7. 0-7. 2，以上均質(zhì)量百分比)中，于37°C, 180rpm條件下振蕩培養(yǎng)2天，發(fā)酵液6000rpm下離心5min,用無菌生理鹽水潤洗菌體3次后，無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液活菌數(shù)為2. 5 X 108cfu/m(懸液A)，備用。將核桃苗在懸液A中沾根后定植。用無菌生理鹽水將懸液A的菌液濃度調(diào)至IX 108cfu/ml(懸液B)，再取50ml懸液B均勻澆灌于核桃苗根部周圍。將核桃根系在無菌生理鹽水中沾根后，澆灌等量無菌生理鹽水作為對照(CK)，正常管理，兩個(gè)月后測定核桃根系的主根長、側(cè)根數(shù)、苗高和地徑。結(jié)果如表所示。從表中可以看出，核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌懸液A處理的核桃的主根長、側(cè)根數(shù)、苗高和地徑均分別比對照提高了 19. 65%、18. 68%,23. 07%和20. 27%。差異均達(dá)顯著水平。以上表明菌株X128對核桃的生長具有明顯的促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌，其特征在于，其分類命名為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)Xl28,已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No. 7071。
2.權(quán)利要求1所述的核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌在促進(jìn)核桃生長中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌，其分類命名為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128，已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.7071。本發(fā)明還提供該核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌在促進(jìn)核桃根系生長中的應(yīng)用。本發(fā)明的核桃根際促生乙酸鈣不動桿菌，以澆灌的方式均勻施入核桃根系的周圍，可明顯促進(jìn)根系生長，提高側(cè)根數(shù)，增加核桃底徑和苗高的生長，與對照相比，差異達(dá)到極顯著水平。因此，本發(fā)明為將來開發(fā)核桃專用的微生物肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。
文檔編號C12N1/20GK103060241SQ20131001653
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者馬海林, 邢尚軍, 劉方春, 杜振宇, 馬丙堯, 杜秉海, 丁延琴, 姚良同, 陳波 申請人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院