專利名稱：一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，主要用于生物材料、生物傳感器中蛋白質(zhì)的固定以及自組裝。
背景技術(shù)：
在生物材料、生物傳感器以及生物燃料電池等應(yīng)用中都涉及到蛋白質(zhì)在界面的吸附固定。為了提高蛋白質(zhì)在界面的取向分布，更好的發(fā)揮其生物功能，人們需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，加工。通常的辦法是引入氨基、羧基以及巰基等活性基團(tuán)，通過(guò)共價(jià)作用將載體蛋白質(zhì)固定在界面上，實(shí)現(xiàn)生物分子固定化的專一性和分子取向的有序性，直接決定了生物傳感器的靈敏性和生物材料的特異性[Rusmini F，et al., Biomacromolecules 2007, 8,1775-1789，Hernandez K，et al., Enzyme and Microbial Technology 2011，48，107 -122]。其中巰基是最常用的一類活性基團(tuán)，硫原子非?；钴S，和很多金屬GnAiuAg和Pt)以及各種含硫分子具有很強(qiáng)的相互作用，可在界面形成高度有序且密集排列的生物功能膜，而且分子另一端可以帶上不同的活性功能團(tuán)以適用不同的性能需求[Kawada J, et al.，Biomacromolecules 2005，6，2271-2274，Rezwanj K，et al.，Langmuir 2005，21，3493-3497]。目前在蛋白質(zhì)中引入自由巰基的方法，主要有定點(diǎn)突變引入半胱氨酸，利用DTT等進(jìn)行二硫鍵還原以及利用巰基特異性試劑如馬來(lái)酰亞胺等進(jìn)行衍生[Johnson S，etal., Anal.Chem.2008, 80, 978-983，Gauvreau V, et al., Bioconjugate Chemistry2004, 15, 1146-1156，Jongsma MA, et al., Proteomics 2006, 6, 2650-2655，Lud SQ,et al., Langmuir 2010, 26，15895 - 15900]。這些方法步驟比較繁瑣，對(duì)溫度、pH等溶劑環(huán)境要求比較高，同時(shí)可能降低或者破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，而且修飾后的蛋白質(zhì)的制備和純化過(guò)程耗時(shí)比較長(zhǎng)，耗材比較貴，從而限制了蛋白質(zhì)在生物傳感器以及生物材料中的應(yīng)用。半胱氨酸、色氨 酸、絡(luò)氨酸是天然的氨基酸，是蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)的重要組成部分。其中兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定以及生物活性具有重要的作用。色氨酸和絡(luò)氨酸等芳香氨基酸是蛋白質(zhì)中重要的吸光氨基酸，受到紫外光的照射，可以發(fā)出熒光，是觀測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的重要探針。通過(guò)對(duì)大量蛋白質(zhì)的序列結(jié)構(gòu)比對(duì)以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)在大量蛋白質(zhì)家族中，都存在芳香氨基酸和二硫鍵臨近的空間構(gòu)象。這一保守的結(jié)構(gòu)模式存在于溶菌酶、角質(zhì)酶、乳白蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白、胰島素以及水解酶、脂肪酶和喊性憐酸酶等蛋白家族[Serrano AL, et al., Protein Science 2012, 21, 157-170,Prompers JJj et al.，F(xiàn)EBS Letter 1999，456，409-416，Wu LZj et al.，J MolStruct 2008， 882， 101-106]。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明的目的是提出一種光激發(fā)蛋白質(zhì)得到自由巰基的方法，具有反應(yīng)快速，操作簡(jiǎn)單，高效穩(wěn)定的特點(diǎn)，可以用于生物傳感器和生物材料中蛋白質(zhì)的特異性固定。本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于該方法包括如下步驟:
(O配制蛋白質(zhì)溶液，其蛋白質(zhì)的濃度小于I mM，PH為7-8，蛋白質(zhì)溶液的溫度為10-40 0C ；
(2)用紫外光照射蛋白質(zhì)溶液，其輻射的強(qiáng)度小于30W/m2，光照時(shí)間10-1000分鐘，得
到含有自由疏基的蛋白質(zhì)。所述的紫外光波段為260_300nm，由高壓汞燈、氫燈或氙燈提供。所述的蛋白質(zhì)為具有芳香氣基酸與_■硫鍵空間臨近構(gòu)象的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)中的芳香基氨基酸和組成硫鍵的半胱氨酸的原子間距離小于ιοΑ。所述蛋白質(zhì)為溶菌酶、角質(zhì)酶、乳白蛋白、免疫球蛋白、水解酶、脂肪酶或堿性磷酸酶。芳香基氨基酸為色氨酸或絡(luò)氨酸吸收光子能量，傳遞給臨近的半胱氨酸，導(dǎo)致二硫鍵還原。一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，生成的自由巰基可以用于蛋白質(zhì)的固定。本發(fā)明的機(jī)理:首先配置一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，在紫外輻射過(guò)程中，芳香氨基酸吸收了光子，躍遷到激發(fā)態(tài)，和臨近的二硫鍵之間存在能量和電子轉(zhuǎn)移，長(zhǎng)期的紫外輻射能導(dǎo)致二硫鍵的還原，從而得到含有自由巰基的蛋白質(zhì)，自由的巰基可以用于蛋白質(zhì)在納米顆粒、電極，襯底等界面的定向固定。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1、利用蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)紫外光的吸收對(duì)二硫鍵還原，同蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變和巰基衍生方法相比，步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速，節(jié)省了時(shí)間和耗材；
2、根據(jù)蛋白質(zhì)中二硫鍵和芳香氨基酸的分布，通過(guò)改變輻射的強(qiáng)度、溫度以及時(shí)間，可以選擇性的打開(kāi)二硫鍵，實(shí)現(xiàn)局域的氧化還原，控制生成的自由巰基的數(shù)目；3、紫外輻射導(dǎo)致二硫鍵還原，瞬時(shí)高效，同定點(diǎn)突變和化學(xué)衍生法相比，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性影響最小；4、光照輻射蛋白質(zhì)產(chǎn)生自由巰基，同定點(diǎn)突變和化學(xué)衍生法相比，對(duì)溶劑環(huán)境要求比較低，可以在較寬范圍的溫度，PH，離子濃度的溶劑環(huán)境中進(jìn)行；5、光照輻射蛋白質(zhì)產(chǎn)生自由巰基，方法簡(jiǎn)單，操作便捷，可以同步實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的二硫鍵還原，便于生物芯片等大量蛋白質(zhì)的特異性固定；6、操作簡(jiǎn)單，高效便捷，只需要控制紫外光的強(qiáng)度和輻射時(shí)間，就可以激發(fā)蛋白質(zhì)中芳香氨基酸附近的二硫鍵斷裂，具有很強(qiáng)的特異性，而且對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞最小。因此光激發(fā)蛋白質(zhì)得到自由巰基的方法可以用于蛋白質(zhì)在界面的高覆蓋率，取向有序、特異性固定，這一技術(shù)在生物傳感器、生物材料以及生物能源等領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用前景，將會(huì)給醫(yī)療、化工等行業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1是紫外輻射蛋白質(zhì)，色氨酸吸收能量導(dǎo)致臨近的二硫鍵還原的示意圖。

圖2是實(shí)施例1中角質(zhì)酶受光照后，測(cè)得熒光信號(hào)圖和生成的自由巰基和DTNB反應(yīng)的紫外吸收?qǐng)D；其中(a)是實(shí)施例1中角質(zhì)酶經(jīng)光照后，測(cè)得熒光信號(hào)圖。角質(zhì)酶在天然狀態(tài)下熒光信號(hào)很弱，經(jīng)光照后，熒光信號(hào)由弱變強(qiáng)。圖2(b)是實(shí)施例1中角質(zhì)酶受光照后，生成的自由巰基和DTNB反應(yīng)的紫外吸收?qǐng)D。角質(zhì)酶受光照輻射后，通過(guò)埃爾曼的試劑檢測(cè)生成的自由巰基，一旦生成自由巰基，將和DTNB反應(yīng)生成TNB—，TNB—在412nm有光譜吸收。圖3是實(shí)施例2中溶菌酶受光照后，生成的自由巰基和DTNB反應(yīng)的紫外吸收?qǐng)D。溶菌酶受光照輻射后，通過(guò)埃爾曼的試劑檢測(cè)生成的自由巰基，一旦生成自由巰基，將和DTNB反應(yīng)生成TNB' TNB-在412nm有光譜吸收。圖4是免疫球蛋白G的”Y”型結(jié)構(gòu)以及光照輻射后生成自由巰基和金納米顆粒結(jié)合的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用紫外光照射蛋白質(zhì)得到自由巰基的原理如圖1所示，主要是芳香氨基酸如色氨酸吸光，能量傳遞給臨近的二硫鍵，導(dǎo)致二硫鍵還原，生成自由巰基。本發(fā)明得到自由巰基的方法，按照下面步驟操作:首先選取蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)得到蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，確定蛋白質(zhì)是否具有二硫鍵和芳香氨基酸臨近的空間構(gòu)象，如果芳香氨基酸和組成硫鍵的半胱氨酸的原子間距離小于10A，則二者具有臨近的空間構(gòu)象。其次配置一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)濃度小于ImM, pH為7-8,將樣品放入實(shí)驗(yàn)暗室內(nèi)，去除雜散光的影響。打開(kāi)紫外燈，通過(guò)控制光照的距離，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，光照強(qiáng)度在0-30W/m2范圍為佳。經(jīng)過(guò)一定的光照時(shí)間，取少量樣品，通過(guò)埃爾曼試劑檢測(cè)生成的自由巰基。一旦生成自由巰基，和埃爾曼試劑DTNB反應(yīng)，生成物TNB_在412nm有紫外吸收。412nm的紫外吸收強(qiáng)度越大，生成的自由巰基越多。因此可以通過(guò)控制光照強(qiáng)度和時(shí)間，得到一定數(shù)量的自由巰基。同時(shí)為了保持蛋白質(zhì)的天然穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)溫度控制在10-40°C，溫度越高，反應(yīng)速度越快。實(shí)施例1: 光照角質(zhì)酶生成自由巰基:角質(zhì)酶是一個(gè)能夠降解角質(zhì)素的脂溶酶，類似脂肪酶，在工業(yè)上有重要的用途,可以用于去除油污。配置0.1mM的角質(zhì)酶溶液，pH為7.5,溫度為25°C，取2ml吸入石英比色皿中。用280-300nm紫外光照射到石英比色皿樣品池，控制光照的距離使得光照強(qiáng)度為0.lW/m2，每隔30min，檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱。角質(zhì)酶是由214個(gè)氨基酸組成的球蛋白，其中69號(hào)氨基酸為色氨酸(Trp69)。如圖2 (a)，在天然狀態(tài)下，角質(zhì)酶色氨酸的熒光信號(hào)被猝滅。當(dāng)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的紫外輻射，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)。其中主要的原因就是色氨酸附近有一對(duì)二硫鍵(Cys31_Cysl09)，在天然狀態(tài)下，色氨酸和臨近的二硫鍵之間存在電子和能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致色氨酸的熒光信號(hào)被猝滅。當(dāng)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的光照，二硫鍵被打開(kāi)，能量轉(zhuǎn)移停止，色氨酸的熒光信號(hào)逐漸恢復(fù)，不斷增強(qiáng)。主要反應(yīng)如下IpH上4%/r+dffiS+f -4(MR)m光照角質(zhì)酶生成的自由巰基
可以通過(guò)埃爾曼試劑檢測(cè)到，見(jiàn)圖2 (b)。角質(zhì)酶受光照輻射后，一旦生成自由巰基，將和埃爾曼試劑DTNB反應(yīng)生成TNB—，TNB—在412nm有光譜吸收，而且吸收值和自由巰基的數(shù)量成正比。隨著光照時(shí)間增強(qiáng)，生成的自由巰基增多。根據(jù)TNB_的吸光系數(shù)為13600 M—1 cnT1，當(dāng)光照4小時(shí)，有50%以上的角質(zhì)酶分子生成了自由的巰基。.實(shí)施例2:
光照溶菌酶生成自由巰基:溶菌酶是一種糖苷水解酶，可以溶解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁，對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的殺滅作用，也可用于防止食品變質(zhì)，在食品保鮮、醫(yī)藥、日化、嬰兒食品及科學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。用TrisHCl緩沖液(pH7.8，溫度為25°C)配置0.0lmM的溶菌酶溶液，取2ml吸入石英比色皿中。用270-300nm紫外光照射到石英比色皿樣品池，控制光照強(qiáng)度，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，通過(guò)埃爾曼試劑檢測(cè)是否有巰基生成。如圖3所示，可以看到溶菌酶具有多對(duì)二硫鍵和色氨酸臨近，經(jīng)過(guò)紫外光照射，蛋白質(zhì)和DTNB反應(yīng)，生成物在412nm有紫外吸收，說(shuō)明有自由巰基生成，而且隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，412nm的紫外吸收增大，說(shuō)明生成的自由巰基數(shù)目增加。當(dāng)光照一小時(shí)后，生成物在412nm的吸收達(dá)到飽和，生成的自由巰基數(shù)目保持穩(wěn)定。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度增加，如0.04mM,當(dāng)光照6小時(shí)后，生成的自由巰基數(shù)目才基本穩(wěn)定。同樣當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度升高到30°C，反應(yīng)加快，光照時(shí)間響應(yīng)減少，只需要4.5小時(shí)，生成的自由巰基數(shù)目穩(wěn)定。根據(jù)TNB_的紫外吸光值，可以得到一個(gè)溶菌酶分子有一對(duì)二硫鍵被破壞。溶菌酶有4對(duì)二硫鍵(Cys6-127，Cys30-115, Cys64_80和Cys76_94)和6個(gè)色氨酸(Trp28，Trp62，Trp63, Trpl08, Trplll和Trpl23)，但是二硫鍵和色氨酸最臨近的是Cys30-115/ Trpl23(根據(jù)TOB 1LYS,最小距離為3.4A)，因此最容易被光照還原，生成自由疏基。實(shí)施例3:、
光照免疫球蛋白G和金納米顆粒結(jié)合:免疫球蛋白G是重要的抗體蛋白，常常和納米金顆粒結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)生物大分子的精確定位，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)，組織學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域。如圖4所示，免疫 球蛋白的結(jié)構(gòu)成一個(gè)“Y”字型，上面的“V”是用以識(shí)別抗原和決定抗體特異性的部位，稱為Fab段，其余的羧基末端為Fe段。免疫球蛋白上有十幾對(duì)二硫鍵都和芳香氨基酸臨近，但大部分都包埋在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，其中圓圈標(biāo)記的一對(duì)二硫鍵的溶劑暴露比較大，當(dāng)紫外光照射時(shí)容易發(fā)生還原，生成自由巰基。在25°C室溫下，用磷酸緩沖液(pH7.4)配置0.2mM的免疫球蛋白，用260_300nm的光照射I小時(shí)，控制輻射強(qiáng)度為IW/m2，免疫球蛋白質(zhì)上的硫鍵可以被打開(kāi)。將制備的IgG樣品和膠體金溶液分別以0.1Mol/LK2CO3調(diào)pH至9.0，按照1:1比例混合，攪拌10分鐘，可以得到如圖4所示的IgG標(biāo)記的金納米顆粒。
權(quán)利要求
1.一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (O配制蛋白質(zhì)溶液，其蛋白質(zhì)的濃度小于1 mM，PH為7-8，蛋白質(zhì)溶液的溫度為10-40 0C ； (2)用紫外光照射蛋白質(zhì)溶液，其輻射的強(qiáng)度小于30W/m2，光照時(shí)間10-1000分鐘，得到含有自由疏基的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于:所述的紫外光波段為260-300nm，由高壓汞燈、氫燈或氙燈提供。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)為具有芳香氨基酸與二硫鍵空間臨近構(gòu)象的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3的一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)中的芳香基氨基酸和組成硫鍵的半胱氨酸的原子間距離小于10A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3的一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)為溶菌酶、角質(zhì)酶、乳白蛋白、免疫球蛋白、水解酶、脂肪酶或堿性磷酸酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種光激發(fā)蛋白質(zhì)中二硫鍵還原得到自由巰基的方法，該方法包括如下步驟(1)配制蛋白質(zhì)溶液，其蛋白質(zhì)的濃度小于1mM，pH為7-8，蛋白質(zhì)溶液的溫度為10-400C；(2)用紫外光照射蛋白質(zhì)溶液，其輻射的強(qiáng)度小于30W/m2，光照時(shí)間10-1000分鐘，得到含有自由巰基的蛋白質(zhì)。該方法操作簡(jiǎn)單，高效便捷，具有很強(qiáng)的特異性，而且對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞最小。因此光激發(fā)蛋白質(zhì)得到自由巰基的方法可以用于蛋白質(zhì)在界面的高覆蓋率，取向有序、特異性固定，這一技術(shù)在生物傳感器、生物材料以及生物能源等領(lǐng)域具有重大的應(yīng)用前景，將會(huì)給醫(yī)療、化工等行業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N13/00GK103087183SQ20131001682
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者武靈芝, 胡棟 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)