專利名稱：檢測含有nos終止子的轉(zhuǎn)基因水稻的引物、試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及檢測轉(zhuǎn)基因水稻的引物、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物是指利用生物技術(shù)，將外源基因轉(zhuǎn)移到物種中以改造其遺傳特性，從而獲得人類所需的性狀、營養(yǎng)品質(zhì)而產(chǎn)生的生物新品種。以轉(zhuǎn)基因生物或以其為原料加工而來的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。從1994年第一例轉(zhuǎn)基因食品(轉(zhuǎn)基因番茄)在美國誕生至今，轉(zhuǎn)基因生物已廣泛用于食品領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)展?fàn)顩r國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)、生產(chǎn)蓬勃發(fā)展，通過基因工程方式培育農(nóng)作物新品種是目前作物育種的發(fā)展方向，在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)、提高抗性等方面具有巨大潛力。水稻(Oryza sativa L.)是我國最重要的主糧,常年播種面積約為3100萬公頃，總收獲量在2億噸左右，約占我國糧食總產(chǎn)量的40%。1991年，Christou等用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。隨后幾年，各國將各類目的基因?qū)胨精@得大量轉(zhuǎn)基因水稻品系。1994年，Hiei等建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效粳稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，隨后爪哇稻和秈稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系也先后建立，并逐步成為水稻的主流轉(zhuǎn)化技術(shù)。其它物種的抗除草齊[J、抗蟲、抗病、抗病毒、耐鹽、改善稻米品質(zhì)等有益基因被引入商業(yè)水稻品種中。中國在轉(zhuǎn)基因水稻培育方面取得了重大進(jìn)展，已將豇豆胰蛋白酶抑制劑基因，CryIAb、CrylAc, Crylc, CryIAh、Cry2a等毒蛋白基因，雪花蓮凝集素基因，抗菌肽基因和來自野生稻的Xa21基因等導(dǎo)入多種雜交 水稻恢復(fù)系中。經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，十多種轉(zhuǎn)基因水稻品系正在進(jìn)行環(huán)境釋放、中間試驗，其中有2個抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻已獲轉(zhuǎn)基因生物安全證書。目前中國正在進(jìn)行環(huán)境釋放、中間試驗的轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建中都含有NOS終止子，故采用NOS終止子特異性方法可篩選檢測轉(zhuǎn)基因水稻及其制品。轉(zhuǎn)基因食品的管理要求轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)得到廣泛使用，但是轉(zhuǎn)基因作為一種新的生物技術(shù)，其對人類健康、生態(tài)平衡的影響以及轉(zhuǎn)基因食品潛在的安全性越來越成為消費者關(guān)注的焦點。2000年聯(lián)合國通過了“生物安全議定書”，該議定書對除了藥物以外的所有進(jìn)出境活性轉(zhuǎn)基因生物有關(guān)過境、審批、檢測、風(fēng)險評估和管理、賠償責(zé)任等做出了詳細(xì)的規(guī)定。世界上主要國家立法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理，美加、歐盟、日本、韓國、澳新的法律明確規(guī)定，轉(zhuǎn)基因生物需經(jīng)政府批準(zhǔn)，并經(jīng)嚴(yán)格的生物安全、環(huán)境安全測試才可以田間種植、環(huán)境釋放及作為食品、飼料。歐盟、日本、韓國、澳洲等要求轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識，并規(guī)定了相應(yīng)閾值水平。我國于2001年5月23日頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，規(guī)定對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實行檢驗檢疫。2002年3月20日開始實行的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》也規(guī)定了轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識制度。對于執(zhí)行上述聯(lián)合國及各國的法規(guī)措施，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測是關(guān)鍵措施之一，需要通過定性檢測確定轉(zhuǎn)基因的種類，鑒別其是否為已批準(zhǔn)的或已獲準(zhǔn)用于食品飼料，以防止具有風(fēng)險的未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的任意擴(kuò)散，對社會產(chǎn)生危害。由于每個國家轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的閾值水平都不相同，還需要通過定量檢測確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量，明確是否已達(dá)到所在國規(guī)定的閾值水平。轉(zhuǎn)基因食品的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法(LAMP)轉(zhuǎn)基因食品檢測大致可分為兩類。一類是核酸檢測，當(dāng)外源基因插入到受體細(xì)胞染色體時，一般要構(gòu)建啟動子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報告基因，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35s啟動子，胭脂堿合酶終止子(NOS終止子)等。轉(zhuǎn)基因食品核酸檢測的靶標(biāo)是插入的外源基因，包括外源基因的整合位點、啟動子、終止子、選擇標(biāo)記基因和報告基因的核酸序列。目前的轉(zhuǎn)基因成分檢測數(shù)據(jù)庫中有超過400對PCR檢測引物和40多種內(nèi)源參照基因。另一類是蛋白檢測，即通過插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或其功能進(jìn)行檢測，已有大約20種轉(zhuǎn)基因蛋白檢測方法在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域中投入使用。核酸檢測主要利用PCR方法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法。核酸檢測方法具有很高的靈敏度，在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域使用最為廣泛。與蛋白質(zhì)具有的組織特異性相比，核酸檢測技術(shù)不受材料的限制。另外，核酸比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，變性之后容易復(fù)性，因此在加工食品中仍可檢出。核酸檢測方法的關(guān)鍵是引物設(shè)計，檢測的特異性和靈敏度取都決于引物序列的設(shè)計。

2000年日本的Notomi發(fā)明一種基因診斷技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)，并在中國獲得發(fā)明專利權(quán)(專利號 00818262. 0)。LAMP法近年已成功地應(yīng)用于多種疾病病原檢測中。LAMP方法具有如下優(yōu)點靈敏度高；反應(yīng)時間短(15 60min完成反應(yīng))；不需要貴重儀器(只需60-70°C左右恒溫)；操作步驟簡單(將反應(yīng)液、酶和模板混合于PCR管中，置于60-65°C保溫);結(jié)果檢測簡單，可肉眼觀察結(jié)果。因此，LAMP方法適合現(xiàn)場快速檢測診斷，是可替代PCR的基因擴(kuò)增技術(shù)。通常，LAMP方法針對靶基因的6個序列區(qū)域設(shè)計4_6條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫(60-650C )持續(xù)15分鐘到I小時左右，將靶基因擴(kuò)增IO9 101°倍?？赏ㄟ^3種方法肉眼判斷檢測結(jié)果1)濁度法，由于LAMP反應(yīng)可產(chǎn)生大量白色焦磷酸鎂沉淀，故可憑肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)是否出現(xiàn)白色渾濁，進(jìn)行結(jié)果判斷；2)熒光顯色劑法，由于LAMP反應(yīng)能將靶基因擴(kuò)增IO9倍以上，在反應(yīng)完成后加入SYBR Green1、Evagreen等核酸染色劑，在紫外光下可對結(jié)果進(jìn)行熒光顯色判定；3)金屬離子滴定指示劑法，由于LAMP反應(yīng)生成大量的焦磷酸根，與反應(yīng)體系中的錳離子、鎂離子生成絡(luò)合物或沉淀，導(dǎo)致反應(yīng)體系中的錳離子、鎂離子濃度降低，故當(dāng)LAMP反應(yīng)體系中加入羥基萘芬藍(lán)(英文名hydroxynaphthol blue 或 2-Hydroxy-l- (2-hydroxy-4-sulfo-l-naphthylazo) -3, 6-naphthalenedisulfonic acid)，反應(yīng)結(jié)束后，溶液由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)色；或者當(dāng)LAMP反應(yīng)體系中加入錳離子與鈣黃綠素(英文名Calcein，又名3，3’-雙(甲胺二乙酸)熒光素，Bis [N, N-bis (carboxymethyl) aminomethyl3’ fluorescein)時，反應(yīng)結(jié)束后，溶液由淺掠色變?yōu)榫G色，可通過觀察反應(yīng)管的顏色變化直接判定反應(yīng)結(jié)果。當(dāng)然，也可以通過電泳對LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，當(dāng)電泳結(jié)果顯示特異性條帶時，則表明所測樣品中包含靶標(biāo)DNA序列。目前，國內(nèi)外少見報道利用LAMP技術(shù)簡單、快速、特異且靈敏地測定含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻。
因此，本領(lǐng)域需要一種簡單、快速、特異性好且靈敏度高的檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種操作簡單、快速、特異而靈敏地檢測含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品用引物、試劑盒及其應(yīng)用以及相應(yīng)的檢測方法。第一方面，本發(fā)明提供了用于通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列為SEQ ID NOs. 1-4或SEQ ID NOs. 1_6。第二方面，本發(fā)明提供了用于通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的試劑盒，其中所述試劑盒包括本發(fā)明第一發(fā)明所述的引物，并進(jìn)一步包括甜菜堿。在一個具體的實施方式中，所述的試劑盒還包括用于提取轉(zhuǎn)基因水稻DNA的試劑、用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的試劑、陽性對照、陰性對照、空白對照以及使用說明書。在一個具體的實施方式中，所述的試劑盒進(jìn)一步包括可用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法的核酸用染色熒光劑和/或金屬離子滴定指示劑。在一個具體的實施方式中，所述核酸染色劑為SYBR Green I或Evagreen,所述金屬離子滴定指示劑為羥基萘芬藍(lán)或錳離子與鈣黃綠素。在一個具體的實施方式中，所述錳離子為硫酸錳。第三方面，本發(fā)明提供了通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用本發(fā)明第一發(fā)明的引物或者本發(fā)明第二方面的試劑
盒。`在一個具體的實施方式中，所述方法包括如下步驟(a)從待測樣品中提取DNA ;和(b)使用本發(fā)明第一方面所述的引物或本發(fā)明第二方面所述的試劑盒，通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。在一個具體的實施方式中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)在實時濁度儀上進(jìn)行。在一個具體的實施方式中，所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫裝置中進(jìn)行。第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的引物或者本發(fā)明第二方面所述的試劑盒在檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。利用本發(fā)明的引物、試劑盒或方法能夠?qū)D(zhuǎn)基因水稻或其制品進(jìn)行簡單、快速、特異而靈敏地檢測，從而檢出含NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品。


圖1 :不加環(huán)引物的LAMP方法在實時濁度儀上檢測轉(zhuǎn)基因水稻是否包含NOS終止子。樣品DNA包括科豐6號、克螟稻(KMDl)、Bt汕優(yōu)63、T2a_l、Tlc_19、陰性對照水稻和空白對照。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因水稻是農(nóng)業(yè)部公布的水稻品系標(biāo)準(zhǔn)名稱。圖2 :以鈣黃綠素為顯色劑檢測轉(zhuǎn)基因水稻是否包含NOS終止子。I為科豐6號，2為克螟稻(KMD1)，3為Bt汕優(yōu)63，4為T2a_l，5為Tlc_19，6為陰性對照水稻，7為空白對照。
圖3 :以SYBR Green I為顯色劑檢測轉(zhuǎn)基因水稻是否包含NOS終止子。I為科豐6號，2為克螟稻(KMD1 )，3為Bt汕優(yōu)63，4為T2a_l，5為Tlc_19，6為陰性水稻，7為空白對照。圖4 :添加鎖核酸修飾環(huán)引物的LAMP方法在實時濁度儀上檢測轉(zhuǎn)基因水稻是否包含NOS終止子。樣品DNA包括科豐6號、克螟稻(KMDl)、Bt汕優(yōu)63、T2a_l、TlC_19、陰性水稻和空白對照。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但是，本發(fā)明并不限于以下具體實施例。實施例1 :不加環(huán)引物在實時濁度儀上檢測轉(zhuǎn)基因水稻在本實施例中利用反向外引物N0S-B3 (SEQ ID No.1)、反向內(nèi)引物NOS-BIP (SEQID No. 2)、正向外引物 N0S-F3 (SEQ ID No. 3)和正向內(nèi)引物 NOS-FIP (SEQ ID No. 4)，通過LAMP法實現(xiàn)了在實時濁度儀上檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻。在本實施例中檢測的DNA樣品分別來自科豐6號、克螟稻(KMDl)、T2a-l、Tlc_19，同時還包括已知包含NOS終止子的Bt汕優(yōu)63作為陽性對照，不含NOS終止子的非轉(zhuǎn)基因水稻的DNA樣品作為陰性對照和不含DNA的樣品作為空白對照。1.主要檢測儀器實時濁度儀(LA-320C，日本);1000uL、100uL、10uL、2.5uL微量移液器(Eppendorf，德國)。2.主要檢測試劑所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(具體序列見表l);BstDNA聚合酶、IOXThermoPol Buffer、MgSO4購自NEB公司；dNTPs購自大連寶生物公司；甜菜堿購自北京東方嘉城生物公司。表1:引物序列
權(quán)利要求
1.用于通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列為SEQ ID NOs. 1-4或SEQ ID NOs. 1-6。
2.用于通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的試劑盒，其中所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物序列，并進(jìn)一步包括甜菜堿。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其還包括用于提取轉(zhuǎn)基因水稻DNA的試劑、用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的試劑、陽性對照、陰性對照、空白對照以及使用說明書。
4.如權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括可用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法的核酸用染色熒光劑和/或金屬離子滴定指示劑。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒,其中所述核酸染色劑為SYBRGreen I或Evagreen,所述金屬離子滴定指示劑為羥基萘芬藍(lán)或錳離子與鈣黃綠素。
6.通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1所述的引物或者權(quán)利要求2-5中任一項所述的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，所述方法包括如下步驟 (a)從待測樣品中提取DNA;和 (b)使用權(quán)利要求1所述的引物或權(quán)利要求2-5中任一項所述的試劑盒，通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)在實時濁度儀上進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫裝置中進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1所述的引物或者權(quán)利要求2-5中任一項所述的試劑盒在檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻或其制品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻的引物SEQ ID NOs.1-4或SEQ ID NOs.1-6，包含所述引物的試劑盒，以及利用所述引物或試劑盒通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻的方法。使用本發(fā)明的引物或試劑盒能夠簡單、快速、高特異性且高靈敏度地測定含有NOS終止子的轉(zhuǎn)基因水稻。
文檔編號C12N15/11GK103060460SQ20131001869
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者黃文勝, 陳穎, 鄧婷婷, 付凱 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院