專利名稱：一種真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是一種利用細(xì)胞壁裂解酶在真空環(huán)境下裂解蘇丹草幼葉和莖的細(xì)胞壁從而制備大量原生質(zhì)體的技術(shù)。
背景技術(shù)：
原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或一個被質(zhì)膜包圍的裸露細(xì)胞。大量制備原生質(zhì)體是細(xì)胞組織培養(yǎng)和植物基因功能研究的重要基礎(chǔ)。蘇 丹草原生質(zhì)體的制備方法目前尚無報道，蘇丹草原生質(zhì)體的制備方法的建立有利于蘇丹草相關(guān)研究的進(jìn)一步開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種真空酶解的方法大量制備蘇丹草的原生質(zhì)體，制備的原生質(zhì)體可以用于蘇丹草的轉(zhuǎn)基因和基因功能等方面的研究。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1. 一種真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)的特征在于，以蘇丹草嫩葉和莖為對象，利用細(xì)胞壁消化酶在真空環(huán)境下消化細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體，它包括①蘇丹草幼苗準(zhǔn)備，
②幼葉和莖的處理，③抽真空酶解，④原生質(zhì)體解離，⑤過濾殘渣和⑥原生質(zhì)體懸浮6個步驟。2.上述的6個步驟是這樣進(jìn)行的
①蘇丹草幼苗準(zhǔn)備選取飽滿的蘇丹草種子，種入營養(yǎng)缽，25°C培養(yǎng)8天。②幼葉和莖的處理剪取蘇丹草的幼葉和莖Ig左右，將幼葉和莖切成約1_長。③抽真空酶解將切好的幼葉和莖放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，真空環(huán)境(-0.1MPa )1小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉(zhuǎn)速40rpm，酶解3小時。④原生質(zhì)體解離倒掉酶解液，加入解離液10ml，28°C搖床，轉(zhuǎn)速為80rpm，解離I小時。⑤過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉(zhuǎn)入50mL離心管，90 G離心3分鐘。⑥原生質(zhì)體懸浮倒掉上清液,加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質(zhì)體，即可得大量的原生質(zhì)體細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果利用真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)可以快捷、大量地制備出蘇丹草的原生質(zhì)體，而且本方法制備的原生質(zhì)體細(xì)胞完整性好，細(xì)胞死亡少，方法簡便。
具體實施例方式 下面結(jié)合具體實例對真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
實施例1 :蘇丹草S722原生質(zhì)體的制備1.蘇丹草幼苗準(zhǔn)備選取飽滿的蘇丹草S722的種子，種入營養(yǎng)缽，25°C培養(yǎng)8天。2.幼葉和莖的處理剪取蘇丹草S722的幼葉和莖lg，用刀片將葉片切成約Imm長。3.抽真空酶解將切好的莖、葉放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，真空環(huán)境(-0.1MPa )1小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉(zhuǎn)速40rpm，酶解3小時。(酶解液配方0. 645M甘露醇，IOmM氯化鉀，ImM氯化鈣，8mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5. 5，1. 5%纖維素酶和O. 3%的離析酶R-1O)。4.原生質(zhì)體解離倒掉酶解液，加入解離液10ml，28°C搖床，轉(zhuǎn)速為80rpm，解離I小時(解離液配方154mM氯化鈉，125mM氯化鈣，5mM氯化鉀，2mM 2-嗎啉乙磺酸，PH 5.7
)O O5.過濾殘渣用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉(zhuǎn)入50mL離心 管，90 G離心3分鐘。6.原生質(zhì)體懸浮倒掉上清液,加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質(zhì)體，即可得大量的原生質(zhì)體細(xì)胞(懸浮液配方0. 6Μ甘露醇，15mM氯化I丐，4mM 2-嗎啉乙磺酸，PH5.7)。經(jīng)檢測，通過以上步驟在得到的原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到IO7個以上，且細(xì)胞完整性好，完全滿足實驗需求。
權(quán)利要求
1.一種真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)的特征在于，以蘇丹草嫩葉和莖為對象，利用細(xì)胞壁消化酶在真空環(huán)境下消化細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體，它包括①蘇丹草幼苗準(zhǔn)備，②幼葉和莖的處理，③抽真空酶解，④原生質(zhì)體解離，⑤過濾殘渣和⑥原生質(zhì)體懸浮6個步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蘇丹草幼苗準(zhǔn)備的做法是選取飽滿的蘇丹草種子，種入營養(yǎng)缽，25°C培養(yǎng)8天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的幼葉和莖的處理的做法是剪取蘇丹草的幼葉和莖Ig左右，將葉片切成Imm長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抽真空酶解的做法是將切好的莖、葉放入已加入IOmL酶解液的三角瓶中，置于-O.1MPa真空環(huán)境I小時，取出后用錫箔紙蓋好三角瓶口放入28°C搖床，轉(zhuǎn)速40rpm，酶解3小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原生質(zhì)體解離的做法是倒掉酶解液，加入解離液10ml, 28°C搖床,轉(zhuǎn)速為80rpm,解離I小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的過濾殘渣的做法是用200目尼龍布過濾解離后的蘇丹草葉片殘渣，濾液轉(zhuǎn)入50mL離心管，90 G離心3分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原生質(zhì)體懸浮的做法是倒掉上清液，加入300 μ L懸浮液，輕輕搖動離心管懸浮原生質(zhì)體，即可得大量的原生質(zhì)體細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種真空酶解法制備蘇丹草原生質(zhì)體的技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。蘇丹草種子出苗后，將蘇丹草幼葉和莖切成一定大小，利用抽真空酶解的方法對幼葉和莖的細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，從而分離出大量蘇丹草原生制體的方法。利用本方法可以便捷、快速地制備出大量細(xì)胞完好的蘇丹草原生質(zhì)體。
文檔編號C12N5/04GK103013905SQ20131001903
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月19日
發(fā)明者李杰勤, 王麗華, 詹秋文, 周青, 萬海波, 王茂輝 申請人:安徽科技學(xué)院