專利名稱：青海弧菌q67b及其分離篩選和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青?；【鶴67B及其分離篩選和應(yīng)用，屬微生物學(xué)的發(fā)光細(xì)菌分離篩選和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。青?；【鶴67B是淡水發(fā)光菌。從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集淡水發(fā)光菌，經(jīng)分離、純化、篩選后，得到一種新的淡水發(fā)光菌種菌株，16SrDNA序列分析表明，該菌屬弧菌屬，定名為“青海弧菌Q67B”。2010年I月28日將其送交武漢市中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO :M2010104。
背景技術(shù)：
發(fā)光菌是一大類能自身發(fā)出熒光的細(xì)菌，在條件合適時，其發(fā)光恒定。若發(fā)光菌接觸到有毒有害物質(zhì)時，其發(fā)光就會受抑制，抑制程度與所接觸的毒物的毒性大小和毒物的濃度有關(guān)。因此發(fā)光菌可用于檢測樣品的生物學(xué)毒性。上世紀(jì)八十年代，發(fā)光菌就己被用于環(huán)境污染的檢測。我國也于1995年發(fā)布了將發(fā)光菌用于水環(huán)境污染的毒性檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)。但不管國際還是國內(nèi)，均使用來源于海洋的海洋發(fā)光菌，該發(fā)光菌適應(yīng)海洋的高鹽度(相當(dāng)于NaCl的質(zhì)量百分濃度為3%)和高滲透壓的環(huán)境條件，否則無法生長，更不會發(fā)光。當(dāng)用于陸地淡水樣品時，必須在淡水樣品中添加NaCl，直至淡水樣品中NaCl的最終質(zhì)量百分濃度為3%，否則淡水樣品中的海洋發(fā)光菌很快就喪失發(fā)光能力，甚至細(xì)菌的細(xì)胞因低滲透壓而吸水破裂，無法繼續(xù)進(jìn)行檢測。上世紀(jì)九十年代，隨著發(fā)光菌應(yīng)用于環(huán)境污染的毒性檢測日益增多，許多研究者發(fā)現(xiàn)，對有些種類的淡水樣品，其檢測結(jié)果往往與其它生物檢測結(jié)果不太吻合，尤其是那些含有重金屬鹽的樣品。究其原因，乃對淡水樣品添加NaCl所致。所以有研究者改用葡萄糖取代NaCl來調(diào)節(jié)滲透壓，使之與質(zhì)量百分濃度為3%的NaCl溶液等滲，但效果并不理想，檢測結(jié)果的重復(fù)性較差。這是因為海洋發(fā)光菌必需要有一定濃度的Na離子存在時才能保持良好而穩(wěn)定的發(fā)光性能，缺乏Na離子的環(huán)境對海洋發(fā)光菌的發(fā)光是不利的，必然影響到海洋發(fā)光菌發(fā)光的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致檢測結(jié)果的嚴(yán)重偏差。如果使用不需要Na離子并適應(yīng)較低的滲透壓就能正常發(fā)光的淡水發(fā)光菌作為檢測用發(fā)光細(xì)菌，對淡水樣品就不必添加NaCl， 避免了應(yīng)用海洋發(fā)光菌作為檢測用發(fā)光細(xì)菌的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是公開一種青?；【鶴67B，其特征在于，(I)形態(tài)特征該菌的菌體呈桿狀微彎，大小介于O. 5 O. 7微米X1. 5 2微米，革蘭氏染色陰性，用利夫生鞭毛染色，觀察到單極生鞭毛似蝌蚪狀，細(xì)胞內(nèi)累積聚β_羥基丁酸；(2)生理生化特征該菌適于生長的溫度范圍和pH范圍分別為4°C 40°C和PH5 pHIO，對弧菌抑制劑2，4- 二氨基-6，7- 二異丙基喋啶敏感，具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力，能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長和發(fā)光；(3)基因特征16SrDNA序列AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGG
TGGTGTTGTTAATAGCAGCATCATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT
AATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGGATTAAGTCAGATGTGAA
AGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGTTCACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTG
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GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGCGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTG
ACATCTACAGAATCCTGCGGAGACGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTAAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT
CGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAA
CTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGC
TACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAG
TCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATA
CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTGGTTAGTTTAACCGCACT
TTCTTCGGAGAGAGTGGAGGACGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。所述的青?；【鶴67B的進(jìn)一步特征在于，該菌最適于生長的溫度和pH值分別為25。。和 pH9. O。本發(fā)明的另一個目的是推出一種分離篩選青海弧菌Q67B的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案，其特征在于，該菌經(jīng)過四個步驟，篩選得到第一步獲取淡水發(fā)光菌，從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌，經(jīng)分離純化，獲得淡水發(fā)光菌；第二步溫度適應(yīng)性篩選，在兩個不同的溫度下對第一步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行溫度適應(yīng)性篩選；第三步PH值適應(yīng)性篩選，在兩個不同的pH值下對第二步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行PH值適應(yīng)性篩選；第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選，用重金屬鹽和有機(jī)毒物對第三步獲得的淡水發(fā)光菌先后進(jìn)行兩次毒物反應(yīng)靈敏性篩選。所述的分離篩選青?；【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的兩個不同的溫度是4°C和40。。。所述的分離篩選青海弧菌Q67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的兩個不同的pH值是 pH5. O 和 pHll. O。所述的分離篩選青?；【鶴67B的方法的進(jìn)一步特征在于，所述的重金屬鹽和有機(jī)毒物分別是HgCl2和苯酚。青?；【鶴67B具有寬的生長和發(fā)光的溫度范圍4°C 40°C ;具有寬的生長和發(fā)光的pH值范圍pH5. O pHll. O ;具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力，能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長和發(fā)光；對毒物的毒性反應(yīng)靈敏，特別適合用于陸地淡水樣品或固體樣品的水相抽提物的生物毒性快速檢測和淡水樣品的生物毒性快速篩選?，F(xiàn)結(jié)合附圖
詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。一種分離篩選青?；【鶴67B的方法，其特征在于，具體操作步驟第一步獲取淡水發(fā)光菌 (I)取新鮮的青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚，截成小段，室溫下放置10小時 24小時，在暗室內(nèi)檢視，在發(fā)綠色熒光的亮點處，用滅菌的接種針括取，劃線于培養(yǎng)皿內(nèi)，(2)將第一步(I)所述的培養(yǎng)皿置于暗室中，20°C培養(yǎng)10小時 18小時，從中挑取發(fā)光良好的單菌落，(3)對第一步(2)所述的單菌落進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)三 五次，取得單細(xì)胞純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于斜面試管，培養(yǎng)生長后得斜面菌種，即淡水發(fā)光菌，保存于4°C冰箱備用，(4)所述的培養(yǎng)皿和斜面試管內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基的配方為，MgSO4
2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g,Mg(HCO3)2 0. 50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，瓊脂20g，溶于IOOOmL蒸餾水中，ρΗ9· 0，121°C滅菌20分鐘，貯于4°C的冰箱備用；第二步溫度適應(yīng)性篩選(I)將第一步(3)所得的斜面菌種，轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管，(2)將第二步(I)所述的斜面試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，檢查發(fā)光狀況，選出發(fā)光良好的菌支，(3)將第二步(2)選出的菌支分別轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管，(4)將第二步(3)所述的試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，檢查發(fā)光狀況，選出發(fā)光良好的菌支，(5)將第二步(4)選出的菌支分別劃線轉(zhuǎn)接于十個平皿，平分成兩組，為第I組和第II組，分別于4°C和40°C培養(yǎng)16小時 18小時，(6)另取十個平皿，平分成兩組，為第III組和第IV組，每組五個平皿，暗室中挑取第I組的每一個平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第III組的五個平皿，暗室中挑取第II組的每一個平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第IV組的五個平皿，將第III組和第IV組分別于40°C和4°C培養(yǎng)16小時 18小時，(7)另取十支斜面試管，分別對應(yīng)上述第III組和第IV組的每個平皿，將各平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于十支對應(yīng)斜面試管中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，(8)另取五支斜面試管，選取第二步(7)所述的十支斜面試管中發(fā)光良好的五個斜面，分別轉(zhuǎn)接到五支斜面試管中，得到五支斜面菌種，保存于4°C冰箱內(nèi)備用，(9)所述的斜面試管和平皿內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基與上述的第一步需用的固體培養(yǎng)基完全相同，(10)經(jīng)第二步溫度適應(yīng)性篩選操作后所得的菌種，具有耐低溫4°C和耐高溫40°C的性能； 第三步pH值適應(yīng)性篩選(I)取第二步的(8)所得的斜面菌種，分別轉(zhuǎn)接于pH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基中，各為五瓶，20°C振蕩培養(yǎng)16小時 18小時， (2)在經(jīng)第三步(I)操作后的pH5. O和pHll. O液體培養(yǎng)物中，各選取其中發(fā)光良好的培養(yǎng)物，進(jìn)行交換轉(zhuǎn)接，即將PH5. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pHll. O液體培養(yǎng)基中，而將pHll. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pH5. O液體培養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)16小時 18小時，(3)另取十個平皿，在經(jīng)第三步(2)操作后的液體培養(yǎng)基中，分別選取pH5. O和pHll. O中發(fā)光良好的培養(yǎng)物為菌種，將選中的菌種分別劃線于平皿中，來源于pH5. O和pHll. O的各五個平皿，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，( 4 )取十個斜面試管，在經(jīng)第三步(3 )操作后的十個平皿中，各選取發(fā)光良好的單菌落，將每一個選中的單菌落各自轉(zhuǎn)接于所述的斜面試管中，共十支，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，選取其中發(fā)光良好的斜面試管6支，得到經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選的菌種，貯于4°C的冰禮備用，(5)第三步需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基與第一步和第二步需用的固體培養(yǎng)基完全相同，第三步需用液體培養(yǎng)基，該液體培養(yǎng)基的配方為，MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g，MgBr2 O. 09g, MgCl2O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0.122g，NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0.50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，溶于IOOOmL蒸餾水中，分別用檸檬酸和氨水調(diào)節(jié)它們的pH，得到pH值分別為PH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基，121°C滅菌20分鐘，固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基貯于4°C的冰箱備用；第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選采用兩種有代表性的毒物=HgCl2和苯酚，分別以倍增梯度濃度系列觀察淡水發(fā)光菌對上述毒物反應(yīng)的大小，以相對發(fā)光強(qiáng)度和EC50大小為衡量毒物抑制淡水發(fā)光菌的指標(biāo)，利用下式計算相對發(fā)光強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種青海弧菌Q67B，其特征在于，(1)形態(tài)特征該菌的菌體呈桿狀微彎，大小介于O.5 O. 7微米X1. 5 2微米，革蘭氏染色陰性，用利夫生鞭毛染色，觀察到單極生鞭毛似蝌蚪狀，細(xì)胞內(nèi)累積聚β_羥基丁酸；(2)生理生化特征該菌適于生長的溫度范圍和pH范圍分別為4°C 40°C和pH5 PH10，對弧菌抑制劑2，4- 二氨基-6，7- 二異丙基喋啶敏感，具有耐鹽、耐高滲透壓和低滲透壓的能力，能在介于質(zhì)量百分濃度0% 8%之間的NaCl溶液中生長和發(fā)光；(3)基因特征16SrDNA序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青?；【鶴67B，其特征在于，該菌最適于生長的溫度和pH值分別為25°C的和pH9.0。
3.一種分離篩選權(quán)利要求1所述的青海弧菌Q67B的方法，其特征在于，該菌經(jīng)過四個步驟，篩選得到第一步獲取淡水發(fā)光菌，從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌，經(jīng)分離純化，獲得淡水發(fā)光菌；第二步溫度適應(yīng)性篩選，在兩個不同的溫度下對第一步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行溫度適應(yīng)性篩選；第三步PH值適應(yīng)性篩選，在兩個不同的pH值下對第二步獲得的淡水發(fā)光菌進(jìn)行PH值適應(yīng)性篩選；第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選，用重金屬鹽和有機(jī)毒物對第三步獲得的淡水發(fā)光菌先后進(jìn)行兩次毒物反應(yīng)靈敏性篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法，其特征在于，所述的兩個不同的溫度是4°C和 40。。。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法，其特征在于，所述的兩個不同的pH值是 ρΗ5· O 和 pHll. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離篩選方法，其特征在于，所述的重金屬鹽和有機(jī)毒物分別是HgCl2和苯酚。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5或6所述的分離篩選方法，其特征在于，具體操作步驟第一步獲取淡水發(fā)光菌(1)取新鮮的青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚，截成小段，室溫下放置10小時 24小時， 在暗室內(nèi)檢視，在發(fā)綠色熒光的亮點處，用滅菌的接種針括取，劃線于培養(yǎng)皿內(nèi)，(2)將第一步(I)所述的培養(yǎng)皿置于暗室中，20°C培養(yǎng)10小時 18小時，從中挑取發(fā)光良好的單菌落，(3)對第一步(2)所述的單菌落進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)三 五次，取得單細(xì)胞純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于斜面試管，培養(yǎng)生長后得斜面菌種，即淡水發(fā)光菌，保存于4°C冰箱備用，(4)所述的培養(yǎng)皿和斜面試管內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基的配方為，MgSO4.2.47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2 O. 09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg(HCO3)2 0. 50g，酵母膏5g，胰胨5g，甘油3g，瓊脂20g，溶于IOOOmL蒸餾水中，ρΗ9· 0， 121°C滅菌20分鐘，貯于4°C的冰箱備用；第二步溫度適應(yīng)性篩選(1)將第一步(3)所得的斜面菌種，轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管，(2)將第二步(I)所述的斜面試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，檢查發(fā)光狀況，選出發(fā)光良好的菌支，(3)將第二步(2)選出的菌支分別轉(zhuǎn)接于五 十支斜面試管，(4)將第二步(3)所述的試管置于暗室中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，檢查發(fā)光狀況， 選出發(fā)光良好的菌支，(5)將第二步(4)選出的菌支分別劃線轉(zhuǎn)接于十個平皿，平分成兩組，為第I組和第II 組，分別于4°C和40°C培養(yǎng)16小時 18小時，(6)另取十個平皿，平分成兩組，為第III組和第IV組，每組五個平皿，暗室中挑取第I組的每一個平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第III組的五個平皿，暗室中挑取第II組的每一個平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于第IV組的五個平皿，將第III組和第IV組分別于40°C和4°C培養(yǎng)16小時 18小時，(7)另取十支斜面試管，分別對應(yīng)上述第III組和第IV組的每個平皿，將各平皿中發(fā)光良好的一個單菌落分別劃線轉(zhuǎn)接于十支對應(yīng)斜面試管中，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，(8)另取五支斜面試管，選取第二步(7)所述的十支斜面試管中發(fā)光良好的五個斜面， 分別轉(zhuǎn)接到五支斜面試管中，得到五支斜面菌種，保存于4°C冰箱內(nèi)備用，(9)所述的斜面試管和平皿內(nèi)需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基與上述的第一步需用的固體培養(yǎng)基完全相同，(10)經(jīng)第二步溫度適應(yīng)性篩選操作后所得的菌種，具有耐低溫4°C和耐高溫40°C的性第三步pH值適應(yīng)性篩選(1)取第二步的(8)所得的斜面菌種， 分別轉(zhuǎn)接于pH5.O和pHll. O的液體培養(yǎng)基中，各為五瓶，20°C振蕩培養(yǎng)16小時 18小時，(2)在經(jīng)第三步(I)操作后的pH5.O和pHl1. O液體培養(yǎng)物中，各選取其中發(fā)光良好的培養(yǎng)物，進(jìn)行交換轉(zhuǎn)接，即將pH5. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pHl1. O液體培養(yǎng)基中，而將pHll. O液體培養(yǎng)基中選中的菌種轉(zhuǎn)接于pH5. O液體培養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)16小時 18小時，(3)另取十個平皿，在經(jīng)第三步(2)操作后的液體培養(yǎng)基中，分別選取pH5.O和pHll. O 中發(fā)光良好的培養(yǎng)物為菌種，將選中的菌種分別劃線于平皿中，來源于pH5. O和pHll. O的各五個平皿，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，(4)取十個斜面試管，在經(jīng)第三步(3)操作后的十個平皿中，各選取發(fā)光良好的單菌落， 將每一個選中的單菌落各自轉(zhuǎn)接于所述的斜面試管中，共十支，20°C培養(yǎng)16小時 18小時，選取其中發(fā)光良好的斜面試管6支，得到經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選的菌種，貯于4°C的冰箱備用，(5)第三步需用固體培養(yǎng)基，該固體培養(yǎng)基與第一步和第二步需用的固體培養(yǎng)基完全相同，第三步需用液體培養(yǎng)基，該液體培養(yǎng)基的配方為，MgSO4 2. 47g, MgCO3 O. 79g, MgBr2O.09g, MgCl2 O. 109g, CaCO3 0. 103g, KCl 0. 122g, NaCl 8. 29g, Mg (HCO3) 2 0. 50g，酵母膏 5g，胰胨5g，3g，溶于IOOOmL蒸餾水中，分別用檸檬酸和氨水調(diào)節(jié)它們的pH，得到pH值分別為PH5. O和pHll. O的液體培養(yǎng)基，121°C滅菌20分鐘，固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基貯于 4°C的冰箱備用；第四步毒物反應(yīng)靈敏性篩選采用兩種有代表性的毒物=HgCl2和苯酚，分別以倍增梯度濃度系列觀察淡水發(fā)光菌對上述毒物反應(yīng)的大小，以相對發(fā)光強(qiáng)度和EC50大小為衡量毒物抑制淡水發(fā)光菌的指標(biāo),利用下式計算相對發(fā)光強(qiáng)度樣品發(fā)光強(qiáng)度相對發(fā)光強(qiáng)度(％)=對照發(fā)光強(qiáng)度X 100% [I],EC50指相對發(fā)光強(qiáng)度為50%時的毒物濃度，測光儀為上海植物生理研究所出品的生物和化學(xué)測光計，(1)取第三步(5)得到的6支菌種，分別經(jīng)二次斜面轉(zhuǎn)接活化后，分別用蒸餾水洗下菌苔，充分混勻后，分別得到6支淡水發(fā)光菌液，用發(fā)光檢測法評估它們對毒物的反應(yīng)，先評估它們對HgCl2的反應(yīng)，每次僅用I支淡水發(fā)光菌液，操作如下在8個測量杯中各加2ml HgCl2樣品，形成濃度梯度系列，每亇濃度設(shè)2個平行，空白對照用蒸餾水，也設(shè)2個平行，然后逐個加入所述的那支淡水發(fā)光菌液的菌液，使測量杯中的淡水發(fā)光菌濃度為5X107/ml，作用15分鐘，立即測定各測量的發(fā)光強(qiáng)度，最后以對照發(fā)光值作基準(zhǔn)，利用公式[I]計算相對發(fā)光強(qiáng)度，并推算出EC50值，其余5支作相同的操作， 用EC50值判斷上述的6支淡水發(fā)光菌對同一毒物的反應(yīng)能力，EC50值越小，表示該菌種的菌株的毒物反應(yīng)越靈敏，篩選得到對HgCl2反應(yīng)最為靈敏的菌種3株，分別制成斜面，進(jìn)行下述測試篩選，(2)取第四步(I)得到的3株菌種的斜面，分別經(jīng)二次斜面轉(zhuǎn)接活化后，分別用蒸餾水洗下菌苔，充分混勻后，分別得到3支淡水發(fā)光菌液，用發(fā)光檢測法評估它們對苯酚的反應(yīng)，每次僅用I支淡水發(fā)光菌液，操作如下在8個測量杯中各加2ml苯酚樣品，使形成濃度梯度系列，每亇濃度設(shè)2個平行，空白對照用蒸餾水，也設(shè)2個平行，然后向各測量杯內(nèi)逐個加入上述的那支淡水發(fā)光菌液，使測量杯中的淡水發(fā)光菌濃度為5X107/ml，作用15分鐘，立即測定各測量的發(fā)光強(qiáng)度，最后以對照發(fā)光值作基準(zhǔn)，利用公式[I]計算相對發(fā)光強(qiáng)度，并推算出EC50值，其余2支作相同的操作，比較上述檢測所得的3個EC50值，取EC50值最小的，與最小EC50值對應(yīng)的菌株就是分離篩選得到的青?；【鶴67B。
8.一種用權(quán)利要求1所述的青?；【鶴67B檢測毒物的生物毒性的方法，其特征在于， 具體操作步驟第一步菌液制備取青?；【鶴67B的菌種斜面I支，轉(zhuǎn)接于試管斜面上，20°C培養(yǎng)18 小時，再轉(zhuǎn)接一次，20°C培養(yǎng)18小時，發(fā)光明亮，用蒸餾水Iml 2ml洗下斜面上的菌苔，轉(zhuǎn)入燒杯，稀釋至光密度0D600為O. 03，得到菌液，立即用于以下操作；弟~■步被測樣品溶液制備若被測樣品為固體，用質(zhì)量百分濃度介于0% 8%的NaCl溶液配制濃度分別為O.1mg/ L、lmg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L的被測樣品溶液，若被測樣品為液體，用質(zhì)量百分濃度介于0% 8%的NaCl溶液稀釋成如下濃度梯度的被測樣品溶液100% (V/V)、75% (V/V)、 50% (V/V),25% (V/V),10% (V/V)；第三步發(fā)光檢測取測光儀的專用測量杯12個，將第二步所述的每種濃度的被測毒物溶液注入2個測量杯，注入量為2ml，在余下的2個測量杯，各注入2ml質(zhì)量百分濃度介于 0% 8%的NaCl溶液，作空白對照，為每個測量杯注入第一步制備的菌液，注入量為50μ 1， 15分鐘后，用測光儀測量各測量杯的發(fā)光強(qiáng)度，按下式計算各測量杯的相對發(fā)光強(qiáng)度樣品發(fā)光強(qiáng)度相對發(fā)光強(qiáng)度(％)= 對照發(fā)光強(qiáng)度X 100%;第四步得到被測毒物的EC50值以相對發(fā)光強(qiáng)度為縱座標(biāo)，被測樣品濃度為橫座標(biāo)， 將第三步的計算得到的相對發(fā)光強(qiáng)度分別記在各自的對應(yīng)的被測毒物溶液的濃度位點上， 找出的相對發(fā)光強(qiáng)度50%時對應(yīng)的被測毒物溶液的濃度，就是被測毒物的EC50值。
全文摘要
本發(fā)明涉及青?；【鶴67B(CCTCC NOM2010104)及其分離篩選和應(yīng)用，屬微生物學(xué)的發(fā)光細(xì)菌分離篩選和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，該菌是從青海省青海湖所產(chǎn)的青海鰉魚體表采集到的發(fā)光菌，經(jīng)分離純化，再經(jīng)溫度適應(yīng)性篩選，又經(jīng)pH值適應(yīng)性篩選，最后經(jīng)毒物反應(yīng)靈敏性篩選，得到的一種淡水發(fā)光菌。該菌在清潔水體中發(fā)光恒定，接觸到毒物，其發(fā)光強(qiáng)度會明顯衰減，據(jù)此可推定毒物的毒性大小及毒物的濃度。在用于地表水如內(nèi)陸河流湖泊、地下水及排放污水的毒性檢測時，可在10℃～37℃下進(jìn)行，無需調(diào)節(jié)水樣滲透壓和pH值，10～15分鐘內(nèi)就可判別水樣的毒性大小，快速、方便、靈敏。上述優(yōu)點是海洋發(fā)光菌所不具備的。
文檔編號C12R1/63GK103045524SQ20131001967
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者朱文杰 申請人:朱文杰