專利名稱：人cd22特異性抗體及其治療和診斷應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對B淋巴細胞抗原(CD22)的抗原決定簇具有特異性的抗體分子。本發(fā)明也涉及所述抗體分子的治療用途和制備所述抗體分子的方法。
背景技術：
在天然抗體分子中，有兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈和每條輕鏈在其N-末端有一個可變區(qū)。每個可變區(qū)由4個構架區(qū)(FR)和交互的3個互補性決定區(qū)(OTR)組成。通?？勺儏^(qū)的殘基按照Kabat等發(fā)明的系統(tǒng)編號。該系統(tǒng)是美國健康與人類服務部NIH USA的 Kabat 等于 1987 年在“Sequence of Proteins of Immunological Interest” 中提出(在下文簡稱為“Kabat等(參見上文)”)。除非另有說明，否則在本說明書中使用該編號系統(tǒng)。Kabat殘基命名經(jīng)常與氨基酸殘基的線性編號不一致。無論是構架區(qū)還是⑶R，實際的線性氨基酸序列可能比嚴格的Kabat編號含有較少或額外的氨基酸，這些較少或額外的氨基酸對應于基本可變區(qū)結構中截短的或插入的結構組分。對于給定的抗體，通過與具有“標準”Kabat編號序列的抗體序列中的同源殘基比對，可確定殘基的正確Kabat編號。根據(jù)Kabat編號，重鏈可變區(qū)的⑶R位于殘基31-35 (OTR-Hl)、殘基50-65 (⑶R-H2)和殘基 95-102 (CDR-H3)中。根據(jù)Kabat編號，輕鏈可變區(qū)的CDR位于殘基24-34 (CDR-Ll)、殘基50-56 (CDR-L2)和殘基 89-97 (CDR-L3)中。歐洲專利申請EP-A-0239400 描述了 Q)R移植抗體(Q)R-grafted antibody)的構建，該申請公開了一種其中使用長的寡核苷酸通過定點誘變將小鼠單克隆抗體的CDR移植到人免疫球蛋白可變區(qū)的構架區(qū)的方法。CDR決定抗體的抗原結合特異性并且是可變區(qū)的構架區(qū)上攜帶的相對短的肽序列。最早有關通過⑶R移植的人源化(humanising)單克隆抗體的工作,是在識別合成抗原例如NP的單克隆抗體上進行。然而，Verhoeyen等(Science，—，1534-1536，1988)和Riechmann等(Nature.332.323-324.1988)分別描述了其中通過CDR移植使識別溶菌酶的小鼠單克隆抗體和識別人T細胞上的抗原的大鼠單克隆抗體人源化的實例。Riechmann等發(fā)現(xiàn)在⑶R移植物中，單獨⑶R的轉移(如Kabat等定義(Kabat等(參見上文)和Wu等，J.Exp.Med.,132,211-250, 1970)不足以提供令人滿意的抗原結合活性。已發(fā)現(xiàn)許多構架殘基必須改變以便使它們與供體構架區(qū)的那些殘基相對應。國際專利申請?zhí)朩090/07861描述了用于選擇需要改變的構架殘基的建議標準。已公開了許多討論⑶R移植抗體的綜述,包括Vaughan等(Nature Biotechnology,16, 535-539，1998)。
惡性淋巴瘤是一類變化較多的腫瘤。大多數(shù)情況發(fā)生在老年人中。目前在美國有200，000位至250，000位患者患有非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkins Lymphoma) (NHL)。在美國該病是增長第二快的癌癥，以每年新增約55，000例的速度增加。該病的發(fā)生率增長已不能簡單地通過老齡人口增長和暴露在已知危險因素中來解釋。淋巴瘤的分類比較復雜，近十年已有進展。在1994年采用了修訂的歐洲-美國淋巴瘤(REAL)分類法。該分類法將B細胞淋巴瘤(最常認定的)、T細胞淋巴瘤和不能分類的原發(fā)性淋巴瘤歸入公認的亞型。在平常的實踐中，依據(jù)它們的一般組織學外觀而將NHL分為低度、中度和高度的分類法充分反映了它們的臨床特征。NHL主要影響淋巴結，但在個別患者中，腫瘤可累及其它解剖學部位，例如肝、脾、骨髓、肺、腸和皮膚。該疾病通常表現(xiàn)為無痛的淋巴結腫大。結外淋巴瘤(extranodallymphoma)最常見影響腸，盡管實際上每種器官的原發(fā)性淋巴瘤已有記載。全身癥狀包括發(fā)熱、盜汗、乏力和體重減輕。直到最近，完全根據(jù)疾病解剖學范圍的Ann Arbor分類系統(tǒng)成為NHL治療的主要決定因素。通過結合另外的預后指征，包括年齡、血清乳酸脫氫酶水平和表現(xiàn)情況，可提煉這些信息。即便如此，Ann.Arbor分類系統(tǒng)的知識與腫瘤的組織學和免疫學亞型一起仍然是治療的主要決定因素。低度NHL具有無痛的病程，患者平均存活8-10年。目前可采用的治療對存活幾乎沒有影響，盡管局部疾病的放療和全身癥狀的化療改善了患者的生活質(zhì)量。組合化療可預備用于復發(fā)的疾病。中度疾病和尤其高度疾病非常具有攻擊性并易于擴散。該級別的疾病需要緊急治療。在患有非常嚴重疾病的患者中，放射治療可為治療的有效組成。已采用許多不同的化療方案，并且可在超過一半的患者中獲得長期無病的幸存者。對于患有復發(fā)性或頑固性疾病的患者，最初采用干細胞支持的大劑量治療，但是現(xiàn)在在一線治療中逐漸發(fā)現(xiàn)一個空間用于患有低危險性疾病的患者。在近年，采用漸趨攻擊性治療方法的趨勢，必須平衡許多NHL患者中一般老年患者和相對體弱的患者，并且需要使治療毒性與每位患者疾病的個體預后相配。需要更有效并且更易耐受的改進的治療。最新采用的藥物包括逐漸加至組合中的新細胞毒性藥物，并采用基于抗體的治療。非霍奇金淋巴瘤包括各種各樣的B細胞淋巴瘤。因此，B細胞抗原是抗體治療的合適革巴。⑶22為135kDa膜糖蛋白，并且屬于稱為唾液酸粘附素的唾液酸結合蛋白家族。其在B細胞發(fā)育早期的細胞質(zhì)中檢測到，與IgD同時出現(xiàn)在細胞表面，并且存在于大多數(shù)成熟B細胞上。表達隨B細胞活化而增加。⑶22隨終末分化而喪失，一般報道在漿細胞上并不存在。因此，該內(nèi)化抗原存在于前B細胞和成熟B細胞的表面，而在干細胞或漿細胞上不存在。在人類中存在兩種⑶22同種型。其主要形式(⑶22 β )在胞外區(qū)含有7個免疫球蛋白樣(Ig樣)結構域。CD22ci變異體缺乏Ig樣結構域4并可具有截短的胞質(zhì)結構域。已表明阻斷CD22粘著至單核細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和紅細胞上的抗體在第I或第2Ig樣結構域內(nèi)結合。 一旦連接B細胞抗原受體并與Lyk、Syk和磷脂酰肌醇3_激酶締合，⑶22的胞質(zhì)結構域則酪氨酸被磷酸化。CD22的功能是負調(diào)節(jié)B細胞活化的閾值。它通過與帶有適當唾液酸糖綴合物(sialoglycoconjugates)的細胞相互作用也可介導細胞粘著。 ⑶22在包括NHL、急性成淋巴細胞性白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)和尤其是急性非淋巴細胞性白血病(ANLL)在內(nèi)的大多數(shù)B細胞白血病和淋巴瘤中表達?，F(xiàn)有技術已描述了抗⑶22的單克隆抗體。W098/41641描述了在VH44和VJOO上具有半胱氨酸殘基的重組抗⑶22抗體。W096/04925描述了抗⑶22抗體LL2的Vh區(qū)和\區(qū)。US5686072描述了抗CD22和抗CD19免疫毒素的組合。W098/42378描述了裸抗CD22抗體在治療B細胞惡性腫瘤中的用途。最近，許多基于抗體的療法或者被許可，例如Rituxan ( 一種未標記的⑶20特異性嵌合人Y I (+m Y IV區(qū)))，或者對該疾病正在進行臨床試驗。對臨床醫(yī)師和患者來說，這些依賴或者補體介導或者ADCC介導的B細胞的殺傷或放射性核素(例如131I或9°Y)的使用，已涉及到制備和使用的難題。需要治療NHL并且能反復使用并可容易而有效制備的抗體分子。也需要對CD22有高親和力而對人體有低免疫原性的抗體分子。

發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供一種對人C D22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區(qū)包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的重鏈，所述CDR具有如下給出的序列:對于 CDR-Hl 在圖1 中的 Hl (SEQ ID NO:1);對于 CDR-H2 在圖1 中的 Η2 (SEQ ID NO: 2)，或已去除潛在糖基化位點的Η2，或其中位置60 (根據(jù)Kabat編號系統(tǒng))的賴氨酸殘基已被其它氨基酸取代的Η2，或其中已去除糖基化位點和位置60的活性賴氨酸的Η2 ;或?qū)τ贑DR-H3 在圖1 中的 H3(SEQ ID NO:3)。本發(fā)明第一方面的抗體分子包含至少一個選自重鏈可變區(qū)的H1、H2和H3 (SEQ IDNO: 1、SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3)的CDR。優(yōu)選所述抗體分子在重鏈可變區(qū)包含至少兩個且更優(yōu)選所有這三個⑶R。本發(fā)明的第二方面，提供一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區(qū)包含CDR(如Kabat等定義(參見上文))的輕鏈，所述CDR具有如下給出的序列:對于 CDR-Ll 在圖1 中的 LI (SEQ ID NO:4)、對于 CDR-L2 在圖1 中的 L2(SEQ ID NO: 5)或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3 (SEQ ID NO:6) 本發(fā)明第二方面的抗體分子包含至少一個選自輕鏈可變區(qū)的L1、L2和L3 (SEQ IDNO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6)的CDR。優(yōu)選所述抗體分子在輕鏈可變區(qū)包含至少兩個且更優(yōu)選所有這三個⑶R。優(yōu)選本發(fā)明的第一和第二方面的抗體分子分別具有互補輕鏈或互補重鏈。優(yōu)選本發(fā)明的第一或第二方面的抗體分子包含其中可變區(qū)包含⑶R(如Kabat等定義(參見上文))的重鏈，所述CDR具有如下給出的序列:對于CDR-Hl在圖1中的Hl (SEQID N0:1)，對于CDR-H2在圖1中的H2(SEQ ID NO:2)、或已去除潛在糖基化位點的H2、或其中位置60(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng))的賴氨酸殘基已被其它氨基酸取代的H2、或其中已去除糖基化位點和位置60的活性賴氨酸的H2，或?qū)τ冖荝-H3在圖1中的H3 (SEQ ID NO: 3);和其中可變區(qū)包含CDR (如Kabat等定義(參見上文))的輕鏈，所述CDR具有如下給出的序列:對于 CDR-Ll 在圖1 中的 LI (SEQ ID NO:4)、對于 CDR-L2 在圖1 中的 L2(SEQ ID NO: 5)或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3 (SEQ ID NO:6) 上述SEQ ID NO: 1-6和圖1中給出的CDR源自小鼠單克隆抗體5/44。小鼠5/44抗體可變區(qū)的全序列示于圖2 (輕鏈)(SEQ ID NO: 7)和圖3 (重鏈)(SEQID N0:8)。該小鼠抗體在下面也被稱為“供體抗體”或“鼠單克隆抗體”。本發(fā)明的第一或第二方面的第一個可供選擇的優(yōu)選實施方案為具有分別如圖
2(SEQ ID NO: 7)和圖3(SEQ ID NO: 8)所示的輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列的小鼠單克隆抗體5/44。5/44的輕鏈恒定區(qū)為K，而重鏈恒定區(qū)為IgGl。在第二個可供選擇的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面中任一方面的抗體為嵌合小鼠/人抗體分子，在本文稱為嵌合5/44抗體分子。該嵌合抗體分子包含小鼠單克隆抗體5/44的可變區(qū)(SEQ ID N0:7和8)和人恒定區(qū)。優(yōu)選嵌合5/44抗體分子在輕鏈中包含人 C K 結構域(Hieter 等，Cell, 22, 197-207，1980 ；Genebank 登記號 J00241)并且在重鏈中包含人Y 4結構域(Flanagan等，Nature, MO, 709-713，1982)，任選位置241的絲氨酸殘基被脯氨酸殘基取代。優(yōu)選本發(fā)明的抗體包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2’的重鏈，其中已去除潛在的糖基化位點序列并且意想不到地提高了嵌合5/44抗體對⑶22抗原的親和力，并且優(yōu)選其作為⑶R-H2具有如H2’ (SEQ ID NO: 13)給出的序列。另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2”的重鏈，其中位置60的賴氨酸殘基被導致保守取代的其它氨基酸取代，所述賴氨酸殘基在⑶R-H2中處于暴露的位置并被認為有可能與綴合劑(conjugation agents)反應導致抗原的結合親和力降低。優(yōu)選⑶R-H2具有如H2”(SEQ ID NO: 15)給出的序列。

另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2”’的重鏈，其中潛在的糖基化位點序列和位置60的賴氨酸殘基被其它氨基酸所取代。優(yōu)選CDR-H2具有如H2”’ (SEQ ID NO: 16)給出的序列。在第三個可供選擇的優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的任一方面的抗體為CDR移植抗體分子。本文所用的術語“CDR移植抗體分子”是指其中重鏈和/或輕鏈含有一個或多個CDR(如果需要，可包括修飾CDR)的抗體分子，CDR來自移植到受體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)構架的供體抗體(例如鼠單克隆抗體)。優(yōu)選該類CDR移植抗體具有包含人受體構架區(qū)以及一個或多個上述供體CDR的可變區(qū)。當移植CDR時，可以使用任何合適的與CDR所來源的供體抗體類別/類型有關的受體可變區(qū)構架序列，包括鼠構架區(qū)、靈長類構架區(qū)和人構架區(qū)?？捎糜诒景l(fā)明的人構架的實例有 KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY 和 POM(Kabat 等(參見上文))。例如 KOL 和NEWM可用于重鏈，REI可用于輕鏈，EU、LAY和POM既可用于重鏈也可用于輕鏈?；蛘?，可以使用人種系序列。優(yōu)選的輕鏈的構架區(qū)為如圖5 (SEQ ID NO: 17)所示的人種系亞型序列(DPK9+JK1)。優(yōu)選的重鏈的構架區(qū)為如圖6(SEQ ID NO:21)所示的人亞型序列(DP7+JH4)。在本發(fā)明的CDR移植抗體中，優(yōu)選作為受體供體使用具有與供體抗體的鏈同源的鏈的抗體。受體重鏈和輕鏈不必源自同一抗體，并且如果需要可包含具有源自不同鏈的構架區(qū)的混合鏈。另外，在本發(fā)明的CDR移植抗體中，構架區(qū)不必具有與受體抗體的那些序列完全相同的序列。例如，罕見殘基可變?yōu)楦?jīng)常出現(xiàn)的該受體鏈類別或類型的殘基?；蛘?，可改變在受體構架區(qū)所選的殘基以便它們對應于在供體抗體的相同位置存在的殘基或?qū)谠诠w抗體的相同位置存在的殘基的保守取代的殘基。應最小限度的保持這些使供體抗體的親和力恢復必需的改變。在W091/09967中提出可能需要改變在受體構架區(qū)選擇殘基的方案。優(yōu)選在本發(fā)明的CDR移植抗體分子中，如果受體輕鏈具有人亞型DPK9+JK1序列(如圖2所示)(SEQ ID勵:17)，那么輕鏈的受體構架區(qū)在位置2、4、37、38、45和60包含供體殘基并可另外在位置3包含供體殘基(根據(jù)Kabat等(參見上文))。優(yōu)選在本發(fā)明的CDR移植抗體分子中，如果受體重鏈具有人DP7+JH4序列(如圖3所示)(SEQ ID勵:21)，那么重鏈的受體構架區(qū)在位置1、28、48、71和93包含除一個或多個供體⑶R外的供體殘基，并可另外在位置67和69包含供體殘基(根據(jù)Kabat等(參見上文))。供體殘基是來自供體抗體的殘基，即CDR最初來源的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗體包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義(參見上文))的H2’的重鏈，其中為提高嵌合5/44抗體對CD22抗原的親和力而去除潛在的糖基化位點序列，并優(yōu)選其作為⑶R-H2具有如H2’ (SEQ ID NO: 13)給出的序列。另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2”的重鏈，其中位置60的賴氨酸殘基被其它氨基酸所取代，所述賴氨酸殘基位于CDR-H2內(nèi)暴露的位置并認為其有可能與綴合劑反應，從而導致抗原結合親和力下降。優(yōu)選CDR-H2具有如H2” (SEQ ID NO: 15)給出的序列。另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為⑶R_H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2”’的重鏈，其中潛在的糖基化位點序列和位置60的賴氨酸殘基被其它氨基酸所取代。優(yōu)選CDR-H2具有如H2”’ (SEQ ID NO: 16)給出的序列。本發(fā)明的抗體分子可包含:具有全長重鏈和輕鏈的完全抗體分子；其片段，例如Fab、修飾的Fab、Fab’、F(ab’)2*Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；單鏈抗體,例如其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過肽接頭連接的單鏈Fv。同樣，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可與其它抗體結構域適當組合。本發(fā)明的抗體分子可具有連接其上的效應分子或報道分子。例如，用于螯合其可具有通過共價橋連結構連接其上的重金屬原子或毒素(例如蓖麻毒蛋白)的大環(huán)。或者，可采用重組DNA技術方法，制備其中完全免疫球蛋白分子的Fe片段(CH2區(qū)、CH3區(qū)和鉸鏈區(qū))、CH2區(qū)和CH3區(qū)或CH3區(qū)已被功能性非免疫球蛋白(例如酶或毒素分子)置換或者通過肽鍵與其連接的抗體分子。本發(fā)明抗體分子的結合親和力優(yōu)選至少0.85X ΙΟ,Μ、更優(yōu)選至少0.75Χ 10_1QM、最優(yōu)選至少0.δΧΙΟ,Μ。優(yōu)選本發(fā)明的抗體分子包含輕鏈可變區(qū)5/44-gLl(SEQ ID NO: 19)和重鏈可變區(qū)5/44-gH7 (SEQ ID N0:27)。這些輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列分別示于圖5和圖6。

本發(fā)明也涉及對CD22具有改進的親和力的本發(fā)明抗體分子的變異體。這些變異體可通過包括以下的許多親和力成熟方案獲得:CDR突變(Yang等，J.Mol.Biol..254.392-403, 1995)、鏈改組(Marks 等，Bio/Technology, K), 779-783，1992)、大腸桿菌(E.coli)增變株的應用(Low 等，J.Mol.Biol.，m 359-368，1996)、DNA 改組(Patten 等，Curr.0pin.Biotechnol, 8, 724-733，1997)、曬菌體展不(Thompson 等，J.Mol.Biol..256.77-88, 1996)和性 PCR(Crameri 等，Nature.391.288-291, 1998)。Vaughan 等(參見上文)討論了這些親和力成熟的方法。本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明抗體分子的重鏈和/或輕鏈的DNA序列。優(yōu)選所述DNA序列編碼本發(fā)明抗體分子的重鏈或輕鏈。本發(fā)明的DNA序列也可包含合成DNA(例如通過化學方法制備的合成DNA)、cDNA、基因組DNA或它們的任何組合。本發(fā)明也涉及包含一個或多個本發(fā)明DNA序列的克隆載體或表達載體。優(yōu)選所述克隆載體或表達載體包含兩種分別編碼本發(fā)明抗體分子的輕鏈和重鏈的DNA序列。

可以構建載體的常規(guī)方法、轉染方法和培養(yǎng)方法是本領域技術人員熟知的。在這一方面，可以參考 “Current Protocol in Molecular Biology”，1999，F(xiàn).M.Ausubel (編著)，Wileylnterscience,紐約以及 Cold Spring Harbor Publishing 出版的 ManiatisManual。通過本領域技術人員熟知的方法，可獲得編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列。例如，根據(jù)確定的DNA序列或根據(jù)相應的氨基酸序列，可按需要合成編碼部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列。編碼受體構架序列的DNA是本領域技術人員十分容易獲得的并可根據(jù)它們的已知氨基酸序列容易地合成。可以用標準分子生物學技術來制備編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列。采用寡核苷酸合成技術，可以完全或部分合成所需要的DNA序列。適當時，也可以使用定點誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)技術?？梢允褂萌魏魏线m的宿主細胞/載體系統(tǒng)來表達編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列。細菌(例如大腸桿菌)和其它微生物系統(tǒng)可部分用來表達Fab和F(ab’)2片段、尤其是Fv片段和單鏈抗體片段(例如單鏈Fv)等抗體片段。真核宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)表達系統(tǒng)可用于制備包括完全抗體分子在內(nèi)的較大抗體分子。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。本發(fā)明也提供一種制備本發(fā)明抗體分子的方法，所述方法包括:在適合導致由編碼本發(fā)明抗體分子的DNA表達蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)含有本發(fā)明載體的宿主細胞，然后分離所述抗體分子。所述抗體分子可以僅包含重鏈多肽或輕鏈多肽，在這種情況下，只需用重鏈多肽或輕鏈多肽編碼序列轉染宿主細胞。為制備既包含重鏈又包含輕鏈的產(chǎn)物，可以用兩種載體轉染細胞系，第一種載體編碼輕鏈多肽，而第二種載體編碼重鏈多肽。或者，可以使用一種載體，該載體包括編碼輕鏈多肽和重鏈多肽的序列。本發(fā)明也提供一種治療或診斷組合物，所述組合物包含本發(fā)明的抗體分子以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。本發(fā)明也提供一種制備治療或診斷組合物的方法，所述方法包括將本發(fā)明的抗體分子與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體混合在一起。在所述治療或診斷組合物中，所述抗體分子可以是唯一的活性成分，或者可以同時包含其它活性成分，包括其它抗體成分(例如抗T細胞、抗IFN Y或抗LPS抗體)或者非抗體成分(例如黃嘌呤)。優(yōu)選所述藥用組合物包含治療有效量的本發(fā)明的抗體。本文所用的術語“治療有效量”是指治療、改善或預防目標疾病或病癥或者表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果需要的治療藥物的量。就任何抗體而言，開始在細胞培養(yǎng)測定或在動物模型(通常用嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物)階段可估算出治療有效劑量。也可以使用動物模型確定合適的濃度范圍和給藥途徑。然后可利用這些資料確定用于人的有效劑量和給藥途徑。用于人患者的準確的有效量將取決于疾病狀態(tài)的嚴重程度、患者的一般健康情況、年齡、體重和性別、飲食、給藥時間和頻率、聯(lián)合用藥、反應靈敏度和耐受性/對治療的反應。該有效量可通過常規(guī)實驗方法確定并且在臨床醫(yī)師的判斷范圍之內(nèi)。一般而言，有效劑量為 0.01mg/kg 至 50mg/kg,優(yōu)選 0.lmg/kg 至 20mg/kg,更優(yōu)選約 15mg/kg。組合物可單獨給予患者或與其它藥劑、藥物或激素聯(lián)合給藥。本發(fā)明的抗體分子給予的劑量取決于待治療病癥的性質(zhì)、惡性淋巴瘤或白血病的分級以及抗體分子是用于預防還是用于治療現(xiàn)有的病癥。給藥頻率將取決于抗體分子的半壽期及其作用持續(xù)時間。如果抗體分子的半壽期短(例如2-10小時)，則可能需要每天給予I個或多個劑量。另一方面，如果抗體分子的半壽期長(例如2-15天)，則可能只需要每天、每周、甚至每I或2個月給予I個劑量。藥用組合物也可含有用于抗體給藥的藥學上可接受的載體。所述載體自身不應該誘導對接受組合物的個體有害的抗體產(chǎn)生并且不應該有毒。合適的載體可以為大的代謝慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒顆粒。 可以使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽(如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽)或有機酸鹽(如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽)。治療組合物中的藥學上可接受的載體可另外含水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另夕卜，在這些組合物中可以含有潤濕劑、乳化劑或pH緩沖物質(zhì)等輔料。這些載體能使藥用組合物配制成供患者攝取的片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑和混懸劑。優(yōu)選的給藥形式包括例如經(jīng)注射或輸注等適合腸胃外給藥的形式，例如經(jīng)快速濃注或連續(xù)輸注。其中當產(chǎn)品用于注射或輸注時，可采用混懸劑、溶液劑或在油性或水性介質(zhì)中的乳劑形式并且可含配方劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，抗體分子可為臨用前用合適的無菌液體重建的干品形式。一旦配成，本發(fā)明的組合物可直接給予患者。待治療的患者可以為動物。然而，優(yōu)選組合物適合給予人患者。可經(jīng)以下的任何途徑給予本發(fā)明的藥用組合物，包括但不限于口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮、經(jīng)皮(例如參見W098/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。也可以使用Hypospray給予本發(fā)明的藥用組合物。這些治療組合物一般可配制成為液體溶液劑或混懸劑的可注射形式。適用于液體溶媒中的溶液劑或混懸劑的固體形式，也可在注射前配制。組合物的直接給藥一般通過注射、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)、或給予組織細胞間隙來實現(xiàn)。也可將組合物給至損傷部位。給藥治療可為單劑量方案或多劑量方案?？衫斫鉃樗鼋M合物中的活性成分為抗體分子。這樣，它在胃腸道內(nèi)容易降解。因此，如果組合物通過采用胃腸道的途徑給藥，該組合物將需要含有保護抗體免受降解的試齊 ，但是一旦被胃腸道吸收，它會釋放抗體。在 RemingtonJ s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,NJ, 1991)中詳細討論了藥學上可接受的載體。也設想可通過采用基因治療來給予本發(fā)明的抗體。為實現(xiàn)這一點，將編碼所述抗體分子的重鏈和輕鏈且處于合適的DNA組分控制之下的DNA序列引入患者體內(nèi)，以便抗體鏈由所述DNA序列表達并且在原位裝配。本發(fā)明也提供用于治療由表達⑶22的細胞介導的疾病的本發(fā)明抗體分子。本發(fā)明還提供本發(fā)明抗體分子在制備用于治療由表達CD22的細胞介導的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的抗體分子可用于其中需要降低表達存在于人或動物體內(nèi)的CD22的細胞水平的任何療法。這些表達⑶22的細胞可在體內(nèi)循環(huán)或以不需要的高水平集中位于體內(nèi)特殊部位。例如，在B細胞淋巴瘤和白血病中，表達CD22的細胞水平升高。本發(fā)明的抗體分子可用于治療由表達CD22的細胞介導的疾病。
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優(yōu)選本發(fā)明的抗體分子用于惡性淋巴瘤和白血病、最優(yōu)選用于治療NHL。本發(fā)明也提供一種治療患有表達CD22的細胞介導的疾病或處于這些疾病危險之中的人或動物患者的方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明的抗體分子給予所述患者。本發(fā)明的抗體分子也可用于診斷，例如用于涉及表達CD22的細胞的疾病狀態(tài)的體內(nèi)診斷和成象。


僅通過以下實施例并參考以下的

進一步描述本發(fā)明，其中:圖1表示小鼠單克隆抗體5/44的⑶R的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1-6)；圖2表示小鼠單克隆抗體5/44輕鏈可變區(qū)的全序列；圖3表示小鼠單克隆抗體5/44重鏈可變區(qū)的全序列；圖4表示CDR-H2中的糖基化位點和活性賴氨酸的去除策略；圖5表示5/44輕鏈序列的移植設計；其中DPK-9是人種系受體構架序列。垂直線表示在鼠源殘基和人源殘基之間存在不同。下劃線的序列表示保留在移植物中的供體殘基。⑶R以藍色表示(對于DPK-9未顯示)。移植物gLl有6個供體構架殘基，gL2有7個。圖6表示5/44重鏈序列的移植設計；其中DP7是人種系受體構架序列。垂直線表示在鼠源殘基和人源殘基之間存在不同。下劃線的序列表示保留在移植物中的供體殘基。⑶R以藍色表示(對于DP7未顯示)。移植物gH4和gH6有6個供體構架殘基，移植物gH5和gH7有4個。圖7 表示載體 pMRR14 和 pMRRl0.1 ；圖8表示嵌合5/44突變體的Biacore測定結果；
圖9表示用于5/44gHl和gLl基因裝配的寡核苷酸；圖10 表示中間載體 pCR2.1 (544gHl)和 pCR2.1 (544gLl)；圖11表示用于制備其它移植物的寡核苷酸盒；圖12表不突光標記的小鼠5/44抗體和移植變異體之間的競爭測定；和圖13表示移植重鏈和移植輕鏈的全部DNA序列和蛋白質(zhì)序列。
具體實施例方式實施例1:各代候選抗體一系列的抗CD22抗體是采用以下的選擇標準從雜交瘤中選出的 與Daudi細胞結合，在Daudi細胞上內(nèi)化，與外周血單核細胞(PBMC)結合，在PBMC上內(nèi)化，親和力(大于10_9M)，小鼠Y I和產(chǎn)率。5/44是作為優(yōu)選的抗體而被選出的。
_4] 實施例2:嵌合5/44抗體分子的基因克隆和表達5/44雜交瘤細胞的制備及其RNA制備雜交瘤5/44是用人⑶22蛋白免疫小鼠后通過常規(guī)雜交瘤技術產(chǎn)生的。RNA是采用RNEasy試劑盒(Qiagen, Crawley, UK ;目錄號74106)從5/44雜交瘤細胞制備的。如下所述，將所獲得的RNA逆轉錄成cDNA。⑶22在NHL腫瘤上的分布使用5/44抗⑶22單克隆抗體進行免疫組織化學研究，來檢查染色的發(fā)生率和分布。在該項研究中包括對照抗CD20抗體和抗CD79a抗體，以確定腫瘤的B細胞區(qū)。共研究了 50個腫瘤,并且采用Working Formulation和REAL分類系統(tǒng)將這些腫瘤如下分類:.7個B成淋巴細胞性白血病/淋巴瘤(高/I).4個B-CLL/小淋巴細胞性淋巴瘤(低/A).3個淋巴衆(zhòng)細胞樣瘤(Iymphoplasmacytoid)/免疫細胞瘤(低/A).I個外套細胞淋巴瘤(中/F).14個濾泡性中心細胞淋巴瘤(低至中/D).13個彌散性大細胞淋巴瘤(中至高/G，H).6個不能分類的淋巴瘤(K).2個T細胞淋巴瘤用0.1 μ g/ml的5/44抗體，有40個B細胞淋巴瘤對⑶22抗原呈陽性，并且當將濃度提高至0.5 μ g/ml時，又有6個呈陽性。對于剩下的2個B細胞瘤來說，在0.1 μ g/ml時呈陰性，剩余的組織不足以用較高濃度測試。然而，用另一種Celltech抗⑶22抗體6/13進行的平行試驗給出比5/44更強的染色，結果所有48個B細胞淋巴瘤對CD22的染色呈陽性。因此，可以推斷⑶22抗原在B細胞淋巴瘤上廣泛表達并因此為NHL的免疫療法提供了一個合適的靶。5/44Vh 和 Vl 的 PCR 克隆使用逆轉錄酶合成編碼5/44重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，產(chǎn)生存在于總RNA中的mRNA的單鏈cDNA拷貝。然后采用特定的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用cDNA為模板用于擴增鼠V區(qū)序列。a)cDNA 合成在含有以下試劑的20μ I反應體積中合成cDNA:50mM Tris-HCl (pH8.3)、75mMKCl、10mM二硫蘇糖醇、3mM MgCl2、脫氧核糖核苷三磷酸各0.5mM、20單位RNAsin、75ng隨機六核苷酸引物、2 μ g5/44RNA和200單位莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶。42°C保溫60分鐘后，通過95°C加熱5分鐘終止該反應。b)PCR使用對重鏈和輕鏈具有特異性的引物組合，將cDNA的等分樣品進行PCR。將設計成與信號肽的保守序列一起退火的簡 并引物庫用作正向引物。所有這些序列都依次含有一個自其5’端7個核苷酸開始的限制位點SfuI; Vh HindIII)、使所獲得的mRNA最佳翻譯的序列GCCGCCACC(SEQ ID N0:50)、一個起始密碼子和基于已知小鼠抗體的前導肽序列的20-30 個核苷酸(Kabat 等，Sequence of proteins of immunological interest,第 5 版，1991, U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, NationalInstitutes of Health (美國健康與人類服務部,公共健康服務，國家健康協(xié)會))。將3’引物設計成跨越該抗體的構架4J-C接點并含有酶BsiWI的限制位點，以使VJ3CR片段的克隆容易進行。重鏈3’引物為設計成跨越該抗體J-C接點的混合物。該3’引物包括ApaI限制位點，以使克隆容易進行。該引物的3’區(qū)含有基于在已知的小鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的那些序列的混合序列(Kabat等，1991，參見上文)上述引物組合能使VdP'的PCR產(chǎn)物直接克隆到合適的表達載體中(參見下文)，從而制備嵌合(小鼠-人)重鏈和輕鏈，并用于這些在哺乳動物細胞中表達的基因制備所需同種型的嵌合抗體。按以下方法進行用于PCR的保溫(100 μ I):每份反應物含有IOmMTris-HCl (pH8.3)、1.5mM MgCl2,50mM KC1、0.01%w/v 明膠、脫氧核糖核苷三磷酸各 0.25mM、10pmole5’引物混合物、10pmole3’引物、I μ I cDNA和I單位Taq聚合酶。將反應物在95°C保溫5分鐘然后經(jīng)過以下循環(huán):94°C I分鐘、55°C I分鐘和72°C I分鐘。30個循環(huán)后，通過瓊脂糖凝膠電泳分析每份反應物的等分樣品。對于重鏈V區(qū)來講，擴增的DNA產(chǎn)物只有當在構架I的起始位點內(nèi)退火的引物庫取代信號肽引物庫時才能獲得。將片段克隆到DNA測序載體中。測定DNA序列并翻譯以給出推導出的氨基酸序列。該推導出的序列可通過參照通過實驗確定的N端蛋白質(zhì)序列來證實。圖2和圖3分別表示小鼠單克隆抗體5/44的成熟輕鏈V區(qū)和重鏈V區(qū)的DNA/蛋白質(zhì)序列。c) PCR片段的分子克隆然后將鼠V區(qū)序列克隆到表達載體pMRRl0.1和pMRR14(圖7)中。這些是用于分別含有編碼人K輕鏈和人Y-4重鏈恒定區(qū)的DNA的輕鏈和重鏈表達的載體。使用SfuI和BsiffI限制位點，通過限制性消化并與測序載體連接，將所述\區(qū)亞克隆到表達載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRRlO (544cL)。使用5’引物通過PCR擴增重鏈DNA引入信號肽，由于這在所述克隆策略一使用來自不同的近交(in-house)雜交瘤(稱為162)的小鼠重鏈抗體前導序列并沒有獲得。該 5’引物具有以下的序列:5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’ (SEQ ID NO:51)。
反向引物與用于最初的乂11基因克隆的引物相同。將所得PCR產(chǎn)物用酶HindIII和ApaI消化，然后將其亞克隆，并確證其DNA序列，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRR14(544cH)。將這兩種表達載體瞬時共轉染到CHO細胞中，產(chǎn)生嵌合c5/44抗體。按照生產(chǎn)商的方案(In Vitrogen: LifeTechnology, Groningen, The Netherlands.目錄號 11668-027),使用 Lipofectamine 試劑，完成這一步。糖基化位點和活性賴氨酸的去除在CDR-H2中觀察到一個潛在的N-聯(lián)糖基化位點序列，該序列具有氨基酸序列N-Y-T (圖3)。對5/44及其片段(包括Fab)進行的SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡法和凝膠糖染色法表明該位點的確糖基化(未顯示)。另外，在CDR-H2內(nèi)暴露的位置觀察到賴氨酸殘基，其通過提供與可以綴合抗體的試劑綴合的額外位點，有可能降低所述抗體的結合親和力。一個PCR策略是用于在CDR-H2序列中引入氨基酸取代，以去除糖基化位點和/或活性賴氨酸，如圖4所示。使用編碼突變N55Q、T57A或T57V的正向引物來去除所述糖基化位點(圖4)，并產(chǎn)生含有取代K60R的第4個正向引物，以去除所述活性賴氨酸殘基(圖
4)。在這些PCR擴增的每一個中都使用構架4反向引物。PCR產(chǎn)物用酶XbaI和ApaI消化并插入到pMRR14(544cH)(也 用XbaI和ApaI切割)中，產(chǎn)生編碼這些突變體的表達質(zhì)粒。N55Q、T57A和T57V突變通過遠離共有序列N-X-T/S處改變氨基酸序列可去除所述糖基化位點，同時K60R突變導致潛在的活性賴氨酸被帶同樣正電荷的殘基精氨酸取代。將所得cH變異質(zhì)粒與CL質(zhì)粒一起共轉染，產(chǎn)生已表達嵌合抗體變異體。嵌合基因活性的評價瞬時轉染到CHO細胞后，對所得嵌合基因的活性進行評價。c)通過BiaCore分析測定親和力常數(shù)采用BIA技術，對嵌合5/44或其變異體與CD22-mFc構建體結合的親和力進行研究，其中所述嵌合5/44或其變異體的糖基化位點或活性賴氨酸已被去除。結果示于圖8。所有結合測定都在BIAcore 2000儀器(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,瑞典)中進行。通過固定化抗小鼠Fe捕獲⑶22mFc，進行該項測定。該抗體存在于可溶相中。將樣品、標準品和對照(50μ1)注射到固定化抗小鼠Fe上，然后注射到可溶相中的抗體上。每個循環(huán)之后，所述表面用50 μ I的40mM HCl以30 μ 1/min再生。運用BIAevaluation3.1軟件(Pharmacia),進行動力學分析。與嵌合5/44相比，構建體T57A中糖基化位點的去除導致締合速率(on-rate)稍微加快而解離速率(off-rate)顯著減慢，得到的親和力改進約為5倍。N55Q突變對親和力沒有影響。該結果是意想不到的，因為這表明糖本身的去除對結合沒有明顯的影響(如同N55Q改變一樣)。僅在T57A改中中觀察到改進的親和力。一種可能的解釋是，無論是否存在糖，位置57的蘇氨酸對結合都產(chǎn)生負面影響，所述結合在蘇氨酸轉變成丙氨酸時去除。丙氨酸較小是重要的并且蘇氨酸的負面影響與其大小有關的假設，可以從使用T57V突變得到的結果得到支持:57位被纈氨酸取代并不好(結果未顯示)。通過K60R突變?nèi)コ嚢彼釋τH和力無影響，即引入精氨酸消除了潛在的活性位點而不影響親和力。因此，用于去除糖基化位點和用于去除活性賴氨酸的突變均包括在人源化設計中。
實施例2:5/44的CDR移棺上面已經(jīng)描述了 5/44抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的分子克隆及其制備嵌合(小鼠/人)5/44抗體的用途。小鼠5/44'區(qū)和Vh區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列分別示于圖2和圖3(SEQ ID N0:7和SEQ ID NO: 8) 按照Adair等(W091/09967)的方法，本實施例描述了將5/44抗體CDR移植到人構架上，以降低人體內(nèi)的可能免疫原性。5/44輕鏈的CDR移植蛋白質(zhì)序列與來自人亞型I K輕鏈V區(qū)的共有序列比對表明有64%序列同一性。因此，為構建CDR移植輕鏈，所選的受體構架區(qū)對應于人VK亞型I種系012，DPK9序列的那些序列。構架4受體序列來源于人J區(qū)種系序列JKl。鼠5/44構架區(qū)的氨基酸序列與受體序列的比較在圖5給出，并顯示在供體鏈和受體鏈之間有27處不同。在每個位置，對鼠源殘基通過對堆積(packing)或在VH/\界面產(chǎn)生影響而直接或間接對抗原結合產(chǎn)生貢獻的可能性進行分析。如果認為一個鼠源殘基重要并且與人源殘基在大小、極性或電荷方面明顯不同，那么就該保留鼠源殘基。基于此分析，構建了兩種具有SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20 (圖5)給出的序列的CDR移植輕鏈。5/44重鏈的CDR移植米用與用于輕鏈描述的方案相同的策略，完成5/44重鏈的CDR移植。發(fā)現(xiàn)5/44重鏈的V區(qū)與屬于亞型I的人重鏈同源(70%序列同一性)，因此用人亞型I種系構架VH1-3, DP7的序列作為受體構架。構架4受體序列來源于人J區(qū)種系序列JH4。5/44重鏈與構架區(qū)的比較示于圖6，其中可以發(fā)現(xiàn)5/44重鏈與受體序列在位置22不同。分析這些序列中的任何序列可能對抗原結合的貢獻，從而構建了 5種具有以下給定序列的 CDR 移植重 鏈:SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID N0:26 和 SEQID N0:27(圖 6)。用于移植序列的基因的構建將基因設計成編碼移植序列gHl和gLl，并設計和構建系列重疊寡核苷酸(圖9)。采用PCR裝配技術來構建⑶R移植V區(qū)基因。配制100 μ I含有以下組分的反應體積:10mMTris-HCl (pH8.3)、1.5mMMgCl2、50mM KC1、0.001% 明膠、脫氧核糖核苷三磷酸各 0.25mM、“內(nèi)部”引物(T1、T2、T3、B1、B2、B3)各 lpmole、“外部”引物(FURl)各 IOpmole 和 I 單位 Taq聚合酶(AmpliTaq, Applied BioSystems,目錄號 N808-0171)。PCR 循環(huán)參數(shù)為 94°C I 分鐘、55°C I分鐘和72°C I分鐘，30個循環(huán)。然后將反應產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，切下電泳條帶，使用QIAGEN離心柱(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄號28706)進行回收。用30 μ I體積洗脫DNA。然后按照生產(chǎn)商的說明，將gHl和gLIDNA的等分樣品(I μ I)克隆到InVitrogen TOPO TA克隆載體pCR2.1Τ0Ρ0(目錄號K4500-01)中。該非表達載體用作克隆中間體，以便于對大量克隆進行測序。使用載體特異性引物，通過DNA測序來鑒定含有gHl 和 gLl 的正確克隆，產(chǎn)生質(zhì)粒 pCR2.1 (544gHl)和 pCR2.1 (544gLl)(圖 10)。使用寡核苷酸盒置換法來產(chǎn)生人源化移植物gH4、gH5、gH6和gH7以及gL2。圖11表示寡核苷酸盒的設計。為構建每種變異體，用所示的限制性酶(對于重鏈而言為XmaI/SacII，對于輕鏈而言為 Xmal/BstEII)切下載體(pCR2.1 (544gHl)或 pCR2.l(544gLl))。將大載體片段用瓊脂糖凝膠電泳純化并用于與寡核苷酸盒連接。這些盒由2種互補寡核苷酸(如圖 11 所示)組成，在 200 μ I 體積(12.5mM Tris-HCl (ρΗ7.5)、2.5mM MgCl2,25mM NaCl,0.25mM 二硫赤蘚糖醇)中以0.5pmole/ μ I的濃度混合。通過在水浴(500ml體積)中加熱至95°C達3分鐘，然后讓反應物慢慢冷卻至室溫，完成退火。將已退火的寡核苷酸盒用水稀釋10倍，然后將其連接到合適的切割載體中。用DNA測序來證實正確的序列，產(chǎn)生質(zhì)粒PCR2.1 (5/44-gH4-7)和pCR2.1 (5/44_gL2)。然后將這些經(jīng)證實的移植序列亞克隆到表達載體pMRR14 (重鏈)和pMRl0.1 (輕鏈)中。⑶R移植序列的⑶22結合活性在各種組合中，將編碼移植變異體的載體與原始嵌合抗體鏈一起共轉染到CHO細胞中。在競爭測定中，比較原始小鼠5/44抗體的結合對與Ramos細胞(得自ATCC，一種表達表面CD22的伯基特淋巴瘤成淋巴細胞性人細胞系)結合的競爭的結合活性。該測定被認為是比較移植物與細胞表面CD22結合的能力的最佳方法。結果示于圖8。正如所見到的，在任何移植物之間存在非常小的差異，在競爭抗鼠親代方面所有都表現(xiàn)出比嵌合體更有效。在⑶R_H3(gH5和gH7)末端引入3個額外的人源殘基并不會明顯影響結合。選擇與最少數(shù)量的鼠源殘基結合的移植物即gLlgH7。輕鏈移植物gLl有6個供體殘基。殘基V2、V4、L37和Q45是潛在的重要堆積殘基。殘基H38位于VH/\界面。殘基D60為靠近⑶R-L2的表面殘基并且可直接對抗原結合作出貢獻。這些殘基中，V2、L37、Q45和D60存在于來自其它亞型的人K基因的種系序列。重鏈移植物gH7有4個供體構架殘基(根據(jù)CDR移植中使用的結構定義(參見Adair等(1991，W091/09967)，殘基R28被認為是⑶R-Hl的一部分)。殘基El和A71為靠近⑶R的表面殘基。殘基148為潛在的堆積殘基。殘基T93存在于VH/\界面。這些殘基中，El和A71存在于人亞型I的其它種系基因中。殘基148存在于人種系亞型4中，而 T73存在于人種系亞型3中。輕鏈和重鏈兩者的全部DNA序列和蛋白質(zhì)序列，包括由載體提供的恒定區(qū)基因內(nèi)的內(nèi)含子的大致位置，如圖13所示，并分別在SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:28中給出(對于輕鏈)以及分別在SEQ ID N0:31和SEQ ID N0:30中給出(對于重鏈)。從這些載體中切下編碼這些輕鏈和重鏈基因的DNA。重鏈DNA在5’HindIII位點消化，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段處理，產(chǎn)生5’平端。在3’ EcoRI位點切害I]，產(chǎn)生重鏈片段，然后通過瓊脂糖凝膠純化。同樣，產(chǎn)生輕鏈片段，在5’ SfuI位點平端化并用3’ EcoRI位點。將這兩個片段克隆到基于DHFR的表達載體中并用來在CHO細胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系。
權利要求
1.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區(qū)包含CDR的重鏈，所述⑶R具有如下給出的序列中的至少一種:對于⑶R-Hl在圖1中的Hl (SEQ IDNO:1);對于 CDR-H2 在圖1 中的 H2 (SEQ ID 勵:2)，或!12’ (SEQ ID NO: 13)或 H2”(SEQ IDNO: 15)或 H2”’ (SEQ ID NO: 16);或?qū)τ?CDR-H3 在圖1 中的 H3(SEQ ID NO: 3)。
2.一種對人CD22具有特異性的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區(qū)包含CDR的輕鏈，所述⑶R具有如下給出的序列中的至少一種:對于⑶R-Ll在圖1中的LI (SEQ IDN0:4)、對于 CDR-L2 在圖1 中的 L2(SEQ ID NO: 5)或?qū)τ?CDR-L3 在圖1 中的 L3 (SEQ IDNO:6)。
3.權利要求1或2的抗體分子，所述抗體分子包含其中可變區(qū)包含⑶R的重鏈，所述CDR具有以下給出的序列中的至少一種:⑶R-Hl的SEQ ID NO:1，CDR-H2的SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16，或 CDR-H3 的 SEQ ID NO: 3;和其中可變區(qū)包含⑶R的輕鏈，所述⑶R具有以下給出的序列中的至少一種ADR-Ll的SEQ ID NO:4,CDR-L2 的 SEQ ID NO:5 或 CDR-L3 的 SEQ ID NO:6。
4.權利要求3的抗體分子，所述抗體分子包含⑶R-Hl的SEQID NO:1 ;CDR_H2的SEQ IDNO:2 或 SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 ;CDR_H3 的 SEQ ID NO:3 ;CDR_L1的 SEQ ID NO:4 ;CDR-L2 的 SEQ ID NO:5 ;和 CDR-L3 的 SEQ ID NO:6。
5.權利要求1-4中任 一項的抗體分子，所述抗體分子是CDR移植抗體分子。
6.權利要求5的抗體分子，其中所述可變區(qū)包含人受體構架區(qū)和非人類供體CDR。
7.權利要求6的抗體分子，其中所述重鏈可變區(qū)的人受體構架區(qū)基于人亞型I共有序列并且在位置1、28、48、71和93包含供體殘基，所述供體殘基對應于SEQ ID NO:8中這些位置的殘基。
8.權利要求7的抗體分子，所述抗體分子還在位置67和69包含供體殘基，所述供體殘基對應于SEQ ID N0:8中這些位置的殘基。
9.權利要求6-8中任一項的抗體分子，其中所述輕鏈可變區(qū)的人受體構架區(qū)基于人亞型I共有序列并且在位置2、4、37、38、45和60包含供體殘基，所述供體殘基對應于SEQ IDNO:7中這些位置的殘基。
10.權利要求9的抗體分子，所述抗體分子還在位置3包含供體殘基，所述供體殘基對應于SEQ ID NO:7中該位置的殘基。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有至少一個CDR的抗體分子，所述CDR源自對人CD22具有特異性的小鼠單克隆抗體。本發(fā)明也公開了一種其中所述CDR中至少一個為修飾CDR的CDR移植抗體。本發(fā)明還公開了編碼所述抗體分子的鏈的DNA序列、載體、轉化宿主細胞以及所述抗體分子在治療由表達CD22的細胞介導的疾病中的用途。
文檔編號C12N15/13GK103172742SQ20131002128
公開日2013年6月26日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權日2002年5月2日
發(fā)明者A.G.波普勒維爾, S.P.蒂克爾, H.M.拉迪曼 申請人:Ucb 制藥公司