專利名稱：一種利用固定化擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株擬無枝酸菌(Amycolatopsissp. ) zhp06,即 CCTCC NO M2011265 的固定化，及其轉(zhuǎn)化阿魏酸制備香草醛的生物轉(zhuǎn)化方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香草醛(3-甲氧基-4-羥基苯甲醛)又名香蘭素，香茅醛，相對分子質(zhì)量152. 15，白色至微黃色針狀或粉末狀結(jié)晶，是香莢蘭的主要成分，主要應(yīng)用于食品、飲料、香料、醫(yī)藥、 皮革、電鍍和藥物等行業(yè)中。
香草醛的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，其主要來源是由石油化工產(chǎn)品愈創(chuàng)木酚、 木質(zhì)素等的化學(xué)合成，這種方法合成的香草醛不僅香型單一，而且合成過程中環(huán)境污染較嚴(yán)重，人們對安全性的擔(dān)憂日益增加；香草醛的另一種生產(chǎn)方法是植物提取法，每年從香草蘭豆莢中提取的天然香草醛只有4ot，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足人們的的需求(每年ieooot);因此，微生物香草醛的研究應(yīng)運(yùn)而生。微生物香草醛生產(chǎn)過程是環(huán)境友好型，已經(jīng)得到歐洲立法的承認(rèn)(EEC Nol334/2008)。
在微生物合成香草醛中前體物質(zhì)有很多，如香草醇、香草胺、松柏醇、藜蘆醇、阿魏酸、香草酸、丁香酚和異丁香酚等，其中阿魏酸為前體合成香草醛最受關(guān)注，并安全性受到認(rèn)可。法國的Lesage-Meessen等人最先采用兩步法,即利用黑曲霉先將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草酸，再由朱紅密孔菌進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成香草醛，其香草醛的濃度為O. 237g/L ;周慶禮等人篩選的鏈霉菌一步轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛，流加兩次底物，產(chǎn)量為7. 12g/L ;許平等人利用鏈霉菌通過發(fā)酵過程添加樹脂，使轉(zhuǎn)化的產(chǎn)量最高達(dá)到19. 2g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率54. 45% ;意大利的 Diana DiGioia等利用假單胞菌轉(zhuǎn)化阿魏酸到香草醛最高產(chǎn)量為1. 27g/L，意大利同一研究團(tuán)隊(duì)還研究了大腸桿菌工程菌生產(chǎn)香草醛，產(chǎn)量達(dá)到2. 52g/L。但是這些轉(zhuǎn)化過程周期長， 生產(chǎn)效率低；對原料阿魏酸的轉(zhuǎn)化率不高(摩爾轉(zhuǎn)化率20%-70%)，生產(chǎn)成本較高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用固定化擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛的方法， 在篩選到一株可轉(zhuǎn)化阿魏酸為香草醒的擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp. ) zhp06即CCTCC NO M2011265 (中國專利CN102321563A已公開)的基礎(chǔ)上，提供一種擬無枝酸菌固定化及其固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化阿魏酸制備香草醛的方法。通過固定化細(xì)胞重復(fù)利用，提高轉(zhuǎn)化效率，降低培養(yǎng)微生物的成本，同時(shí)使得產(chǎn)物香草醛容易提取。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種利用固定化擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸制備香草醛的方法， 其步驟包括
(I)種子培養(yǎng)將實(shí)驗(yàn)室保藏的擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp. )zhp06,即CCTCC NO :M2011265，斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，放置到28-45°C，100_300r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 36h。
(2)菌體準(zhǔn)備將步驟(I)所得種子接種到菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，放置到28_45°C，100-300r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 36h。
所述種子培養(yǎng)和種子擴(kuò)大培養(yǎng)使用的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖I 10g，酵母膏 5 20g，Na2HPO4 · 12H201 lOg，KH2PO4O.1 2g，NaClO. 05 O. 5g, MgSO4 · 7H200. 05 O.5g, CaCl2 ·2Η200. 05 O.1g ;用自來水定容到 1L，調(diào) pH 至 7. 2 7. 4，121°C滅菌 20min ； 接種量為1%-10%。
(3)固定化細(xì)胞制備將用清水洗凈的木屑或甘蔗渣等纖維質(zhì)材料粉碎成粒徑為 20目到120目，用清水清洗凈后滅菌，按60-300g/L用量加入到培養(yǎng)好菌體的步驟(2)所得培養(yǎng)液中，常溫?cái)嚢栉絣_24h，過濾得到固定化細(xì)胞。
(4)轉(zhuǎn)化阿魏酸為香草醛以步驟(3)中得到的固定化細(xì)胞為催化劑，與底物阿魏酸溶液混合，在35-40°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
底物阿魏酸溶液組成K2HP033 6g/L，KH2PO3O.1 lg/L，底物(阿魏酸)5_50g/L， 初始PH為7. 0-9. 0，在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行反應(yīng)。
搖瓶轉(zhuǎn)化裝液量30-100mL/250-500mL三角瓶，轉(zhuǎn)速 100_300r/min，轉(zhuǎn)化 10_48h。
或發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化在發(fā)酵罐中反應(yīng)，發(fā)酵罐通氣量100_400L/h，轉(zhuǎn)速100_300r/ min，連續(xù)轉(zhuǎn)化 140-200h。
本發(fā)明的固定化細(xì)胞可以重復(fù)利用10次以上，轉(zhuǎn)化完成后，將固定化細(xì)胞過濾出來，再加入緩沖液和底物，按照上述搖瓶轉(zhuǎn)化或發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
在發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，還可將耦聯(lián)吸附樹脂(如附圖1所示)，連續(xù)運(yùn)行 14(Tl50h，轉(zhuǎn)化液中的香草醛吸附到樹脂中，有利于產(chǎn)物的提取。
產(chǎn)物的提取和產(chǎn)物分析方法詳見中國專利申請?zhí)?01110325488.1巳公開，中國專利CN102321563A已公開。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所使用的固定化材料都是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢棄物，材料來源廣，成本低，制作簡單。用固定化生長細(xì)胞合成香草醛，具有反應(yīng)條件溫和，固定化材料廉價(jià)易得，環(huán)保無污染，能夠重復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，有利于連續(xù)化生產(chǎn)。并且，轉(zhuǎn)化與吸附樹脂偶聯(lián)可實(shí)現(xiàn)香草醛轉(zhuǎn)化與分離提取同步進(jìn)行，降低轉(zhuǎn)化液中香草醛的含量，減小甚至消除產(chǎn)物抑制，縮短香草醛整個(gè)生產(chǎn)過程的時(shí)間，對環(huán)境無污染。
生物材料樣品保藏?cái)M無枝酸菌(Amycolatopsis sp. ) zhp06,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期2011年7月26日，保藏編號為 CCTCC NO M2011265o


圖1發(fā)酵罐與樹脂耦聯(lián)示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1-4，不同處理方式的木屑制備固定化細(xì)胞產(chǎn)香草醛情況
木屑分別進(jìn)行以 下處理用清水浸泡沖洗干凈，H2O2處理；Na0H水??；Na0H煮沸。 從保藏斜面上取一環(huán)菌苔，接種到種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的組成葡萄糖5g ;酵母膏 5g ；Na2HP04 · 12H204g ；KH2PO4Ig ；NaC10. 2g ；MgS04 · 7H200. 2g ；CaCl2 · 2H200. 05g ;用自來水定容到1L，調(diào)pH7. 2，裝液量30mL/250mL三角瓶。在30°C，200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h ；以8%接種量將種子接種到菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基中(擴(kuò)大培養(yǎng)基組成同種子培養(yǎng)基，裝液量50mL/500mL三角瓶)，37°C，200r/min下擴(kuò)大培養(yǎng)24h，加入處理好的木屑10g，繼續(xù)培養(yǎng) IOh,過濾，與12g/L底物阿魏酸溶液混合，置于37°C，200r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化24h。結(jié)果如表I。取水洗處理即可。
表I木屑不同處理方式對固定細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛的比較
權(quán)利要求
1.一種利用固定化擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛的方法，其步驟包括(1)種子培養(yǎng)將擬無枝酸菌sp.)zhp06，即 CCTCC N0 M 2011265，斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，放置到28-45°C，100-300 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)1(T36 h ；(2)菌體準(zhǔn)備將步驟(I)所得種子接種到菌體擴(kuò)大培養(yǎng)基中，放置到28-45°C， 100-300 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 36 h ；所述種子培養(yǎng)基和種子擴(kuò)大培養(yǎng)基配方為葡萄糖I 10 g，酵母膏5 20 g, Na2HP04 12H20 I 10 g, KH2P04 0.1 2 g, NaCl 0. 05 0. 5 g, MgS04 7H20 0. 05 0. 5 g, CaCl2 2H20 0. 05 0.1 g ;用自來水定容到 I L，調(diào) pH 至 7. 2 7. 4，121°C滅菌 20 min ； 接種量為1%_10% ；(3)固定化細(xì)胞制備將用清水洗凈的木屑或甘蔗渣纖維質(zhì)材料粉碎成粒徑為20目到 120目，清水清洗干凈后滅菌，用量為60-300 g/L加入到培養(yǎng)好菌體的步驟(2)所得培養(yǎng)液中，常溫?cái)嚢栉?-24 h，過濾得到固定化細(xì)胞；(4)轉(zhuǎn)化阿魏酸為香草醛以步驟(3)中得到的固定化細(xì)胞為催化劑，加入底物阿魏酸溶液，在35-40°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；底物阿魏酸溶液組成=K2HP03 3 6 g/L, KH2P03 0.1 I g/L，底物阿魏酸5-50 g/L, 初始PH為7. 0-9. 0，在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行反應(yīng)；搖瓶轉(zhuǎn)化裝液量30-100 mL/ 250-500 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速100-300 r/min，轉(zhuǎn)化10-48h ；或發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化在發(fā)酵罐中反應(yīng)，發(fā)酵罐通氣量100-400 L/h，轉(zhuǎn)速100-300 r/min, 連續(xù)轉(zhuǎn)化140-200 h0
全文摘要
一種利用固定化擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香草醛的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以木屑、甘蔗渣等纖維素材料為載體，以吸附方式固定擬無枝酸菌細(xì)胞。固定化細(xì)胞能重復(fù)利用10次，轉(zhuǎn)化阿魏酸為香草醛的摩爾轉(zhuǎn)化率保持在50%以上。在轉(zhuǎn)化體系中耦聯(lián)吸附樹脂，香草醛產(chǎn)量達(dá)到19.65g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度0.131g/L·h。本發(fā)明轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境污染小，生產(chǎn)周期短，成本低，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物易分離純化，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N11/12GK103060392SQ20131002318
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者鄭璞, 王興林 申請人:江南大學(xué)