專利名稱：茄子est-ssr標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種植物的育種方法，具體涉及茄子EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)方法，以及利用該標(biāo)記進(jìn)行茄子遺傳多樣性的評價、分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和茄子重要性狀的QTL定位的應(yīng)用方法，屬于育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
SSR標(biāo)記，又稱微衛(wèi)星DNA，由串連重復(fù)的短序列組成，重復(fù)單位長度一般為1_6個bp。由于SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、數(shù)量豐富、基因組覆蓋距離廣、高分辨率、易于檢測及操作簡單等特征，因此在遺傳分析中起著重要的作用(Powell et al., 1996 ；Stagelet al.，2008)。爺子(Solanum melongena L.),屬于爺科爺屬，是許多國家的重要蔬菜作物。爺子含有豐富的礦物質(zhì)和維生素，茄子中含有的多酚物質(zhì)具有重要的抗氧化活性(Nisha etal.,2009 ；Sudheesh et al.，1999)。與茄科的兩個模式作物番茄和土豆相比，茄子具有大果型和各種抗逆性；而且，茄子具有獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)生特征(Fukuoka et al.，2012)。盡管茄子種植廣泛且具有如此重要的價值，但是與同科作物番茄(S.lycopersicum L.)、土豆(S.tuberosum L.)、辣椒(Capsicum spp.L.)相比,它的分子生物學(xué)研究仍然比較落后(Nunome et al., 2009 ；Fukuoka et al.,2012)。目前，在茄子研究中，已經(jīng)報道有一些分子遺傳圖譜(Barchi et al.,2010 ；Caoet al.,2006 ；Doganlar et al.,2002a ；Doganlar et al.,2002b ;Nunome et al.,2001 ；Nunome et al.,2003；Nunome et al.,2009 ；Sunseri et al.,2003 ；ffu et al.,2009)。然而，這些圖譜主要是由標(biāo)記RAPD(random amplified polymorphic DNA)、RFLP(restrictionfragment length polymorphism) >AFLP(amplified fragment length polymorphism)標(biāo)記(Nunome et al.,2001 ；DoganIar et al.,2002b ；Nunome et al.,2003 ；Sunseri et al.,2003 ；Cao et al.,2006 ；Barchi et al.,2010)、cos II標(biāo)記(constructed with conservedortholog set II) (Wu et al., 2009)和 SOL (Solanum orthologous)標(biāo)記(Fukuoka etal.,2012)構(gòu)建。2009年，Nunome et al.構(gòu)建了一個包含236個SSR標(biāo)記的連鎖圖，這張圖譜是目前茄子研究中包含最多SSR標(biāo)記的一張。此外，這些圖譜的構(gòu)圖群體仍具有局限性。到目前為止，所有構(gòu)圖的種間F2群體均為S.linnaeanun^PS.melongena的雜交后代(Doganlar et al., 2002a ；DoganIar et al.,2002b ；Sunseri et al., 2003 ；ffu et al.,
2009)，其余的圖譜則均為種內(nèi)F2群體，其主要原因是茄子種間雜交種具有各種障礙。在爺子上，已經(jīng)開發(fā)出部分SSR標(biāo)記(Nunome et al., 2009 ；Stagel et al.,2008)并應(yīng)用于圖譜的構(gòu)建(Nunome et al.，2009)。然而，在茄子種內(nèi)，標(biāo)記的多態(tài)性比較低，為了構(gòu)建一個高密度的連鎖圖譜，需要開發(fā)更多的標(biāo)記。目前，茄子的研究基礎(chǔ)相比茄科其他作物一直比較薄弱，在公共數(shù)據(jù)庫中能得到的序列信息比較有限。在2009年，F(xiàn)ukuoka等上傳了大量的EST序列(Fukuoka et al.，
2010)，這大大豐富了茄子數(shù)據(jù)庫，并且為開發(fā)SSR標(biāo)記提供了大量的信息。
為了進(jìn)一步豐富茄子SSR的標(biāo)記，用于分子遺傳育種，申請人根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的爺子EST序列，開發(fā)了部分EST-SSR標(biāo)記,并利用開發(fā)的標(biāo)記對爺子種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位研究等應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對目前對爺子遺傳育種技術(shù)比較薄弱的不足，開發(fā)爺子EST-SSR標(biāo)記的引物序列，并將其應(yīng)用于茄子遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位的研究。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種茄子EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用方法，其特征在于，具體按照以下步驟完成:I)從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得EST序列，對所獲得的EST序列進(jìn)行處理并檢測該EST序列中的SSR ；2 )設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記的弓丨物序列；3)從田間獲取如表I所不的編號1-48的爺子材料和爺子F2群體的植株的嫩綠葉片，提取其總DNA ；4)用步驟2)所設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記的引物序列擴(kuò)增步驟3)中表I所示的編號1_12的茄子材料；5)獲得在步驟3)中表I所示的編號7-12的茄子材料中有差異的EST-SSR標(biāo)記，其序列如序列表所示；6)用步驟5)所獲得的EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增步驟3)中表I所示的編號13-48的茄子材料和F2群體；7)計(jì)算每對引物的多態(tài)性信息含量并對步驟3)中表1所示的編號13-48的茄子材料進(jìn)行遺傳多樣性的聚類分析；8)對步驟6)所獲得的F2群體擴(kuò)增的標(biāo)記進(jìn)行連鎖作圖和茄子果實(shí)性狀的QTL定位。表I本發(fā)明所用的所有植物材料
權(quán)利要求
1.一種茄子EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用方法，其特征在于，具體按照以下步驟完成: 1)從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得EST序列，對所獲得的EST序列進(jìn)行處理并檢測該EST序列中的 SSR ； 2)設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記的引物序列； 3)從田間獲取如表I所不的編號1-48的爺子材料和爺子F2群體的植株的嫩綠葉片，提取其總DNA ； 4)用步驟2)所設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記的引物序列擴(kuò)增步驟3)中表I所示的編號1-12的茄子材料； 5)獲得在步驟3)中表I所示的編號7-12的茄子材料中有差異的EST-SSR標(biāo)記，其序列如序列表所示； 6)用步驟5)所獲得的EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增步驟3)中表I所示的編號13-48的茄子材料和F2群體； 7)計(jì)算每對引物的多態(tài)性信息含量并對步驟3)中表I所示的編號13-48的茄子材料進(jìn)行遺傳多樣性的聚類分析； 8)對步驟6)所獲得的F2群體擴(kuò)增的標(biāo)記進(jìn)行連鎖作圖和茄子果實(shí)性狀的QTL定位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茄子EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用方法，其特征在于，步驟3)中所述的提取總DNA的具體方法步驟如下: 1)將100-200mg所述嫩綠葉片的凍葉或鮮葉放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨，將研磨的粉末轉(zhuǎn)入2ml離心管中，加`入SOOul新鮮配制的提取緩沖液，渦旋混勻，冰浴保存IOmin, 10000rpm、4°C離心 15min,棄上清； 2)于沉淀中加入700ul65°C預(yù)熱的裂解緩沖液，并用牙簽攪松，渦旋混勻，65°C水浴30min ； 3)加入750ul的氯仿:異戊醇為24:1的混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，10000rpm、4°C離心15min，將上清轉(zhuǎn)入2ml的離心管中； 4)加入750ul的氯仿:異戊醇為24:1的混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，10000rpm、4°C離心15min，將上清轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中； 5)加0.1體積pH5.2的3M醋酸鈉，加等體積的異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次，放置30min，IOOOOrpm離心5min,棄上清液,加700ul70%乙醇洗DNA小團(tuán)，10000rpm、4°C離心IOmin,倒掉上清液，通風(fēng)干燥20min ； 6)加200ill的TE緩沖液4°C，30min以上溶解DNA，并保存。
全文摘要
一種茄子EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用方法，步驟為1)從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得EST序列，進(jìn)行處理并檢測SSR；2)設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記的引物序列；3)獲取表1編號1-48的茄子材料和茄子F2群體的植株嫩綠葉片，提取總DNA；4)用設(shè)計(jì)的SSR標(biāo)記引物序列擴(kuò)增表1編號1-12的茄子材料；5)獲得表1編號7-12的茄子材料中有差異的EST-SSR標(biāo)記，其序列如序列表；6)用所獲EST-SSR標(biāo)記擴(kuò)增表1編號13-48的茄子材料和F2群體；7)計(jì)算每對引物的多態(tài)性信息含量并對表1編號13-48的茄子材料進(jìn)行遺傳多樣性聚類分析；8)對步驟6)所獲F2群體擴(kuò)增標(biāo)記進(jìn)行連鎖作圖和QTL定位。結(jié)果表明G249引物與茄子果實(shí)長度及果型性狀連鎖，分別解釋表型變異的4%和5.1%；G192引物與茄子花萼果實(shí)大小性狀連鎖，解釋表型變異的5.3%。
文檔編號C12Q1/68GK103103268SQ20131002357
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者陳火英, 葛海燕, 劉楊, 王新華 申請人:上海交通大學(xué)