大草蛉p450新基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重要天敵昆蟲大草蛉(Chrysopa?septempunctata)P450新基因DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列，填補(bǔ)了脈翅目昆蟲中P450基因分子信息的缺乏，為P450基因在天敵昆蟲抗藥性中的作用機(jī)制等研究提供了新的基因。在害蟲綜合防治領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】大草蛉P450新基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，涉及大草蛉(Chrysopaseptempunctata) P450家族基因的克隆及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大草蛉是蚜蟲、葉螨、鱗翅目卵及低齡幼蟲等多種農(nóng)林害蟲的重要天敵，是害蟲生物防治中極具應(yīng)用價(jià)值的一種天敵昆蟲。細(xì)胞色素P450單加氧酶系,又名多功能氧化酶，是一類具有血紅素結(jié)合位點(diǎn)的超基因家族蛋白。目前，已發(fā)現(xiàn)的昆蟲P450主要有兩方面的功能:一是催化內(nèi)源性物質(zhì)(如蛻皮激素、保幼激素、留醇、脂肪酸及信息激素等)的生物合成和降解，維持生命體的正常功能；二是針對外源性物質(zhì)(如殺蟲劑、植物次生物質(zhì)及誘變劑前體等)起到解毒與活化的作用。其中細(xì)胞色素P450對殺蟲劑的代謝作用增強(qiáng)是大多數(shù)昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制。昆蟲在長期的進(jìn)化過程中獲得了適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境的能力，在此過程中，解毒酶系(尤其是P450酶系)的誘導(dǎo)，能夠幫助昆蟲解毒對自身有毒而不利于生存的各種外源和內(nèi)源化合物，從而增強(qiáng)其自我保護(hù)和對外界環(huán)境的適應(yīng)能力。
[0003]化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，產(chǎn)生抗藥性的害蟲種類及數(shù)量在不斷增加，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，昆蟲P450基因不斷被分離、克隆并實(shí)現(xiàn)體外表達(dá)，其結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控及與昆蟲抗藥性研究的關(guān)系不斷深入，但是在大敵昆蟲中還沒有相關(guān)的研究。因此本發(fā)明以大草蛉為材料，克隆了四種大草蛉P450基因，并對其編碼的氨基酸序列、同源性及進(jìn)化地位進(jìn)行分析，為研究P450基因家族的功能及進(jìn)化研究提供新的P450基因片段，為研究P450基因在天敵昆蟲抗藥性中的作用機(jī)制提供了新的基因材料和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明包括以下內(nèi)容:
[0005]1.提供了一種克隆大草蛉P450基因的引物及其克隆方法。
[0006]2.本發(fā)明從大草蛉幼蟲中克隆得到四個(gè)新的P450基因片段。
[0007]3.本發(fā)明提供了大草蛉P450基因的應(yīng)用方法。
[0008]有益效果
[0009]本發(fā)明以大草蛉幼蟲為材料，克隆了大草蛉P450基因cDNA序列4個(gè)，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對大草蛉P450基因進(jìn)行了研究，并對其編碼的蛋白序列特征、同源性、進(jìn)化地位進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究大草蛉P450基因的表達(dá)、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為P450基因參與昆蟲抗藥性產(chǎn)生提供參考，同時(shí)也為脈翅目昆蟲P450基因功能研究和進(jìn)化研究提供了新材料。同時(shí)該系列基因也可應(yīng)用于天敵昆蟲抗藥性作用機(jī)制等基礎(chǔ)研究，為培育抗藥性天敵昆蟲優(yōu)勢品種及其利用提供理論基礎(chǔ)。 [0010]下面將引用非限定性實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
【具體實(shí)施方式】[0011]實(shí)例I
[0012]大草蛉P450基因中間片段的克隆
[0013]1、提取總RNA:采用Trizol法一步提取大草蛉幼蟲的總RNA。
[0014]2、cDNA第一鏈合成:參考北京全式金生物技術(shù)有限公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行，具體為:取總 RNA3y 1、oligo(dT)18 引物 1μ 1、2XTS Reaction MixlOy 1，Transcript RT/RI Enzyme mixlμ I, RNase-free H2O 加至 20 μ I,混勻，42 V 30min,85°C 5min，4°C冷卻，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0015]3、PCR擴(kuò)增大草蛉P450基因的中間片段:根據(jù)昆蟲P450基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物(引物如下)，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增大草蛉P450基因的中間片段；
[0016]S1:5’ -ACNYTYATGTTYGARGGHCAYGAYAC-3’
[0017]Al:5’ -CDATRCARTTTCKKGRHCCDGC-3，
[0018]鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR擴(kuò)增)所用的反應(yīng)試劑組成及反應(yīng)條件如下:首先將下述試劑混合在一起，
[0019]模板cDNAlyl
[0020]脫氧核苷 酸底物dNTP4 μ I[0021 ] Ex-Taq DNA 聚合酶 0.5 μ I
[0022]10 X Taq DNA聚合酶緩沖液5 μ I
[0023]正向引物(10μ Μ)2 μ I
[0024]反向引物(10μ Μ)2 μ I
[0025]ddH2035.5 μ I
[0026]總體積50 μ I
[0027]反應(yīng)條件為:首先94°C預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)行如下循環(huán):94°C 30秒，57°C 30秒，720C I分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]4、PCR產(chǎn)物純化:利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自北京天根生物科技公司)對PCR產(chǎn)物回收、純化，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。
[0029]5、PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化與鑒定:取5μ I上述PCR純化產(chǎn)物，連接于pMD19-T simple載體(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)，反應(yīng)體系如PMD19-T simple載體試劑盒所示，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO，涂布與含Amp的LB平板上于37°C靜置培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，使用克隆載體PMD19-T simple上通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行菌液PCR鑒定含P450中間片段的陽性克隆子。
[0030]6、將步驟5所得的陽性克隆子送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比較。
[0031]實(shí)例2
[0032]吡蟲啉對大草蛉P450的誘導(dǎo)
[0033]以吡蟲啉對大草蛉三齡幼蟲進(jìn)行誘導(dǎo)，并提取誘導(dǎo)后4h.8h.16h的大草蛉幼蟲RNA,經(jīng)DNA酶消化后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量對不同時(shí)間P450mRNA的變化情況進(jìn)行檢測，以actin基因作為內(nèi)參。用2_Λ Δετ方法計(jì)算Ρ450基因的相對表達(dá)量，以對照組的表達(dá)量設(shè)為1，誘導(dǎo)后不同時(shí)間的的表達(dá)為相對于對照組的變化倍數(shù)(表1)。
[0034]表1.誘導(dǎo)后不同時(shí)間的的表達(dá)為相對于對照組的變化倍數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種大草蛉4個(gè)P450基因的cDNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4 所述。
2.權(quán)利要求1所述大草蛉4個(gè)P450基因，其氨基酸序列如SEQID NO:5_SEQ ID NO:8所述。
3.權(quán)利要求1所述大草蛉P450cDNA的克隆方法，包括以下步驟: (1)從大草蛉幼蟲中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA第一鏈的合成； (2)根據(jù)昆蟲P450基因家族基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物:
S1:5’ -ACNYTYATGTTYGARGGHCAYGAYAC-3’
Al:5’ -CDATRCARTTTCKKGRHCCDGC-3’ (3)以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增大草蛉P450基因的中間片段； (4)純化步驟(3)所得PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pMD19-Tsimple載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，使用克隆載體PMD19-T simple上通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行菌液PCR鑒定含P450中間片段的陽性克隆子。 (5)將步驟4所得的陽性克隆子送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比較。
4.權(quán)利要求1所述大草蛉P450基因cDNA在大草蛉抗藥研究中的應(yīng)用，用吡蟲啉對大草蛉三齡幼蟲進(jìn)行誘導(dǎo)，提 取誘導(dǎo)后4h，8h, 16h的大草蛉總RNA，并用Takara DNA酶去除基因組DNA，并根據(jù)這四個(gè)P450基因設(shè)汁熒光定量引物，運(yùn)用熒光定量的方法對吡蟲啉誘導(dǎo)后這個(gè)4個(gè)P450基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析，以actin基因作為內(nèi)參。
【文檔編號】C12N9/02GK103966242SQ201310027131
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月25日
【發(fā)明者】曾凡榮, 劉昌燕, 毛建軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所