專利名稱：一種產(chǎn)s-3-羥基丁酮基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
3-羥基丁酮又名甲基乙酰甲醇、乙偶姻，可作為一種平臺化合物，廣泛應(yīng)用于日化食品、制藥、涂料、液晶材料等眾多領(lǐng)域。2004年，美國能源部將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一。3-羥基丁酮存在2個旋光異構(gòu)體，分別為R型和S型3-羥基丁酮，S-3-羥基丁酮可用于合成4-氯-4，5- 二甲基-1，3 二氧雜環(huán)戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是合成青霉素、氨芐青霉素等抗生素類藥物重要的醫(yī)藥中間體；S-3-羥基丁酮還可以用于合成抗菌藥倫氨芐西林鹽酸鹽的中間體一4-溴甲基5-甲基-1，3-二氧戊環(huán)-2-酮。近年來，隨著人們對S-3-羥基丁酮需求的不斷增長，有關(guān)S-3-羥基丁酮的生產(chǎn)方法及應(yīng)用研究已引起人們的廣泛關(guān)注。目前S-3-羥基丁酮的合成方法主要有兩種一是化學(xué)合成法，二是生物合成法?；瘜W(xué)合成法存在反應(yīng)步驟多，還需手性拆分，工藝繁瑣，導(dǎo)致成本高、收率底，環(huán)境污染比較嚴(yán)重，且原料大都是不可再生的化石資源一石油，原料來源受到限制。生物合成法包括酶法和微生物發(fā)酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇為原料，在酶的催化特異性作用下生產(chǎn)S-3-羥基丁酮，該方法轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度均能達(dá)到100%，但是和化學(xué)法一樣原料來源受到限制，且產(chǎn)量偏低，難以大批量制備S-3-羥基丁酮。目前用于3-羥基丁酮生產(chǎn)及研究的菌株主要有克雷伯氏菌屬(Klebisella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及沙雷氏菌屬(Serratia)等，但是尚未發(fā)現(xiàn)用于生產(chǎn)光學(xué)純S_3_羥基丁酮的野生菌株。目前文獻(xiàn)報道的利用基因工程手段構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組菌生產(chǎn)S-3-羥基丁酮，研究者將Bacillus subtilis 168中的2，3-丁二醇脫氧酶基因(Bud A)導(dǎo)入大腸桿菌Escherichiacoli BL21(DE3)中，構(gòu)建重組菌E. coli BL21-Bud A，并以meso-2，3-丁二醇為底物利用該重組菌轉(zhuǎn)化制備S-3-羥基丁酮，雖然獲得成功，產(chǎn)量在36. 7g/L左右，但是該方法依然存在底物meso-2，3-丁二醇價格昂貴且難以獲得，并存在重組質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題，產(chǎn)量低，成本高等缺陷。(Xiao Zijun, Plos 0ne5 (2010,1) 1-6)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明還最后要解決的技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌的應(yīng)用。技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種產(chǎn)S-3-輕基丁酮基因工程菌，其分類命名為paenibacillus polymyxaCGMCC 3044-Bud A_，該工程菌是通過下列方法構(gòu)建得到的利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中擴(kuò)增出 2，3_ 丁二醇脫氧酶基因 Bud A,5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點(diǎn)將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶ARed同源重組序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重組粘粒轉(zhuǎn)化 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介導(dǎo)下與paenibacillus polymyxa CGMCC 3044發(fā)生同源雙交換,得到重組的多粘類芽抱桿菌，即產(chǎn)S-3-輕基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'其中，SuperCos_l/pIJ790中 SuperCos-1 為粘粒；質(zhì)粒 pIJ790 攜帶 λ Red 同源重組序列、oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK等序列。該基因工程菌通過下列方法構(gòu)建得到(I)基因Bud A的克隆根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)PCR 反應(yīng)條件94° C 變性 5min，經(jīng) 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過72° C延伸lOmin，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接,進(jìn)行序列測定`,獲得來源于多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044 的 2，3- 丁二醇脫氫酶基因(Bud A)；(2)重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II”的構(gòu)建在Bud A的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂
II;根據(jù)所述酶切位點(diǎn)連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II ；(3)重組基因工程菌的獲得將重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790-Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽抱桿菌，命名為 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'其中該方法包括下列步驟利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044中擴(kuò)增出2，3_ 丁二醇脫氫酶基因Bud A，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點(diǎn)將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶λ Red同源重組序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II ”序列的重組粘粒SuperCos_l/pIJ790,重組粘粒轉(zhuǎn)化paenibacillus polymyxaCGMCC 3044，并在λ Red介導(dǎo)下與宿主菌發(fā)生同源雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，SP產(chǎn) S-3-輕基丁酮基因工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'其中，上述產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌的構(gòu)建方法包括下列步驟(I)基因BudA的克隆根據(jù)Genebank公布的多粘類芽抱桿菌paenibacillus polymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)PCR 反應(yīng)條件94° C 變性 5min，經(jīng) 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過72° C延伸lOmin，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接,進(jìn)行序列測定,獲得來源于多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044 的 2，3- 丁二醇脫氫酶基因(Bud A)；(2)重組粘粒“SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II”的構(gòu)建在Bud A的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂
II;根據(jù)所述酶切位點(diǎn)連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II ；(3)重組基因工程菌的獲得將重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790-Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽抱桿菌，命名為 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'上述的產(chǎn)S_3_ 輕基丁酮基因工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA_在生產(chǎn)S-3-羥基丁酮中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，將構(gòu)建的基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-接種于含碳源、氮源和無機(jī)鹽的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純S-3-羥基丁酮，其中，所述碳源為未經(jīng)任何水解處理的菊芋菊粉粗提液。上述的應(yīng)用，該基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液為底物生產(chǎn)S-3-羥基丁酮，具體生產(chǎn)工藝為(1)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)種子培養(yǎng)基(NH4)2HPO4O. 5-2. 0g/L,KCl 0. 10-0. 3g/L,MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L,酵母膏0. 1-0. 3g/L，葡萄糖2. 0-8. 0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉3. 0-1. 0g/L,阿泊拉霉素 20-50 μ g/mL ；種子培養(yǎng)1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30_37oC，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng) 12_36h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成菊芋菊粉粗提液含菊粉20. 0-120. 0g/L, (NH4)2HPO40. 5-2. 0g/L, KCl 0. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母膏 3· 0-8. 0g/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ；培養(yǎng)條件接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30_37oC，pH6. 0-8. 0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h,控制轉(zhuǎn)速240rpm,發(fā)酵24h后,控制轉(zhuǎn)速120rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵。其中，本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室選育并保藏的微生物菌株為能產(chǎn)菊粉酶的多粘芽孢桿菌(paenibacillus polymyxa) CGMCC No. 3044,目前該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，登記入冊的編號是CGMCC No. 3044，保藏日期是2009年4月29日。以此菌作為出發(fā)菌株。該菌株相應(yīng)的專利的申請日為2009年6月I日，專利號為ZL200910026807.1。有益效果本發(fā)明在于提供一種新型基因工程菌，用于發(fā)酵產(chǎn)S-3-羥基丁酮，該菌在微氧條件下直接利用未經(jīng)處理 的菊芋菊粉粗提液高效發(fā)酵產(chǎn)S-3-羥基丁酮，突破了傳統(tǒng)發(fā)酵難以獲得光學(xué)純S-3-羥基丁酮和低效率生產(chǎn)S-3-羥基丁酮的局限。與原始多粘類芽孢桿菌相比，重組菌株生產(chǎn)3-羥基丁酮的能力得到顯著提高，提高了對底物菊粉的利用能力和轉(zhuǎn)化率，且獲得的是附加值更高的光學(xué)純S-3-羥基丁酮。與目前文獻(xiàn)所報道利用基因工程手段構(gòu)建重組微生物生產(chǎn)S-3-羥基丁酮方法相比，不僅重組菌產(chǎn)S-3-羥基丁酮穩(wěn)定性高，而且產(chǎn)物濃度也較高，且底物是價格低、容易獲得的能源植物菊芋菊粉粗提液，另外還可在發(fā)酵過程中添加微量的阿泊拉霉素，達(dá)到抑制部分細(xì)菌的目的，大大減少了在工業(yè)化過程中較易發(fā)生的染雜菌現(xiàn)象，提高產(chǎn)物質(zhì)量，發(fā)酵時間也有所縮短，為微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)S-3-羥基丁酮奠定了良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 :菊芋菊粉粗提液的制備方法新鮮的菊芋洗凈去皮，熱燙滅酶(100°C，15min)后切成薄片，70°C下鼓風(fēng)干燥，然后粉碎過80目篩制得菊芋粗粉，冰箱保存?zhèn)溆?。按?:6的比例稱取菊芋粗粉放入水中攪拌均勻后，70°C水浴加熱浸提4h，用石灰乳調(diào)節(jié)pH為9，然后80°C水浴保溫lh，用紗布過濾后即可得菊芋菊粉粗提液。實(shí)施例2 :基因Bud A的克隆根據(jù)Genebank 公布的多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa ATCC 12321 中Bud A基因的序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl :5，-ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5， -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’以多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)；PCR 反應(yīng)條件94° C 變性 5min，94° C30s ；56° C30s ；72° Clmin 共 32 次循環(huán)，72° C延伸lOmin，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接,進(jìn)行序列測定,獲得來源于多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脫氫酶基因Bud A。實(shí)施例3 :重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II”的構(gòu)建在Bud A的5’端約39bp堿基序列的兩端分別弓I入EcoR I7Xho I，得到Bud A同源臂I ;在Bud A的3’端約20bp堿基序列的兩端分別引入Not I，BamH I，得到Bud A同源臂II。根據(jù)所述酶切位點(diǎn)連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II ”序列和λ Red序列的重組粘粒SuperCos_l/pIJ790。實(shí)施例4 :重組粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044。將重組粘粒SuperCos_l/pIJ790- “SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽抱桿菌，命名為 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'實(shí)施例5 :工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-中 2，3_丁二醇脫氫酶酶活測定 (I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-(2)所用培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，阿泊拉霉素40 μ g/mL,ρΗ6· O(3)酶活測定方法酶活力測定的基本反應(yīng)體系(200 μ L)組成50mmol/LTris-HClpH8. 0,177 μ L,酶液 10 μ L，1. lmol/L2, 3-丁二醇(乙偶姻)10yL，25mMNAD+(NADH) 3 μ L，37°C反應(yīng)5min后，測定Imin內(nèi)340nm處吸光度的變化率。一個酶活力單位(U)定義為Imin NADH增加(減少)的ymoL數(shù)量。酶粗提液的制備如下將發(fā)酵液離心所得的菌體用生理鹽水(0. 85%NaCl)洗滌兩次后重懸于pH8. 0,50mmol/L Tris-HCl中，在300W,30min,超聲2s,停4s條件下進(jìn)行超聲破碎,冰浴保護(hù),8500rpm低溫離心30min,上清液即為酶粗提液。蛋白濃度用Bradford法檢測，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。考察結(jié)果重組菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-中 2，3_ 丁二醇脫氫酶酶活為O。對比例1:原始菌株 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中 2，3_ 丁二醇脫氫酶酶活測定(I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044(2)所用培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，ρΗ6· O(3)酶活測定方法酶活力測定的基本反應(yīng)體系(200 μ L)組成50mmol/LTris-HClpH8. 0,177 μ L,酶液 10 μ L，1. lmol/L2, 3-丁二醇(乙偶姻)10yL，25mMNAD+(NADH) 3 μ L，37°C反應(yīng)5min后，測定Imin內(nèi)340nm處吸光度的變化率。一個酶活力單位(U)定義為Imin NADH增加(減少)的ymoL數(shù)量。酶粗提液的制備如下將發(fā)酵液離心所得的菌體用生理鹽水(0. 85%NaCl)洗滌兩次后重懸于pH8. 050mmol/LTris-HCl中，在300W，30min,超聲2s,停4s進(jìn)行超聲破碎,冰浴保護(hù),8500rpm低溫離心30min,上清液即為酶粗提液。蛋白濃度用Bradford法檢測，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。
考察結(jié)果原始菌株paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044 中 2，3_丁二醇脫氫酶酶活為 O. 133U/mg。實(shí)施例6 :工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-直接利用菊芋菊粉粗提液在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)S-3-羥基丁酮(I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)種子培養(yǎng)基(g/L) : (NH4)2HPO4LO, KCl 0. 2,MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 0. 2，葡萄糖5. O,菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；種子培養(yǎng)1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30oC，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成(g/L):菊芋菊粉粗提液含菊粉60. O, (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 10，MgSO4. 7H20 O. 1，酵母膏 6. 0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；培養(yǎng)條件接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30oC，pH6. 0，控制氧氣的通入量，搖床轉(zhuǎn)速120rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵即可，發(fā)酵時間42h。發(fā)酵結(jié)果菊芋菊粉粗提液中含60. Og/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到25. 2g/L的S-3-羥基丁酮，光學(xué)純度100%。對比例2 :原始菌paenibacillus polymyxa CGMCC直接利用菊芋菊粉粗提液在搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)S-3-羥基丁酮 (I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 ；(2)種子培養(yǎng)基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 2，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 O. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；種子培養(yǎng)1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30oC，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60. O, (NH4)2HPO4 1.0, KCl0. 10，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 6. 0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；培養(yǎng)條件接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30oC，pH6. 0，控制氧氣的通入量，搖床轉(zhuǎn)速120rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵即可，發(fā)酵時間42h。發(fā)酵結(jié)果菊芋菊粉粗提液中含60. 0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到10. 5g/L的S-3-羥基丁酮，光學(xué)純度40. 4%。實(shí)施例7 :工程菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)S-3-羥基丁酮(I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-;(2)種子培養(yǎng)基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl 0. 2，MgSO4. 7H20 0. 1，酵母膏 0. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；種子培養(yǎng)1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30oC，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 6. 0，(NH4)2HPO4L O, KCl 0. 10，MgSO4. 7H20 0. 1，菊粉粗提液含菊粉80. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度30oC，pH6. O,控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速240rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速120rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵。發(fā)酵時間42± lh，分批補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30. 0±1· Og/L。發(fā)酵結(jié)果底物約為120. Og/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到48. 7g/L的S-3-羥基丁酮，光學(xué)純度100%。對比例3 :原始菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)S-3-羥基丁酮(I)出發(fā)菌株paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 ；(2)種子培養(yǎng)基(g/L) (NH4)2HPO41. 0，KCl O. 2，MgSO4. 7H20 O. 1，酵母膏 O. 2，葡萄糖5. 0，菊粉2. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；種子培養(yǎng)1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30oC，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)22h ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4 1.0, KCl O. 10,MgSO4. 7H20 O. 1，菊粉粗提液含菊粉80. O,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；培養(yǎng)條件5L發(fā)酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接種量 10v/v%,發(fā)酵溫度30oC，pH6. O,控制 氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h，控制轉(zhuǎn)速240rpm，發(fā)酵24h后，控制轉(zhuǎn)速120rpm，維持微氧環(huán)境發(fā)酵。發(fā)酵時間54± lh，分批補(bǔ)料流加菊粉維持菊粉濃度在30. 0±1· Og/L。發(fā)酵結(jié)果底物約為110. 0g/L的菊粉，經(jīng)發(fā)酵得到16. 4g/L的S_3_羥基丁酮，光學(xué)純度40. 3%。
SEQl ENCE LISTiNG
<πο>鹽城工學(xué)院
<120〉一種產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用 <130〉 20130122 <160> 2
<170〉PatentIn version 3. 3 〈210〉 I <211> 1053 <212〉 DNA
<213〉 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 <220〉
<221> CDS <222〉 (I).. (1053)
<400> I atg caa gca ttg aga tgg cat gga ata aaa gat tta cgt ttg gaa aac48
Met Gln Ala Leu Arg Trp His Gly He Lys Asp Leu Arg Leu Glu Asn I51015
att gag caa ccc get get ctt cca gga aaa gta aaa ate aaa gta gaayb
He Glu Gln Pro Ala Ala Leu Pro Gly Lys Val Lys He Lys Val Glu 202530
tgg tgt ggc att tgc gga agt gat ctt cac gaa tat gta gca gga ccg144
Trp Cys Gly He Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Val Ala Gly Pro 354045
ate ttc att cct gaa aac get cag cat cca ctg act ggg gaa aaa tct192
He Phe He Pro Glu Asn Ala Gln His Pro Leu Thr Gly Glu Lys Ser
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)S-3-輕基丁酮基因工程菌，其分類命名為paenibacillus poIymyxaCGMCC 3044-Bud A_，該工程菌是通過下列方法構(gòu)建得到利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044 中擴(kuò)增出 2，3_ 丁二醇脫氧酶基因 Bud A,5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點(diǎn)將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶ARed同源重組序列克隆粘粒SuperCOs-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II,重組粘粒轉(zhuǎn)化 paenibacillus po lymyxa CGMCC 3044,并在λ Red介導(dǎo)下與paenibacillus polymyxa CGMCC 3044發(fā)生同源雙交換,得到重組的多粘類芽抱桿菌，即產(chǎn)S-3-輕基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-BudA'
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌，其特征在于該工程菌通過下列方法構(gòu)建得到 (1)基因BudA的克隆根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl :5’ -ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5’ -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’ 以多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)PCR 反應(yīng)條件94° C 變性 5min，經(jīng) 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過72° C延伸lOmin，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接,進(jìn)行序列測定,獲得來源于多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脫氫酶基因，即Bud A基因； (2)重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790_BudA 同源臂1-oriT_ApraK-Bud A 同源臂II” 的構(gòu)建在Bud A的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I;在Bud A的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I，BamH I，得至Ij Bud A同源臂II ；根據(jù)所述酶切位點(diǎn)連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II； (3)重組基因工程菌的獲得將重組粘?！癝uperCOS-l/pIJ790-BudA同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽抱桿菌，命名為 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'
3.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括下列步驟利用PCR技術(shù)從多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044中擴(kuò)增出2，3-丁二醇脫氫酶基因Bud A，5’端39bp堿基序列構(gòu)成同源臂I，3’端20bp堿基序列構(gòu)成同源臂II，通過多克隆位點(diǎn)將同源臂I和同源臂II分別串聯(lián)到攜帶XRed同源重組序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-Bud A同源臂II”序列的重組粘粒SuperCos_l/pIJ790,重組粘粒轉(zhuǎn)化paenibacillus polymyxa CGMCC 3044,并在 λ Red介導(dǎo)下與宿主菌發(fā)生同源雙交換，得到重組的多粘類芽孢桿菌，即產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud PC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括下列步驟(1)基因Bud A的克隆根據(jù)Genebank公布的多粘類芽孢桿菌paenibacilluspolymyxa ATCC 12321中Bud A基因的序列設(shè)計(jì)合成PCR所需的引物Pl :5’ -ATGCAAGCATTGAGATGGCA-3’P2 :5’ -TTAGGCTTTCGGAGATACCA-3’ 以多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044基因組為模板完成PCR反應(yīng)PCR 反應(yīng)條件94° C 變性 5min，經(jīng) 94° C30s，56° C30s，72° Clmin，共 32 個循環(huán)，再經(jīng)過72° C延伸lOmin，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析確認(rèn)，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，與PMD18-T載體連接,進(jìn)行序列測定,獲得來源于多粘類芽孢桿菌paenibacillus polymyxaCGMCC 3044的2，3- 丁二醇脫氫酶基因，即Bud A基因； (2)重組粘?！癝uperCos-l/pIJ790_BudA 同源臂1-oriT_ApraK-Bud A 同源臂II” 的構(gòu)建在Bud A的5’端39bp堿基序列的兩端分別引入EcoR I，Xho I，得到Bud A同源臂I;在Bud A的3’端20bp堿基序列的兩端分別引入Not I，BamH I，得至Ij Bud A同源臂II ；根據(jù)所述酶切位點(diǎn)連接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT復(fù)制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的兩端，得到含“Bud A同源臂1-oriT-ApraK-BUd A同源臂II”序列和 λ Red 序列的重組粘粒 SuperCos-l/pIJ790_Bud A 同源臂1-oriT_ApraR-Bud A 同源臂II； (3)重組基因工程菌的獲得將重組粘?！癝uperCOS-l/pIJ790-BudA同源臂1-oriT-ApraE-Bud A 同源臂 II ” 轉(zhuǎn)化多粘類芽抱桿菌 paenibacillus polymyxa CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取陽性重組子，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到重組多粘類芽抱桿菌，命名為 paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A'
5.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)S_3_輕基丁酮基因工程菌paenibacilluspolymyxa CGMCC3044-Bud k_在生產(chǎn)S-3-羥基丁酮中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于將構(gòu)建的基因工程菌paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044-Bud A_接種于含碳源、氮源和無機(jī)鹽的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純S-3-羥基丁酮，其中，所述碳源為未經(jīng)任何水解處理的菊芋菊粉粗提液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于該基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液為底物生產(chǎn)S-3-羥基丁酮，具體生產(chǎn)工藝為 (1)出發(fā)菌株paenibacilluspolymyxa CGMCC 3044-Bud A-；(2)種子培養(yǎng)基(NH4)2HPO4O. 5-2. Og/L, KCl O. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L,酵母膏0. 1-0. 3g/L，葡萄糖2. 0-8. Og/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉3. 0-1. 0g/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ； 種子培養(yǎng)=IOOOmL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度30_37oC，搖床轉(zhuǎn)速120-200rpm，培養(yǎng) 12-36h ； (3)發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-120. 0g/L，(NH4)2HPO4.0. 5-2. 0g/L, KCl 0. 10-0. 3g/L, MgSO4. 7H20 0. 1-0. 3g/L，酵母膏 3· 0-8. Og/L,阿泊拉霉素20-50 μ g/mL ； 培養(yǎng)條件接種量10v/v%，發(fā)酵溫度30-37oC，pH6. 0-8. 0，控制氧氣的通入量，接種后發(fā)酵前24h,控制轉(zhuǎn)速240rpm,發(fā)酵24h后,控制轉(zhuǎn)速120rpm,維持微氧環(huán)境發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)S-3-羥基丁酮基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該菌株分類命名為paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A-。Bud A為2,3-丁二醇脫氫酶基因，通過同源雙交換，敲除P.polymyxa CGMCC 3044中的Bud A基因獲得菌株p.polymyxa CGMCC 3044-Bud A-。通過上述方法構(gòu)建的重組菌能發(fā)酵合成光學(xué)純S-3-羥基丁酮，光學(xué)純度可達(dá)100%，無3-羥基丁酮還原態(tài)副產(chǎn)物2,3-丁二醇，該菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、丁二酮等底物，培養(yǎng)條件粗放，操作方便簡單，光學(xué)純度高，生產(chǎn)成本低，有利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK103060255SQ20131002809
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者高健, 徐虹, 李莎, 馮小海, 薛鋒, 李鳳偉, 邵榮 申請人:鹽城工學(xué)院