專(zhuān)利名稱(chēng)：CEACAMl蛋白磁粒的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子l(CEACAMl)細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)、純化的方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1(CEACAM1，NCBI GenBank:NM_001712)是廣泛表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，屬癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物學(xué)功能包括促進(jìn)血管的形成，調(diào)節(jié)血管的重塑，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控、促進(jìn)腺體管腔的形成及調(diào)控胰島素的清除以維持細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，同時(shí)CEACAM1也是致病微生物的粘著受體。淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides, NM)通過(guò)其細(xì)胞膜表面的Opa(colonyopacity-associated)蛋白與粘膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的CEACAM1受體結(jié)合，使其粘附并侵入細(xì)胞，以利于吞噬細(xì)胞吞噬。Opa蛋白是存在于NG和NM細(xì)胞壁上的膜蛋白，是這兩種致病微生物的主要侵襲蛋白。微納米磁粒是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的以Fe304為核心的超磁性顆粒，其大小為200ηπΓ μ m，具有無(wú)磁記憶性，表面積大的特點(diǎn)，可在其表面包裹自由羧基、羥基等基團(tuán)，再通過(guò)偶聯(lián)劑與蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，目前被用于核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞的分離純化，腫瘤的定向靶診斷與治療。目前的研究已經(jīng)克隆表達(dá)了CEACAM1細(xì)胞外的部分結(jié)構(gòu)域，并獲得純度較高的蛋白，但還沒(méi)有相應(yīng)制備CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物，用于淋病奈瑟氏菌的快速分離，以提高臨床診斷的敏感性和特異性的相關(guān)技術(shù)報(bào)道，也沒(méi)有CEACAM1與水體藍(lán)藻相互作用的報(bào)道。

微納米磁粒是后基因組時(shí)代生物大分子和細(xì)胞分離純化的有力武器，具有快速、特異性高、無(wú)毒、無(wú)污染、有利于機(jī)械自動(dòng)化大樣本處理的新技術(shù)材料，可在其表面包被帶正電荷的娃、金屬鎳、及不同的蛋白質(zhì)如蛋白A等,可應(yīng)用于DNA、RNA> mRNA、抗體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌的分離純化1-3。但該技術(shù)僅國(guó)外少數(shù)幾個(gè)公司(如挪威的Dynabeads)擁有且保密，售價(jià)很高，普及受限。CEACAM1屬I(mǎi)型膜蛋白，廣泛存在于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上4_6，該蛋白具有許多重要的生物學(xué)功能，如能抑制腫瘤及上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖7’8，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)9’1(1，延遲粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的凋亡n，通過(guò)調(diào)控胰島素的清除而維持細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性12’13。該蛋白分子量51KDa，由細(xì)胞外、跨膜區(qū)、胞質(zhì)內(nèi)三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，胞外結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞間的同質(zhì)粘附(homotypic adhesion)和異質(zhì)粘附(heterotypic adhesion)有關(guān)1446,該結(jié)構(gòu)域通過(guò)剪切可激活caspase-Ι和_3參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控17。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由C端的12 14個(gè)氨基酸組成，與細(xì)胞生長(zhǎng)和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)18。CEACAM1在表達(dá)時(shí)有不同的剪切體，它們的差異主要在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，據(jù)此分為長(zhǎng)短兩型，而胞外結(jié)構(gòu)域是較保守的19’2°。奈瑟氏菌常寄生于動(dòng)物粘膜表層，Opa是這該類(lèi)革藍(lán)氏染色陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的粘附蛋白，在細(xì)菌粘著及侵入粘膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中起重要作用，同時(shí)它也是中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及⑶4+T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)劑9’14，是該類(lèi)細(xì)菌的主要抗原。Opa蛋白雖然像其它細(xì)菌抗原一樣，為逃避宿主免疫，其基因和氨基酸序列會(huì)發(fā)生突變，但在體外的研究中發(fā)現(xiàn)，在絕大部分突變體中，Opa蛋白仍能與CEACAM1結(jié)合21_24，其突變區(qū)域與其它受體的結(jié)合有關(guān)，這說(shuō)明Opa蛋白具有與宿主細(xì)胞膜多種受體結(jié)合的潛力，但無(wú)論怎樣突變，它仍然保持其與CEACAM1結(jié)合的最基本的功能。淋病奈瑟氏菌是性傳播疾病淋病的主要病原體。淋病在我國(guó)各種法定傳染病中發(fā)病率僅次于瘧疾和肝炎居第3位25。大多起病急，傳染性強(qiáng)，近年來(lái)其感染率略有下降，但在很多地區(qū)仍是優(yōu)勢(shì)病種，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，對(duì)于淋病的防治具有重要意義。目前臨床對(duì)淋病奈瑟氏菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有四種，革蘭氏染色鏡檢；PCR檢測(cè)法；細(xì)菌培養(yǎng)；試紙法。其中最具臨床價(jià)值的是細(xì)菌培養(yǎng)，是淋病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但需要2-3天，陽(yáng)性率20-30%，并且僅在較少部分醫(yī)院開(kāi)展，采用傳統(tǒng)的取樣涂片方法其敏感性僅為10%左右，PCR檢測(cè)法雖然敏感性較高，但特異性較低26'27。本發(fā)明擬采用自行研發(fā)的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物開(kāi)展淋病奈瑟氏菌的快速分離檢測(cè)方法的研究，具有較高的臨床應(yīng)用及研究?jī)r(jià)值。 藍(lán)藻(bluealgae)又名藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、藍(lán)綠藻(blue-green algae),主要特征是是原核，不具載色體，色素主要為葉綠素a，貯藏物質(zhì)主要是藍(lán)藻淀粉，細(xì)胞壁主要成分為粘肽，革蘭氏陰性，能進(jìn)行產(chǎn)氧性光合作用。滇池是云南高原上面積最大的淡水湖泊，素有“高原明珠”之稱(chēng)。但自20世紀(jì)80年代以來(lái)，入湖污染物不斷增力口，導(dǎo)致湖內(nèi)藍(lán)藻大量繁殖，在藻類(lèi)生長(zhǎng)的高峰季節(jié)，會(huì)形成嚴(yán)重的藍(lán)藻“水華”現(xiàn)象，現(xiàn)已屬重富營(yíng)養(yǎng)化水體。2002年的一項(xiàng)調(diào)查中共鑒定出浮游植物106種及變種，隸屬于綠藻門(mén)(Chlorophyta)、娃藻門(mén)(Bacillariophyta)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanophata)、隱藻門(mén)(Cryptophyta)、甲藻門(mén)(Pyrrophyta)和裸藻門(mén)(Euglenophyta)等6個(gè)門(mén)。在浮游植物數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的是藍(lán)藻門(mén)的微囊藻屬(Mi crocystis Kutz.),尤以銅綠微囊藻(M. aerginosaKutz.)最多，其次是惠氏微囊藻(M. weissenbergi i (Kom.)Kom.1n Kondr.)28 目前，國(guó)內(nèi)外去除藍(lán)藻的方法主要有生物法、化學(xué)法和物理法三種29。生物法除藻具有綜合效益，但見(jiàn)效慢、周期長(zhǎng)?；瘜W(xué)藥劑法除藻工藝簡(jiǎn)單，操作方便，但是會(huì)造成二次污染，現(xiàn)已較少使用。物理法除藻主要有機(jī)械清除、人工打撈、活性炭吸附等方法。其中，機(jī)械清除法除藻效果好、處理量大，但成本高；人工打撈、超聲波和電磁波除藻處理量小，只適合小范圍除藻；活性炭吸附對(duì)藻類(lèi)的去除效果很好，但活性炭再生比較困難，因此，處理成本很聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物，并成功用此復(fù)合物對(duì)淋病奈瑟氏菌及水體藍(lán)藻進(jìn)行了分離，為淋病奈瑟氏菌的臨床檢測(cè)及水體藍(lán)藻的分離去除提供一種高效、快捷無(wú)污染的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增目的基因人體CEACAM1，通過(guò)異源表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌(E. coli BL21)中表達(dá)CEACAM1細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域蛋白；通過(guò)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行變復(fù)性及凝膠過(guò)濾層析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣，在酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成CEACAM1蛋白磁粒。本發(fā)明的具體技術(shù)步驟為以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因人體 CEACAM1，所用的一對(duì)弓丨物序列為 Ceacaml-F: 5’ -AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3’ ， Ceacaml-R:5’-GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’ ，將經(jīng) BamHI/XhoI 處理過(guò)的人體CEACAM1編碼區(qū)序列和pET-28a(+)連接構(gòu)建表達(dá)載體；把構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，E. coliBL21 (DE3)大量表達(dá)包涵體形式的人體CEACAM1 ;包涵體洗滌及重懸浮后，依次經(jīng)過(guò)變性、凝膠過(guò)濾層析、復(fù)性和二次凝膠過(guò)濾層析，獲得可溶的人體CEACAM1 ；以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣后，先后在酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成表面帶有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠經(jīng)結(jié)合液清洗并重懸后，加入CEACAM1融合蛋白及偶聯(lián)劑，室溫振搖2(Γ24小時(shí)，即成為CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物。通過(guò)此方法制備的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物，核心部分為表面帶有活性羧基的磁性微球，外層為以共價(jià)鍵與羧基結(jié)合的CEACAM1融合蛋白，整個(gè)復(fù)合物表面直徑約200nm lumo通過(guò)此方法制備的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物可應(yīng)用于制備分離檢測(cè)淋病奈瑟氏菌的復(fù)合物中。通過(guò)此方法制備的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物可應(yīng)用于制備分離檢測(cè)水體藍(lán)藻的復(fù)合物中。 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是制備出的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物是表面包被有CEACAM1融合蛋白的磁性微粒，直徑約200nnTlum，具有較大的比表面積，增加了與微生物的結(jié)合能力，特異性高，可高效、特異、快速、方便地應(yīng)用于淋病奈瑟氏菌及藍(lán)藻的微生物分離。該方法的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)有；構(gòu)建的pET_28a(+)CEACAMl表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)目的蛋白，經(jīng)過(guò)尿素變復(fù)性、凝膠過(guò)濾層析可獲得電泳純的有功能的目的蛋白，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低；CEACAM1蛋白磁粒的制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。應(yīng)用CEACAM1蛋白磁粒分離淋病奈瑟氏菌及藍(lán)藻，方法高效、特異、快速、方便，所使用的化學(xué)試劑均無(wú)毒，并且對(duì)環(huán)境無(wú)污染；CEACAM1蛋白磁?？稍偕褂?。
具體實(shí)施例方式以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因人體CEACAMI (NCBIAccessionNo. :NM_001712)，所用引物序列為 Ceacaml-F:5，-GAAAGGATCC ATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3，，Ceacaml-R:5，-GAAACTCGAG TTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’。將經(jīng)BamHI/XhoI處理過(guò)的人體CEACAMI編碼區(qū)序列和pET_28a(+)連接構(gòu)建表達(dá)載體。把構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，E. coli BL21(DE3)大量表達(dá)包涵體形式的人體CEACAMI。包涵體洗滌及重懸浮后，依次經(jīng)過(guò)變性、凝膠過(guò)濾層析、復(fù)性和二次凝膠過(guò)濾層析，獲得較高純度的人體CEACAMI。以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣后，先后在高溫酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在常溫堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成表面帶有活性羧基的磁性微球。羧化磁珠經(jīng)結(jié)合液清洗并重懸后，加入CEACAMI融合蛋白及偶聯(lián)劑，室溫振搖20~24小時(shí)，即成為CEACAMI蛋白磁粒復(fù)合物。往懸浮于結(jié)合液中的CEACAMI蛋白磁粒復(fù)合物中加入樣本(人體尿道分泌物或者富營(yíng)養(yǎng)化污水)，室溫下輕輕振搖1(Γ15分鐘，磁力吸附2分鐘后，棄上清，洗脫液重懸磁粒，取上清檢測(cè)。具體步驟如下1.人體CEACAMI編碼區(qū)序列的獲得I) PCR擴(kuò)增體系在PCR反應(yīng)管中按下列組成配制反應(yīng)液
權(quán)利要求
1.一種CEACAM1蛋白磁粒的制備方法，其特征是以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增目的基因人體CEACAM1，通過(guò)異源表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌(E. coli BL21)中表達(dá)CEACAM1細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域蛋白；通過(guò)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行變復(fù)性及凝膠過(guò)濾層析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣，在酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成CEACAM1蛋白磁粒。
2.按權(quán)利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的制備方法，其特征及具體步驟為以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因人體CEACAM1，所用的一對(duì)引物序列為Ceacaml-F:5’-AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3’ ， Ceacaml-R:5’- GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3’，將經(jīng)BamHI/XhoI處理過(guò)的人體CEACAM1編碼區(qū)序列和pET_28a(+)連接構(gòu)建表達(dá)載體；把構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化萬(wàn).coli BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，E. coliBL21 (DE3)大量表達(dá)包涵體形式的人體CEACAM1 ;包涵體洗滌及重懸浮后，依次經(jīng)過(guò)變性、凝膠過(guò)濾層析、復(fù)性和二次凝膠過(guò)濾層析，獲得可溶的人體CEACAM1 ；以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣后，先后在酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成表面帶有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠經(jīng)結(jié)合液清洗并重懸后，加入CEACAM1融合蛋白及偶聯(lián)劑，室溫振搖20 24小時(shí)，即成為CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物。
3.按權(quán)利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的制備方法，其特征是通過(guò)此方法制備的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物，核心部分為表面帶有活性羧基的磁性微球，外層為以共價(jià)鍵與羧基結(jié)合的CEACAM1融合蛋白，整個(gè)復(fù)合物表面直徑約200nm lum。
4.一種權(quán)利要求1、2或3所述的方法在制備分離檢測(cè)淋病奈瑟氏菌的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物中的應(yīng)用。
5.一種權(quán)利要求1、2或3所述的方法在制備分離檢測(cè)水體藍(lán)藻的CEACAM1蛋白磁粒復(fù)合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(CEACAMl)細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)、純化的方法和應(yīng)用。本發(fā)明以人體肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，擴(kuò)增目的基因人體CEACAM1，通過(guò)異源表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌(E.coliBL21)中表達(dá)CEACAM1細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域蛋白；通過(guò)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行變復(fù)性及凝膠過(guò)濾層析，得到可溶的CEACAMl融合蛋白；以Fe3O4為載體，經(jīng)硅酸包衣，在酸性環(huán)境中與硅烷反應(yīng)、在堿性環(huán)境中與戌二酸酐反應(yīng)，制成CEACAMl蛋白磁粒。本發(fā)明能大量生產(chǎn)較高純度的人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(CEACAMl)細(xì)胞外特定結(jié)構(gòu)域，并且以其為基本成分制備了一種微納米磁粒-CEACAM1復(fù)合物?，F(xiàn)階段研究表明，該復(fù)合物可以用于淋病奈瑟氏菌和藍(lán)藻的快速分離檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/89GK103060361SQ201310030348
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者孟照輝, 謝月輝, 李玉葉, 葉秋芳 申請(qǐng)人:昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院