專利名稱：家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaip1及其重組表達載體和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl,還涉及含有該基因的重組表達載體和該基因的應用。
背景技術(shù)：
隨著21世紀生物工程以及基因工程的迅速發(fā)展，人們對醫(yī)用、藥用、食用、美容、保健等各種用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然來源的蛋白質(zhì)提取已無法滿足快速增長的市場需求。建立和完善各種高效的原核和真核表達系統(tǒng)，并利用菌株、細胞和昆蟲等作為宿主生物反應器，是實現(xiàn)低成本、規(guī)?；a(chǎn)具有生物學活性的重組外源蛋白的有效和可持續(xù)方法，并成為當今世界研究的熱點。利用中國倉鼠卵巢細胞作為生物反應器生產(chǎn)外源蛋白是目前最為標準的表達模式，但其運營成本和對環(huán)境的要求極為苛刻，嚴重限制了其大規(guī)模推廣應用。為了建立低成本、規(guī)?；?、安全可持續(xù)的高效生產(chǎn)外源蛋白的生物工廠，自2000年以來，科研人員開始嘗試利用轉(zhuǎn)基因生物，如哺乳動物、鳥類、昆蟲以及植物的器官作為生物反應器來生產(chǎn)重組外源蛋白。家蠶以泌絲著稱，是最早被人類所完全馴化利用的經(jīng)濟動物(昆蟲)之一。絹絲腺是合成、分泌蠶絲蛋白的唯一器官，為整個蠶絲業(yè)的生物學基礎(chǔ)。經(jīng)過數(shù)千年的人工馴化，家蠶的絹絲腺具備了超強的蛋白質(zhì)合成與分泌能力，一頭體重5g左右家蠶能合成分泌約
O.5g蠶絲蛋白，為目前已知昆蟲之最。蠶絲蛋白主要由絲素蛋白(fibroin)和覆被在其外層的絲膠蛋白(sericin) 構(gòu)成絲素蛋白是蠶絲的主體，約占75%，由蠶的后部絲腺合成，包括fib-H鏈、fib-L鏈和P25三種主要組分，均不溶于水；其余為絲膠蛋白，約占25%，由蠶的中部絲腺合成，包括絲膠I (5ferici/ l)、絲膠2{Sericin2、和絲膠3(5ferici/ 3)三種主要組分，其中又以絲膠I蛋白含量最高，均可溶于水。隨著現(xiàn)代分子生物學和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，家蠶絹絲腺的高效合成與分泌絲蛋白這一特征，以及所具備的糖基化、甲基化等對外源蛋白保持活性極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工能力，飼養(yǎng)成本低，可工廠化生產(chǎn)，對人畜安全等特點，使其成為理想的生物反應器模型，備受各國研究人員關(guān)注并競相開發(fā)利用。2000年，田村等人利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導顯微注射家蠶早期胚胎獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因蠶；2003年，夏慶友等人完成了家蠶基因組計劃，家蠶絲腺中涉及絲蛋白合成的重要編碼基因如絲素重鏈(FibH chain)基因、絲素輕鏈(FibL chain)基因、絲膠I(Sericinl)基因、絲膠2 (Sericin2)基因、絲膠3 (Sericin3)基因以及P25基因等的啟動子調(diào)控元件被鑒定和克隆，這些基礎(chǔ)研究結(jié)果使得利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在家蠶特異組織如絲腺中大規(guī)模生產(chǎn)重組外源蛋白成為可能。近年來，國內(nèi)外利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及家蠶組織特異啟動子元件在絲腺中嘗試表達了多個外源蛋白，包括在后部絲腺表達了絲素重鏈融合的EGFP (Zhao et al. 2010)、貓干擾素(Kurihara et al. 2007)、蜘蛛絲牽引蛋白(Zhu et al. 2010)、人III型膠原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、增強型紅色熒光蛋白(Tomita et al. 2003)，絲素輕鏈融合的羥基脯氨酸膠原部分肽段(Adachi et al. 2006)、成纖維細胞生長因子(Hino et al. 2006)、增強型綠色熒光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分膠原蛋白妝段(Yanagisawa et al. 2007),以及 P25 融合的紅色突光蛋白(Royer et al. 2005)等；在中部絲腺表達了人血清白蛋白(Ogawa etal. 2007)、增強型綠色突光蛋白(Tomita et al. (2007)、鼠單克隆抗體(Iizuka et al.2009)、人膠原蛋白α鏈基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受體a (Urano etal. 2010)等。但總體上，上述研究成果的產(chǎn)業(yè)化推進頗為困難，主要原因在于在絲素中生產(chǎn)的外源蛋白雖具有較高的含量，但重組蛋白極難純化且易破壞其生物活性；在絲膠中生產(chǎn)的外源蛋白雖較容易純化，但利用現(xiàn)有絲膠表達系統(tǒng)獲得的重組蛋白含量極低而難以實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。因此，針對外源蛋白表達合成的各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，改造并建立新的高效、穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)，是解決上述瓶頸的根本出路。也是今后家蠶生物反應器開發(fā)的核心所在。外源基因在真核細胞、組織中的表達受到轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(包括mRNA的轉(zhuǎn)運和穩(wěn)定性調(diào)控)、翻譯效率、翻譯后調(diào)控以及蛋白分泌等一系列調(diào)控，這些調(diào)控是由啟動子調(diào)控區(qū)、外源基因ORF中的順式作用元件與宿主體內(nèi)的反式調(diào)控因子協(xié)同完成。已有的研究結(jié)果表明對轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺表達系統(tǒng)的絲膠I(Seicinl)啟動子活性進行改進，使其驅(qū)動的外源基因的轉(zhuǎn)錄水平達到了內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄水平的40-160%，但是外源基因的蛋白合成量卻只約占內(nèi)源基因蛋白合成量的O. 8-2. 8%，暗示翻譯效率是外源重組蛋白表達量的重要限速步驟，因此需要迫切提高外源基因mRNA的翻譯效率。真核生物mRNA翻譯的起始是由一系列蛋白因子e復合物的形成是整個翻譯過程的限速步驟。其中，PABP結(jié)合蛋白互作因子(Poly(A)-binding protein (PABP) interacting protein-1，Paipl)是一個關(guān)鍵蛋白因子，在翻譯起始復合物的形成中起著橋聯(lián)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在C0S-7細胞中過量表達Paipl基因可以提高熒光素酶(LUC)的mRNA的翻譯效率。但是目前未見家蠶Paipl基因的相關(guān)報道。`

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl，解決現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)基因家蠶中外源基因轉(zhuǎn)錄水平高，但翻譯效率低的問題；本發(fā)明的目的之二在于提供含有家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl的重組表達載體，能夠高效表達BmPaipl基因；本發(fā)明的目的之三在于提供家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl的應用。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案1.家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2.含有所述家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl的重組表達載體。優(yōu)選的，所述重組表達載體由家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl i^Bgl II和Afoi I酶切后，連入經(jīng)及麗Y I和Afoi I酶切后的psl 1180[hr3BmAct4-l 14LUCSer 1PA]載體而得。3.所述家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl在提高外源基因翻譯效率中的應用。優(yōu)選的，所述外源基因為熒光素酶基因。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明從家蠶大造品系的絲腺中克隆獲得家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl，該基因全長1194bp，為一個完整的表達框，由8個外顯子構(gòu)成，編碼398個氨基酸,將該序列構(gòu)建一個重組的表達載體，通過在昆蟲細胞中的表達檢測，發(fā)現(xiàn)BmPaipl能顯著提高報告基因LUC的表達水平；因此本發(fā)明公開的BmPaipl基因具有提聞外源基因翻譯效率的功能，該基因可應用于提聞外源基因在轉(zhuǎn)基因家香中的表達量，促進家蠶轉(zhuǎn)基因生物反應器實用化進程。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明
圖1家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因BmPaipl結(jié)構(gòu)圖；(A)為家蠶BmPaipl基因結(jié)構(gòu)示意圖，該基因全長1194bp，由8個外顯子構(gòu)成，編碼398個氨基酸，白色方框表示外顯子，上方數(shù)字表示DNA堿基個數(shù)；(B)為BmPaipl蛋白功能域。BmPaipl蛋白C端含有一個與eIF4G蛋白高度同源的結(jié)構(gòu)域，與eIF4E和eIF4A結(jié)合形成翻譯起始復合物。圖2重組表達載體結(jié)構(gòu)圖(A為pSL[hA4LUCSerlPA]載體結(jié)構(gòu)圖；B為pSL[hA4BmPaipISerlPA]載體結(jié)構(gòu)圖；hr3CQ為增強子Hr3，BmA4為家蠶肌動蛋白4基因啟動子，SerlPA為絲膠I基因3’ UTR序列，AMP為氨芐抗性基因)。圖3熒光素酶活性檢測圖(為BmPaipl促進LUC在家蠶胚胎細胞系BmE中的表達檢測 '為BmPaipl促進LUC在Sf9細胞系中的表達檢測；LUC的活性結(jié)果表示為螢火蟲的熒光素酶酶活性除以海 參熒光素酶酶活性(內(nèi)參)的比值RLU再除以蛋白濃度；每個實驗組設(shè)置3個平行試驗，并進行3次獨立重復實驗)。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中使用的家蠶細胞系為家蠶胚胎細胞系BmE，以及Sf9細胞系均由中國西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室培養(yǎng)和保存。實施例一、家蠶BmPaipl基因的分子克隆
將從 NCBI 下載的人類 Paipl 基因(Homo sapiens poly (A) binding proteininteracting protein I, PAIP1, G1:208022642)序列，在家香 SilkDB 中進行同源比對，檢索出一條同源序列BGIBMGA009981-TA，將該序列進行EST拼接發(fā)現(xiàn)具有完整的0RF，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計家蠶BmPaipl的編碼區(qū)引物上游引物為BmPaipl-F: 5' -aaaaagatctatgaataacggtgatattagtgct-3’ (SEQ ID NO.1),下劃線為限制性內(nèi)切酶位點Bgl II ;下游引物為BmPaipl-R: 5’ -aaaagcggccgcttatcgctttatctgattcgatat-3’ (SEQ ID NO. 2),下劃線為限制性內(nèi)切酶位點Not I。以家蠶大造絲腺cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為94°C預變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火45秒，72 °C延伸60秒，共30個循環(huán)；最后72 °〇延伸10分鐘，4 °C保存。將擴增所得PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳回收，然后與PMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5ci，將篩選獲得的陽性克隆進行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO. 3所示，并命名為家蠶PABP結(jié)合蛋白互作因子基因，簡稱家蠶BmPaipl基因。由SEQ ID NO. 3可知，家蠶BmPaipl基因編碼框全長1194bp,由8個外顯子構(gòu)成,編碼398個氨基酸,理論蛋白分子量為44kDa,等電點pl=5. 02,如圖1A所示。通過SMART在線軟件(http://smart,embl-heidelberg. de/)分析發(fā)現(xiàn)家蠶BmPaipl編碼的氨基酸序列中第100至398位與真核生物的eIF4G蛋白結(jié)構(gòu)高度同源的結(jié)構(gòu)域，因此推測家蠶BmPaipl可能與eIF4E和eIF4A結(jié)合形成翻譯起始復合物，可能具有已報道的Paipl蛋白促進基因翻譯效率的功能，其原理如圖1B所示。實施例二、家蠶BmPaipl基因的功能檢測
利用Bgl II和Not I限制性內(nèi)切酶將BmPaipl從pMD18_T載體上切下，連接至經(jīng) BamH I 和 Not I 酶切后的 psl1180 [hr3BmAct4_l 14LUCSer 1PA]骨架載體上(又名 pSL[hA4LUCSerlPA])，形成重組載體 pSL[hA4BmPaip ISerlPA]，如圖 2A 所示(psl1180[hr3BmAct4-l 14LUCSer 1PA]載體在
發(fā)明者夏慶友, 王峰, 徐漢福, 袁林, 王元成, 趙萍, 向仲懷 申請人:西南大學