專利名稱：快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于與生物工程領域，尤其是一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法。
背景技術：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,簡稱ALA)又名S-氨基乙酰丙酸、S-氨基戊酮酸，其用途非常廣泛，已應用于農業(yè)和醫(yī)學等領域。如作為光活化綠色無公害的除草劑、殺蟲劑、抗微生物藥劑和植物生長促進劑而應用于農業(yè)領域；在醫(yī)學上已被應用于癌癥的光動力學治療和診斷上，另外，還可作為治療痤瘡的外用藥及生發(fā)劑。Nishikawa等以NTG (亞硝基胍，CH4N4O)重復誘變紅假單胞菌屬的類球紅細菌( o而如cter
而s)并通過對類球紅細菌生長條件的控制，增大了 5-氨基乙酰丙酸的產量；日本科莫斯石油公司也是利用變異的類球紅細菌iRhodebacter sphaeroides、來制取5_氨基乙酰丙酸，極大的提高了產量。提高5-氨基乙酰丙酸產量的關鍵是對高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的篩選，現有的篩選方法是通過搖瓶培養(yǎng)菌株后進行篩選，但由于誘變育種的盲目性及誘變產生的優(yōu)良生產性狀不易保持，增大了誘變育種篩選的難度，使得篩選工作量大，篩選效率低。·

發(fā)明內容
本發(fā)明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法。本發(fā)明的技術解決方案是:一種快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，依次按照如下步驟進行:
a.將經過誘變處理的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌IRhodobactersphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，32°C培養(yǎng)后稀釋制成IO3^lO4個/ml的菌懸液，涂平板培養(yǎng)至生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于深孔板各孔中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 48h，然后再向液體培養(yǎng)基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分別為甘氨酸15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24h ;所述液體培養(yǎng)基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養(yǎng)是在恒溫微孔快速振蕩器上，30 32°C，黑暗，振蕩15(Tl80r/min培養(yǎng)；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。本發(fā)明操作簡單，不僅篩選準確度高于現有技術，而且縮短了篩選周期，保留了突變菌株的突變性狀，可減少篩選工作量，提高篩選效率，可以應用于高通量、大規(guī)模篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。


圖1為本發(fā)明實施例1的96深孔板篩選直方圖。
具體實施例方式實施例1:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(處理方法同現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，32°C培養(yǎng)后稀釋制成IO4個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養(yǎng)，31°C黑暗培養(yǎng)4天，平板上生成菌落； b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板的96個孔中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)40h，然后再向液體培養(yǎng)基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，每升培養(yǎng)基中加入量為甘氨酸30mmol,琥拍酸30 mmol,乙酰丙酸45mmol,繼續(xù)培養(yǎng)24h ;所述液體培養(yǎng)基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.Sg,硫酸鎂 0.2g，氯化鈣 0.053g，硫酸錳 1.2X10_3g，尼克酸 1.0X10_3g，VB1 1.0Xl(T3g，酵母膏2.0g，生物素1.0X10_5g ;所述培養(yǎng)的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，32°C，黑暗，振蕩170r/min 培養(yǎng)；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。實施例2:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，32°C培養(yǎng)后稀釋制成IO3個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養(yǎng)，32°C黑暗培養(yǎng)4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板的96孔中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，然后再向液體培養(yǎng)基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量為甘氨酸15mmol/L，琥拍酸20 mmol/L,乙酰丙酸30mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24h ;所述液體培養(yǎng)基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.8g,磷酸氫二鉀0.5g,磷酸二氫鉀0.5g,硫酸銨0.8g,硫酸鎂0.2g,氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養(yǎng)的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，32°C，黑暗，振蕩180r/min培養(yǎng)；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。實施例3:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌GWotZo如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，31°C培養(yǎng)后稀釋制成IO4個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養(yǎng)，32°C黑暗培養(yǎng)4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板96孔中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，然后再向液體培養(yǎng)基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量為甘氨酸45mmol/L，琥拍酸40 mmol/L,乙酰丙酸60mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24h ;所述液體培養(yǎng)基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.8g,磷酸氫二鉀0.5g,磷酸二氫鉀0.5g,硫酸銨0.8g,硫酸鎂0.2g,氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素
1.0X 10_5g ;所述培養(yǎng)的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，30°C，黑暗，振蕩150r/min培養(yǎng)；
c.向每孔中加入0.1ml IM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的體積濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。Ehrlich顯色劑為現有技術，即2%的對-二甲氨基苯甲醛的醋酸溶液和0.1ml質量濃度16%的高氯酸。本發(fā)明實施例1的96深孔板篩選直方圖如圖1所示，從圖1中可以看出，G12菌液的553nm分光光度值為0.340，為96孔菌液中的最大值。將96孔中菌液配制成相同濃度，按照現有技術方法生產5-氨基乙酰丙酸，結果表明G12菌液所生產ALA濃度為33.1 mg/L,為高產5-氨基乙酰丙酸誘變菌株。以G組為例，G組的12株菌液試驗如表1:
表I G組12株菌產5-氨基乙酰丙酸的濃度(單位:mg/L)
權利要求
1.一種快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，依次按照如下步驟進行: a.將經過誘變處理的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌iRhodobactersphaeroides) (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，32°C培養(yǎng)后稀釋制成IO3^lO4個/ml的菌懸液，涂平板培養(yǎng)至生成菌落； b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于深孔板各孔中的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)·36 48h，然后再向液體培養(yǎng)基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分別為甘氨酸·15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24h ;所述液體培養(yǎng)基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀·0.5g，硫酸銨0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養(yǎng)是在恒溫微孔快速振蕩器上，·30 32°C，黑暗，振蕩15(Tl80r/min培養(yǎng)； c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株?！ぁ?br> 全文摘要
本發(fā)明公開一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，是將一株類球紅細菌通過物理或化學方法誘變處理后，無菌生理鹽水洗滌，液體培養(yǎng)基重懸，32℃培養(yǎng)后，稀釋菌懸液涂平板；從平板上挑單個菌落到無菌的96孔深孔板的對應孔中，32℃，黑暗，振蕩培養(yǎng)48h，加前體和琥珀酸，再培養(yǎng)24h；ALA微量顯色法(深孔板法)檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。
文檔編號C12N15/01GK103232993SQ20131003091
公開日2013年8月7日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權日2013年1月28日
發(fā)明者莊國宏, 宋濤, 張琪 申請人:大連三儀動物藥品有限公司